Joo Ricardo M.

Alves Costa
bilogo licenciado (Cincias Biolgicas UFPR)
M.Sc., Cincias Biolgicas, Morfologia (Biologia Celular UFPR)
BIOMARCADORES DE POLUIO AMBIENTAL:
que so, para que servem,
quando e onde empreg-los...
LABORATRIO DE TOXICOLOGIA CELULAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR
SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN
Programa de Ps-Graduao (doutorado) em
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR (UFPR/IBMP)
Orientao:
Prof. Dr. Ciro A. Oliveira Ribeiro (UFPR)
Co-orientao:
Prof. Dr. Samuel Goldenberg (IBMP)

XII CICLO DE ATUALIZAO
EM CINCIAS BIOLGICAS:
A BIOLOGIA NO NOVO MILNIO

CONSERVAO DA BIODIVERSIDADE
GERAO DE CONHECIMENTO TCNICO-CIENTFICO
Objeto central de estudos: CLULA EUCARITICA
MODELO BIOLGICO empregado atualmente:
spp de PEIXES DULCCOLAS TROPICAIS e SUBTROPICAIS

BIOMONITORAMENTO

MONITORAMENTO AMBIENTAL
parmetros fsico-qumicos
mtodos qumico-analticos


AMBIENTES AQUTICOS

H
2
O recurso natural essencial

COMPARTIMENTO FINAL DE POLUENTES



COMO ASSIM PEIXES DE GUA DOCE ??
VERTEBRADOS
nveis trficos superiores: CONSUMIDORES
importante papel ecossistmico
INTERPRETAO de resultados POR EXTENSO:
fenmenos e processos biolgicos comuns
OPERAR da CLULA EUCARITICA
Pb
++

Hg
++

TBT
FS
petrleo
HgCH
3
+

FAMLIA ERYTHRINIDAE
GNERO Hoplias (TRARAS)
ampla distribuio geogrfica:
NEOTROPICA
posio elevada na CADEIA TRFICA
ALTAMENTE ESPECIALIZADA
Hoplias lacerdae
Hoplias malabaricus
Oreochromis niloticus
FAMLIA CICHLIDAE
(TILPIA)
EXTICA
ALGVORA-ONVORA (posio intermediria)
ALTAMENTE ADAPTVEL, OPORTUNISTA e RESISTENTE
Amplamente empregada na PISCICULTURA
CULTIVO INTENSIVO em REGIES TROPICAIS
com alta densidade de estocagem
rusticidade, curto ciclo de reproduo, crescimento rpido
maturao precoce (reverso sexual)

dC
B
/ d
t
= [k
w
C
w
+ k
F
C
F
] - [k
EXC
+ k
MET
]C
B


BCF = k
W
/ k
B
= C
B
/ C
W


k
OC
= k
W
/ k
S
= C
S
/ C
W


BSAF = C
B
/ C
S
= BCF / k
OC


BMF = k
F
/ k
B
= F
F
E
F
/ k
B

C concentrao
k taxas constantes
no equilbrio

adaptado de van der OOST et alii, 2003
BIOACUMULAO em ORGANISMO AQUTICO
BIOCONCENTRAO
BIOMAGNIFICAO
DISTRIBUIO DE XENOBIONTES
EM COMPARTIMENTOS ECOSSISTMICOS
REPRESENTAM um PROCESSO BIOLGICO (fenmeno)
ALTERADO: SINAIS CLNICOS SUBLETAIS

INTEGRAM sistemas biolgicos operacionais indicando
CONTAMINAO ou INTOXICAO

EXISTEM em diferentes
NVEIS DE ORGANIZAO BIOLGICA:
alterao MOLECULAR, CELULAR, TECIDUAL,
ou SISTMICA (de rgo ou aparelho)
BIOMARCADOR

ALTERAO MENSURVEL OU OBSERVVEL DE UMA
RESPOSTA BIOLGICA (EFEITO) RELACIONADA
EXPOSIO DE UM ORGANISMO (CAUSA)
A AGENTES EXGENOS OU XENOBIONTES.

