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Determinación

de Urea

Ana Fernández; Dayane Rivera; Daniela Soto

Fecha: 26junio 2012

La urea es una sustancia con alto contenido en nitrógeno que se produce


cuando el cuerpo metaboliza las proteínas y aminoácidos. Se produce en el
hígado; y el riñón es el encargado de eliminarla del cuerpo a través de la
orina. Su concentración la determinamos en una muestra, utilizando un kit
enzimático que cuantifica dicha concentración a través de la denominada
reacción de Berthelot modificada (donde los iones amonio reaccionan con
hipoclorito y salicilato para formar un complejo de color verde).
El objetivo de esta prueba diagnóstica es determinar si los riñones funcionan
en su normalidad, si ha empeorado una enfermedad renal existente; también,
para llevar el seguimiento de una enfermedad renal o para determinar si una
persona se encuentra o no deshidratada.
INTRODUCCIÓN

Es de vital importancia mantener el organismo en un constante


equilibrio, uno de tantos órganos que ayudan a esta nivelación son
los riñones, los cuales están constantemente excretando orina. El
compuesto más abundante en la orina es la urea, ésta se forma a
partir del amoníaco a nivel hepático. La urea es el producto normal
de la degradación de las proteínas.
En el presente informe se determinará la concentración de urea en
una muestra de orina, con el fin de valorar la función renal; para ello
utilizaremos un kit enzimático que cuantifica dicha concentración a
través de una reacción de Berthelot modificada (donde los iones
amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato para formar un
complejo color verde). Además, se pretende dar a conocer la
relación de la concentración plasmática de urea y otros compuestos
nitrogenados, como son creatinina y ácido úrico con la función de
los riñones.

Valores normales en cuanto a la concentración de urea fluctúan


entre 20-40 mg/dl. Alteraciones en este rango puede llevar por
ejemplo, a una elevación de este compuesto en la sangre que
puede deberse: a deshidratación, obstrucciones renales, fallo renal,
entre otros.

El presente informe tiene por objetivo conocer la técnica para el


análisis cuantitativo de urea en una muestra de orina por medio de
reacciones colorimétricas enzimáticas a realizar.
Materiales

Para realizar este trabajo se necesitara:

 Espectrofotómetro ajustado a 578 nm.


 Cubetas de plástico de 1,5 ml.
 Material volumétrico.
 Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl
 Tubos de ensayo.
 Muestra de suero.
 Kit para la determinación enzimática de urea en orina.
 Timer o cronometro.

Método

Para realizar las mediciones de las concentraciones de urea presente en


la orina se necesitan preparar previamente unas diluciones de ésta,
debido a que se encuentra muy concentrada. Se preparan 3 soluciones
en tubos de ensayos distintos de la siguiente forma:

 En el primer tubo se agregan 10 µl de orina mas 490 µl de agua, la


cual resulta en una disolución de 500 de dilución 1/50.
 En el segundo tubo se prepara una dilución extrayendo 100 µl de
la dilución anterior (1/50) más 100 µl de agua quedando 200 µl de
dilución 1/100.
 Por último en el tercer tubo se agregaran 100 µl de la dilución
anterior (1/100) más 100 µl de agua quedando 200 µl de dilución
1/200.
Teniendo los tres tubos listos con sus respectivas diluciones, se
prepararan de la siguiente manera para su posterior medición:

 Tubo N°1: (blanco) contienen 10 µl de H2O más 1mL de reactivo 1.


 Tubo N°2: (estándar) contienen 10 µl de estándar de urea más
1mL de reactivo 1.
 Tubo N°3: (dilución 1/50) contienen 500 µl de la dilución más 1mL
de reactivo 1.
 Tubo N°4: (dilución 1/100) contienen 200 µl de dilución más 1mL
de reactivo 1.
 Tubo N°5: (dilución 1/200) contienen 200 µl de dilución más 1 mL
de reactivo 1.

