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Berufskolleg Olsberg des Hochsauerlandkreises Höhere Berufsfachschule für Biologisch-Technische-Assistenten

Berufskolleg Olsberg des Hochsauerlandkreises Höhere Berufsfachschule für Biologisch-Technische-Assistenten

Laborausbildung: Mikrobiologie/Bioverfahrenstechnik

Arbeitsmaterialien

Mikrobiologie/Bioverfahrenstechnik Arbeitsmaterialien Zusammengestellt von Manfred Albracht, Olsberg (2007/2008) 1

Zusammengestellt von Manfred Albracht, Olsberg (2007/2008)

Arbeitsregeln für den Umgang mit Mikroorganismen

Mikroorganismen existieren überall in unserer Umgebung. Um einerseits sich selbst beim Arbeiten mit Mikroorganismen vor einer Infektion zu schützen und andererseits eine Kontamination der Proben und eigenen Kulturen zu vermeiden, sind folgende Regeln beim Umgang mit Mikroorganismen zu beachten:

1.

Behandeln Sie jede Probe so, als ob sich pathogene Keime darin befänden.

 

2.

Essen und Trinken sind am Arbeitsplatz zu unterlassen. Im Labor sind stets Kittel und bei Bedarf Schutzbrille und Schutzhandschuhe zu tragen.

3.

Der Sitzplatz muss sauber sein (Desinfektionslösung!), Fenster und Türen sind während der Untersuchungen zu schließen. Unnötiges Herumgehen ist zu vermeiden, um das Aufwirbeln der Luftkeime zu reduzieren.

4.

Am Arbeitsplatz befinden sich nur die für die Untersuchung unmittelbar benötigten Geräte und Chemikalien. Taschen, Kleidungsstücke u.ä. sind gesondert aufzubewahren.

5.

Flüssigkeiten werden nie mit dem Mund sondern stets mit Pipettierhilfen angesaugt.

 

6.

Gefäße, die sterile Lösungen, Proben oder Reinkulturen enthalten, sind stets so kurz wie möglich und immer in Brennernähe zu öffnen.

7.

Öffnungen von Kulturgefäßen sind nach der Entnahme durch die entleuchtete Flamme zu führen.

 

8.

Impfösen sind vor und nach jedem Benutzen in der Brennerflamme auszuglühen.

9.

Kolbenhubpipetten, Reagenzgläser und Impfösen sind immer im entsprechenden Ständer aufzubewahren.

10.

Wenn versehentlich keimhaltiges Material auf die Arbeitsplatte gelangt, wird diese durch Übergießen mit einer Desinfektionslösung gereinigt.

11.

Geräte, die mit keimhaltigem Material kontaminiert sind, werden vor dem Reinigen abgekocht (Petrischalen etc.). Nach dem Spülen und Klarspülen werden die Geräte in der Hitze sterilisiert.

12.

Die Hände werden nach Abschluss der Arbeiten Lösung desinfiziert.

spätestens beim Verlassen des Labors

mit einer geeigneten

Man sollte sich vom Misslingen einer erstmalig durchgeführten Untersuchung nicht entmutigen lassen. Nach kritischem Durchdenken sollte eine neue Untersuchung durchgeführt werden.

Zu guten Ergebnissen führen nur größte Sauberkeit, Ausdauer und geschickter, fachgerechter Umgang mit den Arbeitsgeräten und den Proben.

Ich bestätige hiermit, dass ich die Sicherheitsbestimmungen für den Umgang mit Mikroorganismen zur Kenntnis genommen habe.

Name:

Klasse:

Gruppe:

Datum:

Inhaltsverzeichnis:

Arbeitsregeln für den Umgang mit Mikroorganismen

 

2

1.0

Methodische Grundlagen der Mikrobiologie:

5

1.1 Umgang mit Mikroorganismen

 

5

1.2 Bereitung von Nährböden

 

6

1.3 Sterilisationstechniken

10

 

1.3.1 Sterilisation durch trockene Hitze

 

11

1.3.2 Sterilisation durch feuchte Hitze (Dampf)

 

12

1.3.3 Andere Sterilisationsmethoden

 

14

1.4 Kulturgefäße

 

15

1.5 Impftechniken

18

1.6 Kulturtechniken

22

1.7 Beschaffung und Aufbewahrung von Mikroorganismen

25

2.0

Allgemeine Grundlagen:

 

27

2.1 Bunsenbrenner (Ausglühen und Abflammen

 

27

2.2 Umgang mit dem pH-Meter

 

29

2.3 Umgang mit dem Mikroskop

30

2.4 Herstellung von Nährböden

32

2.5 Sterile-Werkbank

 

34

3.0

Allgemeine mikrobiologische Methoden:

 

36

3.1 Risikogruppen von Bakterien und Pilzen

36

3.2 Identifizierung (Bestimmen) von Bakterien

39

3.3 Mikroskopie fixierter und gefärbter Bakterien

 

44

 

3.3.01 Herstellung eines gefärbten Ausstrichpräparates mit Methylenblau

44

3.3.02 Negativ-Darstellung von Mikroorganismen

 

45

3.3.03 Sporenfärbung

46

3.3.04 Färbung von Zellinhaltsstoffen

 

47

3.3.05 Der Katalase-Nachweis

49

3.3.06 Oxidase-Nachweis

 

50

3.3.07 Gramfärbung

51

3.3.08 Unterscheidung gramnegativer und -positiver Bakterien mittels KOH-Test

52

3.3.09 Aminopeptidase-Test

 

53

3.3.10 Geißelfärbung nach LEIFSON

 

54

3.3.11 Nachweis der Beweglichkeit

55

3.3.12 Lactobacillus spec.

 

56

3.3.13 Micrococcus spec.

57

3.3.14 Streptococcus spec.

58

3.3.15 Actinomyceten

59

3.3.16 Anreicherung und mikroskopische Untersuchung von Schimmelpilzen

60

3.3.17 Saccharomyces – Hefen

 

63

3.3.18 Einführung in die mikrobiologische Diagnostik mit Hilfe verschiedener Nährmedien

64

4.0

Versuchsanleitungen:

68

4.01 Mikroorganismen der Luft, der Haut und an Gebrauchsgegenständen

68

4.02 Gewinnung von Reinkulturen der Luftfangplatten(Techniken zum fraktionierten Ausstrich von Mikroorganismen)

72

4.03 Herstellung und Beimpfen eines Schrägagarröhrchens

76

4.04 Isolierung von Streptokokken aus Zahnbelag

 

77

4.05 Anreicherung und Isolierung fluoreszierender Pseudomonaden

79

4.06 Anreicherung,Kultur und Identifizierung buttersäurebildender Clostridien (Saccharolytische Clostridien)

81

4.07 Quantitative und qualitative Bestimmung von Milchsäurebakterien

85

4.08 Bestimmung der Keimzahl von Milch

 

89

4.09

Antibiogramm mittels Agardiffusionstest

91

4.10 Bestimmung der Penicillinkonzentration durch ein Antibiogramm

93

4.11 ATB Antibiogramm

96

4.12 Bouillondilutionstest

98

4.13 Bakteriologische Trinkwasseruntersuchung

99

4.14 Keimtiter, Coliformen -Titer von Wasser, wahrscheinlichste Keimzahl (MPN)

101

4.15 Zellzahlbestimmung bei Hefen

109

4.16 Fermentation von Hefezellen

116

4.17 Bakteriologische und chemische Harndiagnostik

120

5.0

Anhang:

124

5.1 Gebrauchsanleitung API 20 E

124

5.2 Gebrauchsanleitung Enterotube II

130

5.3 Gebrauchsanleitung „Sensi Disc-Dispenser“

135

5.4 Hemmhofdurchmesser zur Bewertung von Agardiffusionstest-Ergebnissen

140

5.5 Identifizierung von Mikroorganismen

144

5.6 Bactident E.coli-Test

145

5.7 Gebrauchsanleitung Autoklav

146

5.8 Vorlage für Betriebsanleitung

147

6.0

Literatur:

148

1.0

Methodische Grundlagen der Mikrobiologie:

Zur Untersuchung von Mikroorganismen werden im wesentlichen, ungeachtet der zahlreichen Merkmalsunterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen, die gleichen Verfahren angewendet. Die beiden wichtigsten sind die Isolierung und Kultivierung.

Isolierung: Trennung einer einzelnen Zelle eines bestimmten Mikroorganismus aus einer von verschiedenen Stämmen und Arten gebildeten natürlichen Population mit dem Ziel eine Reinkultur dieses Organismus zu gewinnen. Unter einer Reinkultur versteht man in der Bakteriologie die durch vegetative Vermehrung entstandene Nachkommenschaft (= Klon) einer einzelnen Zelle. Es handelt sich also um eine Kultur, die aus genetisch identischen Bakterien besteht. In der Mykologie gilt auch die Kultur einer Art als Reinkultur. Kultivierung: Züchtung von Mikroorganismen unter Bereitstellung einer künstlichen Umwelt (Nährboden, Kulturgefäß, kontrollierte Temperaturbedingungen u. a.). Das Kultivieren kann einem der folgenden Zwecke dienen:

1. Reinkulturen zu gewinnen und unter Ausschluss stamm- und artfremder Mikroorganismen zu erhalten,

2. morphologische, physiologische und biochemische Merkmale eines bestimmten Mikroorganismenstammes zu untersuchen,

3. die in gemischten Populationen bestehenden zwischenartlichen Beziehungen zu erkunden und

4. mikrobielle Produkte zu erzeugen.

Isolieren und Kultivieren setzen voraus, dass man bestimmte grundlegende Techniken beherrscht und sorgfältig und

umsichtig mit Mikroorganismen umgeht.