PARMETRO MORFOLGICO OU FISIOLGICO ALTERADO
HEPATCITOS
DE TRARA
MICROSCOPIA
ELETRNICA DE
TRANSMISSO
BIOMARCADORES
MORFOLGICOS
Pb
++

40 DIAS
IO
D -
1
2
3
4
5
6
7
8
Pb I
Pb II control II
group
With Control
Dunnett's
0,05
Densidade ptica Integrada: [DNA]
MICROSCOPIA DE LUZ
IMPRINT
REAO DE FELGEN
BENEVENUTO, 2003
BIOMARCADORES
MORFO-FISIOLGICOS
EM NVEL SISTMICO (DE RGOS OU APARELHOS)
do sistema nervoso (NEUROTOXICIDADE)
parmetros METABLICOS, IMUNOLGICOS,
REPRODUTIVOS, ENDCRINOS, et cetera
MTODOS BIOQUMICOS e da BIOFSICA

EM NVEL TECIDUAL
interaes CLULA-CLULA e CLULA-MATRIZ
TEORES TECIDUAIS de METABLITOS ENDGENOS
MTODOS BIOQUMICOS: histoqumica,
imunocitoqumica, purificaes e extraes

EM NVEL MOLECULAR
atividade de ENZIMAS (rotas), EXPRESSO GNICA
macromolculas: CROMOSSOMOS, GENOMA, PROTEOMA
MTODOS BIOQUMICOS: caracterizao de
molculas, citogentica, Bio.Mol. do DNA recombinante
SISTEMA HEPTICO
(HEPATCITO)

Expresso de METALOTIONENA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerncia a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante



HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerncia a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expresso de P450
uso de EsROx em oxidaes
l catabolismo (MFOS):
oxidao de esterides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expresso de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrognica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrognica
(fmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibio :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
[ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO

Glutationa S-transf

GSH + ROH GSROH
tiol transferases

GSH + R-SH

GSSR
COMPOSTOS DE OXIGNIO PARCIALMENTE REDUZIDOS
e
-
e
-
e
-
e
-

O
2
O
2

H
2
O
2
OH

H
2
O

superxido dismutase
O
2
-
+ O
2
-
+ 2 H
+
H
2
O
2
+ O
2


citocromo P450

O
2
+ RH ROH

CATALASE

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


CATALASE

R-O-OH + AH
2
H
2
O + R-OH + A
GSSG red
GS-SG + 2 NADPH 2 GSH + 2 NADP
+

GSH perox
2 GSH + ROOH GSSG + H
2
O + ROH
EQUILBRIO REDOX
DO SISTEMA GSH/GSSG
GSH peroxidase / GSSG redutase
glutationa S-transferase
hemesintese
o-ALAs: sintetase do o-aminolevulinato
o-ALA: o-aminolevulinato (linear)
o-ALAd: desidratase do o-aminolevulinato
PBG: porfobilinognio (1 anel)
sHEME: heme-sintetase ou ferro-quelatase
4PBG
o-ALAd
PBG
o-ALA + o-ALA
o-ALAs
o-ALA
GLICINA +
4X
5 ENZIMAS
4 ETAPAS
3 COMPOSTOS
INTERMEDIRIOS
PROTOPORFIRINA IX
(4 anis)
KREBS
SUCCINIL-CoA
HEME
(4 anis)
HEMEs
Fe
++

[HEME]
o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA o-ALA
o-ALA
o-ALA
Erythrocyte o -ALAd activity in
Hoplias malabaricus:
subchronic and trophic exposure
CTRL
Pb
++
(8) Pb
++
(14) HgCH
3
+
(14)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
**
**
***
21 g Pb
++
. g
-1
(w.w.) . 120 h
-1
: 8 and 14 doses
75 ng HgCH
3
+
. g
-1
(w.w.) . 120 h
-1
: 14 doses
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
B
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
Pb
++
x Oreochromis niloticus
exposio hdrica de 96 h
ctrl
100 g.L
-1
300 g.L
-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
o -ALAd activity at 550 nm, 37
o
C per 1h
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
b
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
**
**
Hg
++
x Oreochromis niloticus
exposio hdrica de 96 h
ctrl-Hg
15 g.L
-1
4 5 g.L
-1
0.000
0.025
0.050
0.075
o -ALAd activity at 550 nm, 37
o
C per 1h
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
b
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
BIOMARCADOR = BIOINDICADOR =
= INDICADOR ECOLGICO

BIOINDICADOR corresponde a um conjunto de organismos de
uma determinada espcie ou populao natural que fornece
informaes sobre as CONDIES AMBIENTAIS de seu habitat
atravs de sua PRESENA, AUSNCIA ou COMPORTAMENTO.

