PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION BACTERIANA. SISTEMAS MANUALES Y AUTOMATICOS. ULTIMAS TENDENCIAS DE IDENTIFICACION . 1.- INTRODUCCION. 2.- ENSAYOS BIOQUIMICOS 2.1.

- COMERCIALES 2.2.CLASIFICACION DE PRUEBAS PARA IDENTIFICACION BACTERIANA 2.2.1.- DEFINICION Y LECTURA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACION BACTERIANA. 2.2.1.1.- CATALASA 2.2.1.2.- PRUEBA DE COAGULASA. 2.2.1.3.- HIDRLISIS AL HIPURATO. 2.2.1.4.- TOLERANCIA A SAL. BILIS-ESCULINA 2.2.1.5.- AGAR DNAsa. 2.2.1.6.- AGAR MANITOL. 2.2.1.7.- OXIDASA 2.2.1.8 .- ROJO DE METILO 2.2.1. 9.- AGAR CITRATO 2.2.1.10.- FENILALANIN DEAMINASA 2.2.1.11.- DESCARBOXILACION LISINA. 2.2.1.12.- INDOL 2.2.1.13.- LACTOSA 2.2.1.14.- MANITOL, MOVILIDAD, NITRATOS 2.2.1.15.- UREASA 2.2.1.16.- AGAR HIERRO KLIEGER (KIA). 2.2.1.17.- AGAR AZUCAR TRIPLE HIERRO (TSI). 2.3.- IDENTIFICACION AUTOMATICA Y SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA. 2.4.IDENTIFICACION SEMIAUTOMATICA BACTERINA (SISTEMA API).

1.- INTRODUCCION. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. Los pasos a seguir para un perfecta identificacin bacteriana son: obtener un cultivo puro examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. realizacin de pruebas primarias (Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.) . A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el nmero o letra del antgeno correspondiente. En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. Tambin se pueden utilizar mtodos de cromatografa gaseosa para identificar productos metablicos, en particular para la identificacin de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: Yersinia entercoltica 4 03 gnero especie biotipo serotipo 2

2.- ENSAYOS BIOQUIMICOS 2.1.- COMERCIALES La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales ms comnmente usados son : BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas. OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas bioqumicas.

API (Biomerieux) Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram negativos. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana. Existen distintos equipos, que identifican cada bacteria, entre ellos tenemos: API 20 E, bacilos gram negativos fermentadores de glucosa, BGNFG (Enterrobacterias) API 20 NE, bacilos gram negativos no fermentadores de glucosa , BGNNFG ( No enterobaterias). API C, versin para Candida spp. API 10S, versin minimizada de API 20E. API NH, versin para Neiseria spp y Haemophilus spp. En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica: cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. en todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. 2.2.- CLASIFICACION DE PRUEBAS PARA IDENTIFICACION BACTERIANA Para llevar a cabo una perfecta identificacin bacteriana, hay que llevar a cabo una serie de pruebas como las que siguen: enzimas vinculadas con la respiracin oxidasa catalasa descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros requerimientos de oxgeno 4

o OF (xido-fermentacin) o crecimiento en caldo tioglicolato produccin de cido, o cido y gas fermentacin de carbohidratos deteccin de enzimas y vas metablicas RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) Gluconato O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico) Esculina Hipurato fuente nica de carbono citrato malonato hipurato para coliformes utilizacin de compuestos nitrogenados reduccin de nitrato o asimilacin o denitrificacin descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros o indol o H 2S o fenilalanina o lisina, arginina, ornitina o urea ensayos combinados TSI (Triple Azcar Hierro) LIA (Agar Hierro Lisina) Bilis esculina deteccin de exoenzimas lecitinasa proteasas, coagulasa amilasas celulasas desoxirribonucleasas accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) miscelneos KCN Bilis produccin de pigmentos test de crecimiento o inhibicin temperatura NaCl antibiticos 2.2.1.- DEFINICION Y LECTURA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACION BACTERIANA.

