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2 MATERIALES Y METODOS

2.1 Obtencin del material biolgico 2.1.1 Plntulas. Se utilizaron plntulas de slo 4 - 6 hojas verdaderas, ya que las hojas jvenes son ms susceptibles a la enfermedad que las mas antiguas (Li y Xu, 2002). Las plantas provenan de cruzamientos realizados durante una etapa anterior del proyecto (Cuadro 1), adems de 300 plntulas de la variedad Braeburn obtenidas de semillas de frutos comerciales y 20 plantas de un ao de la misma variedad, que seran utilizadas para masificar el inculo de Venturia inaequalis para el ao siguiente. CUADRO 1. Nmero de plntulas a inocular provenientes de los distintos cruzamientos.

Cruzamiento 01 x 06 02 x 06 04 x 06 01 x 022 02 x 022 01 x 025 02 x 025 00 x 029 01 x 029 02 x 029 04 x 029 PxG Total hbridos

Padre resistente Prima Prima Prima Crimsoncrisp Crimsoncrisp Enterprise Enterprise Goldrush Goldrush Goldrush Goldrush Pristine x Goldrush

N hbridos 76 467 127 291 684 72 498 169 347 650 142 49 3572

Las plntulas estaban contenidas en bandejas de poliestireno expandido de 60 divisiones, con un sustrato de turba y compost en una proporcin de 2:1.

Las bandejas fueron ubicadas en un sombreadero de malla antifidos, dividido en tres salas contiguas desde la 5 a la 3 de este a oeste y de exposicin norte.

FIGURA 1 Mapa de ubicacin de las plntulas provenientes de distintos cruzamientos en las salas del sombreadero.

2.1.2 Inculo. Correspondi a conidias de Venturia inaequalis presentes en hojas de huertos de variedades altamente suceptibles infestados con la enfermedad (Tartarini et. al., 2000) (Cuadro 2).

CUADRO 2. Sectores de colecta del inculo.

Huerto Huerto Cocharcas, San Nicols. Huerto Jorge Lagos, Cato. Estacin esxperimental Santa Rosa, Cato.

Ubicacin 36 31 32 S 72 4 24 O 36 33' 37'' S 71 54' 30'' O 36 33' 0'' S 72 1' 11'' O

Las hojas fueron colectadas durante los meses de mayo y junio de 2011, en su mayora directamente desde los rboles debido a que las que ya haban cado al suelo presentaban pstulas de otros patgenos y de saprfitos. El material fue dispuesto en bolsas plsticas y almacenado a -18 C para su posterior utilizacin (Hartman, et. al., 1999). 2.2 Preparacin del inculo Las hojas con el inculo fueron agitadas en agua destilada estril para permitir que las conidias de V. inaequalis se desprendan. Luego, la suspensin fue filtrada en varias capas de gasa para remover restos de hoja (Bnauof y Parisi, 2000; Hartman et. al., 1999; Parisi et. al., 1993, 1996; Schenato, et. al., 2008). 2.2.1 Prueba de germinacin. Se sembr 0,1 ml de la solucin de conidias ajustada a una concentracin de 1 x 106, utilizando una cmara de Neubauer, en placas con medio de cultivo agar agua (agar agar Winkler 2%). Posteriormente se esparci la gota utilizando una bagueta estril, de manera que las conidias fueran sembradas de manera uniforme en el medio. Se sembraron 6 placas, tres de las cuales fueron incubadas en cmara de cultivo a 25 C y oscuridad. Las otras tres fueron incubadas en el sombreadero donde estaban las plntulas, de manera de tener una idea del momento de germinacin de las conidias en las plntulas. Despus de 48 horas

aproximadamente, se realiz una evaluacin de la proporcin de conidias germinadas para lo cual se contaron por lo menos 200 por placa bajo microscopio. 2.3 Inoculacin de las plntulas. La suspensin de conidias se ajust a una concentracin de 2 x 105 conidias/ml y fue asperjada utilizando un nebulizador manual hasta punto de escurrimiento (Figura 2) (Hartman, et. al., 1999; Parisi et. al., 1993, Parisi y Lespinasse, 1996; Schenato, et. al., 2008), lo cual correspondi a 50 ml por bandeja de plantas, aproximadamente. Las plantas fueron inoculadas el da 14/09/2012.

FIGURA 2. A) Inoculacin de las plntulas, B) plntulas inoculadas hasta punto de escurrimiento. Despus de la inoculacin, se mantuvo una niebla constante por medio de nebulizacin, con el fin de que la superficie foliar permaneciera constantemente hmeda para favorecer la germinacin y posterior penetracin del hongo, y evitar que la solucin de conidias se lave como ocurrira con aspersores comunes. La temperatura mxima promedio desde la inoculacin hasta la aparicin de los primeros sntomas fue de 22,8 C y la mnima promedio de 6,5 C (Anexo 1).

FIGURA 3. Bandejas de plntulas inoculadas. 2.4 Evaluacin de las plntulas inoculadas. La evaluacin fue realizada mediante una escala visual de incidencia de sntomas (Croxall et. al., 1952; Bnauof y Parisi, 2000; Parisi et. al., 1993) y adems se incluy la observacin de si el sntoma era local o difuso. CUADRO 3. Escala de evaluacin de incidencia de los sntomas en hojas basada en Croxall et. al. (1952).

Nota 0 1 2 3 4 5

Incidencia (%) 0 - 0,9 1 - 4,9 5 - 9,9 10 - 24,9 25 - 49,9 50

FIGURA 4. Diagrama utilizado para la evaluacin de sarna en hojas de manzano (Croxall et. al., 1952).

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