1.1 Umgang mit Mikroorganismen

Der Arbeitsraum sollte möglichst staubfrei gehalten werden. Sein Fußboden und die Fläche des Arbeitsplatzes sollten leicht zu säubern und zu desinfizieren sein (Beläge aus Fliesen oder aus Kunststoff). Protokollieren und Mikroskopieren sollten nicht am Arbeitsplatz selbst erfolgen, da Schreibzeug und Mikroskop im Fall einer Kontamination (unbeabsichtigte mikrobiologische Verschmutzung, Verseuchung) nur schwer zu desinfizieren sind. Zur ständigen Ausrüstung des Arbeitsplatzes gehören in der Regel ein Brenner, Impfbestecke (s. Kap.1.5) und ein Gefäß mit einem Desinfektionsmittel (z.B. 70%iger Alkohol (s. Kap. 1.3.)). Zur Desinfektion von verschmutzten Geräten (Objektträger, Glasstäbe, Pipetten, Spatel u.a.). eine Spritzflasche mit 70%igem Alkohol oder einem anderen Desinfektionsmittel. Dies muss auch für die Flächendesinfektion der Arbeitsplatte bereitstehen.

Bei der Arbeit ist ein kochfester Baumwollkittel zu tragen, der nach Möglichkeit im Arbeitsraum verbleiben sollte. Die Kontamination des Arbeitsplatzes erfolgt in der Regel durch Luftkeime, die zusammen mit Staubpartikeln sedimentieren und durch, vom Menschen, eingeschleppte Mikroorganismen. Einige Angaben sollen das verdeutlichen:

1. Keimgehalt der Raumluft (in Abhängigkeit von der Anzahl der in einem Raum beschäftigten Menschen):

500-2000 Keime/m³

2. Keimgehalt der Außenluft (je nach Standort und Jahreszeit): 100-500/m³

3. Keimabgabe durch den Menschen:

Fingerkuppe: 20-100/cm² Handfläche: 1000-6000 einmal Niesen: 10 4 -10 6

1 ml Speichel: 10 6 -10 8

1 ml Nasensekret: 10 6 -10 7

Folgende Verhaltensmaßregeln müssen beim mikrobiologischen Arbeiten beachtet werden:

1. Vor und nach der Arbeit gründlich die Hände waschen.

2. Arbeitsplatzoberfläche vor und nach der Arbeit mit 70%igem Alkohol abreiben.

3. Essen und Trinken sowie Rauchen unterlassen.

4. Unnötiges Umherlaufen und zu viele Bewegungen vermeiden.

5.

Beim Hantieren mit Kulturen darauf achten, dass keine Keime unkontrolliert aus dem Kulturgefäß nach außen gelangen können. Vorsicht bei Bildung von Kondens- und Synäereswasser (Kap.1.4): Verschlüsse von Kulturgefäßen sind in der Regel nicht wasserdicht.

6. Kulturgefäße nur kurzfristig öffnen.

7. Sprechen, Husten und Niesen nach Möglichkeit unterlassen.

8. Mikroorganismensuspensionen nicht mit dem Mund pipettieren, sondern Pipettierhilfen (z.B. Pipettierbälle) verwenden.

9. Durch Mikroorganismen verunreinigte Geräte nicht ablegen, sondern in eine Desinfektionsmittellösung

geben bzw. flämmen oder ausglühen.

10. Impfgeräte sofort nach Gebrauch sterilisieren.

11. Gefäße mit nicht mehr benötigten Kulturen vor der Reinigung durch feuchte Hitze sterilisieren (Kap.1.3.2) oder 2 h in 10%iges Formalin legen. Plattenkulturen können zu Demonstrationszwecken gefahrlos aufbewahrt und herumgereicht werden, wenn man zuvor ein mit 10 %igem Formalin gefülltes Uhrglas über Nacht in die umgekehrt aufgestellte Schale setzt. Die Formalindämpfe (s. S. 45) töten die Kolonien ab.

12. Alle Arbeiten in der Nähe der Brennerflamme ausführen, da die aufsteigende heiße Luft dem Sedimentieren von Keimen entgegenwirkt.

Erste-Hilfe-Maßnahmen

Die Hände kamen versehentlich mit Mikroorganismen in Berührung

Hände 2 min mit einem Desinfektionsmittel waschen (70%iger Alkohol + l% Glycerin, 2%iges Sagrotan u. a.)

Mikroorganismensuspension ist in den Mund gelangt

Mit viel Wasser spülen und mit 0,1%iger Kaliumpermanganat-Lsg. gurgeln

Mikroorganismensuspension ist ins Auge gelangt

Auge unter fließendem Wasser spülen oder Augendusche verwenden, Arzt aufsuchen.

Mikroorganismensuspension wurde verschluckt

Erbrechen herbeiführen (starke NaCI-Lsg. trinken). Arzt aufsuchen

Mikroorganismen sind in eine Hautwunde gelangt

Kleinere Wunden lässt man gegebenenfalls zunächst ausbluten und deckt sie dann steril ab. Arzt aufsuchen.

1.2 Bereitung von Nährböden

Mikroorganismen werden auf bzw. in Nährböden kultiviert, die alle für das Wachstum wichtigen Stoffe enthalten. Die Zusammensetzung der Nährmedien richtet sich nach den Ansprüchen des zu züchtenden Mikroorganismus. Je nach Verwendung unterscheidet man folgende Nährböden:

I. Allgemeine (kollektive) Nährböden: sie genügen den Nährstoffansprüchen vieler Arten,

II. Spezielle (selektive) Nährböden: nur wenige Arten gelangen darauf zur Entwicklung.

Nährböden können auch nach ihrer Herkunft unterschieden werden:

a) Komplexe -(natürliche) Nährböden: sie enthalten Naturprodukte oder aus ihnen gewonnene Substanzen, dabei ist

ihre Zusammensetzung nicht immer identisch,

b) Synthetische Nährböden: sie bestehen aus Chemikalien und sind daher von ihrer chemischen Zusammensetzung her

genau definiert. In der Bakteriologie werden auch Indikatornährböden verwendet, mit deren Hilfe besondere Stoffwechselleistungen erkannt werden können.

Zur Bereitung komplexer Nährböden werden folgende Nährstoffquellen häufig verwendet:

1.Fleischwasser: 500 g fettarmes Rind- oder Pferdefleisch werden im Fleischwolf zerkleinert und mit 1 l Wasser überschichtet. Der Ansatz wird etwa 12 h im Kühlschrank aufbewahrt. Man presst dann das Fleischwasser durch ein Tuch ab und füllt mit Wasser auf ein Liter auf.

2.Fleischextrakt ist ein konzentrierter Auszug aus enzymatisch angedautem Fleisch. Er dient als Stickstoffquelle und enthält außerdem Vitamine und mineralische Bestandteile. Anwendung: 0,2-1,0%

3.Peptone enthalten vor allem Eiweißspaltprodukte, die durch Behandlung pflanzlicher oder tierischer Eiweiße mit Enzymen hergestellt wurden (Pepton aus Fleisch, aus Casein, aus Sojamehl u. a.). Anwendung: 0,2-2,0 %

4.Hefeextrakt wird aus Hefe gewonnen und kann an Stelle von Fleischextrakt gebraucht werden. Der Extrakt ist reich an Vitaminen. Anwendung: 0,1 -0,5%

5.Malzextrakt wird durch Auslaugen von Malz bei 55°C und anschließende Einengung hergestellt. Er dient vor allem als Zusatz für Pilznährböden. Anwendung: 3-5%

6.Kohlenhydrate dienen ausschließlich als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die gleiche Aufgabe erfüllen auch ein- bis mehrwertige Alkohole (Glycerin, Mannit u. a.) sowie verschiedene Säuren (Citronensäure, bestimmte Fettsäuren u. a.). Auch Sojamehl, Extrakte aus pflanzlichen Organen (z. B. Möhren, Kartoffeln, Tomaten) und Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut und Serum (in der medizinischen Mikrobiologie), werden bestimmten Nährböden zugesetzt.

Alle Nährmedien enthalten einen hohen Anteil an Wasser. Man kann bei der Nährbodenbereitung Leitungswasser verwenden, wenn keine für Mikroorganismen schädlichen Stoffe darin vorkommen. Häufig nimmt man auch Aqua destillata und deionisiertes Wasser, vor allem bei der Herstellung genau definierter synthetischer Nährböden. Je nach Konsistenz der Nährmedien unterscheidet man flüssige und feste Nährböden. Als Verfestigungsmittel werden Agar-Agar oder Gelatine eingesetzt.

Agar-Agar (kurz Agar genannt) ist ein aus bestimmten Rotalgen gewonnenes Polysaccharid, das in fädiger und pulverisierter Form angeboten wird. Die im Handel befindlichen Fabrikate in Pulverform sind weitgehend gereinigt und enthalten daher, im Gegensatz zum Fadenagar, nur noch wenige Begleitstoffe (organische Nährstoffe, Salze). Agar wird in 1-2%iger Konzentration verwendet. Er verflüssigt sich bei etwa 95°C und erstarrt bei 40-45°C zu einem Gel.

Gelatine ist ein Gerüsteiweiß, das durch Auskochen aus Knochen und Sehnen gewonnen wird. Sie löst sich bei 25-30°C und verfestigt sich bei 20-22°C. Je Liter Nährlösung werden in der Regel etwa 150g Gelatine zugesetzt. Da eine gelatinehaltige Lösung sauer reagiert, muss sie vor dem Erhitzen mit 1 N NaOH-Lösung neutralisiert werden. Nachteilig ist, dass Gelatine von bestimmten Mikroorganismen abgebaut wird, einen niedrigen Schmelzpunkt besitzt und bei zu starkem Erwärmen ihre Gelierfähigkeit verliert. Gelatinenährböden werden zur Sterilisierung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 20 min auf 100°C erhitzt (s. Kap.1.3).

