1

RESUMEN
Las enzimas, protenas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto
gracias a su potencial cataltico. Realizan la reaccin en razn a una velocidad de
transformacin del sustrato a producto traducindose en actividad enzimtica. En este
informe se da a conocer el comportamiento de la enzima Biolactasa NTL de acuerdo a 2
diferentes temperaturas de operacin y sustrato.
En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la
enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reaccin esta actividad
aumenta, donde a 55C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de
8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los
10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45C es de un 14,4%, mientras que a
temperatura de 55C la perdida es mayor, alcanzando un 17%.
La puesta en marcha de un reactor enzimtico en comparacin con un reactor de cultivo
celular, a modalidad por lotes, su operacin y control es ms simple de acuerdo al manejo
de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura.
Como segunda experiencia se evala el comportamiento del reactor en forma terico-
prctica en relacin al grado de conversin del sustrato lactosa a los monosacridos,
glucosa y galactosa, alcanzando slo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operacin del
reactor.
En la ltima experiencia, correspondiente a la elaboracin de manjar, donde la hidrolisis
parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentracin de slidos, pues por
medicin en refractmetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentracin
requerida de 60-70Brix, en menor tiempo de operacin. Proporcionando propiedades
organolpticas, que la leche sin tratamiento enzimtico pierde durante el proceso, como lo
es el efecto nocivo de la cristalizacin de lactosa.


2

INDICE GENERAL
1. Introduccin ............................................................................................................ 3
2. Materiales y mtodos ............................................................................................. 4
2.1. Determinacin de azucares reductores por la tcnica de miller (dns) ..................... 4
2.2. Mtodo de glucostat. .............................................................................................. 4
2.3. Metodologa analtica. ............................................................................................ 5
2.3.1. Determinacin del grado de hidrlisis de la leche. .................................................. 5
2.4. Metodologa experimental. ..................................................................................... 6
2.4.1. Determinacin de la actividad de la enzima. ........................................................... 6
2.4.2. Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando lactosa como sustrato) . 6
2.4.3. Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando leche como sustrato) .... 7
2.4.4. Determinacin de la estabilidad de la enzima. ........................................................ 7
2.4.5. Puesta en marcha del reactor. ................................................................................ 7
2.4.6. Hidrlisis enzimtica de lactosa. ............................................................................. 8
2.4.7. Fabricacin del manjar. .......................................................................................... 8
3. Resultados y discusiones ....................................................................................... 9
3.1. Caracterizacin del preparado enzimtico .............................................................. 9
3.1.1. Actividad enzimtica ............................................................................................... 9
3.1.2. Estabilidad enzimtica .......................................................................................... 11
3.2. Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes. ................................... 14
3.3. Hidrlisis enzimtica de lactosa para produccin de manjar ................................. 16
4. Conclusiones ........................................................................................................ 18
5. Bibliografa ........................................................................................................... 19
6. Anexos ................................................................................................................. 20


3

1. INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica con capacidad cataltica,
altamente especfica y activa en condiciones moderadas, lo que hace favorable su uso
como catalizadores en la industria de procesos. Los progresos que estn realizando
actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar un desarrollo cada
vez mayor del uso de las enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales
con la actividad deseada a precios razonables.

En el presente informe se muestra el trabajo realizado con el preparado enzimtico
Biolactasa-NLT, que acta de forma similar a la Lactasa en la leche, la cual es una
enzima producida de forma natural en el intestino delgado, y de forma artificial como
preparado enzimtico, que juega un papel vital en el desdoblamiento de la lactosa,
mediante una reaccin enzimtica de hidrolisis, en sus dos componentes bsicos: glucosa
y galactosa.

