PRACTICA No. 4 CUANTIFICACIN DE ADN OBJETIVO GENERAL El alumno realizar la cuantificacin de ADN obtenido anteriormente por distintos mtodos.

OBJETIVOS ESPECFICOS Cuantificar DNA por mtodos espectrofotomtricos.

Cuantificar DNA por densitometra en gel.

Realizar el anlisis comparativo de ambos mtodos. FUNDAMENTO TERICO Espectrofotometa La concentracin de DNA se puede estimar utilizando un espectrofotmetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases pricas y pirimidnicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. Es importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de hidrgeno), el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario. Una unidad de densidad ptica (DO) a 260 nm equivale a 50 g/ml de ADN de doble cadena, a 40 g/ml de ARN y ADN de cadena simple, y a 33 g de oligonucletidos.

La determinacin de la pureza de ADN se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260, 280 y 230 nm. En las preparaciones de cidos nuclicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobreestimaciones de la concentracin de cidos nuclicos. La concentracin de protena puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de protenas en la muestra har que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para cidos nuclicos puros. Una muestra pura debe presentar un radio de absorbancia a 260/280 nm que exceda el valor de 1.75 para propsitos analticos (para ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 1.8). Si la muestra es impura debern repetirse extracciones con fenol para remover dichas impurezas. Teniendo el valor de absorbancia a 230 nm, podemos obtener la razn Abs230/Abs260, si sta es mayor de 0.5, sugiere contaminacin con fenol, cloroformo o carbohidratos. Otro parmetro a considerar es la absorbancia a 320 nm, que est relacionada con la difraccin de la luz por material particulado en la muestra.

Otro mtodo empleado para la estimacin de la concentracin de ADN, es por visualizacin en gel mediante corrida electrofortica. Para ello se colocan las muestras a analizar en pozos individuales, se corre la electroforesis a un voltaje constante, se visualiza el producto con U.V. en el transiluminador y se toma una fotografa. En este mtodo la estimacin se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algn programa computacional que contraste intensidades de color. Electroforesis en gel de agarosa El movimiento de molculas cargadas a travs de un soporte slido bajo la influencia de un campo elctrico, es conocido como electroforesis. Si el campo elctrico es aplicado a travs de electrodos a una solucin de molculas cargadas positivamente, stas se dirigirn hacia el electrodo negativo y aquellas cargadas negativamente hacia el electrodo positivo. Las molculas de ADN presentan una elevada carga

negativa, por lo tanto su movimiento ser hacia el electrodo positivo. Su migracin a travs del gel es inversamente proporcional al log 10 del nmero de bases de pares. Las grandes molculas migran con mayor lentitud debido al arrastre de una mayor friccin, y debido a que su paso a travs de los poros del gel es menos eficiente que el de las molculas pequeas.

Los geles de agarosa son el medio ms comn para la electroforesis de ADN. La agarosa es un polmero lineal compuesto de residuos alternantes de D- y L- galactosa unidos por enlaces glucoslicos (1-3) y (1-4). Un amplio rango de tamaos (<10 bp a >20 kb) puede ser resuelto dependiendo de la concentracin de agarosa (Tabla 1). Existe una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad electrofortica del DNA () y la concentracin del gel () que se describe con la ecuacin:

Log = log 0 K r

0= movilidad electrofortica libre del ADN, K r=coeficiente de retardacin, una constante relacionada a las propiedades del gel, el tamao y forma de las molculas migratorias. La acrilamida puede tambin ser usada para la separacin de pequeos cidos nuclicos y oligonucletidos (Tabla 1).

Tabla1. Porcentajes de agarosa y el posible rango de kb observado en gel.

Las molculas de DNA del mismo tamao se movern a travs del gel a la misma velocidad, observndose como una sola banda. Una muestra de ADN con diferentes tamaos producir varias bandas en el gel.

El mtodo ms conveniente y comnmente utilizado para la visualizacin de ADN y RNA en geles de agarosa es mediante tincin con bromuro de etidio, el cual contiene un grupo tricclico planar que se intercala entre las bases de los cidos nuclicos. Una radiacin a 254 nm es absorbido por el ADN y transmitido a la tincin. La energa es re-emitida a 590 nm en la regin rojo-naranja del espectro visible.

