MOLECULAR MARKERS AND THE DNA EXTRACTION MARCADORES MOLECULARES Y LA EXTRACCIN DE ADN Facultad de Ciencias Agropecuarias. Vol 3 No.

1 Marzo 2005 REINALDO VELASCO MOSQUERA INTRODUCCION

Los marcadores moleculares relacionados a una caracterstica especfica son de particular inters porque permiten identificar individuos que contengan esa caracterstica y diferenciarlos de los que no la posean, es decir que dan informacin sobre la diversidad gentica. Esto es un aspecto esencial en el campo de la biologa tanto aplicada como fundamental: Ecologa, Biologa de la Evolucin, Taxonoma, Agronoma, Biotecnologa, Microbiologa, Gentica, etc (1). Un gran nmero de tcnicas moleculares puede ser utilizado para obtener marcadores de diversidad mediante la deteccin de polimorfismo a nivel de ADN (2). La mayora de los marcadores moleculares se clasifican en dos categoras de tcnicas que se basan en la hibridacin o en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa. PCR. La aplicacin de las diferentes tcnicas empleadas en biologa molecular para el anlisis del genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se utilizan diversos mtodos de extraccin, dependiendo del tipo de tejido a emplear Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composicin de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrgeno lquido (6). La mezcla de tejido as obtenida se agrega a una solucin buffer o tampn de extraccin, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o alta fuerza inica (para que sea soluble el ADN) (7) y de altas concentraciones de NaCl. Los agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la accin de enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que acten como cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl se emplean para prevenir la contaminacin de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas. MATERIAL Y METODOS Obtencin de muestras Se coleccionaron muestras de hojas de plantas del orden zingiberales, de brotes recientes provenientes de la reserva natural NIRVANA y de la coleccin que se posee en el Invernadero de la Universidad Nacional sede Palmira. Extraccin La extraccin de ADN se bas en la metodologa estandarizada para la extraccin de ADN de robles colombianos DELLAPORTA modificado: 1. Preparar un bao a 65C y colocar el buffer de extraccin 2. Marcar los tubos ependorf de 1.5 ml (dos juegos iguales) 3. Macerar de 20 a 30 mg de tejido foliar maduro en Nitrgeno Lquido 4. Transferir el tejido a un tubo de 1.5 ml usando una esptula limpia y baada en etanol 5. Adicionar 800 ?l de buffer de extraccin y 55 de SDS al 20% 6. Mezclar bien el tejido con el buffer usando vortex o una punta limpia 7. Incubar a 65C por 20 minutos, invirtiendo los tubos peridicamente

8. Adicionar 250 ?l de acetato de potasio 5 M fro y mezclar 9. Incubar en hielo 20 min. en agitacin 10. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos 11. Transferir 800 ?l del sobrenadante a un tubo nuevo marcado 12. Adicionar 640 ?l de isopropanol fro y mezclar 8- veces 13. Incubar a .20 C por 2 horas 14. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos 15. Remover el isopropanol y secar las gotas con toalla 16. Adicionar 500 ?l de T10E1 e incubar a 65C por 15 minutos, mezclar 17. Adicionar 400 l de isopropanol y mezclar 8-10 veces 18. Incubar a .20C por 2 horas 19. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos 20. Remover el isopropanol 21. Dejar secar 1 hora sobre una toalla. Secar las gotas con toalla 22. Resuspender en 80 ?l de T10E1 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) 23. Adicionar 1 ?l de RNAsa (10 mg/ml), hacer un corto spin 12000 rpm 1 minuto 24. Guardar a 4 C. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
(1) Cornide M.DIVERSIDAD GENETICA Y MARCADORES MOLECULARES: Addison-Wesley Iberoamericana; La Habana, 2000 (2) Tautz D.,HYPERVARIABILITY OF SIMPLE SEQUENCES AS A GENERAL SOURCE FOR POLYMORPHIC DNA MARKERS. Nucleic Acids Research 17, 6463-6471. 1989 (6) Rogers S.O., Bendish A.J., EXTRACCION OF DNA FROM PLANT TISSUES. Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10.Kluwer Academic Publishers, Belgium, 1988 (7) Howell S.H., THE ISOLATION AND ANALYSIS OF DNA FROM EUKARYOTIC CELLS. In Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Chrispeels M.J., Ed. WileyInterscience Publication, NY p 127- 130., 1973.