De forma experimental se contemplan tres prcticas de laboratorio, primero se determina
la actividad y la estabilidad al preparado enzimtico comercial con el cual se est
trabajando, midiendo generacin de producto por el mtodo de glucostat utilizando leche
semi-descremada y lactosa como sustratos. Luego esta enzima se incuba de forma
soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reaccin, bajo
condiciones ambientales controladas, donde se determina el grado de hidrlisis de la
leche en razn del tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinndose tambin la
generacin de producto por el mtodo de glucostat, y la concentracin de lactosa por el
mtodo de DNS.

Finalmente utilizando dos reactores por lotes en las mismas condiciones mencionadas
anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzima y el otro no, y luego de un
determinado tiempo de reaccin y grado de conversin, se lleva a cabo la elaboracin de
manjar, hasta llegar a un contenido de slidos de un 65-70%.

4

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1. Determinacin de azucares reductores por la tcnica de Miller (DNS)
El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico para la
hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la determinacin
espectrofotomtrica a 540 nm de los azcares reductores.
Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica.


Reaccin del mtodo
El acido 3,5-dinitrosalicilico en presencia de azcares reductores se reduce a acido 3-
amino-5-dinitrosalicilico.
2.2. Mtodo de Glucostat.
La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente especfica que cataliza la oxidacin de
la glucosa a -D-gluconolactona, sin que ningn otro azcar natural reaccione en
extensin apreciable.


Reaccin del mtodo.
Esta reaccin en la que se consume oxgeno podra seguirse manomtricamente
mediante un electrodo de oxgeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta
5

reaccin espectrofotomtricamente es necesario acoplar a la misma una segunda
reaccin enzimtica indicadora adecuada. Para la determinacin colorimtrica de glucosa
por el mtodo de la oxidasa, se aade al medio peroxidasa de rbano silvestre (HRP),
que elimina el perxido de hidrgeno a medida que se forma, a la vez que se genera un
colorante adecuado segn el siguiente esquema de reaccin:


Reaccin del mtodo.


Se podran utilizar como aceptores de oxgeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin
embargo, la naturaleza carcinognica de estos compuestos ha impulsado la bsqueda de
aceptores alternativos

2.3. Metodologa analtica
2.3.1. Determinacin del grado de hidrlisis de la leche.
- Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un
bao con agua a 80C para detener la reaccin.
- Se toman 0,2 ml de la muestras anterior, se le agrega 0,2 ml de una solucin de
sulfato de zinc y 0,2 ml de hidrxido de bario, se centrifugan a 5000 rpm por 5
minutos y se retira el sobrenadante.
- Se toman 0.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimtico
para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe
diluir con agua destilada antes de realizar la determinacin de glucosa.
- Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37C y se determina la absorbancia a
505nm.
- Se realiza un blanco utilizando tampn fosfato como muestra y una muestra
Standard con una solucin de glucosa de 0.1 g/l
6


2.4. Metodologa experimental
2.4.1. Determinacin de la actividad de la enzima.
- Se adicionan 4 mL de una solucin de Lactosa (100 g/L preparada en tampn
fosfato 0.1 M pH 6), en un tubo de ensayo.
- Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 C o hasta que el sustrato alcance
la temperatura de reaccin.
- Adiciona 0.1 mL de la muestra enzimtica, previamente diluida con tampn fosfato
0.1 M pH 6.
- Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un bao a 45 C.
- Cumplido el tiempo de reaccin, tomar la solucin y colocarla en un bao con agua
hirviendo, para detener la reaccin.
- Realizar un blanco de reaccin sin enzima.
- Determinar la concentracin de glucosa mediante el metodo de glucostat.

Las experiencias se realizan por triplicado.
- Se repite la experiencia a 55 C.
- Se repite la experiencia tambin utilizando leche semidescremada.

2.4.2. Determinacin de la concentracin de Glucosa (utilizando lactosa como
sustrato)

- En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reaccin enzimtica
(inactivada).
- Adicionar 1 mL del reactivo de determinacin de glucosa.
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
- Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampn fosfato y 1 mL del reactivo, y
que tambin es incubado.
- Interceptar en la curva de calibrado.

