UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA MANUAL DE PRACTICAS DE TOXICOLOGIA DE ALIMENTO

Clave: 2332087 Dr. Mendoza Martinez Eduardo

CUANTIFICACIN DE UN TXICO VOLTIL (CIANURO DE HIDRGENO) EN GLUCSIDOS CIANOGNICOS. ASIGNATURA: Toxicologa de Alimentos DEPARTAMENTO: Ciencias Biolgicas de la Salud

OBJETIVO ACADMICO: Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de glucsidos cianognicos presentes en muestras de plantas y semillas que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico.

PROBLEMA: Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie de 3 muestras de semillas o plantas. Una de estas ser proporcionada por el profesor y se deber reportar al menos el 80% de la concentracin real. Al final de la prctica el alumno indicar cual semilla podra presentar mayor riesgo de toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que estara presente en el consumo de 50 g de muestra.

INTRODUCCIN: Existe en la naturaleza una amplia gama de vegetales, alrededor de 1000 especies, que contienen glucsidos cianognicos. Algunos de stos estn constituidos por alfahidroxinitrilos (aglucn), unidos a travs de un enlace beta a un carbohidrato, que puede ser un monosacrido o un disacrido. Al hidrolizar estos compuestos, se obtiene, entre otros productos, cido cianhdrico. Dicho proceso requiere de la presencia de la enzima glucosidasa, que rompe el enlace glucosdico, y de la enzima hidroxinitriliasa, que libera el cido cianhdrico. Estas enzimas se encuentran presentes en la misma planta y actan sobre los glucsidos, cuando la planta sufre ruptura del tejido debido a daos mecnicos( 2,3 ). La importancia de estos compuestos desde el punto de vista toxicolgico radica en que se encuentran presentes a diferentes concentraciones, en vegetales que forman parte de la dieta de humanos y animales. Los estudios realizados en algunos alimentos, han permitido detectar glucsidos cianognicos tales como: faseoliona, amigdalina, durrina y linamarina entre otros( 2 ). Entre dichos alimentos se encuentran leguminosas (varios tipos de frijol incluyendo el colorin); tubrculos como la casava; cereales como el sorgo; y semillas de algunas frutas como limn, lima, manzana, pera, cereza, durazno, albericoque y ciruela( 1, 4, 5 ).

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FUNDAMENTO: El mtodo en el presente guin aprovecha la reaccin, sensible y especfica de Guignard, la cual es ampliamente utilizada en pruebas cualitativas para la deteccin de HCN como de glucsidos cianognicos; sin embargo, con el uso de una curva estndar de cianuro alcalino, se podr realizar dicha prueba en forma cuantitativa, expresndose en base al cido cianhdrico liberado ( 4, 6, 7 ).

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MATERIAL DE LABORATORIO MATERIAL Tubos de ensaye ( 20*150) con tapn de hule. Cajas petri Papel filtro cualitativo( filtracin rpida ) 2 x10 cm. Tijeras, pinzas de diseccin y regla o escuadra graduada. Matraz erlenmeyer de 250ml. con tapn de hule. Mortero con pistilo Navaja Pipeta de 1ml. graduada. Probeta de 50ml. Matraces volumtricos de 10 ml Embudo de cola corta. Vaso de precipitado de 100ml. Tubo de ensaye( 13*150 mm ) Celdas de 1 cm de dimetro Guantes de hule 1 par Hielo Espectrofotmetro Balanza analtica Estufa CANTIDAD 10 1 2x10cm 1 juego por equipo 10 1 1 por equipo 3 1 6 5 3 2 2 1 por equipo

MATERIAL BIOLOGICO Traer por equipo aproximadamente 1g de muestras de plantas o semillas de: durazno, manzana roja, ciruela pasa, sorgo, bamb, colorn, lima, almendra de capuln, germen de soya.

REACTIVOS Acido clorhdrico concentrado. Acido pcrico. Carbonato de sodio. Cloroformo. Cianuro de potasio

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PRECAUCIN: ALTAMENTE TXICO, PREPARAR Y MANEJAR CON GUANTES ( SOLUCIN ESTNDAR II). SEGURIDAD: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL50 en ratones, no deber descuidar las medidas de seguridad para su trabajo. MANEJO DE RESIDUOS: Los residuos de las soluciones que contienen KCN no debern ser tiradas al drenaje directamente, recolectarlas en frascos y etiquetarlas. Tratamiento de residuos de soluciones que contienen KCN: colocarlas en hielo y adicionar lentamente una solucin de hipoclorito de sodio, se dejan reposar por 24 horas y posteriormente podrn ser desechadas por la tarja con abundante agua.

PROCEDIMIENTO: El alumno trabajar 3 muestras problema de plantas o semillas segn la lista mencionada. Una de las cuales ser proporcionada por el profesor. A) PREPARACIN DE LA TIRA REACTIVA Cortar papel filtro en tiras exactamente de 2x10 cm (preparar 1 tira por muestra), se sumergen en el reactivo de Guignard, dejndose escurrir. Introducirlas en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-55oC, donde se dejan por aproximadamente 10 min (las tiras reactivas preparadas deben quedar ligeramente humedecidas al ser utilizadas en el procedimiento). B) PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE SEMILLAS O PLANTAS. Pesar 1 g de muestra de y colocarla por separado en el mortero, y con la ayuda de las pinzas de diseccin y navaja cortarlas y macerarlas lo ms rpido posible. A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento: Colocar la muestra fragmentada en un matraz erlenmeyer de 250 mL, medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos al matraz. A continuacin aadir 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl 0.5 N. Colocar con cuidado la tira de papel reactivo humedecida como se ilustra en la figura (1). PRECAUCIN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. Colocar el matraz Erlenmeyer en la estufa a 40oC por espacio de 1 h, agitando suavemente a intervalos de 15 min, teniendo precaucin de que el contenido del matraz no tenga contacto con la tira reactiva de papel filtro, meter simultneamente a la estufa los matraces con las diferentes concentraciones de la curva estndar de HCN. (El gas de HCN 29 liberado reacciona con el reactivo de Guignard de la tira reactiva, formando un complejo NO TXICO).