Das Wachstum von Mikroorganismen ist in hohem Maße vom pH-Wert des Substrats abhängig. Bakterien wachsen am besten bei pH 6-8, während Pilze einen pH von 4-6 bevorzugen. Die notwendige Wasserstoffionenkonzentration ([H + ]) wird bei der Nährbodenbereitung mit 1 N NaOH und 1 N HCl eingestellt. Bakteriennährböden stellt man vor dem Sterilisieren auf pH 7,3 ein, da die H + -Konzentration durch das Erhitzen auf pH 7 absinkt, einen Wert, der für die meisten Bakterien optimal ist. Ist eine starke Ansäuerung des Mediums infolge des Bakterienwachstums zu erwarten, so setzt man dem Nährboden zur Pufferung CaC0 3 zu.

Im Folgenden sollen einige allgemeine (= kollektive) Nährböden für Bakterien bzw. Pilze und als Beispiel für einen Selektiv- und gleichzeitig Indikatornährboden der ENDO-Agar angegeben werden. Weitere Nährmedien werden in späteren Kapiteln berücksichtigt.

Indikatornährboden der ENDO-Agar angegeben werden. Weitere Nährmedien werden in späteren Kapiteln berücksichtigt. 7

I. Nährböden für Bakterien

1.

Fleischextrakt-Pepton-Bouillon (FPB)

 

Fleischextrakt Pepton aus Fleisch

 

3,0 g

5,0 g

Aqua dest. pH 7 (einstellen)

1000 ml

2.

Fleischextrakt-Pepton-Agar (FPA)

 

Fleischextrakt Pepton aus Fleisch

 

3,0 g

5,0 g

Aqua dest. pH 7 (einstellen)

1000 ml

Agar (pulverisiert und gereinigt)

3.

Hefeextrakt-Pepton-Bouillon

 

Hefeextrakt

1,0 g

Aqua dest.

1000 ml

Pepton aus Fleisch 10,0 g

 

pH 7 (einregulieren)

Glucose

4,0 g

4.

Hefeextrakt-Pepton-Agar

 

Der zuvor angegebenen Nährlösung 18,0 g Pulver-Agar

zusetzen.

 

5.

Nährbouillon

 

Pepton aus Fleisch 10,0 g

 

Fleischwasser pH 7 (einstellen)

1000 ml

NaC1

3,0 g

6.

Nähragar

 

Der Nährbouillon 18,0g Pulver-Agar zugeben.

7.

ENDO-Agar (ENDO, japanischer Bakteriologe)

Zusammensetzung:

ENDO-Agar ist ein häufig verwendeter Selektiv- und Indikator-Nährboden zur Differenzierung (Unterscheidung) von Darmkeimen (Enterobacteriaceae). Er zeigt an, ob Bakterien Lactose (Milchzucker) abbauen können. Der Nährboden enthält außer Lactose und anderen Zutaten noch sulfitreduziertes Fuchsin, auch fuchsinschweflige Säure genannt. Die beim Lactoseabbau entstehenden Aldehyde wandeln das nahezu farblose, reduzierte Fuchsin in rotes Fuchsin um. Demzufolge färben sich die Kolonien lactoseverwertender Darmbakterien rot, während bei lactosenegativen Keimen kein Farbumschlag eintritt. Die Anfärbung ist besonders bei den Kolonien von Escherichia coli sehr intensiv. Diese Kolonien zeigen auf ihrer Oberfläche einen grüngoldenen Glanz, Fuchsinglanz genannt.

Das Medium kann auch als Trockennährboden fertig bezogen werden (z.B. Merck 4044). Als Selektiv- und Indikatornährböden für Darmkeime werden auch der MACCONKEY-Agar (MCA) (Merck 5465, Oxoid CM 115) und der Eosin-Methylenblau-Agar (EMA) (Merck 1347, Oxoid CM 69) verwendet. E. coli bildet auf MCA violettrote, oft von einem trüben Hof (= ausgefallene Gallensalze) umgebene Kolonien. Auf EMA zeigen diese Kolonien im reflektierten Licht einen grünlichen Metallglanz.

Lactose Pepton aus Fleisch Na 2 SO 3 (Na-Sulfit) basisches Fuchsin

10,0 g

K 2 HPO 4 Agar dest. Wasser

3,5 g

10,0 g

15,0 g

2,5 g

1000 ml

0,4 g

pH 7,4 (vorgegeben)

 

II. Nährböden für Pilze

1. Sabouraud-Glucose-Agar (benannt nach dem franz. Dermatologen SABOURAUD

(1869-1938), der dieses Substrat zur Züchtung von Hautpilzen einsetzte.

Pepton aus Fleisch

 

10,0 g

Aqua dest.

1000 ml

Glukose (für Hefen Maltose)

40,0 g

pH 5,6 (einstellen)

 

2.

Czapek- Dox-Agar

Saccharose (oder Glukose)

 

30,0 g

Fe SO 4 x 7H 2 O

0,01 g

MaNO 3

 

2,0 g

Agar

15,0 g

MgSO 4 x 7H 2 O

 

0,5 g

dest. Wasser

1000 ml

KCl

 

0,5 g

pH 4,5 (vorgegeben)

 

KH 2 PO 4

 

1,0 g

   

3. Czapek-Dox-Nährlösung

Obige Bestandteile, aber ohne Agar

Die Zubereitung eines Agarnährbodens soll am Beispiel des Fleischextrakt-Pepton-Agars (FPA, s. o.) dargestellt werden.

Material: Fleischextrakt, Pepton aus Fleisch, gepulverter Agar, dest. Wasser, je eine Tropfflasche mit 1 N NaOH und

N HCl, Indikatorpapier pH 4-8 oder pH-Meter, graduierter 300 ml-Erlenmeyerkolben, 2 100 ml-Bechergläser, 3 Spatel, 1

Glasstab, Schere, Zellstoff, Aluminiumfolie, Wasserbad 100°C oder Heizplatte, Autoklav oder Dampfdrucktopf Kap. 1.3.2), Waage

(s.

1

Ausführung:

a. 0,3 g Fleischextrakt und 0,5 g Pepton in je ein Becherglas geben und in ein wenig Wasser lösen.

b. Beide Lösungen mischen und unter Zugabe von NaOH bzw. HCl auf etwa pH 7,3 einstellen.

c. Mischung in den 300 ml-Kolben schütten, 1,8 g Agar dazugeben und mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen.

d. pH-Wert kontrollieren.

e. Kolben ins Wasserbad oder auf eine Heizplatte stellen und unter Rühren oder Schwenken erhitzen, bis der Agar gelöst ist

f. Kolben nun locker mit einem Zellstoffstopfen verschließen (Abb. 1.7) und als Schutz gegen herabtropfendes Wasser über den Verschluss eine Kappe aus Alufolie legen.

g. 15 min bei 121°C im Autoklav sterilisieren.

h. Gerät auf etwa 80°C abkühlen lassen, den Nähragar entnehmen und in Mengen von etwa 15 ml in sterile Petrischalen oder Röhrchen (Abb.1.6) abfüllen.

Die Schalen können mehrere Tage, die Röhrchen dagegen wesentlich länger im Kühlschrank bevorratet werden (Abb. 1.4). Man kann den pH-Wert eines Nährbodens auch so regulieren, dass man an einem Aliquot des fertigen Nährmediums, z. B. an 10,0 ml, den NaOH- bzw. HCl-Verbrauch beim Einstellen misst und daraus errechnet, wie viel ml einer 1 N Lösung der Gesamtnährbodenmenge beigegeben werden müssen. Beim Abfüllen von Nährböden ist immer darauf zu achten, dass das Medium nicht mit den Verschlüssen der Kulturgefäße

in Berührung kommt, sonst können Organismen von außen in das Gefäß eindringen oder aus dem Gefäß nach außen

gelangen.

Zur Bereitung von zuckerhaltigen Nährböden, die bei Gärungsprüfungen eingesetzt werden, sollten die Kohlenhydrate getrennt vom übrigen Medium sterilisiert werden, weil bei der Erhitzung des Gesamtmediums auf 120°C stoffliche Veränderungen eintreten, die sich auf die Versuchsergebnisse auswirken. Man stellt in der Regel konzentrierte Zuckerlösungen her und gibt davon den separat sterilisierten übrigen Nährbodenbestandteilen so viel bei, dass die Endkonzentration erreicht wird. Im Handel befinden sich auch Fertignährböden, die in Pulverform angeboten werden. Man muss diese Trockennährböden lediglich mit der erforderlichen Wassermenge versetzen und dann sterilisieren. Die Vorteile liegen in der leichten Handhabung und der gleichbleibenden Zusammensetzung.

1.3 Sterilisationstechniken

Mikrobiologisches Arbeiten setzt in der Regel voraus, dass Nährböden, Kulturgefäße und Geräte steril sind. Unter Sterilisation versteht man die Abtötung von lebenden Mikroorganismen oder deren Ruhestadien (Sporen). Als Indiz dafür gilt der irreversible Verlust der Fortpflanzungsfähigkeit. Die nicht mehr vermehrungsfähigen Zellen verbleiben in der Regel am sterilisierten Gut.

Der Begriff Entkeimung wird häufig im Sinne von Sterilisation verwendet. In der Hygiene versteht man darunter auch die Entfernung aller lebenden und toten Zellen aus einem Medium, was nur durch Filtration erreicht werden kann. Viruspartikel verbleiben allerdings in der filtrierten Lösung.

Unter Desinfektion versteht man die Vernichtung von pathogenen Mikroorganismen. Man meint also eine selektiv wirksame Maßnahme zur Verhinderung einer Übertragung von Krankheitserregern. Oft beschränkt man sich lediglich auf die Verringerung der Keimmenge, z. B. bei der Händedesinfektion. Desinfektionsmaßnahmen zielen aber häufig nicht nur auf die Beseitigung pathogener Keime sondern auch auf die Vernichtung saprophytischer Mikroorganismen, z. B. in der Lebensmittelindustrie und bei der Oberflächendesinfektion des mikrobiologischen Arbeitsplatzes. In diesen Fällen kann man den Ausdruck pathogen durch die Bezeichnung "unerwünscht" ersetzen.

Die Pasteurisierung ist eine Teilsterilisation, durch die nur die vegetativen Zellen, nicht jedoch die Sporenstadien von Pilzen und Bakterien abgetötet werden. Bei der Pasteurisierung wird das Gut in der Regel 5-10 min auf 75-80 °C erhitzt. Milch wird zur Erhaltung des Geschmackswerts kürzeren Erhitzungszeiten unterworfen:

Kurzzeiterhitzung:

20-40 s auf

71

- 74 °C

Hocherhitzung:

2-5 s auf

85

- 87 °C

Ultrahocherhitzung: -

1-2 s auf 135-150 °C (durch Einleiten von überhitztem Dampf)

Die wichtigsten Verfahren zur Sterilisierung basieren auf der Anwendung von Hitze. Das folgende Diagramm gibt einen Überblick über die wichtigsten Formen der Hitzesterilisierung.

über die wichtigsten Formen der Hitzesterilisierung. Bei den einzelnen Formen der Heißluft- und

Bei den einzelnen Formen der Heißluft- und Dampfsterilisation ist zu beachten, dass das Sterilisiergut in den Sterilisatoren erst nach einer bestimmten Zeit die Sterilisiertemperatur annimmt. Der Ablauf einer Sterilisierung lässt sich von der Zeit her in vier Abschnitte gliedern (vgl. Abb.1.1):

1. Anheizzeit - Zeit für das Anheizen des Sterilisators,

2. Ausgleichszeit: Zeitspanne, bis das Gut die Sterilisiertemperatur angenommen hat,

3. Abtötungszeit: Einwirkungszeit der für das Abtöten erforderlichen Temperatur,

4. Abkühlzeit: Die für die Abkühlung des Gutes notwendige Zeit.

der für das Abtöten erforderlichen Temperatur, 4. Abkühlzeit: Die für die Abkühlung des Gutes notwendige Zeit.
Abb. 1.1: Zeitlicher Ablauf einer Sterilisation im Autoklaven. 1.3.1 Sterilisation durch trockene Hitze 1. Behandlung

Abb. 1.1: Zeitlicher Ablauf einer Sterilisation im Autoklaven.

1.3.1 Sterilisation durch trockene Hitze

1. Behandlung mit trockener Heißluft Gefäße und Geräte aus Glas werden in der Regel mit Heißluft sterilisiert. Verbindungen zwischen Geräteteilen werden gelockert, wenn diese aus verschiedenen Materialien bestehen (unterschiedliche Ausdehnungskoeffizienten!). Alle Geräte müssen vor der Sterilisation in Metallbehälter oder Aluminiumfolie verpackt werden, um sie vor Rekontamination zu schützen. Folgende Richtwerte gelten für trockenes Sterilisiergut:

Tab. 1.1: Richtwerte für die Heißluftsterilisation.

Temperatur in °C

Zeit in min

160

180

170

120

180

30

Lange Ausgleichszeiten müssen eingeplant werden. So nimmt z.B. ein Stapel Petrischalen in einem auf 180°C aufgeheizten Heißluftschrank erst nach 3,5 Stunden an der für die Sterilisation ungünstigsten Stelle eine Temperatur von 160°C an. Wenn zwischen das Sterilisiergut gelegte Watte nach der Hitzebehandlung leicht braun geworden ist, kann man annehmen, dass die erforderliche Temperatur herrschte. Als sogenannte Bioindikatoren für die richtige Geräteinstellung können auch im Boden enthaltene Bakteriensporen herangezogen werden. Dazu wird eine Spatelspitze lufttrockener Komposterde in einem Kulturröhrchen im Heißluftschrank erhitzt. Eine nach dem Abkühlen in das Röhrchen gegebene Nährlösung (z.B. FPB) darf nach 10tägiger Bebrütung bei 30°C keine Trübung, d.h. keinen Bewuchs, zeigen. Wenn kein spezieller Heißluftschrank zur Verfügung steht, kann auch ein Backofen als Sterilisator verwendet werden.

2. Ausglühen Die metallenen Impfgeräte (Öse, Nadel u.a.) werden in der Brennerflamme zum Glühen gebracht. Auch die Teile des Halters (Abb.1.1), die in ein Kulturgefäß eingeführt werden, müssen in der Flamme erhitzt werden. Weitere Ausführungen hierzu finden Sie im Kapitel 1.5.

3.

Abflammen

Metallgeräte wie Membranfiltergeräte, Scheren, Pinzetten usw. sowie Glasgeräte wie Pipetten und Glasstäbe werden oft zur schnellen Sterilisation abgeflammt. Die Glasgeräte taucht man vor dem Abflammen in 70%igen Alkohol. Auch die Ränder und Verschlüsse von Kulturgefäßen werden unmittelbar nach dem Öffnen und vor dem Verschließen der Gefäße abgeflammt. Die Methode gilt als unzuverlässig, da ihre Wirksamkeit nur schwer überprüft werden kann und zudem Sporen von Bodenbakterien kurzfristig wirkende Temperaturen von 290°C überleben können. Beim Abflammen muss also mit einer Teilsterilisation gerechnet werden.

1.3.2 Sterilisation durch feuchte Hitze (Dampf)

1. Strömender Dampf

Strömender Dampf wird in sogenannten Dampftöpfen erzeugt (Abb.1.2). Man kann sich auch mit einem Einwecktopf behelfen, der mit einem passenden Siebeinsatz versehen wurde. Die Dampfanwendung setzt die Temperaturresistenz der Bakteriensporen herab, da diese bei Benetzung quellen und dann hitzeempfindlicher sind. Aber auch bei 100°C heißem Dampf ist mit einer mehrstündigen Abtötungszeit zu rechnen, wenn es sich um Bakteriensporen handelt während vegetative Zellen bereits nach kurzer Zeit abgetötet werden. Nährmedien werden zur Sterilisation an drei aufeinanderfolgenden Tagen 30 min auf 100°C erhitzt. Damit wird erreicht, dass die das erste Erhitzen überlebenden Sporen auskeimen können und die dann gebildeten vegetativen Zellen vor einer erneuten Sporenbildung beim zweiten bzw. dritten Erwärmen abgetötet werden. Diese als fraktionierte Sterilisation oder

Tyndallisation bezeichnete Methode ist nur für die Sterilisierung von Nährmedien geeignet.

ist nur für die Sterilisierung von Nährmedien geeignet. Abb. 1.2: Aufbau eines Dampftopfs für die fraktionierte

Abb. 1.2: Aufbau eines Dampftopfs für die fraktionierte Sterilisation (Tyndallisation).

2. Gespannter Dampf

Das wichtigste und zuverlässigste Verfahren zur Keimtötung ist die Dampfsterilisation im Autoklaven (Abb.1.3). In diesem Druckgefäß können Wasserdampftemperaturen von über 100°C erzielt werden. Hierzu wird Wasser zum Sieden gebracht. Durch das geöffnete Ventil treibt der erzeugte Dampf die im Gefäß enthaltene Luft aus. Nach Verschluss des Ventils steigt nun die Temperatur des Wasserdampfes parallel mit dem ansteigenden Druck bis auf den durch einen Thermostaten oder ein Ventilgewicht vorgegebenen Wert.

Tab. 1.2: Abhängigkeit der Temperatur im Autoklaven vom jeweils herrschenden Dampfdruck

Dampfdruck in bar

Temperatur in °C

2

121

3

134

4

144

Der zeitliche Ablauf der Sterilisation ist aus Abb.1.1 ersichtlich. Während die Anheizzeit vom Autoklaventyp abhängig ist, verdienen Ausgleichszeit und Abtötungszeit besondere Beachtung. Für die Ausgleichszeit wurden folgende Richtwerte ermittelt:

Tab. 1.3: Richtwerte für die Ausgleichszeit beim Autoklavieren

Gefäß

Inhalt (in ml)

Ausgleichszeit (in min)

dünnwandige Ampulle dickwandige Arzneiflaschen

bis 10

0

100

10

 

250

15

500

20

1000

22

Die Abtötungszeit muss bei 121°C (2,1 bar) 20 Minuten und bei 134°C (3 bar) 5 Minuten betragen. Nach Ablauf der Abtötungszeit darf der Druck nicht abgelassen werden; man lässt vielmehr das Gerät nach Abschalten auf etwa 80°C abkühlen, bevor man das Sterilisiergut entnimmt. Auch bei der Dampfsterilisation müssen die Materialien vor einer späteren Rekontamination geschützt werden. Petrischalen und Pipetten werden daher schon vor der Sterilisation in entsprechende Büchsen (Petrischalen- bzw. Pipettenbüchsen) gestellt oder in Aluminiumfolie gepackt. Mit Watte oder Zellstoff verschlossene Gefäße werden im Dampftopf und im Autoklaven mit Aluminiumfolie abgedeckt und so vor herabtropfendem Kondenswasser geschützt. In der Schule kann man statt eines Autoklaven auch einen Schnellkochtopf benutzen. Die Betriebstemperatur dieses Gerätes beträgt etwa 125°C.

eines Autoklaven auch einen Schnellkochtopf benutzen. Die Betriebstemperatur dieses Gerätes beträgt etwa 125°C. 13
Abb. 1.3: Aufbau eines doppelwandigen Autoklavs 1.3.3 Andere Sterilisationsmethoden Lösungen hitzeempfindlicher Stoffe

Abb. 1.3: Aufbau eines doppelwandigen Autoklavs

1.3.3 Andere Sterilisationsmethoden

Lösungen hitzeempfindlicher Stoffe werden in der Regel durch Sterilfiltration entkeimt. Hierbei werden engporige Filter verwendet, deren Poren eine definierte Größe aufweisen (z.B. 0,2 µm). Die in einer Flüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen werden an der Filteroberfläche zurückgehalten. Das in einem sterilen Gefäß aufgefangene Filtrat ist frei von Mikroorganismen (Ausnahme: Viren). Spezielle Bakterienfilter sind im Handel erhältlich. Sterilfiltrationen können auch mittels Membranfiltergeräten vorgenommen werden.

Auch chemische Mittel werden zur Sterilisation bzw. Desinfektion eingesetzt. Die gebräuchlichsten sind 70%iger Alkohol (z.B. Ethanol, Isopropanol) und 10%iges Formalin. Diese Stoffe bewirken das Fällen von Eiweißen. Von Bedeutung sind auch das Phenol und seine Derivate (z.B. Sagrotan), deren Angriffspunkt die Cytoplasmamembran ist. Das gasförmige, mit Luft leicht entflammbare Ethylenoxid wird bei der Sterilisation von Nahrungsmitteln, Medikamenten und Kunststoffgeräten (z.B. Plastikpetrischalen) verwendet. Dieser sehr giftige Stoff - er wird mit CO 2 oder N 2 gemischt - wirkt nur, wenn Wasser zugegen ist.

Zum Abtöten von Mikroorganismen in Raumluft und auf Oberflächen wird häufig UV-Strahlung eingesetzt. Sie wirkt jedoch nur im direkt angestrahlten Bereich von Räumen. Die UV-Strahlen schädigen die Erbsubstanz und töten auf diese Weise Mikroorganismen ab. Besonders wirksam ist UV-Strahlung aus dem Wellenlängenbereich um 260 nm.

töten auf diese Weise Mikroorganismen ab. Besonders wirksam ist UV-Strahlung aus dem Wellenlängenbereich um 260 nm.
töten auf diese Weise Mikroorganismen ab. Besonders wirksam ist UV-Strahlung aus dem Wellenlängenbereich um 260 nm.

1.4 Kulturgefäße

Die der Züchtung von Mikroorganismen dienenden Gefäße werden als Kulturgefäße bezeichnet. Einige zur Kultur kleinerer Mengen von Mikroorganismen verwendete Gefäße sollen im folgenden beschrieben werden.

verwendete Gefäße sollen im folgenden beschrieben werden. Abb. 1.4 Gießen von Agarplatten Petrischalen sind aus Boden

Abb. 1.4 Gießen von Agarplatten

Petrischalen sind aus Boden und Deckel bestehende Doppelschalen. Meistens werden Schalen mit 9-10 cm Bodendurchmesser verwendet. Sie werden mit 15-20 ml Nährboden beschickt. In der Regel bewahrt man eine größere Anzahl bereits sterilisierter Nährbodenportionen in Röhrchen abgefüllt im Kühlschrank auf, um sie bei Bedarf zu verflüssigen (erhitzen) und dann in sterile Petrischalen zu gießen (Abb.1.4). Solche mit Nährboden beschickte Schalen werden Platten genannt.

Da sich an der Innenseite des Schalendeckels und am Innenrand des Bodens nach dem Plattenguss Kondenswasser ansammelt und der Agar beim Abkühlen infolge Entquellung Wasser auspresst (Synäresewasser), müssen Agarplatten vor der Beimpfung in einem keimarmen, 37 - 40°C warmen Trockenschrank 30-60 Minuten getrocknet werden. Dabei werden Boden und Deckel getrennt und mit den Öffnungen nach unten schräg aufgestellt (Abb.1.5). Werden nasse Platten nicht getrocknet, so können nach Beimpfen keine deutlich voneinander abgegrenzten Kolonien entstehen (s. Kap.4.1), da das Kondenswasser Bakterien abschwemmt und die Bakterien selbst sich in dem Feuchtigkeitsfilm durch Schwimmen ausbreiten können. Um beimpfte Platten vor herabtropfendem Kondenswasser zu schützen, werden Petrischalen mit der Bodenseite nach oben aufbewahrt.

werden Petrischalen mit der Bodenseite nach oben aufbewahrt. Abb. 1.5: Aufstellen von Agarplatten zum Trocknen bei

Abb. 1.5: Aufstellen von Agarplatten zum Trocknen bei 40°C.

Kulturröhrchen besitzen im Gegensatz zu Reagenzgläsern eine dickere Wand und einen geraden Rand (Abb.1.6). Sie werden mit luftdurchlässigem Material (Watte, Zellstoff) oder Leichtmetallkappen (z.B. Kapsenbergkappen), die der Röhrchenöffnung elastisch anliegen, verschlossen. Zwischen Gefäßwand und Kappenrand darf sich keine Flüssigkeit ansammeln, da diese den Gasaustausch behindern und zudem zur Infektionsquelle für den sterilen Röhrcheninhalt werden könnte. Abb. 1.7 zeigt, wie man Verschlüsse aus Watte bzw. Zellstoff herstellen kann.

man Verschlüsse aus Watte bzw. Zellstoff herstellen kann. Abb. 1.6: Kulturröhrchen mit Kapsenbergkappe bzw.

Abb. 1.6: Kulturröhrchen mit Kapsenbergkappe bzw. Zellstoffstopfen.

Kulturröhrchen mit Kapsenbergkappe bzw. Zellstoffstopfen. Abb. 1.7: Herstellung von Watte- oder Zellstoffverschlüssen

Abb. 1.7: Herstellung von Watte- oder Zellstoffverschlüssen für Röhrchen

Abb. 1.8: Kulturröhrchen. A Hoschichtröhrchen, B Herstellen eines Schrägagarröhrchens. Kulturröhrchen können mit

Abb. 1.8: Kulturröhrchen. A Hoschichtröhrchen, B Herstellen eines Schrägagarröhrchens.

Kulturröhrchen können mit festen, halbfesten oder flüssigen Nährmedien beschickt werden. Die Röhrchen werden anschließend in Bechergläsern, deren Boden mit Watte gepolstert wurde oder in besonderen Metallgestellen aufbewahrt. Für einen sicheren Stand sorgen auch Holzklötze, die mit etwa 6 cm tiefen Bohrungen von ca. 18 mm Durchmesser versehen wurden.

Hochschichtröhrchen dienen der Bevorratung von abgemessenen, sterilen Nährbodenmengen (Abb.1.4) oder dem Anlegen von Stichkulturen. Schrägagarröhrchen enthalten etwa 5-7 ml in schräger Lage erstarrten Nährboden (Abb.1.8). Dadurch steht beim Beimpfen eine größere Oberfläche zur Verfügung.

Flüssigkeitskulturen aerober Mikroorganismen werden vorzugsweise in Erlenmeyerkolben, Steilbrustflaschen und Kulturkolben (Fernbachkolben) angelegt (Abb.1.9). Die große Grenzfläche zwischen Kulturmedium und Luft erleichtert den Gasaustausch und begünstigt so das Wachstum der Kultur. Die genannten Kulturgefäße können sowohl mit Watte- und Zellstoffstopfen als auch mit entsprechenden Metallkappen verschlossen werden.

auch mit entsprechenden Metallkappen verschlossen werden. Abb. 1.9: Verschiedene Typen von Kulturflaschen. Die

Abb. 1.9: Verschiedene Typen von Kulturflaschen. Die Zahlenangaben beziehen sich auf die am häufigsten verwendeten Größen (Nenninhalt).

1.5 Impftechniken

In der Mikrobiologie versteht man unter Impfen die Übertragung lebender Mikroorganismen auf oder in ein Nährmedium. Dabei bedient man sich verschiedener Impfgeräte (Abb.1.10).

Dabei bedient man sich verschiedener Impfgeräte (Abb.1.10). Abb. 1.10: Impfgeräte für die Übertragung von

Abb. 1.10: Impfgeräte für die Übertragung von Mikroorganismen.

Die Impföse besteht aus einem 5-6 cm langen Draht aus Platin-Iridium oder einer hitzebeständigen Stahllegierung. Der Draht ist am Vorderende zu einem Ring gebogen, der je nach Durchmesser und Drahtdicke verschiedene Flüssigkeitsmengen aufnehmen kann:

Tab. 1.4: Fassungsvermögen von Impfösen

Ösendurchmesser (in mm)

Flüssigkeitsmengen (in mm³)

2

2

3

5

4

7,5

Mit der Impföse werden vorwiegend Agarnährböden und kleinere Mengen flüssiger Nährmedien beimpft. Die Öse wird vor und nach Gebrauch in der Entleuchteten, prasselnden Brennerflamme ausgeglüht. Man hält den Kollerhalter dabei fast senkrecht und bewegt die Öse im äußeren (oxidierenden) Teil der Flamme langsam auf und ab (Abb.1.11). Die Hitze soll auch den Raum unter der Überwurfmutter erreichen, wo sich Keime ansammeln können. In gleicher Weise müssen die Teile des Kollerhalters, die beim Impfen mit dem Kulturgefäß in Berührung kommen könnten, abgeflammt werden, aber ohne den Halter zu überhitzen. Vorsicht ist geboten, wenn nach dem Impfen noch größere Mengen von Mikroorganismen an der Öse haften. In diesem Fall wird die Öse zunächst über der Brennerflamme getrocknet oder in 70%igen Alkohol getaucht und erst dann ausgeglüht, um ein Verspritzen noch lebenden Impfmaterials und die Bildung eines keimhaltigen Aerosols zu vermeiden.

Abb. 1.11: Trocknen (1) und Ausglühen (2) der Impföse in der Brennerflamme.

Der Drigalski-Spatel dient der gleichmäßigen Verteilung von Impfmaterial (z.B. einer Bakteriensuspension) auf einer festen Nährbodenoberfläche (Spatelplatten-Methode). Spatel werden zur Sterilisierung in 70%igen Alkohol getaucht und danach abgeflammt. Impfgeräte sind nicht auf den Arbeitsplatz zu legen, sondern auf- rechtstehend in einem mit passenden Bohrungen versehenen Holzblock aufzubewahren.

Definierte Mengen von Mikroorganismensuspensionen und Verdünnungsmedien werden mit sterilen Pipetten aufgezogen und übertragen. Die Pipetten werden vor dem Sterilisieren (bei trockener Hitze oder gespanntem Dampf) am oberen Ende ("Mundstück") mit einem etwa 2 cm langen, lockeren Wattepfropfen versehen, damit beim Ablassen der Flüssigkeit mit der nachströmenden Luft keine Keime in den Innenraum der Pipette gelangen. Beim Pipettieren von Flüssigkeitskulturen und gefährlichen Materialien verwendet man einen Pipetierball (z.B. Peleus-Ball). Pipetten werden nach Gebrauch in einen mit 70%igem Alkohol oder Desinfektionslösung gefüllten Glaszylinder gestellt.

Einige grundlegende Impftechniken sollen im folgenden dargestellt werden.

I. Übertragung von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen auf eine Agarplatte mit der

Öse (Abb.1.12 u.1.13)

Material: Schrägagarkultur, Agarplatte, Brenner, Impföse, Reagenzglasständer, Filzschreiber

Ausführung:

a) Röhrchen in die linke Hand, Impfgerät zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger der rechten Hand nehmen (Schreibhaltung).

b) Öse und unteren Teil des Kollerhalters ausglühen bzw. abflammen.

c) Verschluss des Röhrchens, mit dem Handrücken nach unten, zwischen Mittel- und Ringfinger der rechten Hand nehmen und entfernen, ohne ihn abzulegen. Sofort die Öffnung des waagerecht gehaltenen Röhrchens abflammen.

d) Impföse ohne Randberührung einführen, abkühlen lassen und das Bakterien- oder Sporenmaterial entnehmen.

e) Nach Abflammen der Öffnung und des Verschlusses das Röhrchen verschließen und wegstellen.

f) Mit der linken Hand den Deckel der Petrischale auf einer Seite anheben und Impfmaterial in Schlangenlinie auf Nährbodenoberfläche ausstreichen, Deckel wieder schließen.

g) Öse trocknen, ausglühen und den Halter wegstellen.

h) Schale mit dem Boden nach oben aufstellen und beschriften (Kennzeichnung des Mikroorganismus, Datum/Uhrzeit, evtl. Kulturbedingungen und Name der Person, die die Überimpfung vornahm ).

des Mikroorganismus, Datum/Uhrzeit, evtl. Kulturbedingungen und Name der Person, die die Überimpfung vornahm ). 19

II. Überimpfung von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen in ein anderes mittels Öse

(Abb.1.14)

Material. Schrägagarkultur, frisches Schrägagarröhrchcn, Brenner, Impföse, Reagenzglasständer

Ausführung: 1.) Beide Röhrchen in die linke Hand nehmen. 2.) Impfgerät sterilisieren (wie oben angegeben). 3.) Die beiden Röhrchenverschlüsse mit dem 3. und 4. bzw. dem 4. und 5 Finger nacheinander entfernen und in der Hand behalten. Öffnungen der beiden Röhrchen abflammen. 4.) Mit der abgekühlten Öse Impfmaterial aus dem einen Röhrchen entnehmen und auf der Nährbodenoberfläche des anderen Röhrchens in Schlangenlinie ausstreichen. 5.) Öffnungen sowie Verschlüsse abflammen und Röhrchen verschließen. 6.) Öse trocknen, ausglühen und Halter wegstellen. 7.) Das beimpfte Röhrchen beschriften.

Halter wegstellen. 7.) Das beimpfte Röhrchen beschriften. Abb. 1.14: Überimpfen von Mikroorganismen aus einem

Abb. 1.14: Überimpfen von Mikroorganismen aus einem Röhrchen in ein anderes mittels Impföse.

III. Verteilen von Mikroorganismen auf einer Agaroberfläche mit Hilfe des Drigalski-Spatels (Spatelplatten-Methode)

Material: Mikroorganismensuspension, Agarplatte mit trockener Oberfläche, Gefäß mit 70%igem Alkohol, sterile 0,1 ml- Pipette, Pipettier-Ball, steriler Spatel, Brenner

Ausführung: 1.) Röhrchen mit der Suspension in die linke Hand, die Pipette in die rechte Hand nehmen. 2.) Mit dem 3. und 4. Finger der rechten Hand den Verschluss des Röhrchens entfernen. 3.) Öffnung des Röhrchens und unteren Teil der Pipette kurz abflammen. 4.) Pipette in das Gefäß einführen und 0,1 ml Suspension aufziehen. 5.) Röhrchen verschließen und wegstellen. 6.) Mit der linken Hand Deckel der Petrischale anheben und Suspension in 3-4 Tropfen portioniert auf die Agaroberfläche tropfen. 7.) Pipette in Alkohol stellen und die aufgetragene Suspension sofort etwa 30 s lang ausstreichen. Dabei die Platte fortwährend drehen und den Spatel in radialen Bahnen hin- und herschieben. 8.) Glasspatel in Alkohol stellen. 9.) Platte verschließen, auf der Bodenseite beschriften und auf dem Deckel stehend aufbewahren. Die Beherrschung der hier dargestellten Impftechniken wird in späteren Kapiteln vorausgesetzt.

Eine besondere Impftechnik ist die von Lederberg entwickelte Stempelmethode, die es erlaubt, alle auf einer Platte (Mutterplatte) vorhandenen Kolonien von Mikroorganismen, Koloniemuster genannt, auf frische Platten (Tochterplatten) zu überimpfen. Bis zu 100 Kolonien können so in einem einzigen Impfvorgang übertragen werden. Diese Überimpfung erfolgt mit dem sogenannten Ledercke-Stempel, den man sich wie folgt herstellen kann (Abb.1.15):

Abb. 1.15: Ledercke-Stempel für die Überimpfung von Koloniemustern. Erklärung im Text. Die Fläche eines zylindrischen

Abb. 1.15: Ledercke-Stempel für die Überimpfung von Koloniemustern. Erklärung im Text.

Die Fläche eines zylindrischen Holzblocks, Durchmesser 80 mm, Höhe 50 mm, mit einem im Autoklaven sterilisierten feinflorigen Samttuch der Größe 15 x 15 cm fest bespannen. Dabei die Ränder des Samtstücks mit einem vorgefertigten, sterilen Metallring (z.B. Drahtring) seitlich am Holzblock festklemmen. Am Ring eine Markierung anbringen. Jedes der Samthaare hat die Funktion einer winzigen Impföse, die Bakterienmaterial aufnimmt und auf frischen Nährboden überträgt.

Im folgenden wird der Arbeitsgang bei der Stempelmethode kurz dargestellt:

a) Brenner mit nichtleuchtender Flamme in der Nähe des Stempels aufstellen.

b) An der Mutterplatte (master plate), und zwar am Rand des Schalenbodens, Markierung anbringen.

c) Die Nährbodenoberfläche der bewachsenen Mutterplatte von oben her, so dass die Markierungen an Metallring und Schale übereinanderstehen, leicht auf die Samtfläche des Stempels drücken.

d) Die frischen Tochterplatten, die in gleicher Weise wie die Mutterplatte mit einer Markierung versehen wurden, nacheinander auf die Samtfläche drücken. Auch hierbei müssen die Marken an Stempel und Platten überein- anderstehen.

Die letzte Tochterplatte dient als Kontrolle. Sie enthält den gleichen Nährboden wie die Mutterplatte und wird in der gleichen Weise bebrütet. Nur wenn diese Kontrollplatte nach Bebrütung das gleiche Koloniemuster wie die Mutterplatte zeigt, kann man davon ausgehen, dass dieses Muster auch auf die übrigen Tochterplatten überimpft wurde. Die überimpften Mikroorganismen können unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden (Nährbodenzusammensetzung, Temperatur, Belüftung, Hemmstoffzusatz u.a.). Auf den entsprechenden Tochterplatten werden nur die Kolonien derjenigen Bakterien erscheinen, die unter den vorgegebenen Bedingungen wachsen können. Lücken im Koloniemuster erlauben dann Rückschlüsse auf entsprechende physiologische Ansprüche oder andere Eigenschaften.

1.6 Kulturtechniken

Die Kultivierung von Mikroorganismen umfasst in der Regel zwei Schritte:

1. Beimpfung des sterilen Nährmediums mit einer kleinen Keimmenge, Inokulum oder

Einsaat genannt,

2. Bereitstellung der notwendigen Wachstumsbedingungen.

Neben der Temperatur spielt die Sauerstoffversorgung eine wichtige Rolle. Man unterscheidet zwischen aeroben und anaeroben Kulturverfahren.

Aerobe Kulturverfahren dienen der Züchtung von Mikroorganismen, die entweder als obligate Aerobier nur zur Atmung oder als fakultative Anaerobier sowohl zum Atmungs- als auch zum Gärungsstoffwechsel befähigt sind. Den an der Oberfläche von Nährmedien wachsenden Mikroorganismen steht genügend Sauerstoff zur Verfügung. Solche OberfIächenkulturen werden in der Regel auf festen Nährböden (Platten, Schrägagar) oder als Deckenkulturen an der Oberfläche von Nährlösungen angelegt, was besonders für die Kultivierung von Pilzen gilt. Diese Pilzdecken bestehen aus einem stark verflochtenen Mycel, das sich aber nur dann bilden kann, wenn die Kulturflüssigkeit nicht geschüttelt wird. Auch aerobe Bakterien können geschlossene Decken entwickeln, die durch Verkleben der Zellen infolge Schleimbildung entstehen und Kahmhäute genannt werden. Während der Sauerstoff bei Oberflächenkulturen leicht ins Zellinnere gelangen kann, ist die Diffusion dann sehr stark behindert, wenn die Zellen in einer Nährlösung wachsen. In einer solchen Submerskultur entstehen infolge der Sauerstoffzehrung unter der Flüssigkeitsoberfläche alsbald anaerobe Bedingungen. Aerobe Mikroben lassen sich daher nur dann submers züchten, wenn für eine fortlaufende Sauerstoffversorgung gesorgt wird. Hierzu wird eine im Verhältnis zum Flüssigkeitsvolumen große Phasengrenzfläche zwischen Luft und Nährmedium geschaffen. Dafür bieten sich folgende Techniken an:

1. Kultur in flacher Schicht (Abb.1.16 A),

2. Schütteln oder Rollern, was eine fortlaufende Erneuerung der Grenzschicht bewirkt (Abb.1.17 A bzw. C),

3. Einleitung von entkeimter Luft in die Nährlösung (submerse Belüftung, Abb.1.17 B).

Verschiedene Formen der submersen Belüftung werden bei der Kultivierung von Mikroorganismen in Fermentern (Tanks mit einem Fassungsvermögen bis zu 1000 hl Nährlösung) angewandt.

Bei den anaeroben Kulturverfahren erfolgt die Züchtung der Mikroorganismen in einer nahezu sauerstofffreien Atmosphäre. Diese Organismen, es handelt sich um die obligat anaeroben und fakultativ anaeroben Formen, gewinnen unter diesen Bedingungen die notwendige Energie in der Regel auf dem Weg der Gärung. Fakultativ anaerobe Mikroorganismen werden oft in Röhrchen, die bis zu 2/3 ihres Volumens mit Nährlösung gefüllt sind, gezüchtet. Über die kleine Phasengrenze zwischen Medium und Luft kann nur wenig Sauerstoff eindringen, so dass am Grund des Gefäßes anaerobe Bedingungen herrschen (Kultur in hoher Schicht, Abb.1.16 C). Das anaerobe Milieu in einem Hochschichtröhrchen kann noch besser geschützt werden, wenn bei der Züchtung anaerober Mikroorganismen anstelle eines flüssigen Substrates Nähragar verwendet wird.

Abb. 1.16: Einfache aerobe und anaerobe Kulturverfahren. Stichkulturen verraten, ob ein Mikroorganismus aerob (D),

Abb. 1.16: Einfache aerobe und anaerobe Kulturverfahren. Stichkulturen verraten, ob ein Mikroorganismus aerob (D), fakultativ anaerob (E) oder obligat anaerob (F) ist. Ein beimpfter Hochschichtagar kann noch mit sterilem Agar oder Paraffinöl überschüttet werden (0). Weitere Erklärungen im Text.

Dieser wird entweder im noch flüssigen Zustand, d.h. bei 46°C, mit dem Impfmaterial durch Schütteln vermischt (Schüttelagar-Kultur) oder nach Erstarren durch Einstich mit einer Nadel beimpft (Stichkultur, Abb.1.16 D-G). Überschichtet man den beimpften Agar noch mit sterilem Agar oder Paraffinöl, so entsteht eine zusätzliche Barriere gegen den Luftsauerstoff (Abb.1.16 G). Stichkulturen werden häufig angelegt, um zu erkunden, ob ein Mikroorganismus aerob, fakultativ anaerob oder obligat anaerob ist. Der betreffende Keim entwickelt sich nach Überimpfung in dem Teil des Hochschichtagars, erkennbar am Abstand der Trübungszone (Wachstumszone) von der Substratoberfläche, in dem die für ihn günstigste Sauerstoffspannung herrscht (Abb.1.16 D-F). Nichtgasbildende Anaerobier können auch in luftblasenfrei verschlossenen Flaschen gezüchtet werden (Flaschenkultur, Abb.1.16 B).

Abb.1.17: Einrichtungen für die Belüftung und Bewegung von Submerskulturen. A. Schüttelapparatur

Abb.1.17: Einrichtungen für die Belüftung und Bewegung von Submerskulturen. A. Schüttelapparatur (Horizontalschüttler); Kulturflaschen sind zwecks stärkerer Turbulenz oft mit Einbuchtungen (Schikanen) versehen (siehe Grundriss oben mitte). B Belüftung mit Hilfe einer Aquarienpumpe. Zur Luftentkeimung können Waschflaschen mit Kaliumpermanganat (1 %) und Sublimat (0,1 %) vorgeschaltet werden. C Rollerapparatur zum Selbstbau.

Für die Kultur im sauerstofffreien Raum verwendet man in der Regel spezielle Anaerobentöpfe, aus denen der Sauerstoff entweder durch Absaugen oder durch Verdrängen mit Stickstoff, Wasserstoff oder Edelgasen unter Zugabe von 5 Vol.% Kohlendioxid entfernt wurde. Der Sauerstoff kann außerdem auf chemischem Wege mit Hilfe eines Absorptionsmittels wie z. B. alkalischem Pyrogallol und auf biologischem Wege mittels fakultativ anaerober Mikroorganismen, die zusammen mit den obligat anaeroben Keimen kultiviert werden, aus dem Kulturgefäß entfernt werden. Einige dieser anaeroben Verfahren werden bei der Anreicherung und Züchtung von Clostridien angewandt.

1.7

Beschaffung und Aufbewahrung von Mikroorganismen

Die für Praktika benötigten Mikroorganismen sollten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) oder einer anderen zuverlässigen Quelle bezogen werden. Manche Stämme können auch im Praktikumsverlauf aus dem Boden, dem Wasser und der Luft isoliert werden. Die Gefahr der Isolierung pathogener Keime kann eingeschränkt werden, wenn man die Anreicherungskulturen bei Raumtemperatur, d.h. bei etwa 21°C, bebrütet. Grundsätzlich müssen alle unbekannten und noch nicht sicher bestimmten Isolate wie pathogene Formen behandelt werden. Auch beim Umgang mit Kulturen von Mikroorganismen, die als nichtpathogen gelten, ist zu bedenken, dass Zellen infolge Mutationen ihr Verhalten so verändert haben könnten, dass sie nunmehr für den Menschen gefährlich sind oder dass die Kulturen möglicherweise durch pathogene Formen verunreinigt wurden.

Folgende Mikroorganismen werden als nahezu ungefährlich angesehen und können unter Beachtung der entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen auch in Schulen verwandt werden':

1. Bakterien:

Acetobacter aceti (Essigsäurebakterium), Bacillus subtilis ("Heubazillus"), Janthinobacterium lividum (= Chromobacterium lividum), Erwinia carotovora, Escherichia coli (nur spezielle Stämme!), Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium leguminosarum (Knöllchenbakterium), Spirillum serpens, Staphylococcus warneri (= Staphylococcus albus), Staphylococcus epidermidis, Streptococcus lactis, Streptomyces griseus, Vibrio natriegens (= Beneckea natriegens)

2. Pilze:

Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Botrytis cinerea (Grauschimmel), Chaetomium-globosum, Coprinus lagopus, Fusarium solani, Mucor hiemalis, Mucor mucedo, Penicillium notatum, Phycomyces blakesleeanus, Pythium debaryanum,

Phytophthora infestans, Rhizopus sexualis, Rhizopus niger (= Rhizopus stolonifer), Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces pombe, Saprolegnia litoralis, Sordana fimicola

3. Viren:

Bacteriophagen (T-Typ bei E. coli)

Die Liste erfasst nicht sämtliche für die Schule bzw. ein Anfängerpraktikum geeigneten Mikroorganismen, sondern berücksichtigt nur jene, die in Großbritannien im Rahmen von Science Teaching Projects eingesetzt werden und sich dabei bewährt haben. Gleichwohl sei darauf hingewiesen, dass auch die hier erwähnten Schimmelpilze, vor allem die Aspergillen und Köpfchenschimmel, mit Vorsicht zu behandeln sind. So muss z. B. im Hinblick auf mögliche Infektionen der Luftwege, Allergien und Kontaminationen des Arbeitsraumes vermieden werden, dass beim Öffnen von Kulturgefäßen größere Sporenmengen eingeatmet werden bzw. in die Raumluft gelangen. Für einführende mikrobiologische Untersuchungen eignen sich auch Bacillus megaterium und Bacillus cereus var. mycoides ("Wurzelbazillus") sowie Schwefelbakterien, ebenso einige bei der Lebensmittelbereitung genutzte Mikroorganismen wie z. B. Penicillium camemberti, P. roqueforti und die zur Herstellung von Sauermilchprodukten verwendete Milchsäurebakterien.

Abb. 1.18: Sicherung der Stammkultur und Anlegen von Gebrauchskulturen. Mikroorganismen werden in der Regel in

Abb. 1.18: Sicherung der Stammkultur und Anlegen von Gebrauchskulturen.

Mikroorganismen werden in der Regel in Form von Stammkulturen verfügbar gehalten. Dazu überimpft man die Keime am besten in Stichröhrchen (Abb. 1.16 und 1.18), die man anschließend, z. B. bei Raumtemperatur, bebrütet. Nach Anwachsen der Kultur werden die Röhrchen luftdicht verschlossen (Plastikklebeband um Kapsenbergkappe, steriler Gummistopfen, in verflüssigtes Paraffin getauchter Watte- oder Zellstoffstopfen). Stichröhrchen sind vorteilhafter als Schrägagarröhrchen, weil der Nährboden nicht so schnell austrocknet und der Bewuchs schwächer ist. Infolgedessen werden weniger Nährstoffe verbraucht und geringere Mengen schädlicher Stoffwechselprodukte gebildet. Hinzu kommt, dass Zellen im sauerstoffarmen Stichkanal länger leben. Als Nährböden für Stammkulturen von Bakterien eignen sich vor allem kohlenhydratarme Medien. Auf solchen Substraten produzieren Bakterien nur kleine Säuremengen, so dass der pH-Wert nicht bedrohlich absinken kann.