INDICADOR ECOLGICO corresponde a uma espcie ou uma
populao especfica em dado local que, por alteraes em sua
DINMICA POPULACIONAL (migrao, mortalidade,
nascimentos et cetera) INDICAM o COMPROMETIMENTO da
ESTRUTURA de uma COMUNIDADE ECOSSISTMICA por
determinado(s) poluente(s) ou condies de stress fsico ou
qumico.
POUCA
RELEVNCIA
ECOLGICA
GRANDE
RELEVNCIA
ECOLGICA
RESPOSTA A
LONGO PRAZO
RESPOSTA A
CURTO PRAZO
parmetros
bioqumicos
enzimas de
desintoxicao
parmetros
imunolgicos
parmetros
histopatolgicos
condies
bioenergticas
populaes &
comunidades
capacidade
reprodutiva
parmetros
fisiolgicos
ADAMS et alii, 1989
3 TIPOS DE
BIOMARCADORES
BIOMARCADOR DE EXPOSIO
indica a PRESENA do xenobionte no organismo
por EXPOSIO prvia
ndices de BIOACUMULAO:
determinaes por mtodos de qumica analtica

BIOMARCADOR DE EFEITO
EFEITO ADVERSO, prejudicial ao OPERAR NORMAL
do organismo saudvel
EFEITO PR-CLNICO, SUBLETAL ou letal

BIOMARCADOR DE SUSCEPTIBILIDADE
indica a habilidade inerente ou adquirida por um
organismo de RESPONDER EXPOSIO
elucida variaes no grau de RESPOSTA DIFERENCIAL
entre organismos
demonstra a TOLERNCIA FISIOLGICA adquirida
ou controlada por expresso gnica hereditria
FISH BIOACCUMULATION AND BIOMARKERS
IN ENVIRONMENTAL RISK ASSESSMENT:
A REWIEW
Environmental Toxicology and Pharmacology,
v. 13, 2003.
Ron van der OOST, Jonny BEYER &
Nico P. E. VERMEULEN
_______________________________________

MARCADORES de BIOACUMULAO
DETERMINAES QUMICO-ANALTICAS de
TEORES TECIDUAIS de xenobiontes

BIOMARCADORES
RESPOSTAS BIOLGICAS de um organismo:
bioqumicas, fisiolgicas,
histolgicas ou morfolgicas
BIOMARCADOR DE EXPOSIO
indica a PRESENA do xenobionte no organismo
por EXPOSIO prvia
ndices de BIOACUMULAO:
determinaes por mtodos de qumica analtica

BIOMARCADOR DE EFEITO
efeito ADVERSO, prejudicial ao OPERAR NORMAL
do organismo saudvel
EFEITO PR-CLNICO, SUBLETAL ou letal

BIOMARCADOR DE SUSCEPTIBILIDADE
indica a habilidade inerente ou adquirida por um
organismo de RESPONDER EXPOSIO
elucida variaes no grau de RESPOSTA DIFERENCIAL
entre organismos
demonstra a TOLERNCIA FISIOLGICA adquirida
ou controlada por expresso gnica hereditria

EFEITO
ALTERAO
de um PARMETRO BIOLGICO MENSURVEL
SUBJETIVAMENTE:
variveis discretas, avaliao qualitativa
+ OBJETIVAMENTE
variveis contnuas, avaliao quantitativa

CAUSAS INTERVENIENTES
EXPOSIO AO XENOBIONTE
FATORES AMBIENTAIS
BITICOS (interaes)
E ABITICOS (fsico-qumicos)
FATORES BIOLGICOS INTRNSECOS (ORGANISMO)

ESPECIFICIDADE DE UM BIOMARCADOR:
RELAES DE CAUSA-EFEITO
EFEITO:
RESPOSTA
BIOLGICA
CAUSA x
CAUSA z
XENOBIONTE
CAUSA y
CONJUNTAMENTE SUFICIENTES
SEPARADAMENTE
NECESSRIAS
RECIPROCIDADE
DEDUTIVA

