INTRODUCCIN

En el presente laboratorio abordaremos dos temas fundamentales para el curso de Microbiologa: MICROSCOPIO COMPUESTO Y TINCION GRAM o COLORACIN DE BACTERIAS. El uso adecuado de un microscopio es una de las destrezas ms importantes que debe aprender un estudiante microbiologa. Los microscopios se desarrollaron a finales del siglo XVII y hoy en da, continan siendo importantes para la identificacin de hongos y algunos otros microorganismos. Es por eso que los estudiantes debemos aprender como utilizarlos y cuidarlos adecuadamente.Y en cuanto al tema de Tincin de Bacterias, definiremos el uso de colorantes, del mtodo Gram, y utilizando las muestras hechas en la semana anterior con los medios de cultivo, hallaremos los tipos de Bacteria y que Bacterias son especficamente.

OBJETIVOS MICROSCOPIO COMPUESTO Manejar correctamente el microscopio conociendo la funcin de cada parte del microscopio. Conocer, mediante la observacin de las muestras, cual es el objetivo apropiado para observarlas (1Ox; 43x; 97x). Ensear el cuidado y mantenimiento apropiado de los microscopios. Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observacin de muestras con el microscopio.

TINCIN DE LAS BACTERIAS (Mtodo Gram) Mediante este mtodo podemos teir las bacterias, para su mejor descripcin Determinacin de bacterias Gram (+) Gram (-) El mtodo de tincin de bacterias sirve para diferenciar entre distintas formas de microorganismos. Podemos usar amplificaciones mayores.

FUNDAMENTO TEORICO MICROSCOPIO COMPUESTO Un microscopio compuesto tiene ms de un lente objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas: * El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar. * El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz. * El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente". Sabemos que existen dos tipos de microscpicos: Simple y Compuesto. MICROSCOPIO SIMPLE Consiste en una lente o cristal de aumento montado en una armazn graduable provisto de un soporte para la conveniente colocacin del objeto y de un espejo que refleja la luz. MICROSCOPIO COMPUESTO Se diferencia del simple por que consta de dos juegos de lentes, uno conocido como objetivo, y el otro por ocular; montado en un tubo (como observaremos a continuacin en la figura siguiente). Podemos conseguir un enfoque preciso con la ayuda de un tornillo micromtrico. Los microscopios compuestos dan un aumento mayor que los simples; y son necesarios para ver y examinar objetos tan minsculos como las bacterias. Un microscopio compuesto se divide en dos partes: Mecnica y ptica. A continuacin veremos cada una de las partes.

PARTE MECNICA Principales componentes de los microscopios, descripcin general y usos Descripcin Parte de metal o plstico sobre la cual descansa el resto de las partes Base del microscopio. Columna en forma de C que se proyecta de la base y que sostiene a Brazo la platina y a los componentes pticos. Plataforma plana unida a la parte inferior del brazo sobre la cual se Platina colocan los portaobjetos o muestras a observar. Manija debajo de la abertura de la platina que consiste de un grupo de Cierre del Diafragma o piezas de metal a manera de obturador que regula la cantidad de luz Condensador que atraviesa al portaobjetos colocado en la platina. No est presente en todos los microscopios colecta los rayos de luz Condensador del iluminador y los enfoca incrementa la resolucin, aumenta el contraste de la muestra. Botn de ajuste del Sube y baja el condensador. condensador knob Parte cilndrica/vertical unida en la parte superior del brazo que Cabezal sostiene el sistema ptico. Plato giratorio que sostiene los objetivos (lentes), unido a la parte Revlver inferior del cabezal, puede drsele la vuelta para cambiar los lentes (objetivos). Ajuste del Botn grande que mueve el cabezal hacia arriba y abajo para observar macromtrico la muestra en el enfoque macromtrico. Botn pequeo que mueve el cabezal a distancias ms cortas, de Ajuste del manera ms lenta y es usado para observar a la muestra con un micromtrico enfoque ms ntido. Iluminador, Fuente Controla la cantidad de luz que se transfiere a la muestra. lumnica Tubo de metal corto, removible que contiene lentes ubicados en la Oculares parte superior del tubo, generalmente de 10X, 43X, 97X de aumento. Componente

Principales componentes de los microscopios, descripcin general y usos Componente Ajuste de Dioptra Descripcin Ajuste usado para compensar la diferencia de observacin de los ojos. Tubos de metales pequeos, atornillados dentro del revlver que Objetivos (lentes) incrementa el aumento de la muestra (a menudo se refieren slo como objetivos). Espejo Usado para reflejar la luz a travs de la muestra. Usado para ajustar el espejo para que refleje la luz a travs de la Eje giratorio del espejo muestra. Tambin se les refiere como lentes suplementarios, pueden ser Lentes auxiliares encontrados en microscopios de diseccin en la base de la cubierta de los objetivos o cabezal.

TINCIN DE BACTERIAS DEFINICIN DE COLORANTES O TINTES Un tinte se define como una sustancia o compuesto orgnico que tienen los grupos cromforo y auxocromo ligados al ncleo bencnico. Existen varios mtodos de tincin pero estos estn agrupados en tres tipos de tincin especficos, los cuales pasaremos a mencionar. Los tipos de tincin son: A. Tincin simple: 1. 2. 3. B. C. Tincin compuesta: Tincin de estructuras: 1. 2. 1. 2. 3. 4. 5. Colorantes bsicos Colorantes cidos Colorantes indiferentes Tincin de Gram Tincin de cidos resistentes Feulgen (para material nuclear) Tincin de endsporas Tincin de pared celular Tincin de flgelos Tincin de cpsulas

El mtodo que usaremos para estudiar para la descripcin de bacterias es el mtodo de Tincin de Gram. TINCIN DE GRAM La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva

a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram.