7

2.4.3. Determinacin de la concentracin de glucosa (utilizando leche como
sustrato)

- En un tubo de eppendorf colocar 0,2 mL de la muestra de reaccin enzimtica
(inactivada), adicionar sobre este 0,2 ml de una solucin de sulfato de zinc y 0,2 ml
de hidrxido de bario, agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5
minutos.
- En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1
mL del reactivo de determinacin de glucosa.
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
- Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampn y 1 mL del reactivo, y que
tambin es incubado.
- Interceptar en la curva de calibrado.

2.4.4. Determinacin de la estabilidad de la enzima.

- Preparar 5 mL de una solucin enzimtica en tampn fosfato 0.1 M pH 6.
- Tomar 0,5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado),
como se describe previamente.
- Incubar a 45C la solucin enzimtica restante (4,5 mL).
- Cada 10 minutos tomar muestras de la solucin enzimtica (0,5 mL) y medir su
actividad enzimtica residual, como se describe previamente.

Las experiencias deben ser realizadas por triplicado.
- Repetir la experiencia a 55C


2.4.5. Puesta en marcha del reactor.

- Instalar el reactor.
- Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos.
- Evaluar la potencia de agitacin.
8

- Instalar y calibrar el electrodo de pH.
- Poner en marcha el sistema de calefaccin.
- Adicionar al reactor el medio de reaccin que es la leche a hidrolizar.
- Adicionar la cantidad de enzima lactasa, calculada previamente.
- Instalar el termmetro para medir temperatura.
- Poner en marcha el sistema de agitacin que consiste en un agitador mecnico de
hlice.
- Mantener la leche bajo agitacin suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrlisis preestablecido.

2.4.6. Hidrlisis enzimtica de lactosa.
- Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH.
- Tomar una muestra para determinar la concentracin de lactosa inicial (tiempo
cero).
- Poner en marcha el sistema de agitacin y calentamiento (45C o 55C).
- Esperar que el sistema de reaccin alcance la temperatura deseada.
- Adicionar la enzima de acuerdo a la razn enzima sustrato entregada.
- Mantener la leche bajo agitacin suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrlisis preestablecido.
Cada 10 minutos sacar muestras de 2 ml para determinar el grado de hidrlisis de la
lactosa.
2.4.7. Elaboracin del manjar.
Una vez finalizada la etapa de hidrlisis se procede a la fabricacin del manjar
Debemos:
- Calentar la leche bajo agitacin hasta 80C, en algn recipiente u olla, midiendo
temperatura constantemente.
- Adicionar lentamente la cantidad de sacarosa de acuerdo a la dosificacin
sugerida (200 g/l de leche).
- Mantener bajo agitacin hasta llegar a un contenido de slidos de un 65-70%, el
que se determina mediante un refractmetro y corresponde a un valor de 70Brix.


9

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Caracterizacin del preparado enzimtico
3.1.1. Actividad enzimtica
En esta prctica se procede a determinar la actividad de la enzima a dos temperaturas,
45y 55Celsius, para el preparado enzimtico comercial Biolactasa NTL.
Como primera experiencia se procede a determinar la actividad de la enzima, la cual se
realiza adicionando 4 [ml] de una solucin de Lactosa en un tubo de ensayo, el cual se
incuba por 5 minutos a 45C, luego se procede a adicionar 0,1 [ml] de la muestra
enzimtica previamente diluida con tampn fosfato, que en este caso la dilucin aplicada
es de 1:1000, se agita suavemente y se deja reaccionar por 5 minutos en un bao
termostatizado a 45 C. Una vez cumplido el tiempo, la muestra se lleva a un bao de
agua hirviendo para la detener la reaccin. Finalmente se determina la glucosa existente
en la muestra mediante el mtodo de glucostat.
La experiencia se realiza tambin para una muestra de leche descremada a la misma
temperatura (45C) adems de repetirla para 55C junto a la de Lactosa.
Todas las muestras se realizan por triplicado. ES NECESARIO QUE APAREZCA ACA
TAMBIEN?
Se desea analizar el comportamiento de la hidrlisis de la lactosa, cuantificando la
aparicin de producto final en trminos de concentracin de glucosa. En la tabla siguiente
se muestran los datos obtenidos en laboratorio. (Ver Anexo D, Tabla D.5.)

