TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

Dr. Daniel Alarcn Cano

CONCEPTOS
GENMICA: Es la ciencia o conjunto de ciencias y tcnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, la evolucin y el origen del Genoma. PROTEMICA: Puede definirse como genmica funcional a nivel de protenas, estudia la correlacin entre las protenas y sus genes.

Qu molculas hay en una clula?

Protena

ARN

ADN

Estudio del ADN

Protena

ARN

ADN

Ingeniera gentica (tecnologa del ADN recombinante)

Conjunto de tcnicas y tecnologas que permiten manipular la informacin gentica de distintos organismos
Permite aislar un gen de un organismo para su posterior manipulacin e insercin en otro ADN diferente, logrando que un organismo produzca una protena nueva para el. (Ejemplo: Insulina)

Hibridacin
Puentes hidrgeno 1M Urea (desnaturalizacin qumica) 90C (desnaturalizacin trmica) Renaturalizacin (Hibridacin) Dilisis Descenso lento de la temp.

ADN o ARN desnaturalizado Hbrido Zona no complementaria

Astringencia
Es una caracterstica del medio que hace que 2 cadenas de cido nuclico necesiten una mayor homologa para poder hibridizar Es mayor cuanto mayor es: Temperatura Concentracin salina (NaCl) pH

Enzimas de Restriccin
70s descubrimiento de las Enzimas de restriccin (Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith- 1978 premio Novel)

Sistema bacteriano de defensa antiviral?

Endonucleasas de DNA que reconocen y cortan dentro de zonas palindrmicas especficas de 4 o 10 nt. (la mayora)
palndrome: (dbale arroz a la zorra el abad), (La ruta nos aporto otro paso natural)

Tipos de fragmentos de restriccin

EcoRI Sticky ends 5 protruyentes Ext.cohesivos 5 protruyentes 5 3 G 5 AATTC CTTAA G 3 HhaI Sticky ends 3 protruyentes Ext.cohesivos 3 protruyentes 5 3 5GCG C C 3C GCG GCG HpaI Blunt ends extremos romos 5 3 AAC 5GTTAAC CAATTG TTG 3 EcoRI G AATTC 3 CTTAA G 5 HhaI GCG 3 GCG C C C GCG 5 HpaI GTT 3 GTT AAC CAA 5 CAA TTG

Ligacin
nick G AATTC GAATTC

CTTAA G CTTAAG nick

Clonado de genes
Vectores
plsmido Restriccin parcial (cond. Subptimas)
AATTC G
AATTC G AATTC G

G CTTAA AATTC G G CTTAA

G CTTAA AATTC G G CTTAA G CTTAA

Restriccin completa (cond. ptimas)

TTAA AATT

G CTTAA AATTC G

Hibridacin y ligacin Inserto

Clonado de genes
Bacterias Competentes

Transformacin de bacterias
LB-agar+antibitico Incubacin ON a 37oC

Heat Shock 5 42oC inoculacin

LB-agar+antibitico

Incubacin ON a 37oC LB sin antibitico

Inoculacin en medio selectivo

Vectores de expresin eucariotas

origen de replicacin bacteriana

Marcador de seleccin eucariota

Sitio de reconocimiento de muchas enzimas de restriccin

Protena de fusin

Proteina Verde Fluorescente Seal de fin de transcripcin eucariota

Marcador de seleccin procariota

Transfeccin
Mtodo utilizado para introducir genes en clulas eucariotas superiores. Puede ser: Transient (transitoria): el vector queda como elemento episomal Estable: El vector se integra en algn cromosoma (evento aleatorio y poco frecuente => Requiere de marcador de seleccin) Mtodos ms usados CaCl2 se tratan las clulas con una mezcla de ADN y CaCl2. Baja eficiencia, pero muy barato Lipofeccin: Se incuban las clulas con un complejo ADN-Lpido catinico. El ms usado. Buena eficiencia, pero los lpidos son caros. Electroporacin: Se someten las clulas a un campo elctrico que les genera poros por donde puede entrar el ADN. Para las clulas que lo resisten tiene muy buenas eficiencia, pero es caro porque necesita un equipo especial. FuGene 6: Lo ltimo!! Es un reactivo de composicin secreta que tiene muy buena eficiencia de transfeccin.

