Recuentos de viables

El recuento directo al microscopio o el recuento electrnico proporcionan un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide slo las clulas vivas de una poblacin, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtracin, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas tcnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Recuentos de viables Recuento en placa Filtracin por membrana Nmero ms problable

Recuento en placa
Permite la determinacin de los microorganismos presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa o menos segn el caso. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimacin del recuento, y si es posible se repite hasta caer en las condiciones ptimas. Procedimiento: La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas, partiendo en general de 10 gramos de muestra para la primer dilucin, y tomando 1 mL de sta descargndolo en 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Cada vez que se prepara una dilucin se carga y descarga la pipeta tres veces, descargndola finalmente sobre el tubo con diluyente estril. Se descarta la pipeta luego de preparada cada dilucin. Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes . ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS, EN EL FONDO, CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificacin de la muestra: Nombre y/o Nmero de lote Dilucin Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador Siembra en superficie: Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones y se comienza por la ms diluda. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando rastrillo estril, en el mismo orden que la siembra (o sea de la ms diluda a la ms concentrada). Siembra incorporada: Se procede de la dilucin mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45C en bao o estufa. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario (4 veces o ms para polvos insolubles) y antihorario (4 veces) y movimiento hacia arriba y hacia abajo (siempre sin levantar la placa de la mesa). En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no ms de 2.5 mL por placa. Medio de cultivo: Se elige segn el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos.

Incubacin: Una vez enfriado el agar en el caso del incorporado, y secada la muestra en el caso de superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn los microorganismos a contar, incubndose el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente. Interpretacin: Finalizado el perodo de incubacin, observar con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partcula de muestra que pueda haber. Si molesta, borrar la escritura. Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms pequea. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma: Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Se hace el clculo promediando los valores y multiplicando por la inversa de la dilucin. Si slo hubiera placas con menos de 30 colonias, se informa igualmente el resultado, expresndolo por g o mL de muestra. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (segn sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor. Si en todas las placas hubiera ms de 300 colonias, se ESTIMA el resultado contando las colonias en una superficie conocida de la placa y luego llevando a la superficie total de la placa: 65 cm 2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico. Se siguen las siguientes reglas: 1) Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4 segn el tipo de placa, para estimar el nmero de colonias en toda la placa. 2) Si hay ms de 10 colonias por cm 2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 segn el tipo de placa. 3) Si hay ms de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como Mayor de 6500 o 5700 por placa. Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el factor de correccin para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al mtodo (incorporado o superficie), y a las diluciones plaqueadas. Es frecuente que desarrollen colonias extendidas, sobre la superficie, o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como uno. Cuando el spreader cubre ms del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si estn uniformemente distribudas. Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej: contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Para alimentos se utilizan los lmites de 25 a 250 ufc/placa.

Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se considera ptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la tcnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretacin de los resultados. Expresin de los resultados: Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Ej: 142 se informa 140 155 se informa 160 El informe debe decir: Recuento de microorganismos (tipo): X u.f.c. /g o mL Ventajas y desventajas de ambos mtodos:

Incorporado Mayor cantidad de muestra. Menor error Mejor aprovechamiento de nutrientes Dificultades al subcultivar colonias Visualizacin de colonias dificultada Temperatura del agar puede afectar Desarrollan microaerofilicos

Superficie Menor cantidad de muestra Mayor error Peor aprovechamiento de nutrientes Facilidad para subcultivar colonias incorporadas. Fcil visualizacin No se afectan las clulas termosensibles a ciertos microorganismos En aerobiosis slo crecen aerobios y

anaerobios facultativos

NUMERO MAS PROBABLE o METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores que se dejan crecer en medio lquido. Por ejemplo se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0.1 g. de muestra, en tres 0,01 g. y en los otros tres 0.001 g. Luego de la incubacin, se observan y cuenta el nmero de tubos positivos. Segn el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo, o medios de propagacin. En funcin de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que: a) hubo crecimiento b) hubo crecimiento y se produjo gas que se ve en campana invertida (Durham) c) hubo crecimiento y se produjo viraje de indicador d) hubo crecimiento y se produjo pigmento Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o sospechosos de serlo a placa, o a otro tubo a efectos de confirmarlo. El nmero (de tubos positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en l sembrada haba por lo menos 1 microorganismo de los que se est contando. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo 1: N de tubos sembrados: Volumen de muestra en c/u (mL): Nmero de tubos positivos: 5 5 5 0,1 0 (dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las siguientes)

