Universidad Politcnica de Pachuca

Ingeniera en Biotecnologa

Metodologa de la investigacin

Micro propagacin de Cephalocereus senilis, cactcea en peligro de extincin, mediante el cultivo in vitro de tejidos.

Marcelino Ayala Manuel

Ortega Monter Cindy Cindy

Cuatrimestre: 2 Periodo: Enero Abril 2012

Profesor: Jos Novoa Espinoza

Introduccion
Por cultivo de tejidos se entiende comnmente a la regeneracin de plantas completas a partir de una masa amorfa de clulas. Esta tcnica consiste en cultivar fragmentos vegetales denominados explantes, originados a partir de pices de raz y tallo, primordios de hoja, flores, frutos inmaduros, rganos aislados, embriones, ovarios, vulos, anteras o polen, en forma asptica y en medios que contienen elementos nutritivos, vitaminas y factores de crecimiento. (Hurtado y Merino, 2000, citados por Gmez 2004) La micropropagacin es quiz la tcnica mas empleada dentro del cultivo de tejidos vegetales para propagar plantas de inters hortcola, ornamental y forestal, entre otros. (Hu y Wang, 1983; George y Sherrigton, 1984; Debergh, 1987; Evans, 1990; George y Debergh, 2008; citados por Lpez ,2005)

Este mtodo se basa en la obtencin del mayor nmero de plantas posibles, con caractersticas uniformes, libres de enfermedades prcticamente en cualquier poca del ao y a partir de tan solo una pequea porcin de tejido (explante inicial) que puede ser desde embriones, semillas, tallos, meristemos apicales, callos, clulas aisladas o granos de polen. (Aceves y Hernndez, 2000, citados por Lpez, 2005)

Antecedentes
El fundamento terico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular. Schleiden y Schwan (1887) describen en su teora celular, que la clula es capaz de subsistir por si sola si las condiciones externas le son favorables. A Morgan (1901) se le atribuye el trmino de la totipotencialidad celular propiamente dicho, que dice que una clula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estmulos adecuados. Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos fueron inexitosos debido a que utiliz un medio de cultivo relativamente simple y por otra parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados. White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos pices de races de jitomate. Los tejidos meristemticos del pice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debi, como lo menciona White, a la mala eleccin del material vegetativo y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las tcnicas de cultivo in vitro; sin embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferacin celular en forma, los pices de raz solo crecen en longitud como lo haran normalmente como parte de la raz de la planta intacta. No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferacin celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultneamente la formacin de una masa de clulas parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en s el despegue de las tcnicas de cultivo in vitro. Un factor importante en el desarrollo de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la divisin celular (efecto citocinnico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenia un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado por calor, tena un efecto muy marcado en la formacin de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este cido desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores (1955) aislaron un compuesto de naturaleza purnica enominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina. En 1926 dos cientficos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudricin en plntulas de arroz. El efecto que produca dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la induccin de germinacin en semillas, brotacin en algunos tubrculos como la papa etc.

Los cultivos celulares

El trmino genrico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes tcnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (clulas desprovistas de su pared celular), clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras tcnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo asptico (estril) en condiciones ambientales controladas. Tambin se lo conoce como cultivo in vitro de plantas por realizarse en recipientes de vidrio (hoy tambin de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recin en 1922 se logr el primer experimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas de orqudeas. Luego de la germinacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones aspticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos (hongos, virus y bacterias). Hoy esta tcnica tiene numerosas aplicaciones, y entre la que interesa a nuestro proyecto es: Propagacin masiva de plantas, especialmente para especies de difcil propagacin por otros mtodos, o en vas de extincin La reproduccin asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias clulas de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningn tipo de fusin de clulas sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es caracterstica de un grupo de clulas