REACTIVOS Agarosa Agua destilada TAE 1x Buffer de carga para DNA (Glicerina 30%, Azul de bromofenol 0.05%)

MATERIAL (por equipo) Cmara de electroforesis para cidos nuclicos Molde para gel Fuente de poder Espectrofotmetro

TE 1x Bromuro de etidio 10mg/ml Marcador de peso molecular de 1 Kb (Adicionar a un tubo eppendorf 15 l de marcador 1kb + 15 l de buffer de carga)

Celdas de cuarzo 1 Probeta de 100 ml estril 1 Matraz erlenmeyer de 250 ml estril 1 esptula papel para pesar Papel parafilm Transiluminador Cmara fotogrfica Puntas de 2-20L, de 20-200L y de 100-1000l estriles Micropipetas de 2-20L, de 20-200L y de 1001000l Hielera Hielo

METODOLOGA MUESTRAS 1. ADN total de bacterias 2. ADN total de plantas de chile

CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS MEDIANTE DENSITOMETRA A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de las muestras. 1.- Pesar 0.5 gramos de agarosa para preparar 50 ml de un gel al 1% en buffer TAE 1X. 2.- Disolver en horno de microondas, verter la preparacin de agarosa en un molde adecuado con peines y dejar gelificar. 3.- Colocar el gel en la cmara de electroforesis y cubrir con buffer de corrida TAE 1X (aproximadamente 300-400 mL). 4.- Colocar 5 l de cada muestra de ADN en parafilm de forma independiente, mezclar con 2 l de buffer de carga para ADN. Colocar el volumen total (7 l) dentro de los pozos del gel de agarosa con ayuda de una micropipeta. 5.- Adicione en uno de los pozos 4 l de 1 Kb como marcador de peso molecular. 6.- Corra el gel a 100 V. 7.- Tia el gel en la solucin de bromuro de etidio (Solucin de Tincin de los geles: 20 l de bromuro de etidio 10 mg/ml + 200 ml de agua destilada. Colocar el gel en una charola conteniendo esta solucin durante 5 minutos, cubra la charola con papel aluminio o tapa. Para desteir coloque el gel en una charola con agua, durante 5 minutos). 8. Visualice en el transiluminador y obtenga la foto. 9.- Integre la fotografa digitalizada en un programa de cmputo para procesamiento y anlisis de las imgenes previamente sugerido por sus profesores.

10.- Estime la concentracin de ADN de las muestras mediante el programa de cmputo.

CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRA. 1.- Previo a la medicin de los cidos nuclicos, enjuagar las celdas de cuarzo con agua destilada, dejar secar. 2.- Encender el espectrofotmetro y ajustarlo a una longitud de onda de 260 nm permitiendo el calentamiento de la lmpara de deuterium por 20 min. 3.- Colocar 1 ml de solucin TE en la celda de cuarzo y utilizarlo como blanco, retirar la solucin TE y secar la celda. 4.- Colocar 10 l de la solucin de cidos nuclicos en la celda de cuarzo y adicionar 990 l de solucin TE, colocar la tapa de la celda y mezclar por inversin. 5.- Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm para evaluar la concentracin de cidos nucleicos. Si la absorbancia de la muestra excede el valor de 0.8, diluir la muestra. 6.- Considerar el los factores de dilucin utilizados y calcular la concentracin de ADN (Tabla 2) utilizando la siguiente frmula: Concentracin de ADN (g/ml)= 50/(1/OD 260)

CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EL NANODROP 1.- Procesar la muestra de acuerdo a un protocolo establecido. 2.- Enchufar el cable USB del Nanodrop a la computadora y el cable correspondiente a la corriente elctrica que indique el aparato (110V 220 V). 3.- Limpiar con agua destilada la celda del aparato, hacerlo pipeteando un pequeo volumen (20 sobre la l) celda y retirando varias veces, de tal manera que quede lo ms limpio posible la celda. 4.- Colocar de 1-2 l de agua destilada en la celda, para que el aparato haga la lectura del blanco (260/280 nm). Cubrir nuevamente la celda. 5.- Mediante la computadora, realizar la lectura del blanco. 6.- Colocar de 1-2 l de la muestra. 7.- Mediante la computadora, realizar la lectura de la muestra. En caso de que la muestra se encuentre muy concentrada y el Nanodrop no la pueda leer, diluir la muestra en el orden de magnitud conveniente. 8.- Interpretar y reportar resultados.