10 1 2 0

De la tabla adecuada surge el valor: 5 en 100 mL Se informa: Nmero ms probable de (tipo de microorganismo) = 5/100mL Ejemplo 2: N de tubos sembrados: Volumen por tubo (mL) Dilucin de la muestra: Equivalente en gramos/tubo Tubos positivos 3 1 10-2 0.01 3 3 1 10-3 0.001 2 3 1 10-4 0.0001 0

El resultado 3-2-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 93/gramo, cuando en la primer serie de tubos se siembra 0.1 g, como en nuestro caso sembramos 0.01 gramos debe aplicarse el factor de correccin = 0.1/0.01 o sea 10 por lo que el resultado a informar es: NMP de (tipo de microorganismo) = 930/gramo

Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est construda para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual nmero de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean mltipo o submltiplo. La correccin se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un ndice de la carga microbiana, y se conocen los lmites de confianza para cada valor. Ventajas y desventajas del mtodo: Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni recomendable el de placas debido a la presencia de partculas. Se prefiere tambin este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.). Es posible enumerar tambin por este mtodo microorganismos anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA

Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o solucin en agua o en solvente apropiado (miristato de isopropilo) a travs de un filtro de membrana estril (dimetro 50 mm, poro 0.45 mm), colocado en un equipo de filtracin. Luego de enjuagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiologa se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofbicos, que minimizan la adsorcin de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo:

1) 2)

Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas. Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el nmero de

colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el area del cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro). 3) 4) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. Si hay ms de 20 se considera >2000 por filtro

Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: 1. Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volmenes de 100 y hasta 500 mL por vez. 2. Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos. Expresin de los resultados: Una vez conocido el nmero de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresndolo por gramo, o mililitro de muestra.

por Homogenizacin en Masa

Apartados de este ejercicio A. Introduccin B. Obtencin de diluciones seriadas C. Siembra de las placas D. Incubacin

Recuento en Placa

E. Recuento de las colonias F. Clculo y Presentacin de los resultados

A. Introduccin
Determinacin del nmero de microorganismos La medida del nmero de microorganismos en una muestra es una determinacin muy utilizada en microbiologa. Para ello se utilizan varios tipos de tcnicas. Algunas tcnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - como la turbidez, el peso seco, o una concreta actividad metablica - de la masa de clulas de una poblacin. Otras tcnicas son directas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico y los recuentos de viables.

Determinacin del nmero de microorganismos

Tcnicas indirectas

(Ver descripcin)

Tcnicas directas Recuentos de viables

Recuentos al microscopio (Ver descripcin) Recuento electrnico (Ver descripcin) Recuentos de viables

El recuento directo al microscopio o el recuento electrnico proporcionan un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide slo las clulas vivas de una poblacin, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). La tcnica mas utilizada en Microbiologa de los alimentos tanto para el recuento de viables como para la determinacin del nmero de microorganismos es el recuento en placa objeto de este ejercicio. La filtracin por membrana y la determinacin del nmero ms probable (NMP) son tambin recuentos de viables, aunque usados con menor frecuencia.

Recuentos de viables

Recuento en placa (Este ejercicio) Filtracin por membrana (Ver descripcin) Nmero ms probable (Ver descripcin)

Mtodos de Recuento en Placa Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidades conocidas de las mismas en placas de Petri. Evidentemente, alguna de las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa originar colonias separadas. De igual manera, conocidos el nmero de colonias, la cantidad sembrada y la dilucin correspondiente, esta tcnica permite calcular el nmero de microorganismos viables en la muestra original . Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: Unidades Formadoras de Colonias (UFC.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de recuento se dan cuando se desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa o menos si se trata de hongos (cuyas colonias son mayores que las de las bacterias). Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimacin del recuento, y si es posible se repiten las diluciones para conseguir una de ellas que al sembrar en placa produzca un nmero de colonias de entre 30 a 300. Existen 2 mtodos de recuento en placa segn el mtodo de siembra de la muestra: Siembra en superficie: Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo solidificado, 0.1 mL de la muestra o de cada dilucin. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estril. Se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidos vara segn el tipo de microorganismos) y pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido sobre la superficie del agar. Siembra incorporada u homogenizacin en masa: Se deposita 1 mL de la muestra o de cada dilucin en placas estriles, vacas. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 47C. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivn (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inculo con el agar. Se deja solidificar y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidos vara segn el tipo de microorganismos). Pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido dentro del agar (en la masa del agar).