Standarization of microsatellite molecular markers for Misiones (Argentina) forest industry Estandarizacin de marcadores moleculares microsatlites para su uso en la industria forestal de Misiones, Argentina
Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIV No. 1 Julio 2012 216-223 Teza, Vernica Graciela; Fonseca, Mara Isabel; Walantus. Leonardo Horacio; Davalos Paula; Toro, Alejandro Alberto; Zapata, Pedro Daro

INTRODUCCION
Los marcadores moleculares son secuencias genmicas que pueden ser seguidos a travs de la progenie de una especie. Algunos de ellos pueden ser ubicados referenciando posiciones definidas dentro del genoma y son los ms tiles para certificacin y caracterizacin de especies, as como para la seleccin y monitoreo de los programas de mejoramiento gentico (1) Para pino y otras conferas actualmente se desarrolla el Proyecto Genoma de Conferas a cargo de un consorcio internacional y provee de datos de gran relevancia a todo el mundo de manera libre y gratuita, siendo necesario el desarrollo de programas de transferencia tecnolgica que permitan la insercin de esta tecnologa en la regin. Este trabajo presenta los resultados del Proyecto Federal de Innovacin Productiva (PFIP Mi09) cuyo objetivo principal fue estandarizar un conjunto de marcadores moleculares microsatlites para ser aplicado al anlisis de poblaciones y forestaciones de Araucaria angustifolia y Pinus taeda provenientes de la provincia de Misiones (Argentina). Esto permitir relacionar el perfil gentico con determinadas caractersticas fenotpicas, pudiendo aplicarse a la certificacin de calidad en la produccin forestal o a la seleccin de ejemplares de especies nativas.

MATERIAL Y METODOS
Material vegetal Se utilizaron hojas jvenes y saludables recogidas y conservadas en bolsas de nylon hermticas en freezer a -20C hasta el momento de su procesamiento. Para Pinus taeda se muestrearon individuos provenientes de forestaciones ubicadas en los departamentos de Eldorado y Capital de la provincia de Misiones, Argentina. Extraccin de DNA Aproximadamente 600 mg de hojas fueron molidas en nitrgeno lquido junto con la adicin de 0,01 g de polivinilpirrolidona. Al macerado se le adicion tampn de extraccin (2% CTAB p/v; Tris HCl 100 mM pH 8,0; EDTA 50 mM; NaCl 500 mM; 1% mercaptoetanol; proteinasa K 0,1 mg/ml) previamente calentado a 65C. La digestin prosigui a 65C por 1 h, homogeneizando regularmente la mezcla. Purificacin del DNA La purificacin del DNA fue realizada para disminuir al mnimo la presencia de posibles interferentes que dificulten la amplificacin del mismo por PCR. El DNA obtenido fue purificado mediante resinas de slice comerciales (Fermentas, K1533). La cantidad y calidad del DNA obtenido fueron analizadas mediante absorbancia UV y electroforesis en 1% de agarosa. La pureza se valor mediante la relacin DO260/DO280.

Amplificacin de STR para Pinus taeda Fueron utilizados cebadores de la base de datos de secuencias Gen Bank, teniendo en consideracin las secuencias disponibles para regiones microsatlites descriptos por Echt et al., 1997, y Elsik et al., 2000, para Pinus taeda. Los nmeros de acceso de las secuencias fueron: BV683040, BV683146, BV683043, BV683044, BV683047, BV683052, BV683053, AF143959, AF143975. La reaccin se llev a cabo con 10 pmoles de cada cebador, 200 mM de cada dNTP, 2 mM de MgCl2, 0,5 U de Taq DNA polimerasa y 20 ng de DNA. Reacciones sin DNA fueron usadas como control negativo. El ciclado utilizado fue de tipo Touch Down: 94C por 2 min, seguidos de 35 ciclos de 94C por 15 s, Th por 15 s y 72C por 15 s, con una extensin final a 72C por 3 min. Durante los 20 primeros ciclos la temperatura de hibridacin decreci 2C cada 2 ciclos, iniciando con 60C y posteriormente 15 ciclos con una temperatura de hibridacin de 50C.