RESULTADOS I) Describa la composicin e integridad de las muestras observadas en el gel de agarosa despus de la electroforesis. II) Determinacin de la concentracin de cidos nuclicos mediante anlisis densitomtrico del gel. III). Complete la siguiente tabla con los parmetros de la cuantificacin del DNA y las relaciones de absorbancia.

Muestra

Dilucin

Abs. 260 nm

Abs. 280 nm

Abs. 230 nm

260/280

230/260

DNA (g/ml)

DNA total de bacterias

DNA total de plantas

ANALISIS Y DISCUSION Analizar y discutir sus resultados en base a lo obtenido en la prctica y a la bibliografa consultada: De los dos mtodos de cuantificacin utilizados en la prctica (espectrofotomtrico y densitomtrico) determine cual considera ms preciso y cual ms exacto. Realice un anlisis y comparacin de las relaciones 260/280 y 230/260 de cada una de las muestras, haciendo referencia a su fundamento de cada relacin y a la naturaleza de las muestras. CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos, el anlisis, la discusin, los objetivos y la bibliografa consultada dar las conclusiones de la prctica. CUESTIONARIO 1.- De que manera cuantificaras el ADN en caso de no contar con espectrofotmetro? 2.-Menciona otra tincin que podras utilizar para la visualizacin de ADN en geles de agarosa

REFERENCIAS Nelson, D. y Cox, M. (2001). Principios de Bioqumica, (3r Ed.). Barcelona, Espaa: Editorial Omega. Stryer, L.; Berg, J. y Tymoczko, J. (2003). Bioqumica, (5t Ed.) Barcelona, Espaa: Editorial Revert. Sambrook, J. y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3r Ed.). Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories.

PRACTICA No. 6 CUANTIFICACIN DE ARN OBJETIVO GENERAL El alumno realizar la cuantificacin del ARN obtenido anteriormente por distintos mtodos. OBJETIVOS ESPECFICOS Cuantificar el RNA obtenido a partir de plantas por mtodos espectrofotomtricos.

Cuantificar el RNA obtenido a partir de plantas por densitometra en gel.

Realizar el anlisis comparativo de ambos mtodos.

FUNDAMENTO TERICO Espectrofotometa La concentracin de cidos nuclicos se puede estimar utilizando un espectrofotmetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases pricas y pirimidnicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. Una unidad de densidad ptica (DO) a 260 nm equivale a 50 g/ml de ADN de doble cadena, a 40 g/ml de ARN y ADN de cadena simple, y a 33 g de oligonucletidos. De modo que para obtener la concentracin de los cidos nuclicos se utilizan las siguientes frmulas:

Concentracin de ADN (g/ml)= 50/(1/OD 260) Concentracin de ARN (g/ml)= 40/(1/OD 260)

La determinacin de la pureza del cido nuclico se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260, 280 y 230 nm. En las preparaciones de cidos nuclicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobreestimaciones de la concentracin de cidos nuclicos. La concentracin de protena puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de protenas en la muestra har que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para cidos nuclicos puros. Una muestra pura debe presentar un radio de absorbancia a 260/280 nm que exceda el valor de 1.75 para propsitos analticos (para ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 1.8 y para ARN, A260/A280 2.0). Si la muestra es impura debern repetirse extracciones con fenol para remover dichas impurezas.

Teniendo el valor de absorbancia a 230 nm, podemos obtener la razn Abs230/Abs260, si sta es mayor de 0.5, sugiere contaminacin con fenol, cloroformo o carbohidratos. Otro parmetro a considerar es la absorbancia a 320 nm, que est relacionada con la difraccin de la luz por material particulado en la muestra.

Otro mtodo empleado para la estimacin de la concentracin de cidos nuclicos, es por visualizacin en gel mediante corrida electrofortica. Para ello se colocan las muestras a analizar en pozos individuales, se corre la electroforesis a un voltaje constante, se visualiza el producto con U.V. en el transiluminador y se toma una fotografa. En este mtodo la estimacin se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algn programa computacional que contraste intensidades de color. Electroforesis en gel de agarosa El movimiento de molculas cargadas a travs de un soporte slido bajo la influencia de un campo elctrico, es conocido como electroforesis. Si el campo elctrico es aplicado a travs de electrodos a una solucin de molculas cargadas positivamente, stas se dirigirn hacia el electrodo negativo y aquellas cargadas negativamente hacia el electrodo positivo. Las molculas de ADN presentan una elevada carga negativa, por lo tanto su movimiento ser hacia el electrodo positivo. Su migracin a travs del gel es inversamente proporcional al log 10 del nmero de bases de pares. Las grandes molculas migran con mayor lentitud debido al arrastre de una mayor friccin, y debido a que su paso a travs de los poros del gel es menos eficiente que el de las molculas pequeas.