B. Obtencin de diluciones seriadas

Se realizan diluciones decimales y seriadas del alimento.

La preparacin de la muestra se realiza utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas, partiendo en general de 10 gramos de muestra (y 90 mL de diluyente) para la primer dilucin, y tomando 1 mL de sta descargndolo en 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas. Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1.000 (10-3), 1:10.000 (10-4)

Mezclar mecnicamente o manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ngulo de abertura aproximado de 60 entre brazo y antebrazo.

C. Siembra de las placas mediante homogenizacin en masa

Transferir con una pipeta estril 1 mL de cada dilucin de la muestra a placas de Petri vacas y estriles. Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilucin. En la transferencia de las diluciones a las placas es posible emplear tan slo una pipeta si se comienza por la dilucin del factor de dilucin ms alto (la ms diluida). En caso contrario, habr que emplear una pipeta para cada dilucin.

Aadir unos 15-20 mL del medio de cultivo adecuado (segn el tipo de microorganismos de los que queremos hacer el recuento). En este mtodo el medio ha de ser siempre un medio slido (agar). En el momento de aadir el agar a las placas ste debe estar estril y encontrarse fundido y a una temperatura de unos 50C.

Homogenizar el agar con el inculo imprimiendo a la placa suaves movimientos circulares y de vaivn. Esperar a que el agar solidifique en las placas.

D. Incubacin

Incubar las placas a la temperatura necesaria y durante el tiempo necesario, siempre en posicin invertida.

E. Recuento de las colonias

Pasado el tiempo de incubacin examinar las placas. Las colonias aparecern en la masa del agar. Cada colonia representa los descendientes de una bacteria o, lo que es ms correcto, de una unidad formadora de colonia (UFC). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilucin que presenten un nmero de entre 30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una precisin estadstica suficiente y no es engorroso de hacer). Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lpiz graso a lo largo de los dimetros.

F. Clculo y Expresin de los resultados

El nmero de unidades formadoras de colonia o UFC/g de alimento original ser: Nmero de UFC/g = Nmero de colonias x factor de dilucin Tener en cuenta que en la expresin anterior "Nmero de colonias" = media del nmero de colonias contadas en cada una de las placas de la dilucin elegida "Factor dilucin" = inverso de la dilucin elegida

N= C x D
donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra. C= Nmero de colonias. D= Factor de dilucin.

Obtener el valor del recuento total de grmenes expresado de la siguiente manera: El informe debe decir: Recuento de microorganismos (tipo): N UFC /g o mL de alimento. Nota: La diferencia entre los resultados extremos de la determinacin efectuada por duplicado, no deber exceder del 10% de la media aritmtica de los 2 resultados; en caso contrario, debe repetirse el examen. Redondeo Cuando se dan los valores del recuento en placa (N) deben utilizarse nicamente dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dgitos primero y segundo (empezando por la izquierda) de la media de las colonias halladas. Los dgitos restantes tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado es de 523.000, este ha de darse como 520.000 (52 X 104) . Si el tercer dgito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le aade una unidad al segundo dgito (se redondea). Por ejemplo si el valor calculado es 83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 X 10 3). Cuando no se encuentran colonias en ninguna de las placas sembradas, expresar el recuento como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la dilucin ms concentrada. Ejemplos: *Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado ser: <1 X 10= <10 UFC/ g o mL de alimento. *Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-2, 10-3 , 10-4 y 10-5 y no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado ser: <1 X 102= <100 UFC/ g o mL de alimento. Cuando se encuentran ms de 300 colonias en todas las placas sembradas, expresar el recuento como superior a (>) 300 multiplicado por el factor de la dilucin ms diluida. Ejemplos: *Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y en todas las placas hay ms de 300 colonias el resultado ser: >300 X 104= >3000000 = 30 X 105 UFC/ g o mL de alimento.

*Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-2, 10-3 , 10-4 y 10-5 y en todas las placas hay ms de 300 colonias el resultado ser: >300 X 105= >30000000 = 30 X 106 UFC/ g o mL de alimento.