MICROBIOLOGIE ALIMENTARA

LUCRAREA PRACTICA 2

Ce am invatat in laboratorul 1
Ce este mediul de cultura? Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,27,4), sa asigure condiiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA

Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: - medii uzuale (obinuite) - pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni.
Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe;

- medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si

cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni.

o Ele mai pot fi sistematizate n medii: de izolare, de imbogatire,

selective, diferentiale;

Dupa starea lor fizica (consisten) mediile se pot imparti in: solide (geloza dreapt, nclinat, n plac), semisolide (n eprubete), lichide (repartizate n eprubete).

Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe.

MEDII DE CULTURA
Mediile de cultura folosite in laboratorul de microbiologie reprezinta substrate pentru cresterea, dezvoltarea, inmultirea si mentinerea microorganismelor. Mediile de cultura pot fi lichide sau solide, pot fi preparate din reactivi ind ividuali sau se pot obtine prin rehidratarea unei pulberi (medii deshidratate), care contine toti ingredientii necesari cresterii microorganismelor prezente in alimente. Dupa scopul utilizarii, mediile se pot imparti in medii simple sau de izolare si medii speciale (medii de imbogatire, medii elective, medii selective, medii diferentiale, medii de conservare sau de mentinere).

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA Cantarirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)

I
Dizolvarea si omogenizarea pulberii prin incalzire pana la fierbere

I
Corectarea pH-ului, in functie de specia care urmeaza a fi cultivata

I
Repartizarea mediului in baloane de sticla, eprubete sterile cu dop

I
Sterilizare la 1200C, 30 min

I
Depozitare la 40C

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA

Geloz simpl

Geloz simpl n coloan nclinat

Definiii

Cultivarea bacteriilor - creterea bacteriilor pe medii de cultur n condiii in vitro.

nsmnare - punerea n contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultur. Colonie bacteriana - aglomerare de bacterii vizibil cu ochiul liber, format din multiplicarea unei singure bacterii de pe mediul de cultur. Izolare - repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultur cu scopul de a obine cultur pur.

Cercetarea i identificarea bacteriilor pe medii de cultur

Identificarea unei bacterii nu se poate face dect dup ce este cultivat pe diferite medii nutritive - solide i lichide i este izolat n cultur pur. Pentru izolarea diferiilor germeni patogeni se fac nsmnri pe medii de cultura, precum si transplantari de germeni in stare pura - cu scopul meninerii lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie).

Reguli generale
In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere cteva reguli general valabile: nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului; n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului; ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.); nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant; n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosfer; imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fr a se omite data nsmnrii.

Tehnica nsamnarii
Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:

Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza nti pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaa cauterizata, facnd cteva miscari spre interior. Se scoate acul din si se face insamntarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facndu-se pe suprafaa acestuia miscari in zig-zag, incepnd de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara.

Tehnica nsamnarii

Cu poriuni de aliment. Cnd alimentul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic.

Tehnica transplantarilor
Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie). Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul). Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

Metode de nsmnare
Pe medii solide - nsmnare prin epuizare (se obin colonii izolate) - nsmnare n sector (se obin colonii confluente) - nsmnare prin nepare Pe medii lichide - omogenizarea unei colonii n mediu lichid
nsmnarea prin epuizare Obinerea culturii primare Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic. Se descarc ansa pe mediu de cultur: - se nsmneaz un prim sector [1]; - din primul sector nsmnat se traseaz cteva striuri paralele n sensul acelor de ceasornic [2]; - se continu nsmnarea prin striuri paralele [3], terminndu-se printr-un striu n zig-zag [4].

Metode de nsmnare
n ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel nct dup incubare se vor forma colonii izolate.

Metode de nsmnare

Metode de nsmnare
Obinerea culturii pure Se replic o singur colonie din cultura primar pe un mediu de cultur proaspt, fie prin epuizare, fie prin nsmnare n sector. nsmnarea n sector Pe o plac pot fi nsmnate mai multe specii bacteriene. Prin nsmnare n sector nu se obin colonii izolate! Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic. Se descarc ansa pe mediu de cultur sub forma unui sector de cerc.

Metode de nsmnare
nsmnarea pe medii n coloan nclinat - Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs. - Se descarc ansa pe partea nclinat a mediului de cultur sub forma unui striu. NU se obin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele.

Metode de nsmnare
nsmnarea prin nepare Se practic pentru nsmnarea mediilor solide turnate n coloan dreapt. Se ncarc acul de inoculare cu produs. Se neap mediul n direcie vertical pe o distan de din nlimea coloanei.
nsmnarea n mediu lichid Se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs. Se omogenizeaz produsul recoltat n mediul de cultur lichid.

Dup nsmnare, prin tehnic adecvat, pe mediu nutritiv solidificat n vase Petri sau lichid n tuburi, se asigur incubarea la termostat. Dup incubare, pe baza observaiilor zilnice, se noteaz: momentul apariiei coloniilor, gradul de uniformitate, forma coloniilor, aspectul suprafeei, aspectul marginii, profilul, culoarea, mrimea etc.

Morfologia coloniilor bacteriene

Informaiile despre caracterele coloniilor bacteriene obinute pe medii nutritive permit identificarea speciei cercetate.

Va
multumesc!