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra liquido cerebroespinal. Si

hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infeccin.

PARTE EXPERIMENTAL Materiales de vidrio: Portaobjetos Tubo de ensayo

Medios de cultivo: Colorantes: Cristal violeta (azul o morado) Lugol Safranina (rojo) Alcohol Acetona Agar nutritivo Caldo nutritivo

Equipo: Mechero Inoculador Microscopio

PROCEDIMIENTO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Secamos el portaobjetos pasando por el fuego Preparamos el frotis de Agar nutritivo y Caldo nutritivo. Dejamos secar al ambiente. Fijamos al calor ( 3 veces) Teimos con cristal violeta por 20 segundos. Lavamos con agua por 2 segundos. Cubrimos el frotis con lugol durante 1 minuto. Decoloramos con agua por 2 segundos. Contracolorear con safranina y dejar que se tia por 20 segundos. Lavamos con agua y lo secamos con papel filtro. Examinamos en el Microscopio con objetivo de 97X luego de secarse.

MICROSCOPIO COMPUESTO

CONCLUSIONES

tipo de Bacteria presente en las muestras que preparamos. -

Pudimos determinar el Los resultados que se obtuvimos en su mayoria de la coloracin Gram fueron Streptococos. Conluimos que es necesario seguir el procedimiento con el debido cuidado pues al inicio no logramos los resultados esperados.

RECOMENDACIONES Es necesario realizar correcta y minuciosamente los procedimientos del frotis y la fijacin para obtener los resultados correctos. Es recomendable tener en cuenta saber el manejo del microscopio correctamente para no daar el microscopio. Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se corre el riesgo de no obtener ningn resultado.

CUESTIONARIO 1. Establecer la diferencia entre poder de resolucin y abertura numrica. Resulta evidente que el poder de resolucin de un Microscopio ptico est restringido por los valores limitados de la abertura numrica y la longitud de onda de la luz visible. 2. Completar:
Partes del Microscopio Ocular Objetivo Condensador Diafragma de Iris Tornillo Macrometrico Tornillo Micrometrico Funcion(es) lFuncin del ocular es presentar al ojo dicha imagen de la forma ms legible posible, agrandndola lo que sea necesario Funcin principal de un cualquier objetivo es obtener una imagen del objeto observado lo ms ntida y luminosa posible Es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacin hacia la preparacin Es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados Sirve para alejar o acercar el tubo y la platina. Se obtiene la imagen de la muestra (enfoque o ajuste grueso). Sirve para dar claridad a la imagen. Se logra el ajuste fino

3. Hacer una tabla en relacin a enfermedades microbianas que son transmitidas por el aire, agua y alimento.

ENFERMEDAD Salmonelosis

SNTOMAS PRINCIPALES Diarrea, dolor abdominal, dolor de

ALIMENTOS TPICOS Huevos, carnes y productos lcteos sin

MODO DE TRANSMISIN Comienzan entre las 8 y 48 horas despus de comer el alimento contaminado y dura entre 1 y 8 das. Comienzan entre 3 y 9 das despus de ingerir el alimento contaminado, dura de 2 a 9 das si no hay complicaciones. Comienza dentro de las 24 horas despus de comer el alimento contaminado. Dura entre 2 y 7 das.

cabeza, fiebre y nuseas pasteurizar. Escherichia coli Dolor de cabeza, diarrea Leche sin pasteurizar, y dolor abdominal Listeria monocytogenes severo. Leche sin pasteurizar y quesos blandos, carnes de ave, pat de carne, ensaladas, etc. vegetales crecidos con estircol, etc. Fiebre repentina, escalofros, dolor de espalda, dolor abdominal y diarrea.

4. Responder a) Existen diferencias qumicas entre las paredes celulares de las Bacterias gram positivas y gram negativas? Las bacterias gram negativas contienen un porcentaje ms alto de lpidos que las bacterias gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son tambin ms delgadas que las de las gram positivas; las paredes de las bacterias gram negativas tienen una cantidad mucho menor de peptido-glucano con ligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias gram positivas.

b) Afecta la edad del cultivo a la reaccin de Tincin de Gram. La edad del cultivo afecta a la reaccin de tincin Gram pues cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la facultad de retener el cristal violeta y se tien con la safranina. 5. Hacer una lista de Bacterias Gram positivas y Gram negativas con las enfermedades que provocan. GRAM POSITIVAS Bacillus subtilis Clostridium tetani Corynebacterium diphtheriae Lactobacillus acidophilus Streptococcus pyogenes GRAM NEGATIVAS Achromobacter Brucella ovis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Salmonella typhi

BIBLIOGRAFA

1. Wesley A. Volk

Microbiologa Basica Ed. Harlon Ao 1996

Mxico (sexta edicin)

2. A. J. Salle

Bacteriologa Ed. Gustavo Gili Ao 1960 Barcelona (cuarta edicin)

3. Harry Seeley

Microbiologa en Accin Ed. Blume Ao 1973

ANEXOS

Estafilococos

Muestra N 01

Muestra N 02