Después de agregar los compuestos en cada tubo, estos se mezclan por


agitación y se dejan incubar durante 10 minutos y se agrega 1 mL de
reactivo 2 en cada uno de los tubos, se agitan y se dejan incubar otros
10 minutos más. Luego se toma 1 mL de cada tubo y son dejados en las
cubetas en las cuales serán medidas las absorbancias en el
espectrofotómetro.

Resultados

Los cálculos se realizaran según la siguiente forma:

Concentración Urea (mg/dL) = Δ Absorbancia de la muestra x 80

Δ Absorbancia del Estándar

Donde:

Δ Absorbancia de la muestra= Abs. de los tubos – Abs. tubo blanco


Δ Absorbancia del Estándar= Abs. del tubo estándar - Abs. tubo blanco.
1).- Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 578nm; como se indica en
tabla correspondiente a la determinación de urea.

Muestras T% Absorbancias
Blanco 78,5 0,105
Estándar urea 7,4 1,130
Orina dilución 1/50 12,2 0,915
Orina dilución 1/100 34,1 0,467
Orina dilución 1/200 51,3 0,290

2).- Para llevar a cabo la medición correcta de las concentraciones de urea se


debe tomar en cuenta los factores de dilución, para desarrollar los cálculos

 Tubo 3 (dilución 1/50)

Concentración urea (mg/dL) = ((0,915 - 0,105)/2) x 80 = 31,61 mg/dL


1,025

 Tubo 4 (dilución 1/100)

Concentración urea (mg/dL) = (0,467- 0,105) x 200 = 28,25 mg/dL


1,025

 Tubo 5 (dilución 1/200)

Concentración urea (mg/dL) = ((0,290- 0,105) x 2) x 80 = 28,88 mg/dL


1,025
Discusión

Es importante señalar que tal cual se pensaba, efectivamente la lectura


de la absorbancia y la relación absorbancia-concentración fue
directamente proporcional; debido a que el muestra estándar (tubo 2)
debía ser el que presentara una absorbancia mayor en comparación con
las demás muestra, lo cual se cumplió.

En el caso de los tubos 3, 4 y 5 en donde corresponden a los muestras


con orina diluida al 1:50, 1:100 y 1:200 respectivamente; al igual como
ocurrió en el caso anterior; lo que se creía fue efectivamente
comprobado. Luego de leer las absorbancias de estas muestras nos
arrojó que la muestra 3 (1:50), que es el tubo que tuvo mayor
concentración de orina fue el que presento una absorbancia mayor en
comparación a las dos restantes muestras con orinas mas diluidas. Por
consiguiente fue la muestra 5 (1:200) el que presento una absorbancia
menor; sin considerar y dejando claro que indudablemente nuestro tubo
blanco será nuestra muestra que arroje valores siempre menores de
absorbancia.

Tal como se ha realizado en trabajos anteriores; en este trabajo también


se ocupo el método “colorimétrico enzimático” el cual nos sigue
colocando en manifiesto los hechos mencionados anteriormente, los
cuales nos dejan en evidencia mediante el cambio de color de las
muestras a una tonalidad verde, que la intensidad de color varia según la
concentración de urea presente siendo proporcional, por este motivo es
la muestra 2 la que presenta un cambio de color a verde de mayor
intensidad, mientras que nuestra muestra 1 que es nuestro tubo blanco
no debía presentar cambios de color lo cual efectivamente así sucedió.
Preguntas Anexas

1. ¿Qué se entiende por uremia?

Por uremia se entiende síndrome producido por la acumulación en la


sangre de los productos tóxicos que en estado general normal, son
eliminados por el riñón y que se hallan retenidos por un trastorno del
funcionamiento renal.

2. ¿Cuáles son los valores normales para los métodos descritos en


el práctico?

Los valores normales descritos en el práctico son entre 10 – 50 mg/dl.

3. Relación entre excreción de productos nitrogenados y función


renal.

La relación que existe es que la capacidad de excretar productos


nitrogenados va directamente relacionada con la función renal, ya que
si hay retención de productos de desechos quiere decir que se
encuentra afectada la capacidad filtradora del riñón acumulándose
este metabolito principalmente en la sangre.