Ensayos de Gene-reporters

1 2 3 4 5

Lumin-O-meter ACME

Separacin de molculas Cromatografa

Particin: slo para molculas pequeas. Se basa en la disolucin diferencial en distintos solventes. Se hace en capa delgada (TLC) o en papel.
migracin

En columna: Filtracin en gel => Sephadex Intercambio inico (aninico o catinico) Afinidad: Acs, Hormona / Receptor,

Fracciones

Separacin de molculas Electroforesis en gel.

Southern blot
E. M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508
El ADN se corta con enzimas de restriccin Los fragmentos de restriccin son sometidos a electrlisis en gel, se ordenan por tamao Lisis celular y purificacin ADN

El ADN se desnaturaoliza y transfiere a una membrana de nylon

La memb. se incuba con un fragmento de ADN radioactivo complementario al buscado (sonda)

Se realiza una autoradiografa: la radioactividad impacta una placa fotogrfica que al revelar muestra una banda

Secuenciacin de ADN
AACCGTAT TTGGCATA
dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddATP* DNAPol
AACCGTA TTGGCAT

dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddTTP * DNAPol

AACCGTA TTGGCAT

dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddCTP * DNAPol

AACCGTA TTGGCAT

dATP, dTTP, dCTP, dGTP ddGTP * DNAPol

AACCGTA TTGGCAT

Gel de secuencia => Poliacrilamida =>Mayor resolucin

EMSA (Gel Shift Assay)

FISH

FISH

PCR Reaccin en cadena de Polimerasa

PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa

Cadena desnaturalizada

Primers

especficos

Sntesis de ADN

ChIP

Microarrays

Microarrays

Basal like

Normal Her2+ Breast like

Luminal C Luminal B

Luminal A

Sorlie Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:10869

Sorlie et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 10869

Sorlie et al (2003) 100: 8418

Mammaprint

Estudio del ARN

ARN

ADN

Northern blot
Gel tenido con BrEt y mirado con UV 28 S

18 S

Membrana

Retrotranscripcion
Se utiliza la enzima Transcriptasa Reversa de las retrovirus que permite convertir ARN en ADN (llamado ADN copia o cDNA) Se le pueden hacer todas las tcnicas basadas en ADN Nos da mayor informacin

Estudio de las Proteinas

Protena

ARN

ADN

Western blot
Lisis celular Mezcla de prots de <> tamao y abundancia relativa Anticuerpos (Acs) Separacin electrofortica en gel Se incuba la membrana con Acs especficos contra la prot de inters

Las protenas se disponen de acuerdo a su tamao de forma descendente

Los Acs reconocen y se unen a la protena

Transferencia a membrana y tincin Se puede ver una banda a la altura donde qued cada una de las proteinas. El espesor de la banda es directamente proporcional a la abundancia de esa protena en el lisado original

Los Acs se detectan por incubacin con un 2 Ac acoplado a una enzima. dirigido contra el primero

Citometra de flujo

Citometra de flujo

Inmunofluorescencia

IHQ

Tissue microarray

Tissue microarray

Tissue microarray
4 2 0

Single marker on many samples Measurement of protein expression (also RNA in situ and FISH) New classification using supervised and unsupervised methods

Positivity score (0-4)

cyc D c-myc Bcl2 ER CK8/18 p27 PR Mcm2 MIB1 p53 C-erbB2 cyc E CK 5/6

Proteomics

Proteomics

Proyecto CMAP del NCI (Cancer Molecular Analysis Project)

Facilitar la identificacin y evaluacin de blancos moleculares Definir las secuencias de alteraciones genticas/ epigenticas que adquieren los tumores Manejar e integrar todos los datos disponibles

Definir los agentes teraputicos de utilidad para esos blancos