MTODO DE DETERMINAO DA VIABILIDADE CELULAR DE LEVEDURAS

No existe um mtodo absoluto para determinao da viabilidade celular de uma populao de clulas de levedura. Para estimar a proporo de clulas viveis em uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou na observao microscpica tm sido usados. Entretanto, at o momento no existe um mtodo que fornea resultados totalmente seguros na determinao da viabilidade celular. No controle da viabilidade celular nos processos de produo de levedura (fermento prensado) e fermentao alcolica, a colorao das clulas da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento so os mais empregados. Devido s facilidades e a rapidez da anlise, nas indstrias de produo de lcool o emprego de eritrosina o mais indicado. Na determinao da viabilidade atravs do uso de eritrosina a porcentagem ou o nmero de clulas viveis por mililitro determinado transferindo-se uma amostra j colorida para a cmara de Neubauer. Nesta so contadas as clulas incolores e as coloridas de rosa, utilizando-se a objetiva de imerso (100x). Devem ser contadas entre 300 a 500 clulas por cmara, o que regulado pela diluio adequada da amostra. Para maior preciso da anlise, a diluio da amostra deve ser tal que no se tenha mais que 1250 clulas por cmara, e, no menos que 100 retculos da cmara (os retculos centrais de cada quadrculo) sejam contados.

1 - Tcnica de Colorao com Eritrosina

1.1 - Preparo das Solues

Soluo estoque de Eritrosina - Pesar 0,1 g de eritrosina. - Dissolver em 10,0 mL de gua destilada esterilizada. Conservar a soluo estoque em frasco mbar fora do alcance da luz e em refrigerador. Validade: 8 meses desde que armazenada protegida da luz e sob refrigerao.

Soluo Tampo de Fosfato - Pesar 17,90 g de Na2HPO4;

- Dissolver em 250,0 mL de gua destilada esterilizada (soluo A);. - Pesar 6,89 g de NaH2PO4; - Dissolver em 250,0 ml de gua destilada esterilizada (soluo B); - Misturar as solues A e B; - Transferir a soluo para um frasco plstico e conservar sob refrigerao; Validade: 8 meses desde que armazenada sob refrigerao.

Observao: Para o uso da soluo tampo deve-se retirar o frasco do refrigerador e aguardar que o mesmo atinja a temperatura ambiente.

Soluo de trabalho - Misturar 0,1 mL da soluo estoque de eritrosina para cada 5,0 mL do tampo fosfato; - Preparar um volume da soluo de trabalho que seja suficiente para uso durante uma semana. Conserv-la fora do alcance da luz; - Recomenda-se que uma poro dessa soluo, suficiente para um dia de trabalho, seja transferida para um tubo de ensaio; - Caso, ao final da jornada, no se utilizar todo o volume preparado, o restante dever ser descartado para evitar contaminaes.

Observao: Solues descartadas. que apresentem contaminaes devem ser imediatamente

1.2 - Procedimento analtico

Aps a coleta da amostra de vinho bruto e/ou creme de levedura, proceder da seguinte maneira: - Homogeneizar a amostra - Transferir uma alquota da amostra (3 - 5 mL) para um tubo de ensaio; - Adicionar papana a amostra;

- Homogeneizar em agitador para tubos; - Deixar em repouso durante 5 min; - Homogeneizar em agitador para tubos; - Diluir a amostra com gua destilada (a diluio realizada para que o nmero de clulas seja adequado para a faixa de maior preciso da metodologia); - Transferir 1 mL da amostra diluda para outro tubo de ensaio; - Transferir 1 ml da soluo de trabalho de eritrosina para o tubo de ensaio que contm 1 mL da amostra diluda; - Homogeneizar em agitador para tubos; - Preparar a cmara de Neubauer, cobrindo a superfcie espelhada com uma lmnula 24x24 mm - Transferir um volume suficiente da soluo (amostra + corante) para cobrir a rea da cmara de Neubauer. - Contar, utilizando a objetiva de imerso (100X), as clulas presentes nos quatro retculos centrais dos 25 quadrculos;

Observao: A contagem utilizando a objetiva de imerso (100X) permite uma observao mais precisa das clulas da levedura quanto a sua estrutura celular. Especificaes da cmara de NEUBAUER - Profundidade: 0,1 mm - Nmero de quadrculos: 25 - Nmero de retculos em cada quadrculo: 16 - Nmero de retculos em cada cmara: 400 - rea do retculo: 0,0025 mm2 - Volume de lquido em cada retculo: 0,00025 mm3 - Volume total da cmara: 0,1 mm3. Preparo das solues