Los geles de agarosa son el medio ms comn para la electroforesis de ADN. La agarosa es un polmero lineal compuesto de residuos alternantes de D- y L- galactosa unidos por enlaces glucoslicos (1-3) y (1-4). Un amplio rango de tamaos (<10 bp a >20 kb) puede ser resuelto dependiendo de la concentracin de agarosa (Tabla 1). Existe una relacin lineal entre el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN () y la concentracin del gel () que se describe con la ecuacin:

Log = log 0 K r

0= movilidad electrofortica libre del ADN, K r=coeficiente de retardacin, una constante relacionada a las propiedades del gel, el tamao y forma de las molculas migratorias. La acrilamida puede tambin ser usada para la separacin de pequeos cidos nucleicos y oligonucletidos (Tabla 1).

Tabla1. Porcentajes de agarosa y el posible rango de kb observado en gel.

Las molculas de cidos nucleicos del mismo tamao se movern a travs del gel a la misma velocidad, observndose como una sola banda. Una muestra con diferentes tamaos producir varias bandas en el gel.

El mtodo ms conveniente y comnmente utilizado para la visualizacin de ADN y ARN en geles de agarosa es mediante tincin con bromuro de etidio, el cual contiene un grupo tricclico planar que se intercala entre las bases de los cidos nuclicos. Una radiacin a 254 nm es absorbido por los cido nuclicos y transmitido a la tincin. La energa es re-emitida a 590 nm en la regin rojo-naranja del espectro visible.

REACTIVOS Agarosa TAE 1x Buffer de carga para RNA 2X (95 % Formamida, 0.025% SDS, 0.025% Azul de bromofenol, 0.025% Xilencianol, 0.5 mM EDTA) Agua miliQ estril TE 1x Bromuro de etidio 10mg/ml Marcador de peso molecular de 1 Kb (Adicionar a un tubo eppendorf 15 l de marcador 1kb + 15 l de buffer de carga)

MATERIAL (por equipo) Cmara de electroforesis para cidos nucleicos Molde para gel Fuente de poder Espectrofotmetro Celdas de cuarzo 1 Probeta de 100 ml estril 1 Matraz erlenmeyer de 250 ml estril 1 esptula papel para pesar Papel parafilm Transiluminador Cmara fotogrfica Puntas de 2-20L, de 20-200L y de 100-1000l estriles Micropipetas de 2-20L, de 20-200L y de 1001000l Hielera Hielo

METODOLOGA Muestras 1. RNA total extrado en prcticas anteriores.

CUANTIFICACIN DE RNA POR DENSITOMETRA A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de las muestras. 1.- Pesar 0.5 gramos de agarosa para preparar 50 ml de un gel al 1% en buffer TAE 1X. 2.- Disolver en horno de microondas, verter la preparacin de agarosa en un molde adecuado con peines y dejar gelificar. 3.- Colocar el gel en la cmara de electroforesis y cubrir con buffer de corrida TAE 1X (aproximadamente 300-400 mL).

4.- Colocar 5 l de cada muestra de ARN en parafilm de forma independiente, mezclar con 2 l de buffer de carga para ARN. Colocar el volumen total (7 l) dentro de los pozos del gel de agarosa con ayuda de una micropipeta. 5.- Adicione en uno de los pozos 4 l de 1 Kb como marcador de peso molecular. 6.- Corra el gel a 100 V. 7.- Tia el gel en la solucin de bromuro de etidio (Solucin de Tincin de los geles: 20 l de bromuro de etidio 10 mg/ml + 200 ml de agua destilada. Colocar el gel en una charola conteniendo esta solucin durante 5 minutos, cubra la charola con papel aluminio o tapa. Para desteir coloque el gel en una charola con agua, durante 5 minutos). 8.- Visualice en el transiluminador y obtenga la foto. 9.- Integre la fotografa digitalizada en un programa de cmputo para procesamiento y anlisis de las imgenes previamente sugerido por sus profesores. 10.- Estime la concentracin de ARN de las muestras mediante el programa de cmputo.