RESULTADOS Y DISCUSION
Estandarizacin de marcadores microsatlites para Pinus taeda La extraccin de DNA para Pinus taeda mostr un rendimiento de 0,25 mg/mg de hojas frescas, asociado a valores de pureza cercanos a los 1,7 (proporcin DO260/DO280). El anlisis cualitativo en agarosa demostr una banda de DNA bien definida sin indicios de degradacin. Una vez verificada la calidad del DNA, se ajustaron los parmetros correspondientes a la amplificacin de las regiones microsatlites seleccionadas. En todos los casos se aplic un protocolo de ciclado del tipo touch down ya que permiti obtener bandas con el tamao esperado para los amplicones de cada marcador. El coaislamiento de polisacridos, fenoles, terpenos y compuestos secundarios es el principal problema encontrado en el aislamiento y purificacin de DNA vegetal, pudiendo daar el DNA e inhibir la accin de la enzima Taq polimerasa .En este sentido, las hojas de las conferas contienen cidos, resinas y polifenoles, los cuales son poderosos agentes oxidantes presentes en muchas especies de plantas, pueden reducir la produccin y pureza del DNA extrado por unin covalente al mismo hacindolo intil para la mayora de las aplicaciones subsiguientes (2). Una manera de minimizar los efectos causados por estos compuestos es con el agregado de agentes antioxidantes como el polivinilpirrilidona (3) (PVP) y el metabisulfito de sodio que tienen por funcin unirse a los polifenoles provocando su precipitacin obtenindose as DNA de mejor calidad. De modo general, el protocolo de extraccin de DNA ms utilizado para las diferentes especies es el CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) (4). Las diferencias bsicas testadas en este trabajo estuvieron en la composicin del tampn de extraccin integrado por: un agente tampn para estabilizar el pH alrededor de 8,0; una sal para disociar las protenas del DNA; un detergente para solubilizar las membranas y auxiliar en la inactivacin de algunas (5) enzimas, y un inhibidor de DNasa para proteger el DNA ; y en los mtodos de purificacin en donde se ensayaron mtodos: por extraccin con solventes, y por extraccin con solventes mas precipitacin salina. La degradacin del DNA se evit realizando todos los pasos a temperatura ambiente.

CONCLUSIONES
Se optimizaron tcnicas de extraccin de DNA genmico para Pinus taeda y A. angustifolia obtenindose DNA amplificable. Para Pinus taeda, la utilizacin de los cebadores RIPPT-1, RIPPT-11, RIPPT-31, RIPPT32, RIPPT-65, RIPPT-79, PtTX3037 y PtTX2037 con DNA extrado de acculas permitieron la obtencin de bandas que corresponden a los tamaos esperados, pudiendo ser utilizados para estudios poblacionales de esta especie.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1) Ferreira ME, Grattapaglia D. Introduccin al Uso de Marcadores Moleculares en anlisis genticos. Brasilia, D.F: Embrapa-Cenargen. 1998 2) Katterman FH, Shattuck VI. An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 1983; 13: 347-359. 3) Maliyakal EJ. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research, 1992 ; 20:2381.

4)

Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus .1990 ; 12 (1): 13-15.

5) Bered F. Extrao de DNA, consideraes e prtica. MILACH, S. (Ed.) Marcadores moleculares em plantas. Brasil, Rio Grande do Soul: Porto Alegre. 1998; p141.

MTODO RPIDO, ECONMICO Y CONFIABLE DE, MINI PREPARACIN DE ADN PARA AMPLIFICACIONES POR RAPD EN BANCOS DEGERMOPLASMA
Agronoma Tropical 52(2): 235-243. 2002 Zambrano, Asia Y; Demey, Jhonny R.; Martnez, Gustavo; Fuenmayor, Francia; Gutirrez, Zulay; Saldaa, Gustavo y Mara Torrealba INTRODUCCIN Las tcnicas de biologa molecular son normalmente laboriosas, con alto requerimiento de tiempo y dinero, siendo esto particularmente cierto cuando se trata de la extraccin de ADN. El anlisis de ADN genmico de plantas es realizado frecuentemente a travs de aplicaciones de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), reduciendo la necesidad del aislamiento de grandes cantidades de ADN. Numerosos mtodos, entre otros los descritos por Dellaporta et al. (1983), Guillemaut y Marechal (1992), Honeycutt et al (1992), Hoisington et al. (1994), Harvey y Botha (1996), Aljanabi y Martnez (1997) y Chen y Ronald (1999) han sido desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayora requieren una alta inversin de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen bajo rendimiento de ADN. En este trabajo se describe un protocolo modificado de extraccin de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea, relativamente sencillo, econmico, que produce alta cantidad de ADN de buena calidad en Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculentapara ser usado en la amplificacin aleatoria de ADN polimrfico (RAPD), y que puede ser realizado completamente en 50 muestras por una persona en un da. MATERIALES Y MTODOS
Material vegetal Se utiliz tejido foliar joven de Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculenta, al cual se le realiz el procedimiento modificado de extraccin de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea en arroz. Protocolo de extraccin de ADN 1. Pulverizar con nitrgeno lquido tejido foliar joven recin cortado. 2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml colocar material vegetal pulverizado hasta la marca de 500 l y resuspender con 750 l de buffer CTAB (2X), (2% de CTAB, 100 mM de tris base pH 8,0, 10 mM de EDTA y 0,7 M de NAC1 agregar agua hasta 500 ml y autoclavar). Adicionar 30 l de 2- mercaptoetanol. Agitar suavemente e incubar por 30 minutos a 65 C. 3. Agregar 300 l de acetato de potasio (3 M, pH 4,8), mezclar suavemente e incubar en hielo por 15 min. Centrifugar 10 min a 14 000 rpm y transferir el sobrenadante a otro tubo. 4. Adicionar 500 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1), mezclar suavemente por inversin del tubo y centrifugar 10 min a 14 000 rpm. 5. Cuidadosamente pipetear la fase superior en tubo con 500 l de Isopropanol fro para precipitar el ADN. Incubar en hielo durante 60 min. 6. Centrifugar en 5 min a 14 000 rpm y descartar el sobrenadante. 7. Lavar el pellet de ADN dos veces con 500 l de Etanol al 70% fro. Descartar el Etanol y permitir que el ADN se seque al aire libre por 30 min. 8. Resuspender el ADN en 30 a 50 l de buffer TE (10 mM de Tris-HC1, 1mM de EDTA pH 8,4) o agua estril y almacenar a -20 C.