DA OCORRNCIA DE CADA CAUSA ISOLADA,
INFERE-SE O EFEITO E VICE-VERSA

CONEXO LGICA UNIVERSAL QUE TORNA O
TEMPO PRESCINDVEL,
PODENDO ESTE SER SUPRIMIDO

SISTEMA LGICO FECHADO:
LEI BIOLGICA DE PROCESSO

ESPECIFICIDADE DE UM BIOMARCADOR:
RELAES DE CAUSA-EFEITO
EFEITO:
RESPOSTA
BIOLGICA
CAUSA x
CAUSA z
XENOBIONTE
CAUSA y
DAS CAUSAS,
INFERE-SE O EFEITO
CONJUNTAMENTE SUFICIENTES
CAUSAS CONTINGENTES
ESPECIFICIDADE DE UM BIOMARCADOR:
RELAES DE CAUSA-EFEITO
EFEITO:
RESPOSTA
BIOLGICA
CAUSA x
CAUSA z
XENOBIONTE
CAUSA y
SEPARADAMENTE
NECESSRIAS
CAUSAS NECESSRIAS DESCONHECIDAS
DO EFEITO, INFERE-SE
A CAUSA
Pb
++

EFEITO:
INIBIO
DA o-ALAd
RESPOSTA BIOLGICA CANDIDATA BIOMARCADOR
CONDIES SINE QUA NON OU REQUISITOS:

O MECANISMO QUE ESTABELECE AS RELAES DE CAUSA-EFEITO
ENTRE A RESPOSTA BIOLGICA E A EXPOSIO AO POLUENTE DEVE SER
BEM COMPREENDIDO E ESTABELECIDO, BEM COMO AS RELAES ENTRE
DOSES, CONCENTRAES E TEMPO DE EXPOSIO E O EFEITO
OBSERVADO.

OS FATORES INTERVENIENTES NA RESPOSTA OBTIDA POR UM
BIOMARCADOR (VALIDADE DO TESTE) DEVEM SER CONHECIDOS E
BEM ESTABELECIDOS.

O BIOMARCADOR (RESPOSTA) DEVE SER SENSVEL EXPOSIO DE
POLUENTE(S) DE FORMA A SERVIR COMO PARMETRO DE RESPOSTA
PREMATURA DE ADVERTNCIA: EFEITOS SUBLETAIS PR-CLNICOS

RESPOSTA BIOLGICA CANDIDATA BIOMARCADOR
CONDIES SINE QUA NON OU REQUISITOS:

O SIGNIFICADO TOXICOLGICO DO BIOMARCADOR DEVE SER EVIDENTE:
RELAO ENTRE RESPOSTA OBTIDA E OS EFEITOS (ADVERSOS) CAUSADOS
AO ORGANISMO

INFORMAES BSICAS SOBRE O BIOMARCADOR (padronizao para cada
espcie, quais os processos biolgicos pertinentes) DEVEM SUPORTAR A
DISTINO ENTRE A RESPOSTA DEVIDA VARIABILIDADE NATURAL
(RUDO) OU AO XENOBIONTE (SINAL)

O ENSAIO LABORATORIAL (TESTE) DEVE TER QUALIDADE ASSEGURADA
E SER BARATO, RPIDO E RELATIVAMENTE FCIL DE SER REALIZADO,
COM BOAS CONDIES DE REPRODUTIBILIDADE
EXTRAPOLAO DE RESULTADOS OBTIDOS
EM LABORATRIO PARA CONDIES REAIS DE CAMPO

MUITO DIFCIL DEVENDO SER FEITO COM CAUTELA E RESTRIES
LAB.: CONDIES AMBIENTAIS CONTROLADAS e MONITORADAS
PADRONIZAO DE METODOLOGIAS:
CUMPREM-SE OS REQUISITOS ??
ADAPTAO E VALIDAO (BIOENSAIO) DO TESTE
TESTE COM ssp DO TERRITRIO NACIONAL
INVESTIGAO COMPLETA EM NVEL INDIVIDUAL (ORGANISMO)
________________________________________________________
ESTUDOS DE CAMPO EM REAS IMPACTADAS

EIA/RIMA: LEVANTAMENTO DE spp
MONITORAMENTO (dados analticos de poluentes)
BIOMONITORAMENTO com uso de BIOMARCADORES
estudo de VARIAES SAZONAIS
estudo de VARIAES ENTRE =s POPULAES de 1 ESPCIE
BIOENSAIOS IN SITU
LEGISLAO AMBIENTAL BRASILEIRA
FALHA E ESTTICA !!!

LIMITES PERMISSVEIS ESTABELECIDOS
PARMETROS ANALTICOS PADRONIZADOS
TESTES DE TOXICIDADE IMPORTADOS

ESPECIAO DE METAIS
EM SOLUO AQUOSA

TWISS et alii, 2001