vegetales conocidas como clulas meristemticas, presentes en los distintos rganos de la planta. La potencialidad de una clula diferenciada (una clula de conduccin, epidrmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciacin alcanzado por esa clula, pero puede revertirse parcial o completamente segn las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las clulas vegetales crecidas en condiciones aspticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta: una desdiferenciacin celular acompaada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de clulas indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar rganos o embriones somticos (llamados as porque son estructuras similares a un embrin, pero que no se originaron por unin de gametas), una respuesta morfogentica por la cual se forman directamente rganos (organognesis) o embriones (embriones somticos). La primera respuesta se conoce como organognesis o embriognesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organognesis o embriognesis directa. El cultivo in vitro consiste en tomar una porcin de una planta (a la que se denominar explanto, como por ej. el pice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrin, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estril (usualmente gelificado, semislido) donde se regenerarn una o muchas plantas. La formulacin del medio cambia segn se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y races, u obtener embriones somticos para producir semillas artificiales. El xito en la propagacin de una planta depender de la posibilidad de expresin de la potencialidad celular total, es decir, que algunas clulas recuperen su condicin meristemtica. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciacin y luego la rediferenciacin celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formacin de las races adventicias en el enraizamiento de estacas, la formacin de yemas adventicias, o cuando se busca la propagacin de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogentica deseada es la composicin del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagacin vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carcter del proceso de diferenciacin depende del genoma de la especie, y que est regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiolgico del rgano, tejido o clula puesta en cultivo. Sin embargo, tambin se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la accin de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagacin de una planta. La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genticamente modificadas o transgnicas. Una vez realizada la transformacin, ya sea por Agrobacterium o por el mtodo de biobalstica, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plntulas que lleven el transgn en todas sus clulas.

Cephalocereus senilis Clasificacin botnica y caractersticas

Reino: Plantae Divisin : Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Caryophyllales Familia: Cactaceae Gnero: Cephalocereus Especie: Cephalocereus senilis
Sinnimos: Cactus senilis Haworth 1824, Cereus senilis (Haworth) A.P. de Candolle 1828, Cephalophorus senilis (Haw.) Lem. 1838, Pilocereus senilis (Haworth) Lemaire 1839. Fig. 1 Cephalocereus senilis

Especie muy llamativa, nombrada as debido a los largos cabellos blancos que le dan la apariencia de una persona de edad. Fue descrito en 1838 por Dudwig Pfeiffer y su nombre tcnico se deriv del griego cephale, cabeza y cereus, refirindose a peludo.

Es columnar, con un tronco nico principal que puede alcanzar 15 metros de alto por 30 cm de ancho. Se ramifica solamente en la base. Su tallo es verde brillante y se vuelve grisceo con la edad. Tiene de 20 a 30 costillas bajas de 9 a 12 mm de altura, ligeramente onduladas. Las costillas poseen las estructuras especializadas en la formacin de las flores ahuates (glquidas) y las espinas denominadas areolas.

Distribucin
En el Holoceno (hace 11,000 a 14,000 millones de aos), las comunidades que habitaba el Cacto Viejito estaban muy extendidas en Norteamrica. Hoy en da se encuentran reducidas en extensin y albergan numerosas especies endmicas como sta.

Distribucin en Mxico:
Se encuentra exclusivamente en Mxico. Se distribuye en la zona rida Queretano-Hidalguense, incluyendo los estados de Guanajuato y Veracruz, exclusivamente en Mxico. En Hidalgo habita la regin de Metztitln, de gran importancia por la cantidad de especies endmicas que ah habitan.

Problemtica
El uso como planta de ornato ha ocasionado que esta especie se encuentre en la categora amenazada por la extincin, en la Norma Oficial Mexicana de Proteccin de Flora y Fauna Silvestre Terrestre y Acutica (NOM-ECOL-059-1994). Por las causas siguientes: La extraccin masiva de semillas limita su multiplicacin en su hbitat, la eliminacin de plantas nodrizas por sobre pastoreo, la recoleccin de plantas jvenes y la extraccin de partes apicales de plantas adultas (Riemman, 2000). Por esta situacin, es conveniente utilizar nuevas tcnicas de propagacin como el cultivo in vitro. Resulta como una herramienta a considerarse para el mantenimiento de poblaciones de especies amenazadas o en peligro de extincin. A partir de esta tcnica se genera la proliferacin masiva de plantas, con un crecimiento rpido, favoreciendo su comercializacin y preservacin.

Justificacion
La demanda de las cactceas como plantas de ornato y su poco abastecimiento han ocasionado que muchas de ellas sean extradas directamente del campo en forma de contrabando, por lo que las poblaciones silvestres estn siendo mermadas constantemente, lo cual conlleva a estragos ecolgicos irreversibles llegando prcticamente a la exterminacin de algunas especies, ya que la habilidad recolectora excede a la tasa natural de reproduccin (Park, 1998). Entre estas se encuentra Cephalocereus senilis Haworth Pfeiffer conocida como viejito; especie endmica de Mxico cuya distribucin se restringe al estado de Hidalgo y parte de los estados de Guanajuato y Veracruz, en Mxico (Bravo-Hollis, 1978). Por esta situacin, es conveniente utilizar nuevas tcnicas de propagacin como el cultivo in vitro pues puede resultar una herramienta a considerarse para el mantenimiento de poblaciones de especies amenazadas o en peligro de extincin, puesto que a partir de esta tcnica se genera la proliferacin masiva de plantas, con un crecimiento rpido, favoreciendo su comercializacin y preservacin (Snchez,1994).
Impacto ambiental:

Se busca poder recuperar los hbitats, ecosistemas y biodiversidad del planeta, para poder mantener el equilibrio ecolgico en el mundo, mediante una seleccin in vitro que permita la produccin de esta planta en masa, ya que est desapareciendo demasiado rpido de nuestro planeta y porque su reproduccin natural es mucho ms lenta y a veces se impide por factores adversos como el clima, evitando la recuperacin esta especie.
Impacto econmico:

Existen diversas plantas que se utilizan para la generacin de materias primas entre ellas la cactcea Cephalocereus senilis, por lo que la produccin de esta planta en masa facilitara la extraccin y duplicara la produccin de materias primas, permitiendo que la economa aumente, adems de que se produciran ms trabajo por el cultivo y cuidado de esta planta.
Impacto social:

Podra satisfacer un poco la demanda de trabajo que en la actualidad se enfrenta, desarrollando as la agricultura, la cual forma parte de una actividad econmica primaria y de la que dependen muchas personas.

Impacto poltico:

Se piensa que es necesario respetar que se trata de una especie endmica originaria de Mxico, para que solo se produzca en sus zonas de origen natural, y as no causar un desequilibrio ecolgico que puede resultar contraproducente.

Objetivo
Conocer la metodologa de la investigacin por medio del mtodo cientfico, el cual permite obtener informacin relevante y fidedigna acerca de una investigacin que analiza datos ya obtenidos para poder continuar con la investigacin o en su caso desarrollar nuevos proyectos siguiendo distintas lneas de investigacin que permitan resolver un problema en particular.

Analisis de variables
Para la propagacin in vitro de Cephalocereus senilis en necesario tener en cuenta el control de la siguientes variables o factores que influyen directamente en el proceso de propagacin, aclimatacin e integracin al medio natural de la especie. Estas las clasificaremos principalmente en dos tipos, las cuales designamos como dependientes las que podemos modificar a nuestro favor en un ambiente controlado en laboratorio y bajo invernadero en donde se realizara la propagacin in vitro de la especie; independientes que dependen de las caractersticas intrnsecas de la especie en cuestin as como de los factores ambientales a la hora de la integracin al medio natural de la especie cultivada in vitro. Dentro de las dependientes las subclasificamos ambientales que influyen directamente en el proceso y las que se involucran en el proceso en si y que se deben tomar en cuenta solo al inicio del proceso ya que estas lo definirn; las variables son las siguientes: Ambiente qumico: Composicin del medio de cultivo PH Ambiente fsico Temperatura Luz y fotoperiodo Humedad