CUANTIFICACIN DE RNA POR ESPECTROFOTOMETRA 1.- Previo a la medicin del ARN, enjuagar las celdas de cuarzo con agua estril, dejar secar. 2.- Encender el espectrofotmetro y ajustarlo a una longitud de onda de 260 nm permitiendo el calentamiento de la lmpara de deuterium por 20 min. 3.- Colocar 1 ml de agua miliQ en la celda de cuarzo y utilizarlo como blanco, retirar la el agua y secar la celda. 4.- Colocar 10 l de la solucin de la muestra de ARN en la celda de cuarzo y adicionar 990 l de agua miliQ, colocar la tapa de la celda y mezclar por inversin. 5.- Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm para evaluar la concentracin de cidos nucleicos. Si la absorbancia de la muestra excede el valor de 0.8, diluir la muestra. 6.- Considerar el los factores de dilucin utilizados y calcular la concentracin de RNA (Tabla 2) utilizando la siguiente frmula: Concentracin de ARN (g/ml)= 40/(1/OD 260)

RESULTADOS I) Describa la composicin e integridad de las muestras observadas en el gel de agarosa despus de la electroforesis. II) Determinacin de la concentracin de cidos nucleicos mediante anlisis densitomtrico del gel. III). Complete la siguiente tabla con los parmetros de la cuantificacin del ARN y las relaciones de absorbancia.

Muestra

Dilucin

Abs. 260 nm

Abs. 280 nm

Abs. 230 nm

260/280

230/260

ARN (g/ml)

RNA de plantas

ANALISIS Y DISCUSION Analizar y discutir sus resultados en base a lo obtenido en la prctica y a la bibliografa consultada: De los dos mtodos de cuantificacin utilizados en la prctica (espectrofotomtrico y densitomtrico) determine cual considera ms preciso y cual ms exacto. Realice un anlisis y comparacin de las relaciones 260/280 y 230/260 de cada una de las muestras, haciendo referencia a su fundamento de cada relacin y a la naturaleza de las muestras. CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos, el anlisis, la discusin, los objetivos y la bibliografa consultada dar las conclusiones de la prctica. CUESTIONARIO 1.- Analice que factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los cidos nucleicos cuando se purifican. 2.- A partir del siguiente problema, responda los incisos a, b, c y d: Las siguientes imgenes muestran los productos de ARNm de tejido de flor de plantas de chile (carril 2, 3 y 4) por un mtodo basado en perlas magnticas (Dynabeads mRNA Purification Kit Dynal Biotech, Brown Deer, WI), a partir de RNAt (carril 8). El panel A corresponde a una corrida despus de 2 minutos de iniciada la electroforesis a 100 V y el panel B a la misma corrida despus de 30 minutos.

a) Analice la integridad de las muestras 2, 3 y 4. b) Teniendo en cuenta los controles de ARN utilizados en la electroforesis (carriles 5, 6 y 7), estime visualmente la cantidad de ARN en las muestras de ARNm de los carriles 2, 3 y 4. c) Calcule mediante un programa de cmputo de anlisis y procesamiento de imgenes, la concentracin de las mismas muestras. d) Compare los resultados obtenidos en los incisos a y b. Emita conclusiones. 3.- Por qu es necesario tomar dos imgenes en diferentes tiempos de corrida para la estimacin visual de la concentracin de ARNm en gel de agarosa. 4.- Realice un anlisis comparativo entre el mtodo espectrofotomtrico y densitomtrico para cuantificar cidos nuclicos, teniendo en cuenta:

 REFERENCIAS

fundamento precisin exactitud reproducibilidad cantidad de muestras a analizar costo de las determinaciones.

Nelson, D. y Cox, M. (2001). Principios de Bioqumica, (3r Ed.). Barcelona, Espaa: Editorial Omega. Stryer, L.; Berg, J. y Tymoczko, J. (2003). Bioqumica, (5t Ed.). Barcelona, Espaa: Editorial Revert. Sambrook, J. y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3r Ed.). Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories.