Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Bilgisayar teknolojisinin molekler biyolojiye paralel olarak hzla gelimesi , iki disiplini birbirine yaklatrmtr. Bylece ,biyoteknolojinin kavramsal olarak ulasabilecei son noktalardan biri olan gen ip (microarray) ortaya kmtr. Microarray tekniinin ilk giriimleri Shalon ve Schena tarafndan gerekletirilmitir. Molekler biyolojideki geleneksel metotlarda genellikle bir deneyde bir gen ilkesi geerlidir. Bu demektir ki gen fonksiyonlarnn btn resmini grmek geleneksel yntemlerle zordur. Gen ip teknolojisinin byk bir ilgi ile karlanmasnn sebebi , btn genomun basit bir ip zerinde grntlenmesini vaat etmesi ve bu sayede bilim adamlarnn ayn anda binlerce genin birbirleriyle olan etkileimlerini grmesine olanak tanmasdr. DNA microarrayi cam, plastik veya silikon ip gibi kat bir yzeye tutturularak sral bir ekilde (array) oluturulmu mikroskobik DNA spotlardr. Bir microarrayde bu spotlardan onbinlerce bulunabilir. Yzeye tutturulan bu DNA paralar (genellikle 20-100 nkleotid uzunluunda ) prob olarak tanmlanmtr. Microarray teknolojisi , DNAnn bir substrata balanp bilinen bir gen ya da fragment ile prob hazrlanmas eklinde tanmlanabilecek Southern Blotting tekniinden tretilmitir. Bu yeni teknikte membran yerine camn kullanlmas , radyoaktivitenin yerini fluoresan iaretlerin almas ve balanmay salayacak yntemlerin hassaslamasyla almalarn verimi ve elde edilen bilgilerin miktar artmtr.
ekil 1. Fotolitografi ynteminde , probun yzeyini normal artlar altnda geirmeyen bir madde (maske) kaplar. Hibridizasyondan sonra UV altnda hibridize olan blgeler bu maddeyi delerek kendilerini belli ederler , hibridize olmayan blgeler ise karanlkta kalr.
ekil 3. Stanford iplerinin DNA fragmentleri; genlerin PCR amplifikasyonuyla elde edilip, cam film zerine robotic spotting yntemiyle kusursuz bir ekilde yerletirilmesiyle elde edilir. PCR rnleri cam film zerine yaklak 2 cm2 bir alana noktacklar halinde yerletirilir. Her bir PCR rnnn yerletirildii blge ve ierdii DNA dizisi kesin olarak bellidir. Daha sonra slayt zerindeki DNA lar kurutulur (100 C de 2 sn ), sabitlenir (UV cross-linking), ve denatre edilerek tek zincirli hale getirilir (95 C de 2 dk ). Hazrlanan ipler, iaretlenmi cDNA fragmentleriyle balanmak zere kullanlrlar.
Gen array deneyleri tipik olarak farkl doku ya da koullardaki ya da bir uygulamadan sonraki gen ekspresyon dzeyini tayin etme amacyla kullanlr. Bu amala ncelikle allan konuya gre farkl dokular, koullar ya da zamanlar baz alnarak RNA izolasyonu yaplr. Bu RNA rnekleri seyraltilerek her bir rnein eit younlukta olmas salanr. Kural olarak, asl RNA populasyonundaki her mRNA molekl iin bu molecule komplementer olan tek iplikli iaretlenmi bir cDNA hazrlanr. Belli bir mRNAnn younluu arttka cDNA miktar da artar. Problar , genellikle, iaretli nkleotidlerin varlnda mRNAnn tek iplikli cDNAya reverse transkripsiypnu ile retilir. Bu nedenle, iaretli prob, aslnda mRNA populasyonunu temsil eden bir cDNA moleklleri populasyonudur. Tek iplikli bir prob oluturmak iin RNA, mRNAdaki polyA ucuna komplementer olan oligo dT primerleri, reverse transkriptaz ve iaretlenmi nkleotidler ieren bir reaksiyon karmna konur. Genellikle iaretlenmi nkleotidler Cy3 (yeil) ve Cy5 (krmz) gibi fluoresan iaretlerle ya da kimyasal luminescent saptama ile saptanabilen digoksijenin (DIG) ile etiketlenmitir. Ele alnan bir klondaki hibridizasyon miktar , ilgili gen iin bulunan mRNA miktarna karlk gelir.
Gen arrayi deneyleri bazen revers northerns olarak da adlandrlr. Northern blotda , RNA bir filtre zerine bir prob yardmyla blot edilir ve burada ama belli bir mRNA trn ayr bir bant ya da spot olarak tespit etmektir. Gen array hibridizasyonunda ise cDNAlar bir filtre ya da lam zerine spotlanr ve bir mRNA populasyonundan elde edilen bir prob yardmyla hibridize edlir. Bu tip almalar iin cDNAlar genellikle bir EST almas ile elde edilir. Arraylerde yaklak 500.000 kadar spot bulunabilmektedir. Her geen gn allan konulara zg array formatlar dizayn edilmektedir. Her bir probun iaret ile inkorporasyonu llr ve hepsinin younluunu eitlemek iin seyreltilirler. Genellikle, denenecek her bir prob iin birer kopya filtre ya da microarray hazrlanr. Problar her array ile ayr ayr hibridize edilir. Filtre arrayler prob ile inkube edilir ve Southern ya da northern blottingdeki gibi ykanr. Cam microarrayler iin hibridizasyon bir coverslip altnda yaplr ve lamlar ykama solusyonuna batrlarak ykanr. Ticari arrayler hibridizasyon, ykama ve tespitin yaplm olduu kasetler ierisinde satlr. Hibridize edilmi prob DIG iaretleme iin kimyasl luminesens , microarrayler iin de dorudan UV fluoresans ile tespit edilir. Her spotun sra younluu bir CCD kamera ile llr ve veri bir TIF grnts olarak elde edilir.
Microarray tipleri
1. Oligonkleotid microarrayleri Oligonkleotid microarraylerinde problar sekans bilinen ya da tahmin edilen mRNAlara uygun olacak ekilde dizayn edilir. Bu tip dizaynlarn bazlarna ticari olarak erimek mmkndr (Affymetrix, GE Healthcare gibi firmalar araclyla) (Bknz. ekil 4) . Bu microarrayler gen ifadesinin kesin deeri ile ilgili tahminler verir; o nedenle, iki durumun karlatrlmasnda iki ayr microarray kullanmak gerekir. Arraydeki her bir geni temsil etmek zere genellikle 25-70 nkleotid uzunluunda oligonkleotidler kullanlr. Daha kk boyutlarda prob balama etkinlii daha dk olmaktadr. Bununla birlikte, kk oligonkleotidlerin zgll daha fazladr. 70 nkleotidden daha uzun olanlarda ise sinyalde ok kk bir art olmaktadr. Oligonkleotidler her seferinde yeniden sentezlendii iin cDNA2larda olduu gibi baka sekanslardan kontaminasyon sz konusu deildir.
ekil 4.
2. Spotlu microarrayler Spotlu microarraylerde problar oligonkleotid . cDNA veya mRNAlara karlk gelen PCR rnlerinin kk paralar olabilir. Bu tip arraylerde genellikle iki farkl boya ile iaretlenmi, karlatrlacak iki rnekten (rnein hasta ve kontrol) gelen cDNA ile hibridize edilmitir. rnekler kartrlp tek bir microarraye hibridize edilebilir; lazer ile taranmas sonucunda up-regulated ve down-regulated genler bir seferde grlebilir (Bknz. ekil 5). Dezavantaj gen ifadesi dzeyinin kesin olarak gzlenememesidir ; ama bu yntemle deneyin maliyeti azalr.
ekil 5. Spotlu microarray Tipik bir microarray almasna rnek olarak Stanford niversitesinden P.Brownun almas gsterilebilir: Bu almada cDNA problar galaktozlu ve glukozlu ortamlarda yetitirilen maya hcrelerinden elde edilmitir. Farkl problardan gelen sinyalleri birbirinden ayrmak iin farkl fluoresans zellikteki etiketlerle (Cy3 ve Cy5) iaretlenmilerdir. Array biri Cy3 dieri Cy5 olmak zere iki kez lazerle taranm; bylece iki boyann orannn ve dolaysyla iki farkl yetime ortamndaki transcript orannn saptanabilecei iki paradan oluan bir grnt elde edilmitir. Pseudocolor grntlerinde, arrayde galaktoz varlnda daha gl ifade edilen genleri temsil eden spotlar yeil, glukoz varlnda daha gl ekilde ifade edilen genleri temsil eden spotlar ise krmz , her iki koulda da ifade edilen genler ise sar renk ile gsterilmitir (Bknz. ekil6).
ekil 6. 3. Genotip microarrayleri DNA microarrayleri ayn zamanda belli bir pozisyondaki bir genom dizisini okumada da kullanlabilir. SNP microarrayler bireylerde ve populasyonlarda genetik varyasyonu belirlemek iin kullanlan zel bir eit DNA microarray tipidir. Genetik eitlilikten ve genetik hastalklara yatknlktan sorumlu olduu dnlen tek nkleotid polimorfizmlerini ( single nucleotide polymorphisms SNP) belirlemede ksa nkleotid arrayleri kullanlabilmektedir. Genel olarak genotip belirleme olarak adlandrlan bu tip microarray uygulamalar adli tp almalarnda, hastalklara genetic yatknln hzl bir ekilde bulunmas almalarnda ya da DNA temelli ila adaylarnn tanmlanmasnda kullanlabilmektedir (Bknz. ekil 7). SNP microarrayleri ayrca kansere neden olan somatic mutasyonlarn , zellikle de heterozigosite kaybnn ya da DNA blgelerinin artan ya da kaybedilen (delesyon) profillerinin belirlenmesinde de kullanlmaktadr. Yeniden sekaslama arrayI bireylerdeki genom ksmlarnn dizisini karmak iin gelitirilmi bir baka array eididir. Bu array teknii bireylerdeki germline mutasyonlar veya kanserdeki somatic mutasyonlar belirlemede kullanlabilmektedir.
ekil 7.
gelitirilmesi,
optimizasyonu
ve
klinik
Microarray tekniinin en gze arpan kullanm alan gen ifadesindeki farkllklarn llmesidir. Genomik DNAdan transkripsiyona urayan genlerin tamamna transkriptom veya gen ekspresyon profili ad verilmektedir. Bir hcrenin fenotipi ve fonksiyonu transkriptomu tarafndan belirlenir. Genom hcreden hcreye sabit olmasna karn gen ekspresyon profili hcrenin iinde bulunduu koullara gre hzla deiebilen bir yapdadr. eitli koullarda genlerin ekspresyon dzeylerindeki deiimler takip edilerek bu genlerin kodlad proteinlerin fonksiyonlar hakknda nemli ip ular elde edilebilir. Mikroarrayler eitli fizyolojik veya patolojik srelerde gen ekspresyon paternlerindeki deiimi izlemek iin kullanlmaktadr. DNA mikroarray kanser hcrelerindeki gen ekspresyon farkllamasnn karakterize edilmesinde olduka kapsaml bir ekilde kullanlr. rnein, insan akcier epitelyum hcreleri tarafndan ekspresyonu yaplan yaklak 5500 gen, akcier kanserli doku genleri ile karlatrlabilmektedir. Bylece kanserleme srecinde rol oynayan gen takmlar hakknda bilgi edinmek mmkndr. Kanser tedavisindeki bir dier nemli rol, gen ekspresyon durumlarna gre kanserleen hcrelerin snflandrlabilmesidir. rnein; nceden tespit edilemeyen malignant melanoma hcrelerinin alt tipleri, ekspresyon paternleri ile belirlenebilmektedir (Bknz. ekil 8).Bu alt tipleri nceden belirleyebilmek dier yntemlerle mmkn deildir. Benzer bir analiz akcier kanser hcrelerinin gen ekspresyon karlatrmas ile yaplmaktadr.
ekil 8.
Kaynaklar 1. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. Oct 20; 270 (5235): 467-70. 2. http://www.gene-chips.com/ 3. http://www.affymetrix.com/ 4. http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html 5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/microarrays.html 6. http://genome-www5.stanford.edu/ 7. http://www.microarraystation.com/