Micropropagacion por: Yemas prexistentes Organognesis Embriognesis somtica En cuanto a las variables independientes dentro del proceso de propagacin se encuentran las siguientes:

 % de germinacin (solo cuando se elige la propagacin mediante organognesis a travs de la utilizacin de semillas.) Numero de brotes obtenidos en la etapa de proliferacin. % de enraizamiento de los brotes en la etapa de aclimatizacin. Las variables que interfieren a la hora de la integracin al medio natural de los brotes cultivados in vitro son las que tienen que ver con el ambiente fsico: Temperatura Luz y fotoperiodo Humedad Estas variables fueron identificadas a partir de la revisin de los trabajos que se han realizado sobre la propagacin in vitro de Cephalocereus senilis los cuales nos sirvieron de antecedentes, estos fueron: A. Establecimiento y propagacin in vitro de cactceas mexicanas, Ana Laura Lpez Escamilla, Laura Patricia Olgun Santos, Judith Mrquez Guzmn, Maritza Lpez Herrera. UAEH, UNAM. B. Cultivo in Vitro de tres especies de cactceas con diversas concentraciones de dos reguladores de crecimiento. M.P. Sandoval, J. Gonzlez, R.Ramrez, Universidad de Guanajuato. C. Propagacin in vitro DE Cephalocereus senilis Haworth Pfeiffer A partir de arolas J. M. Choreo-Tapia; H. Gonzlez-Rosas; T. Terrazas-Salgado; A. Hernndez-Liver. UACh. 2002.

En todos ellos la metodologa general aplicada consta de las siguientes etapas: Etapa 0 Se realiza la seleccin del material vegetal, el cual debe proceder de individuos sanos y estar en buenas condiciones. Etapa I Desinfeccin del material para lograr su establecimiento en condiciones aspticas.

Etapa II Se promueve la proliferacin, en la cual la formacin de los regenerantes se puede presentar por tres diferentes vas: A partir de yemas prexistentes a las cuales se promovi su proliferacin y crecimiento; Por organognesis, que consiste en la formacin de rganos como races, hojas, tallos, llamados estos ltimos brotes; Por embriognesis somtica, que se forman a partir de clulas somticas y no son el resultado de la fusin de gametos, los embriones somticos son estructuras bipolares, por que tienen un eje apical-radical, estn aislados por un tejido epidrmico y no poseen conexin vascular con el tejido materno. Etapa lll: Individualizacin y enraizamiento Los brotes obtenidos se individualizan y subcultivan a un medio de cultivo fresco para promover su elongacin y posteriormente el desarrollo de races (enraizamiento). Etapa lV Es la trasferencia de los tallos enraizados a un sustrato previamente esterilizado para que continen con el proceso de aclimatizacin o lo inicien, pero ya en condiciones ex vitro en un invernadero. Esta etapa es la ms crtica, pues define el xito o el fracaso de todo el mtodo en cuanto a productividad Etapa V: Aclimatizacin Los tallos se exponen a condiciones ex vitro bajo invernadero, las plantas sufren cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el trabajo A en la etapa 0 el material elegido fueron semillas obtenidas por colecta y donaciones. A diferencia de el trabajo B en el que se obtuvieron fragmentos de plantas jvenes de la especie. Se le cortaron las races y se dej la fraccin suculenta. Y el trabajo C en el que se utilizaron plantas de aproximadamente tres aos de edad y se utilizaron las areolas. Para la etapa l en A las semillas primero fueron sometidas a un proceso de escarificacin para eliminar su testa o cubierta y posteriormente se procedi a la desinfeccin no se especifica con que agentes. En B el material fueron lavado profusamente en agua corriente durante dos horas despus se efecto la primera desinfeccin que consisti en la aplicacin de una solucin de etanol al 70 %