Tabla 3.1: Datos obtenidos de actividad enzimtica a dos temperaturas.

Actividad [UI/ml]
Leche Lactosa
45 C 9478,1 7894,6
55C 8847,4 9987,4

De acuerdo a los datos presentados, se evidencia que el potencial cataltico de la enzima
aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con
la enzima. Cabe sealar que al ser mayor esta temperatura cada vez ms, llegar a un
punto donde esta ltima tiende a perder su conformacin tridimensional por efectos
trmicos implicando que la conversin de sustrato a producto, en este caso la hidrlisis de
10

la lactosa a glucosa ms galactosa, decrezcan notoriamente. Segn bibliografa este
punto mximo de capacidad cataltica bordea los 60, punto en que no conviene realizar
esta prctica pues su estabilidad tambin se ve afectada en gran medida.
Analizando la actividad en cuanto a tipo de sustrato, en este caso lactosa y leche semi-
descremada a concentraciones determinada de 100[g/L] y 45[g/L] respectivamente. Se
evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche, aunque lo esperado
es que la enzima al estar en un medio saturado de sustrato sea ms activa. Se podra
pensar que se inhibe por sustrato, pero no es el caso pues de acuerdo a lo estudiado,
esta enzima se comporta de forma distinta, inhibindose posteriormente de forma
competitiva.


11

3.1.2. Estabilidad enzimtica
Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima, la cual se
realiza preparando 5 [ml] de una solucin enzimtica en tampn fosfato, de la cual se
toma 0,5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial, como se realiz en la experiencia
anterior. La solucin enzimtica sobrante se incuba en bao termostatizado a 45C, luego
se toman muestras cada 10 minutos de esta solucin y se mide su actividad enzimtica
residual.
La experiencia se repite para una temperatura de 55 C. Donde todas las muestras se
realizan por triplicado. NECESARIO DENUEVO?
Se entiende por actividad enzimtica residual como la actividad a un determinado tiempo
de incubacin. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero.
Los resultados sern expresados en actividad relativa, la cual se entiende por actividad
residual/actividad inicial.
A continuacin se muestran los resultados obtenidos para la estabilidad de la enzima
respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrlisis de la lactosa en el tiempo.

Tabla 3.2. Actividad enzimtica residual y relativa a 45Celsius.
45C

Actividad enzimtica
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/L] [%]
0 6,99 100
10 5,99 85,6
25 5,47 78,2
40 5,31 76,0
63 5,22 74,6
74 4,90 70,1
88 4,71 67,3
103 4,20 60,0

12


Tabla 3.2. Actividad enzimtica residual y relativa a 55Celsius.
55C
Actividad enzimtica
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/ml] [%]
0 6,47 100
10 5,37 83,0
25 5,08 78,6
40 4,87 75,4
63 4,75 73,5
74 4,44 68,7
103 3,71 57,4

Observando los porcentajes de actividad relativa existentes para cada temperatura, se
puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos, ejemplo de ello es a los
10 minutos la perdida de actividad para 45C es de un 14,4% y para la temperatura de
55C la perdida de actividad de un 17%. Esta prdida mayor a 55C se debe a que la
enzima es termolbil, por lo cual sufre una desnaturalizacin por causa de la temperatura
por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45C.
En la siguiente grafica (grafica 3.1) se muestra la comparacin de la actividad a 45y 55
Celsius, para poder observar el comportamiento que tiene cada una.
De la grfica siguiente se puede decir que la enzima a la temperatura de 45Celsius es
ms estable que la de 55C por el comportamiento apreciado.


13


Grafica 3.1. Comparacin actividad relativa a dos temperaturas de reaccin.

Las fluctuaciones que se aprecian en la Grafica 3.1. de la actividad enzimtica a 55C
pueden deberse al comportamiento normal de la enzima, ya que esta no permanece
estable dentro del medio.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
A
c
t
i
v
i
d
a
d


r
e
l
a
t
i
v
a

[
%
]


Tiempo [min]
45C
55C
14

3.2. Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes.
Para comenzar esta experiencia de hidrlisis enzimtica se calcula la cantidad de enzima
a agregar al reactor. De tal forma que presente una conversin del 99% en 2 horas de
operacin en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F), dando como resultado
a agregar 0,677 ml de enzima.
Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones ptimas para operar, se
pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrlisis de la lactosa obteniendo el
grado de conversin de los azucares reductores en la hidrlisis enzimtica, siendo los que
se muestran en el siguiente grfico:


Grfica 3.2. Grado de conversin en el tiempo de operacin del reactor, segn
ANEXO F.

Para determinar la concentracin de glucosa [g/L] se utiliza el mtodo de glucostat, para
poder calcular los moles de glucosa, y para determinar la concentracin de Lactosa [g/L]
se utiliza el mtodo DNS, dando como resultado una concentracin de lactosa inicial de
33,8 [g/L], valor que se utiliza para determinar el grado de conversin (moles de
glucosa/moles de lactosa) en funcin del tiempo, para poder llevar un seguimiento del
curso de la reaccin. (Clculos en ANEXO F).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[
%
]

d
e

c
o
n
v
e
r
s
i

n

Tiempo [h]
15

Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor, solo se logr un 52,9 % de
conversin en 2.3 horas, esperndose un 99% en 2 horas de operacin, esto pudo haber
sucedido porque se agreg ms enzima de lo que se deba, ya que al realizar los clculos
la cantidad de enzima a adicionar era slo de 0,677 ml, y como la enzima posee una
inhibicin competitiva por producto, al haber ms cantidad de enzima y sta al estar en las
condiciones adecuadas para reaccionar, comenz a hidrolizar la lactosa teniendo as
glucosa y galactosa, donde al pasar del tiempo y al haber ms galactosa que lactosa est
la inhibi y no se alcanz el porcentaje de conversin en el tiempo esperado.


16

3.3. Hidrlisis enzimtica de lactosa para produccin de manjar
sta prctica se desarrolla en dos etapas. Primero se realiza una hidrlisis parcial de
lactosa, donde se recomienda una disminucin del 35%. Luego se procede a la
fabricacin de manjar.
Con respecto al grado de hidrolisis de lactosa, se agrega 1 ml de enzima al reactor de
volumen de reaccin de 2 litros, y temperatura de operacin de 45C, donde transcurrida
una hora de reaccin se obtuvo un grado de hidrolisis de un 14%. Cabe mencionar que
para efectos de este clculo se considera como concentracin inicial de lactosa en la
leche 45 [g/L]. Luego se procede a la elaboracin del manjar, y mediante un refractmetro
se determina el contenido de slidos, finalizando con un valor de 70 Brix
aproximadamente.
Para comparar entre leche hidrolizada y sin hidrolizar, mantenidas a condiciones de
operacin iguales. Se presenta el siguiente grfico:

Grfico 3.3. Elaboracin de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar.
Medicin de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E)

La leche hidrolizada present una mayor alza de grados Brix en menor tiempo que la
leche sin hidrolizar. Cabe mencionar que la medicin de grados Brix representa la
concentracin de azcar presente en solucin. Se mide con un refractmetro y la
concentracin de azcar es proporcional a su ndice de refraccin. Esto debido a que la
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80
G
r
a
d
o
s

B
r
i
x

[

B
r
i
x
]

Tiempo [min]
Chart Title
17

enzima Biolactasa NTL hidroliza la lactosa, generando como producto monosacridos
tales como glucosa y galactosa.