2.2.1.1.- CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus spp. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: Mtodo del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Mtodo del tubo de ensayo: agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro densamente inoculado. observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo 2.2.1.2.- PRUEBA DE COAGULASA. Se emplea para determinar si el Estafilcoco es (+), Staphylococcus aureus. o negativo denominandose estafilcoco coagulasa negativo. Este genero produce una proteina, denominada coagulasa, capaz de aglutinar el plasma que previamente se ha tratado con oxalato, citrato, EDTA o heparina y que esta en presencia de un factor contenido en el suero. La prueba se realiza generalmente en tubo, y la mezcla se incuba a 37 C durante cuatro horas, considerndose positivo ante una coagulacin , en caso de

negatividad el tubo se deja a temperatura ambiente durante 24 horas y se repite de nuevo la lectura del mismo modo. 2.2.1.3.- HIDRLISIS AL HIPURATO. Se emplea en la determiancin de estreptococos capaces de hidrolizar este sustrato mediante una enzima denominada hipuricasa. Como revelador de este prueba se emplea la nirhidrina que al combinarse con los aminocidos presentes da lugar a un producto de color prpura. 2.2.1.4.- TOLERANCIA A SAL. BILIS-ESCULINA Ambas prueba se emplean para la determinacin de estreptocos, la primera consiste en inocular en un medio liquido y alta concentracin de sal (6,5 %) el estreptococo a identificar. Se incuba durante 24 horas a 35 C y se considera positivo cuando hay un viraje del tubo a violeta o hay presencia de crecimiento (liquido turbio). La segunda prueba se emplea como medio diferencial para enterococos y se recomienda para el aislamiento y la identificacin presuntiva de estreptococos del grupo D. La presencia de bilis de buey no inhibe el crecimiento de los enterocos del grupo D, pero si del resto de las bacterias Gram positivas. A su vez, en este medio biliar, todas las cepas del grupo D, son resistentes al calor, toleran la bilis e hidrolizan la esculina, ponindose de manifiesto por coloracin negro-pardusca que toma el cultivo. 2.2.1.5.- AGAR DNAsa. Se emplea para determinar la actividad de la desoxirribonulceasa demicroorganismos principalmente de los estafilococos. Los microorganismos que se siembran en este medio degradan el ADN que contiene, dando lugar a unas zonas de transparencia alrededor de las zonas sembradas, despus de inundar la placa con HCl 0,1N, mientras que esto no produce si no hay produccin de DNAsa. 2.2.1.6.- AGAR MANITOL. Se emplea para el aislamiento selectivo estafilococos de Staphylococcus aureus, el aspecto del medio es blanco y opaco, contiene 5,5% de cloruro sdico confirindole un carcter selectivo. La placa se inocula y se incuba durante 24 horas a 35C, la presencia de colonias de color amarillo o anaranjada rodeada de un halo transparente es indicativo de esta bacteria. 2.2.1.7.- OXIDASA Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de 7

electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asmismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de Neisseria (+) diferenciar Pseudomonas spp de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso, la realizacin de la prueba presenta dos variantes: Mtodo en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Mtodo indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos. 2.2.1.8 ROJO DE METILO Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos: Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos 8

frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella spp Enterobacter spp (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico. Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30C durante un periodo de 3 das como mnimo y 5 como mximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirn para cada uno de los ensayos. Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Voges-Proskauer: A la otra porcin de cultivo se le aade: 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin alguna. 2.2.1. 9.- AGAR CITRATO Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacte rspp, Klebsiella spp , Serrato spp , Citrobacte spp r y algunas especies de Salmonella spp. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, 9

junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. 2.2.1.10.- FENILALANIN DEAMINASA Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus spp y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias. Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado. 2.2.1.11.- DESCARBOXILACION LISINA. Se realiza en tubo (caldo o slido) y se emplea para la identificacin de enterobacterias, cuando estas se proceden a su cultivo fermenta la glucosa y el medio del pH disminuir. A partir de aqu, si son capaces de realizar la descarboxilacion de L-lisina por la produccin de la descarboxilasa el pH volver a aumentar y en presencia de un indicador como el prpura de bromocresol, los tubos inoculados positivos tomaran un color prpura o violeta mientras que los negativos sern de color amarillo. Existe una variante que consiste que en el medio slido se adiciona hierro (agar lisina hierro) capaces sulfuro ferrroso obsrvndose un precipitado negro. Adems pueden aparecer burbujas de gas con lo que el medio se puede desplazarpara Se utiliza para diferenciar Salmonella spp de Proteus spp, 2.2.1.12.- INDOL Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs, cuyos componentes son los siguientes: Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico) p-dimetilamino-benzaldehdo HCl (concentrado) Se disuelve primero el aldehdo en el alcohol y despus se agrega lentamente a esta mezcla el cido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms 10

convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella spp (indol-). Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porcin de unos 2ml que se retira de l aspticamente. 2.2.1.13.- LACTOSA Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los colifomes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis, sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias lactosa (-). 2.2.1.14.- MANITOL, MOVILIDAD, NITRATOS Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioqumicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un nico medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado. Prueba del Manitol Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las 11

enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). Prueba de la Movilidad Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles. El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma lnea de la picadura en que se sembraron. Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella spp (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus spp, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+). Prueba de la reduccin de nitratos Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos despus de su incubacin se aaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretacin final. Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre s determinadas bacterias de los gneros Haemophilus spp y Neisseria spp . 2.2.1.15.-UREASA Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar

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el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus spp vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin. 2.2.1.16.- AGAR HIERRO KLIEGER (KIA). Se utiliza este medio en lengeta para la diferenciacin de los bacilos entricos gram-negativos segn la fermentacin de dos azucares (glucosa y lactosa) y la produccin del sulfuro de hidrogeno. La acidificacin del medio a causa del proceso de fermentacin se pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que solo fermentan la glucosa (Salmonella spp y Shigella spp ) que se encuentra a una concentracin 10 veces inferior a la lactosa, si bien producen viraje a amarillo, este solo se produce en la parte vertical, mientras que la superficie inclinada restablece el color rojo por oxidacin del cido. El color amarillo obtenido en la acidificacin del medio, producida por la fermentacin de la lactosa, es persistente. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar sulfuro ferroso, presentan un precipitado negro. La produccin de gas se observa por la formacin de burbujas e incluso por la rotura del medio. La incubacin se realiza durante 24 horas a 35C realizndose la lectura correspondiente a la fermentacin/oxidacin de los azcares, presencia/ausencia de sulfuro ferrroso y presencia/ausencia de gas 2.2.1.17.- AGAR AZUCAR TRIPLE HIERRO (TSI). Este medio de identificacin es anlogo al anterior, pero se le aade un tercer azcar teniendo pues glucosa (10 veces menos concentracin que lactosa), sacarosa y lactosa LECTURA TSI (AGAR TRIPLE HIERRO) GENERO S. INCLINADA FONDO GAS Escherichia A A + Shigella K A Salmonella K A + Citrobacter A A + Klebsiella A A + Enterobacter A A Serratia A A Hafnia A A Proteus K A + Yersinia K A -

SH2 + + + + + + -

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(A) : amarillo, acidificacin del medio (K): rojo,no acidificacin del medio.

MEDIO CITRATO

SIEMBRA PICADURA Y ESTRIA ESTRIA ESTRIA MEDIO LIQUIDO MEDIO LIQUIDO

UREA FENILALANINA DEAMINASA INDOL

LISINA DESCARBOXILAS A MANITOL MOVILIDAD

TSI

SEMISOLID O PICADURA PICADURA 35 -37C, Y ESTRIA 24 h.oras Lactosa-sacarosa Glucosa Gas SH2

INCUBACI ON 35 -37C, 18-24 h.oras 35 -37C, 24 h.oras 35 -37C, 24 horas (1) 35 -37C, 24 h.oras (2) 35 -37C, 24 h.oras (3) 35 -37C, 24 h.oras