1.3 - Clculos

1) Viabilidade celular

A viabilidade celular indica a porcentagem de clulas em atividade na populao de leveduras da amostra considerada. Total de clulas viveis % Cel. viveis = __________________________ x 100 Total cel. viveis + no viveis

2) Contagem de clulas em brotamento

Indica a percentagem de leveduras em atividade que esto se multiplicando

Total de cel. viveis em brotamento % Brotamento = ________________________________- x 100 Total de clulas viveis

3) Populao de Leveduras

Total de cel. viveis x 4000 Populao leveduras/mL = __________________________ x 1000 x D Total de retculos contados

Onde: D = diluio final

2 - Plaqueamento

Nessa tcnica, uma quantidade conhecida de inculo colocada numa placa de Petri, seguindo-se a adio de gar Padro para Contagem. Admite-se que cada microrganismo vivel cresce e multiplica-se, dando origem a uma massa visvel - uma colnia - ou seja, cada organismo d origem a uma colnia. Dessa forma, atravs do nmero de colnias formadas pode-se saber o nmero de microrganismos viveis no inculo.

A amostra original diluda vrias vezes para que o nmero de colnias presentes na placa fique compreendido entre 30 e 300. Dentro desse limites a contagem pode ser precisa e a possibilidade de interferncia do crescimento de um microrganismo com o de outro mnima. As colnias so contadas contra um fundo escuro ou no contador de colnias. A tcnica de contagem em placas baseada no princpio de que cada organismo vivel formar uma colnia e, alm disso, admite-se que a suspenso microbiana seja homognea e que no existam agregados de clulas. Obviamente, os nicos microrganismos que podero ser contados sero aqueles que puderem crescer no meio utilizado e sob as condies de incubao adotadas (tempo, temperatura, etc.). Esse fato pode ser muito importante no caso da contagem de uma mistura de microrganismos. A tcnica de contagem em placas apresenta como vantagens o fato de ser de fcil realizao; alm disso, mede populaes de qualquer grandeza em virtude das vrias diluies realizadas e apresenta sensibilidade para a deteco de populaes muito pequenas.

2.1 - Plaqueamento em Profundidade

2.1.1 - Procedimento

- Preparar as diluies necessrias, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5. Transferir 10 mL de cada diluio para tubos de ensaio contendo 90 mL de soluo salina peptonada e homogeneizar.

Figura 1 Esquema das diluies sucessivas

- Distribuir 1,0 mL de cada diluio no centro de placas de Petri estreis adicionando-se cerca de 15 mL de gar Padro para contagem fundido. Homogeneizar e resfriar a 45 C. Aps solidificao do meio inverter as placas; - Incubar as placas invertidas a 361 C por 48 horas. Observao: Recomenda-se que a contagem padro em placas seja realizada com, no mnimo, duas placas para cada diluio.

2.1.2 - Resultados

- Sero consideradas significativas apresentarem entre 30 e 300 colnias;

as

contagens

das

diluies

que

- Para calcular o nmero de unidade formadora de colnia (UFC) por grama do produto, multiplicar o nmero significativo encontrado pelo fator de diluio correspondente.

- Para contagens em duplicata, na obteno dos resultados, utilizar a mdia aritmtica das contagens nas placas que apresentarem entre 30 e 300 colnias. - Leituras abaixo de 30 colnias na menor diluio (10 -1), expressar como Abaixo de 300 UFC/grama. - Ausncia de crescimento em 10-1, expressar como Abaixo de 10 UFC/grama. - Leituras acima de 300 colnias na maior diluio expressar como Maior que 300 x 104 UFC/grama.

2.2 Plaqueamento em Superfcie Adicionar o meio de cultura a uma placa de Petri ( o suficiente para cobrir todo o fundo da placa) e esperar solidificar. Com uma pipeta previamente esterilizada, inocular sobre o meio de cultura 0,1mL do inculo e espalhar com o auxilio de uma ala de Drigalski. Incubar as placas a 361 C por 48 horas. Realizar a leitura como descrito no mtodo de plaqueamento em profundidade. O mtodo limita o volume inoculado a 0,1mL da amostra ou suas diluies, mas permite uma melhor visualizao das caractersticas das colnias na superfcie, alm de facilitar sua transferncia para outros meios de cultura.

Ateno:

Diluies Sucessivas (Diluies em srie) Objetivos Obter solues de amostra com concentraes conhecidas Obter amostra com nmero de micro-organismos que possa ser detectado pelo mtodo de anlise Material Erlenmeyer contendo

Pipetas bacteriolgicas de 10 mL com graduao decimal; Tubos de ensaio contendo 90 mL de soluo salina peptonada. Procedimento Como apresentado na figura 1