El mayor problema que presenta el manjar como anomala de producto es la sobre-
estructuracin de la lactosa y su consecuente cristalizacin como lactosa monohidratada.
Es por esto, que la hidrlisis enzimtica constituye uno de los mtodos ms efectivos en
la elaboracin de manjar, pues logra disminuir el efecto nocivo de la cristalizacin
excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organolptica del producto.


18

4. CONCLUSIONES


19

5. BIBLIOGRAFA

- Acevedo F,Gentina Juan Carlos,Illanes A,2002,Fundamentos de Ingeniera
Bioqumica,1era edicin, Capitulo 4 Cintica de Fermentaciones pp.94-118,Chile.
- SENATI, Elaboracin de manjar blanco, Documento de Consulta, 10 Junio de
2012, www.infolactea.com

20

6. ANEXOS
Anexo A
Curva calibrado DNS

Estndar glucosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla A.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estndar Vol. Tampn Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,085 0,055 0,070
0,2 0,8 0,30 0,143 0,131 0,137
0,3 0,7 0,45 0,222 0,214 0,218
0,5 0,5 0,75 0,389 0,365 0,377
0,7 0,3 1,05 0,521 0,520 0,521
0,8 0,2 1,20 0,596 0,585 0,591
1,0 0,0 1,50 0,760 0,739 0,750




Figura A.1. Curva de calibrado de glucosa por mtodo DNS.

y = 0.5038x - 0.0083
R = 0.9996
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
4
0

n
m
]


Concentracin glucosa [mg/ml]
21

Anexo B
Curva calibrado para lactosa

Estndar lactosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla B.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estndar Vol. Tampn Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,044 0,056 0,050
0,2 0,8 0,30 0,106 0,105 0,106
0,3 0,7 0,45 0,171 0,171 0,171
0,5 0,5 0,75 0,266 0,291 0,279
0,7 0,3 1,05 0,421 0,410 0,416
0,8 0,2 1,20 0,478 0,466 0,472
1 0 1,50 0,594 0,591 0,593



Figura B.1. Curva de calibrado para lactosa por mtodo DNS

y = 0.4042x - 0.0139
R = 0.9993
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
4
0

n
m
]

Concentracin lactosa [mg/ml]
22

Anexo C
Curva de calibrado glucostat

Estndar glucosa: 0,25 [mg/ml]
Tabla C.1. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm]
Volumen

Absorbancia
Estndar Tampn Conc. Glucosa [505 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
10 90 0,025 0,080 0,076 0,078
30 70 0,075 0,209 0,255 0,232
50 50 0,125 0,387 0,403 0,395
70 30 0,175 0,553 0,544 0,549
80 20 0,200 0,638 0,637 0,638
100 0 0,250 0,789 0,791 0,790



Figura C.1. Curva de calibrado para glucosa por mtodo glucostat.

y = 3.178x - 0.0034
R = 0.9998
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
0
5

n
m
]

Concentracin de glucosa [mg/ml]
23

Anexo D
Determinacin de actividad y estabilidad de la enzima.

Tabla D.1. Datos para estabilidad a 45Celsius

Tiempo

Absorbancia [nm]

Glucosa

Actividad enzimtica Actividad
Muestra [min]

a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T
0
0 0,496 0,467 0,490 0,484 0,153 6,99 1,00
T
1
10

0,338 0,445 0,460 0,414

0,131

5,99 0,856
T
2
25

0,356 0,390 0,388 0,378

0,120

5,47 0,782
T
3
40

0,318 0,394 0,390 0,367

0,117

5,31 0,760
T
4
63

0,352 0,370 0,360 0,361

0,115

5,22 0,746
T
5
74

0,360 0,340 0,315 0,338

0,108

4,90 0,701
T
6
88

0,360 0,315 0,300 0,325

0,103

4,71 0,673
T
7
103 0,271 0,288 0,309 0,289 0,0921 4,20 0,600


Tabla D.2. Datos para estabilidad a 55Celsius

Tiempo

Absorbancia [nm]