durante 60 segundos. Fue eliminado el etanol y la segunda desinfeccin se hizo con hipoclorito de sodio comercial (blanqueador comn) al 20% (v/v) adicionado de 0.1% de Tween 20, durante 20 minutos. La solucin desinfectante se descart y se dio un tercer tratamiento a base de 2 gramos por litro de Benomyl durante 30 minutos. La suspensin de Benomyl se desech y se dio un tratamiento con hipoclorito de sodio comercial al 20% * 0.1 % de Tween 20, durante 10 minutos, a continuacin se hicieron cinco enjuagues con agua destilada estril. En C los tallos se remojaron en dos tiempos con agua tibia jabonosa durante 20 minutos y se tallaron con cepillo dental de cerdas suaves tratando de no afectar las arolas. Se enjuagaron con abundante agua de la llave y se sumergieron en una solucin de fungicida 6 glitro-1 (Fungimicin 500) durante 20 minutos, enjuagndose con agua destilada. Posteriormente se colocaron en una solucin antioxidante (150 mglitro-1 de cido ctrico y 150 mglitro-1 de cido ascrbico) durante 20 minutos. La desinfestacin se hizo colocndolos en alcohol al 70 % durante tres minutos, posteriormente en una solucin de hipoclorito de calcio al 4 % por 20 minutos adicionado con 0.01 % de Tween 20, y finalmente se enjuagaron tres veces con agua destilada esterilizada. Esta etapa difiri en los tres trabajos debido al material utilizado en cada uno solo son similares algunos desinfectantes utilizados como alcohol y Tween 20 En la etapa II para A las semillas fueron sembradas en medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) (1962), y mantenidas en condiciones de incubacin de 26 2C, fotoperiodo 16/8, para promover su germinacin. Se considero como semilla germinada aquella cuya radcula haba emergido. Para Cephalocereus senilis el % de germinacin fue de 98 que es alto en relacin con el numero de semillas sembradas. Las plntulas que alcanzaron una talla de 0.5 a 1 cm de altura, lo cual duro de tres a cuatro meses, fueron seccionadas dependiendo del tamao y caractersticas morfolgicas de la plntula, en diferentes tipos de explantes: apicales, laterales y/o longitudinales, mtodo de proliferacin Yemas Prexistentes. En B los tallos o cabezas, se cortaron en secciones y se trasplantaron una pieza (planta) por frasco en cada una de las repeticiones de las diferentes combinaciones medio de cultivo. Mtodo de proliferacin Organogenseis. En C Las arolas se extrajeron fraccionando el tallo con un bistur en explantes conteniendo una y tres arolas. Cada fraccin se coloc en la solucin antioxidante esterilizada (150 mglitro-1 de cido ctrico y 150 mglitro-1 de cido ascrbico) durante 20 minutos antes de sembrarse. Mtodo de proliferacin Organognesis. En la etapa III, en A los explantes fueron colocados en un medio de cultivo (MS), adicionado con diferentes concentraciones y combinaciones de citocininas/auxinas fue posible obtener la regeneracin de brotes por organognesis directa principalmente por la activacin de meristemos prexistentes, que en cactceas se denominan areolas. En B los tejidos se se cultivaron en el medio de Murashige y Skoog (MS), adicionado de AIA (0, 1, 2 y 4 mg/l) combinado con cinetina (0, 1, 3, 6