4. Respecto al método de análisis usado en este practico:


¿Por qué es colorímetro enzimático?, ¿Qué diferencia tiene con
el método, también colorímetro enzimático utilizado en el
practico anterior?

Es colorímetro enzimático porque que requiere de reacciones


enzimáticas para poder obtener un compuesto de color a partir de un
sustrato (urea en esta oportunidad). Y la diferencia con el practico
anterior es que necesitamos de dos reactivos (reactivo 1 y reactivo 2)
los cuales incubamos en dos ocasiones (10 minutos primero, 10
minutos después).
5. ¿Cómo es la concentración de los sustratos en relación al Km de
la enzima, porque?

La concentración del sustrato es directamente proporcional al


producto final generado por la enzima.

6. ¿En qué porción de la curva de Michaelis-Menten estamos


trabajando? ¿Porque?

Cuando se trabaja con concentraciones de sustrato muy grandes con


respecto al Km se trabaja en la parte superior de la curva de
Michaelis-Menten, si se trabaja a concentraciones menores de
sustrato, se trabaja en la parte inferior, y si la concentración es infinita
se trabaja a una Vmáx. En este caso y en estas condiciones está
trabajando a un nivel máximo de sustrato, o sea, que la muestra se
saturó.

7. ¿Cuál es el producto que absorbe a la longitud de onda en que


haremos la determinación?

El producto que absorbe la longitud de onda en que haremos la


determinación es el indofenol (colorante obtenido por una reacción de
oxidación, al mezclar para-aminofenol y de un fenol), en donde cuya
intensidad de color es proporcional a la cantidad de urea presente en
la muestra obtenida.

8. ¿Qué entiende por de uso de enzimas como herramientas para


determinación de sustratos?

El uso de enzimas como herramientas para la determinación de


sustratos se entiende como el fin de dar la propiedad de absorber luz a
moléculas que se deseen medir, mediante reacciones enzimáticas que
producen cambios bioquímicos de gran importancia en las moléculas
para que presenten una absorbancia debidamente realizada.
9. ¿En que se basa el cálculo de concentración de un sustrato,
mediante una reacción enzimática colorimétrica, utilizando un
estándar de concentración conocida?

En que la absorbancia obtenida del estándar corresponde a su


respectiva concentración y se relaciona en proporción con las
absorbancias obtenidas de las muestras.

CONCLUSIÓN

Para valorar la función renal es de vital importancia la cuantificación de


concentración de urea en la orina, ya que hay una directa relación de la
capacidad de este órgano, ya sea, a modo de filtración, como también en
la excreción. Por otro lado, es importante recordar que la urea es el
principal producto terminal del metabolismo de proteínas en el ser
humano y en los mamíferos en general. Un adulto elimina de 25 a 39g de
este compuesto diariamente. Acumulaciones de este producto final del
metabolismo, puede provocar graves afecciones, entre otras la uremia,
que es producida por la acumulación en la sangre de los productos
tóxicos que generalmente, son eliminados por el riñón y que se
encuentran suspendidos por un trastorno del funcionamiento renal.

En el práctico al obtener los resultados, logramos comprobar que tal cual


se pensaba, efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación
absorbancia-concentración fue directamente proporcional; debido a que
el muestra estándar que utilizamos (tubo 2), debía ser el que presentara
una absorbancia mayor en comparación con las demás muestras, lo cual
se verificó.
El método colorimétrico enzimático ejecutado en este laboratorio, indica
que es de gran utilidad para la medición de la concentración de urea en la
muestra de orina. Por otro lado, además de ser muy exacto en las
mediciones realizadas de las distintas soluciones, no presenta problemas
en cuanto a la maniobra, lo que lo hace un método bastante expedito y
preciso, de acuerdo a la realización.
Bibliografía

http://es.scribd.com/doc/35196414/CAPITULO08-Enzima-Km-y-Vmax

http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a
%C3%B1o/bioquimica/Seminario%206-Enzimas.pdf

http://blogs.ya.com/tzuvic-
ioqodontolog/files/Guias_Laboratorio_ODON_0007__2008.pdf

Guía de trabajos prácticos Bioquímica para tecnología médica.


Determinación de urea.