Glucosa

Actividad enzimtica Actividad
Muestra [min]

a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T
0
0 0,416 0,437 0,490 0,448 0,142 6,47 1,00
T
1
10

0,362 0,363 0,388 0,371

0,118

5,37 0,830
T
2
25

0,34 0,369 0,344 0,351

0,112

5,08 0,786
T
3
40

0,334 0,301 0,375 0,337

0,107

4,87 0,754
T
4
63

0,306 0,325 0,353 0,328

0,104

4,75 0,735
T
5
74

0,294 0,300 0,325 0,306

0,097

4,44 0,687
T
6
88

0,388 0,3 0,306 0,331

0,105

4,80 0,742
T
7
103 0,204 0,313 0,25 0,256 0,0815 3,71 0,574





24


Tabla D.3. Actividad de la enzima en leche

Absorbancia

45C 55C
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,205 0,237 0,209 0,217 0,239 0,147 0,221 0,202
muestra 0,270 0,302 0,274 0,282 0,308 0,216 0,290 0,271
blanco 0,065 - - 0,065 0,0690 - - 0,0690


Tabla D.4. Actividad de la enzima en lactosa.

Absorbancia

45C 55C
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,52 0,535 0,587 0,547 0,696 0,652 0,732 0,693
muestra 0,542 0,557 0,609 0,569 0,743 0,699 0,779 0,740
blanco 0,0220 - - 0,0220 0,0470 - - 0,0470


Tabla D.5. Actividad enzimtica enleche y lactosa a 45y 55Celsius

Temperatura Promedio Glucosa FD Actividad enzimatica
[C] abs [g/L] [UI]
Leche
45
0,282 0,0694 3000 9478,1
Lactosa 0,569 0,173 - 7894,8

Leche
55
0,271 0,0647 3000 8847,4
Lactosa 0,740 0,219 - 9985,8



25

Ejemplo calculo actividad enzimtica:
Para la leche:
[

[]

[ ]
[]

[ ]
[ ]

[ ]
[ ]

[]
[]

[]
[]

[

] [] [

]
Agregando el factor de dilucin de 3
[

]

Para lactosa:
[

[]

[ ]
[]

[ ]
[ ]

[ ]
[ ]

[]
[]

[]
[]

[

] [] [

]






26

Anexo E
Hidrolisis enzimtica de lactosa para elaboracin de manjar.

Tabla E.1. Medicin de absorbancia por mtodo glucostat y clculo del
porcentaje de conversin de lactosa

Glucosa
Lactosa

Absorbancias [505 nm]
Tiempo
[min]
1 2 3 Prom
concentracin
glucosa [g/L]
mol
glucosa
% de
conversin
Concentracin
lactosa [g/L]
mol
lactosa
0 0,023 0,028 0,031 0,027 0,029 0,000 0,122 45,000 0,132
30 0,014 0,013 0,016 0,014 1,674 0,009 7,068

60 0,030 0,034 0,031 0,032 3,310 0,018 13,977



Utilizando curva de calibrado para determinacin de glucosa por mtodo glucotat se
obtiene la concentracin de glucosa transcurrido 0, 30, 60 minutos de reaccin. El clculo
a tiempo 30 minutos se presenta a continuacin:

[

]
( )

()

]

El clculo de porcentaje de conversin se realiza con los moles de glucosa y lactosa, lo
que se presenta a continuacin:

]
[

]
[

]
[

]

27

Tabla E.2. Medicin de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar

Grados Brix [Brix]
Tiempo
[min]
Leche
Sin Hidrolizar
Leche
Hidrolizada
0 26,2 27
15 28,2 29,2
30 32 37
40 42,6 45
50 60 66
60 63 84
75 71,4