y 10 mg/l). Tabla 1. Combinacin de dos reguladores de crecimiento (CINETINA y AIA) con diferentes concentraciones. CINETINA mg/l AIA mg/l 0 1 3 6 10 0 1 2 3 4 5 1 6 7 8 9 10 2 11 12 13 14 15 4 16 17 18 19 20 En C El medio de cultivo utilizado fue Murashige y Skoog (MS) (1962) como medio basal, complementado con glicina (2 mglitro-1), mio-inositol (100 mglitro-1) tiamina HCl (0.4 mglitro-1), piridoxina (0.5 mglitro-1), cido nicotnico (2.0 mglitro-1) + sacarosa 30 glitro-1. El pH se ajust a 5.7 1. Se solidific con 7.5 glitro-1 de agar (Sigma). Se propusieron como reguladores del crecimiento ANA (cido naftalenactico), BA (benciladenina) y K (cinetina) solas y combinadas en concentraciones 0.0, 0.3, 1.0, 3.0 mglitro-1 en la forma siguiente: ANA:BA, ANA:K. En tubos de ensayo se sirvi 20 ml de medio de cultivo sellndose con papel aluminio y se esterilizaron en autoclave a 121 C durante 15 min. Los explantes se incubaron a temperatura de 27 C 2 con fotoperiodo de 16 h de luz. La fuente luminosa estuvo dada por lmparas fluorescentes las cuales proporcionaron una intensidad luminosa de 62.5 molm-2s-1. El experimento consisti en determinar el mejor tratamiento con reguladores de crecimiento para inducir la activacin del mayor nmero de arolas, la multiplicacin y la induccin de raz. Las plntulas obtenidas (2.5 cm de altura y 1.0 cm de dimetro) se subcultivaron enteras, sin pice y fraccionadas en partes apical, media y basal en el tratamientos 14 (ANA 0.3 + BA 3.0 mglitro-1 y ANA 0.3 + K 3.0 mglitro-1). Para la etapa IV por las caractersticas de los estudios solo A llevo a cabo esta etapa, la principal variable en esta etapa fue el porcentaje de enraizamiento, el cual fue bajo para la especie en cuestin. Otras variables medidas en C, por el objetivo del estudio fueron: induccin callos, nmero de arolas activadas, nmero de brotes, altura de brotes y dimetro de los brotes. Por su objetivo de estudio ninguno llevo a cabo la integracin al medio natural los cultivos in vitro obtenidos.

Metodologa
La micropropagacin se realizar por medio de la extraccin de arolas, a partir de ejemplares de especies que se encuentren totalmente sanos y que se obtengan de un hbitat natural. Se realizar por medio de arolas debido a que segn las metodologas analizadas, este tipo de procedimiento es ms rpido y se pueden obtener plntulas con las mismas condiciones sanas de la cactcea original, adems de que es el procedimiento por el cual se han obtenido mejores resultados para la micropropagacin de Cephalocereus senilis. ETAPA 1: A partir de un ejemplar de la especie que se encuentre totalmente sano y que sea joven, es decir, con pocos aos de edad, se les eliminar las races, las cerdas y las espinas con ayuda de unas tijeras previamente desinfectadas para no daar el ejemplar y se desinfectaran. Los tallos se remojarn en dos tiempos con agua tibia jabonosa durante 20 minutos y se tallaron con cepillo dental de cerdas suaves tratando de no afectar las arolas. Se enjuagarn con abundante agua de la llave y se sumergirn en una solucin de fungicida 6 glitro-1 (Fungimicin 500) durante 20 minutos, enjuagndose con agua destilada. Posteriormente se colocarn en una solucin antioxidante (150 mglitro-1 de cido ctrico y 150 mglitro-1 de cido ascrbico) durante 20 minutos. La desinfestacin se har colocndolos en alcohol al 70 % durante 3 minutos, posteriormente en una solucin de hipoclorito de calcio al 4 % por 20 minutos adicionado con 0.01 % de Tween 20, y finalmente se enjuagarn tres veces con agua destilada esterilizada. ETAPA 2: Despus de tener al ejemplar en condiciones antispticas se extraern las arolas con ayuda de un bistur, pero pretendemos crear conjunto de 3 a 5 clulas en condiciones adecuadas para maximizar su divisin y proliferacin. Se colocarn en un medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) (1962) como medio basal, complementado con glicina (2 mglitro-1), mio-inositol (100 mglitro-1) tiamina HCl (0.4 mglitro-1), piridoxina (0.5 mglitro-1), cido nicotnico (2.0 mglitro-1) + sacarosa 30 glitro-1. El pH se ajust a 5.7 1. Se utilizar K (cinetina) solamente para obtener el 100% de induccin de callos. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Las arolas se incubaran a 27 C 2 con fotoperiodo de 16 h de luz. Durante 45 das.