LECTURA + azul

LECTURA verde

rosa Verde Anillo rosa

crema Amarillo Anillo amarillo Amarillo Rojo No difusin

Purpura Amarillo Difusin

Amarillo Amarillo Ennegrecimi ento Produccin burbujas

Rojo Rojo No ennegrecimi ento No produccin burbujas

La lectura de los tubos de TSI o KIA, se realizan mediante cuatro dgitos, cada uno de los cuales corresponde a la lectura positiva o no de la reaccin, por ejemplo: Escherichia coli AA10 : Amarillo superficie Amarillo fondo No produce gas No produce sulfhdrico Proteus spp KA11: Rojo en superficie Amarillo fondo Produce gas (burbujas)

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 Produce sulfhdrico ( ennegrecimiento del medio, por lo que no se puede ver el fondo del tubo) Shigella spp KA00 Rojo en superficie Amarillo fondo No produce gas No produce sulfhdrico ( se observa el color amarillo del fondo) La nomenclatura en la lectura de los tubos, se puede modificar en los dos ltimos dgitos, modificando el (1) y (0) por (+) y () respectivamente, quedando: E.coli AA10 es igual AA+ 2.3.- IDENTIFICACION BACTERIANA. AUTOMATICA Y SUSCEPTIBILIDAD

Hoy en da, en el mercado existen dispositivos automticos capaces de identificar automticamente al microorganismo (gram positivo, gram negativos y levaduras) as como la concentracin mnima inhibitoria (CMI), entre estos dispositivos tenemos: VITEK 2 (Biomerieaux) MICROSCAN ( Dade-Diagnostics) Ambos sistemas, empelan una tecnologa de fluorescencia para la deteccin del metabolismo bacteriano y un test de sensibilidad al microorganismo, basado en el principio de curvas de crecimiento cintico segn el patrn fenotpico de resistencia, adems se le puede asociar una deteccin rpida de alto nivel que proporciona datos fiables y rpidos que ayudan al clnico en el tratamiento de pacientes con infecciones. Independientemente de la utilizacin de uno u otro equipo, ambos constan del siguiente aparataje: consola satlite, en la cual se identifica la placa correspondiente de lectura, en la cual se ha inoculado el microorganismo correspondiente. mdulo de incubacin-anlisis, en el cual se efectan las lecturas correspondientes. Se pueden realizar mltiples incubaciones de distintas cepas, atendiendo al volumen del mdulo ordenador software de anlisis y deteccin del microorganismo microplacas de lectura ( 80 o 64 pocillos dependiendo del sistema utilizado), en ellas se tienen tanto las pruebas bioqumicas para identificar al germen y las concentraciones de antibiticos distintas con las que se le enfrenta. Estas se tiene que conservar en lugar refrigerado.

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el procedimiento se puede resumir del siguiente modo:

Tincin de Gram Aislamiento de la bacteria Preparacin de inculo bacteriano 0,5 escala de Mc Farland

Lectura de los datos bioqumicos y cintica bacteriana cada 4 horas

Incubacin de microplaca 35-37C, 24 horas

Inoculacin en la microplaca correspondiente (G+, G-, levaduras)

Salida de informe previa comprobacin del analista

2.4.IDENTIFICACION (SISTEMA API).

SEMIAUTOMATICA

BACTERIANA

El sistema API es un sistema estandarizado que permite la identificacin de cepas bacterianas (G+ y G-) y levaduras (auxonograma) mediante test bioquimicos miniaturizados. El test consiste en 20 microtubos (API20) o 10 microtubos (API 10) que contienen los sustratos deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensin bacteriana que reconstituye los test. Las reacciones producidas durante el periodo de incubacin se traducen en cambios de color (perceptibles o en presencia de reactivos que delatan el color) o presencia de turbidez. La identificacin de la bacteria se realiza mediante un cdigo de 7 dgitos utilizando una tabla de lectura, catalogo analtico o del software de identificacin. El procedimiento sera el siguiente:
Preparacin de inculo bacteriano 0,5 escala de Mc Farland

Tincin de Gram

Aislamiento de la bacteria

Revelar los pocillos correspondientes(*), lectura e interpretacin mediante el catlogo

Incubacin de galeria 35-37C, 24 horas

Inoculacin en la galeria correspondiente (G+, G-, levaduras)

Salida de informe previa comprobacin del analista

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