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FIGURA 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira reactiva. C) PREPARACIN DE LA CURVA ESTNDAR La curva estndar de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los volmenes de la solucin patrn indicados en la siguiente tabla y llevando a volumen con agua destilada: CURVA ESTNDAR DE HCN. Alcuota de la solucin patrn (mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Concentracin (g/mL) Blanco 0.4 0.8 1.2 1.6 2 ]

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Tratamiento de la curva estndar: 1) Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a matraces erlenmeyer de 250 ml, debidamente etiquetados. 2) Colocar la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar a cada matraz 1 ml de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de cloroformo. PRECAUCIN: No mojar la tira reactiva con los reactivos anteriores y tapar inmediatamente cada uno de los matraces erlenmeyer con su tapn despus de concluir este procedimiento. 3)Incubar por una hora con agitacin cada 15 minutos. D) TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA ESTNDAR Y BLANCO. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Se observan las tiras reactivas de las muestras problema y aquellas que no muestren ni siquiera una leve coloracin caf-rojiza se considerarn como prueba negativa; en tanto que aquellas que s lo presenten son positivas y se introducen en un tubo de ensaye al cual se le adiciona 20 ml de agua destilada, se tapa y se agita vigorosamente con el fin de extraer el pigmento colorido; se procede a filtrar (con papel Whatman No. 40) para eliminar residuos de la tira de papel. Se determina la absorbancia de las muestras y de la curva patrn en el espectrofotmetro a 520nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva. NOTAS: a) Las soluciones II, III y agua destilada deben de estar en bao de hielo antes de usarse. b) No olvidar poner 2 gotas de cloroformo a los matraces de la curva patrn. c) Antes de meter a la estufa los matraces de la curva patrn, colocar las tiras reactivas a cada uno de ellos (como se indica en la figura 1). PREPARACIN DE SOLUCIONES: Reactivo de Guignard: Se disuelve en agua destilada 2.5 g de cido pcrico y a continuacin 12.5 g de carbonato de sodio, llevndose a un volumen de 500 ml con agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO EL CIDO PCRICO, YA QUE ESTAS SUSTANCIA ES CANCERGENA Y SE ABSORBE FCILMENTE POR PIEL. Solucin patrn de cianuro de potasio: se pesa exactamente 12.05 mg de KCN y se lleva a 50 ml de agua destilada. MANEJAR CON CUIDADO Y CON GUANTES LA SOLUCIN DE CIANURO ALCALINO YA QUE ES ALTAMENTE TXICO COLOCAR LA SOLUCIN EN BAO DE HIELO DESPUS DE PREPARARLA. cido clorhdrico 0.5 N. COLOCAR LA SOLUCIN EN BAO DE HIELO DESPUS DE PREPARARL

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CUESTIONARIO:

1.-Qu importancia tiene durante la prctica que la trituracin de la muestra se realice rpidamente? 2.-Por qu la tira reactiva de papel no debe tocar la solucin y por qu se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto con la muestra? 3.-Por qu considera necesario colocar la solucin patrn de cianuro de potasio y el HCl 0.5N en bao de hielo? 4.- Por qu es necesario calentar la muestra? 5.-Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de una planta comestible? 6.- Grafque los valores de absorbancia vs concentracin obtenidos e interpole las absorbancias de las muestras. 7.- Reportar los resultados obtenidos en mg/50g de muestra, tomando en cuenta que la solucin patrn es equivalente a 100 g HCN/ml y llenar la siguiente tabla:. Muestra de semilla Concentracin de mg HCN/50 g de Riesgo de muestra Toxicidad HCN (g/mL) (marque con cruces)

8.- Con base a los resulta dos obtenidos cul muestra considera que representa un mayor riesgo potencial en su consumo?

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: 1. Linder, E.; Toxicologa de los alimentos; Acribia, pg. 15-19, Zaragoza ( 1978 ). 2. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. In: Toxicants ocurring naturally in foods; National Academy of Sciences; 2th Edition, pp. 290-308, Washington, D.C.( 1973 ). 3. Montgomery, R.D.; Cyanogens: AToxic constituyent of plant food stuffs; Liener, I.E; Academic Press, pp. 143-160, N.Y.( 1980 ). 4. Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides; Agr. Food Chem. 17, 519-526 (1969). 5. Eyjolfsson, R.; Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides; Fortsch. Chem. Orgn. Naurist. 28, 74-108 (1970). 6. Fabre, R. Y Truhaht, R.; Tratado de toxicologa; Paraninfo, S.A., Vol. I, pg. 311-332, Madrid (1976). 7. Lucas, B. and Sotelo, A.; A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated seeds; Nutr. Rep. Int. 29 ( 3 ), 711-719( 1984 ).