Cuantificacin de ADN La calidad del ADN fue determinada a travs de la relacin de absorbancia A260/A280. La concentracin de ADN se evalu en geles de agarosa al 1% por comparacin con marcadores estndar de ADN de no digerido, visualizados con Bromuro de Etilo bajo luz UV. Validacin de la calidad de ADN a travs su amplificacin por RAPD Una vez extrado y cuantificado el ADN se procedi a su validacin a travs de la amplificacin con iniciadores aleatorios, utilizando 15 l de mezcla de reaccin constituida por 1,5 l de Buffer B 10X, 3 mM de MgC1 2, 0,2 mM de cada uno de los dNTPs, 1M de primer, 0,5 U de Taq y 15 ng de ADN. La amplificacin fue realizada en un Termociclador MJ Research PTC 200, empleando un ciclo de desnaturalizacin inicial a 94 C por 5 min, seguido de 45 ciclos de amplificacin a 94 C por 1 min, 36 C por 30 seg, y 72 C por 2 min, y un ciclo final de extensin a 72 C por 7 min. La separacin de los productos de PCR se realiz en geles de agarosa 1,2% corridos Por 2 h a 80 W y visualizados con Bromuro de Etdio bajo luz UV.

RESULTADOS Y DISCUSIN
La metodologa de extraccin de ADN descrita es rpida, sencilla y permite la obtencin de ADN genmico de buena calidad, libre de compuestos secundarios que atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut y Marechal, 1992) y de protenas y polifenoles que coprecipitan con el ADN (Demeke y Adams, 1992; Do y Adams, 1991) los cuales inhiben la reaccin de amplificacin de ADN (Pandey et al., 1996). La calidad del ADN fue validada a travs de su amplificacin, siendo consistentemente amplificable a travs de la tcnica de RAPD utilizando 20 oligonucletidos de OPERON, se observan los patrones generados por los productos de amplificacin con 14 oligonucletidos para Saccharum spp. El tiempo requerido para la extraccin de ADN fue reducido a un 40% y su costo y su nivel de toxicidad a un 50%, comparado con los mtodos utilizados normalmente.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DELLAPORTA S., J., WOOD, J. y HICKS, J.B.1983. A plant DNA minipreparation: versin II. Plant Mol Biol. Rep. 1:19-21. GUILLEMAUT P. L. and D. MARECHAL. 1992. Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive and reliable meted. Plant Mol. Biol. Rep. 10:60-65. HOISINGTON, D., KHAIRALLAH, M. y GONZLEZ de LEN, D. 1994. Laboratory Protocols: CIMMYT. Applied Molecular Genetics Laboratory. Second Edition. Mxico. CIMMYT. 51 p. HONEYCUTT, H.J., SOBRAL, B.W., KIEM, P. y IRVINE J.E. 1992. A rapid DNA extraction-method for sugarcane and relatives. Plant Mol Biol Rep. 10(1):66-72 HARVEY, M. y BOTHA, F.C 1996. Use of PCR-based methodologies for determination of DNA diversity between Saccharum varieties. Euphytica. 89:257265 CHEN, D.H y RONALD, P.C. 1999. A rapid DNA minipreparation meted suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Mol Biol Rep. 17:53-57.