28

Anexo F
Hidrlisis enzimtica de la lactosa en un reactor por lotes.
Para una conversin del 99% en el reactor en 2 horas de operacin, utilizando para esta
enzima los valores de parmetros cinticos de K
m
20 [g/L] y la velocidad mxima de
reaccin se calcul segn lo obtenido en el laboratorio anterior. La expresin que se
utiliz es:
( ) X X
K
S
V K
t V
m rxn m
m
= 1 ln *
*
*
0


X: Grado de Conversin, 99%, 0,99
S
0
: Sustrato inicial, 40 [g/L]
t: Tiempo, 120 [min]
V
rx
: Volumen de reaccin, 2 [L]
K
m
: constante de afinidad, 20 [g/L]
V
m
: Velocidad mxima.

De esto calculamos V
m
= 6418,3 UI.

El V
m
obtenido, lo relacionamos con la actividad de la enzima en UI/ml enzima
(determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma:

9478,1 UI/ml enzima * X = 6418,3 UI
X = 0,677 ml de enzima.

Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0,677 ml de enzima.
29

Determinacin de lactosa por mtodo de DNS.
Tabla F.1. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm].

Tiempo Absorbancia Lactosa Temperatura
[h] 1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd pH [C]
0 0,179 0,157 0,168 0,450 25 33,752 6,51 44
1,0 0,165 0,185 0,175 0,423 30 38,097 6,57 43
2,3 0,108 0,107 0,108 0,230 60 41,460 6,52 44

Mediante la siguiente ecuacin se calcul la concentracin de Lactosa en [g/L], a travs
del tiempo:

( )
fd
Abs
L
g
Lactosa *
4042 , 0
0139 , 0 +
=
(

30

Determinacin de glucosa por mtodo de glucostat.

Tabla F.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm].
Tiempo Absorbancia Glucosa Porcentaje de
[h]
1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd
mol
glucosa
conversin
0 0,099 0,090 0,095 0,031 - 0,092 0,001 0,520
0,2 0,130 0,125 0,128 0,041 60 2,471 0,014 13,9
0,3 0,330 0,350 0,340 0,108 30 3,242 0,018 18,2
0,5 0,480 0,485 0,483 0,153 30 4,587 0,025 25,8
0,7 0,530 0,520 0,525 0,166 30 4,988 0,028 28,1
1,0 0,443 0,410 0,427 0,135 45 6,087 0,034 34,3
1,6 0,532 0,515 0,524 0,166 45 7,461 0,041 42,0
1,8 0,270 0,265 0,268 0,085 101 8,609 0,048 48,5
2,1 0,290 0,280 0,285 0,091 101 9,166 0,051 51,6
2,3 0,285 0,300 0,293 0,093 101 9,404 0,052 52,9

Mediante la siguiente ecuacin se calcul la concentracin de glucosa [g/L], a travs del
tiempo:
( )
fd
Abs
L
g
a Glu *
178 , 3
0034 , 0
cos
+
=
(

Para calcular el grado de conversin en funcin del tiempo se utilizaron las siguientes
ecuaciones:
Grado de conversin = (moles de glucosa/moles de lactosa)
Por lo que la concentracin de glucosa y lactosa en [g/L], se transformo a [moles/L] de la
siguiente forma:
31

Moles de lactosa =
Lactosa M P
L
g
Lactosa
. .
(

Ejemplo:
Moles de lactosa =
(

mol
g
L
g
342
8 , 33
= 0,099 [mol/L]

Moles de glucosa =
a Glu M P
L
g
a Glu
cos . .
cos
(

Ejemplo:
Moles de Glucosa = | |
L
mol
mol
g
L
g
0005 , 0
180
092 , 0
=
(

Luego se realiza el clculo para el grado de conversin:

Grado de conversin =
| |
| |
3 .
10 * 2 , 5
099 , 0
0005 , 0
=
L
mol
L
mol



[%] de conversin= (5,2* 10
-3
)* 100 = 0,516

Todos los clculos de conversin se realizaron con los [mol/L] de la concentracin de
Lactosa inicial