ETAPA 3: Se mantendrn las condiciones de incubacin para obtener la proliferacin y activacin de las arolas para la induccin de la raz. Las plntulas de 0.5 a 1 cm de altura sern subcultivadas mientras que las que tengan mayor altura de 1cm y dimetro sern ramificadas para la obtencin de ms plntulas. ETAPA 4: Obtenido finalmente los ejemplares enraizados, se traspasaran a un suelo con un sustrato suelto, airado, poroso y que nunca se encharque. Con 40% de arena de ro lavada y gruesa, 40% de tierra de hoja y 20% de agrolita. Se aadir un fertilizante granulado, el cual su liberacin debe ser lenta para no daar a la cactcea. Se abonar cada 15 das. Los ejemplares jvenes deben mantenerse a una temperatura de no menos de -5 C o afectaran su crecimiento. La iluminacin debe ser por perodos cortos y con poca iluminacin se utilizar las instalaciones de un invernadero. Cuando generen una cubierta optima se podrn regar con ms regularidad, pero no deben regarse durante el invierno. ETAPA 5: Los adultos se pueden desarrollar normalmente a pleno sol, por lo que se traspasarn a su hbitat natural.

Diagrama de flujo:
Seleccionar la regin de dond se obtendra el ejemplar.
Se reecolectaran los ejemplares sanos y con las caractersticas deseables. Incubar a 27C +/- 2, fotoperodo de 16 horas luz durante 45 das. El conjunto de clulas se trasladan a un medio de cultivo.
Preparacin del medio de cultivo (Murashige y Skoog). Esterilizacin en autoclave.

Las plantlas con raz de 0.5 a 1 cm, se subcultivan.

Las plantlas con raz mayor de 1 cm, se ramifican para obtener ms plantlas.

Se quitan races, cerdas y espinas.

La plantla se aclimatiza para su adaptacin y generacin de cubierta.

Se realiza la desinfeccin de los ejemplares.

Extraccin de las arolas creando un conjunto de clulas.

Riego, abono y exposicin de luz en perodos cortos.

Se trasladan a su hbitat natural.

Cronograma de actividades

Bibliografa
La evolucion de las plantas. (abril-mayo de 2002). CIENCIA HOY, 68. SMALLWOOD, GREEN. (1970). biologia (primera edicion ed.). mexico: publicaciones cultural. http://www.ecoportal.net/Temas_Especiales/Biodiversidad/El_problema_de_la_per dida_de_biodiversidad Los cultivos celulares y sus aplicaciones, Lic. Mara Eugenia Segretn INGEBICONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA, ArgenBio (Consejo Argentino para la Informacion y el Desarrollo de la Biotecnologia. http://www.argenbio.org/ http://www.profepa.gob.mx/innovaportal/v/435/1/mx.wap/perdida_de_biodiversidad _.html Propagacin in vitro DE Cephalocereus senilis Haworth Pfeiffer A partir de arolas J. M. Choreo-Tapia; H. Gonzlez-Rosas; T. Terrazas-Salgado; A. HernndezLivera Establecimiento y propagacin in vitro de cactceas mexicanas, Ana Laura Lpez Escamilla, Laura Patricia Olgun Santos, Judith Mrquez Guzmn, Maritza Lpez Herrera Cultivo in Vitro de tres especies de cactceas con diversas concentraciones de dos reguladores de crecimiento. M.P. Sandoval, J. Gonzlez, R.Ramrez