Als wirksames Verfahren für die Sicherung von Stammkulturen gilt das sogenannte Oil Sealing. Hierbei werden die Kulturen, sobald sie reichliches Wachstum zeigen, mit Paraffinöl, das zuvor 3 h bei 160 °C trockensterilisiert wurde, überschichtet. Stammkulturen können in der Regel mehrere Wochen im Kühlschrank (nicht zusammen mit Lebensmitteln!) oder bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Sie müssen aber nach einem festen Zeitplan, in der Regel etwa alle vier Wochen, auf frischen Nährboden übertragen und so erneuert werden. Ab und zu sollte durch Ausstrich getestet werden, ob die Kulturen nicht mit fremden Keimen verunreinigt sind.

Mikroorganismen können auch in Form von Stammkonserven bereitgehalten werden. Bei der Konservierung werden die Zellen durch Trocknen oder Tiefgefrieren in einen Ruhezustand versetzt, der weder Lebensvorgänge noch Mutationen zulässt. Das Verfahren erfordert allerdings einen hohen technischen Aufwand und wird daher nur bei großen Stammsammlungen, z.B. bei der DSMZ, angewandt.

2.0

Allgemeine Grundlagen:

2.1 Bunsenbrenner (Ausglühen und Abflammen)

Zum Ausglühen und Abflammen benutzt man einen Bunsenbrenner (Abb.2.1). Ist kein Gasanschluss vorhanden, so kann man einen Kartuschenbrenner (Campingbrenner) verwenden, den man auf eine Propan- oder Butangas- Kartusche aufsetzt. Vor Benutzung stellt man die Luftzufuhr am Bunsenbrenner so ein, dass eine nichtleuchtende, rauschende Flamme mit einem hellblauen Innenkegel und einem blasseren, dunkelblauvioletten Außenkegel entsteht (Abb.2.2). Der Innenkegel ist im Innern verhältnismäßig kalt (ca. 300°C), während im Außenkegel Temperaturen bis zu 1500°C erreicht werden.

im Außenkegel Temperaturen bis zu 1500°C erreicht werden. Abb. 2.1: Bunsenbrenner mit Wipphahn Ausglühen: Durch das

Abb. 2.1: Bunsenbrenner mit Wipphahn

Ausglühen:

Durch das Ausglühen im äußeren Teil des Außenkegels der Bunsenbrennerflamme werden Impfösen - und -nadeln schnell und zuverlässig sterilisiert. Die dabei erreichten Temperaturen von über 1000°C (Gelbglut) töten die Mikroorganismen in Sekundenbruchteilen ab. Auch andere Instrumente aus Metall, z.B. Präpariernadeln, Pinzetten, Scheren oder Skalpelle, kann man im Notfall durch Ausglühen sterilisieren, jedoch leidet das Material sehr stark , besonders die Schneidschärfe von Klingen. Vor der Benutzung müssen die Instrumente abgekühlt werden, damit sie keine Zellen schädigen oder thermolabile Substanzen schädigen.

Abb. 2.2: Ausglühen der Impföse in der Bunsenbrennerflamme Abflammen: Es ist weitverbreitete Praxis, Metall-, Glas-

Abb. 2.2: Ausglühen der Impföse in der Bunsenbrennerflamme

Abflammen:

Es ist weitverbreitete Praxis, Metall-, Glas- und Porzellangeräte abzuflammen, um sie oberflächlich zu sterilisieren. Pinzetten, Spatel, Scheren oder Skalpelle werden kurze Zeit in die Flamme gehalten, ohne sie zum Glühen zu bringen; Filtrationsgeräte werden vor der Filtration mit der Bunsenbrennerflamme bestrichen. Der Erfolg dieser Methode ist jedoch zweifelhaft, da Temperaturen und Einwirkzeit oft nicht ausreichen, um alle Keime abzutöten. Dies gilt besonders für raue Oberflächen, in deren Spalten und Poren die Mikroorganismen vor der Flamme geschützt sind. Auch das Eintauchen in 96%igen Ethanol und anschließende Abbrennen des anhaftenden Alkohols bewirkt keine sichere Sterilisation. Beide Verfahren stellen daher nur einen Notbehelf dar. Bei ihrer Anwendung ist zu beachten, dass die Geräte vor der Benutzung genügend abgekühlt seien müssen. Besser ist es aber in jedem Falle, die benötigten Geräte im Autoklaven oder Heißluftsterilisator zu sterilisieren.

Auch das Abflammen sterilisierter Pipetten und der Öffnungen von Kulturgefäßen beim Überimpfen ist in der Regel überflüssig und allenfalls gerechtfertigt, um störende Wattefäden abzubrennen. Es reduziert nicht nennenswert die Kontaminationsgefahr, sondern kann sie durch die dabei auftretenden Luftbewegungen sogar erhöhen. Aus demselben Grunde bringt es keinen Vorteil, Kulturgefäße oder Pipettenbüchsen über der Flamme zu öffnen. Watte- und Zellstoffstopfen sollte man auf keinen Fall abflammen, da dabei Verbrennungsprodukte entstehen, die ins Nährmedium gelangen und das Wachstum der Mikroorganismen hemmen können; außerdem geraten zu locker gefertigte Wattestopfen beim Abflammen leicht in Brand.

2.2

Umgang mit dem pH-Meter

Eichung des pH-Meters

1. pH-Elektrode mit dem Messgerät verbinden, Messgerät einschalten,

2. Elektrode entnehmen und gründlich mit A.dest. abspülen,

3. Pufferlösungen und Elektrode temperaturmäßig angleichen. Temperatur messen und mit dem geeigneten Drehregler am pH-Meter einstellen.

4. Elektrode in den „Nullpuffer“ (6,9 oder 7,0 o.ä.) geben, gleichmäßig langsam drehen, bis eine stabile Anzeige erscheint,

5. mit dem Stellknopf „ pH“ oder „Nullpunkt“ (je nach Gerät) den auf der Pufferlösung angegebenen Wert (6,9 oder 7,0 o.ä.) am pH-Meter einstellen,

6. Elektrode entnehmen und mit A. dest. abspülen,

wenn der pH-Wert der Lösung auf einen alkalischen Wert eingestellt werden soll:

Pufferlösung für den alkalischen Bereich nehmen (9,0 oder 9,2 o.ä.), pH-Elektrode langsam bewegend eintauchen und den vorgegebenen Wert mit dem Stellrad „Steilheit“ , „Slope“ oder „mV/pH“ einstellen;

wenn der pH-Wert der Lösung auf einen sauren Wert eingestellt werden soll:

Pufferlösung für den sauren Bereich nehmen (4,0 o.ä.), pH-Elektrode langsam bewegend eintauchen und den vorgegebenen Wert mit dem Stellrad „Steilheit“, „Slope“ oder „mV/pH“ einstellen;

ist der pH-Wert der Probe noch unbekannt:

ist noch unbekannt, ob der pH-Wert der Probe im alkalischen oder sauren Bereich liegt, so kann zur richtigen Einstellung der Steilheit so verfahren werden, dass man die auf den Nullpunkt geeichte Elektrode in die Probelösung taucht und die Tendenz abliest und demgemäss den zweiten Puffer wählt; als weitere Möglichkeit bietet sich an, den ungefähren pH-Wert mit Hilfe eines Teststäbchens zu erfassen.

7. zur Kontrolle kann der Eichvorgang wiederholt werden.

Messung des pH-Wertes:

a) Elektrode entnehmen und mit A

b) Puffergefäß verschließen und wegstellen;

c) pH-Elektrode in die Probelösung eintauchen und dort (nach Temperaturangleich) langsam gleichmäßig bewegen (oder durch ein Rührwerk die Probe anströmen lassen), bis sich ein stabiler Messwert ergibt;

d) Messwert(e) notieren und Gerät ausschalten.

dest. spülen;

Reinigung der Elektrode:

nach dem Messvorgang die Elektrode entnehmen und gründlich mit A. dest. spülen;

enthält das Messgut der Probe Eiweißbestandteile, wird die Elektrode nach dem Abspülen eine Stunde

lang in eine Pepsinlösung gestellt, anschließend wird gründlich mit A

Schmutz kann mit einer weichen Bürste oder mit weichem Papier und einer verdünnten Spülmittellösung vorher entfernt werden.

dest.

abgespült; stärker anhaftender

Aufbewahren der Elektrode:

zur Aufbewahrung wird die Elektrode mit einer mit 3M KCl-Lösung gefüllten Kunststoffkappe bedeckt:

Elektroden mit Schliff werden mit einem entsprechenden mit 3M KCl gefüllten Messkolben aufbewahrt.

2.3

Umgang mit dem Mikroskop

Mikroskopieren mit der Ölimmersion

Einstellen des Mikroskopes:

Der Objektträger wird auf dem Kreuztisch eingespannt und durch Drehen an den Bedienungsschrauben in das aus dem Kondensor austretende Lichtbündel gebracht. Mit der Grob- und Feineinstellung am Mikroskopstativ wird das Präparat an das Objektiv (40x) herangeführt und die Bildebene scharf eingestellt. Nun senkt man den Kreuztisch ganz nach unten und dreht am Objektivrevolver das Objektiv (Oel/100x) ein - mit diesem Objektiv wird in der Mikrobiologie (Bakteriologie) stets mikroskopiert. Jetzt wird bei abgesenktem Kreuztisch auf das Präparat ein sehr kleiner Tropfen Immersionsöl gebracht. Dann wird der Kreuztisch durch Drehen am Grob- bzw. Feintrieb vorsichtig gehoben, bis die Frontlinse des Objektives in das Öl eintaucht und den Objektträger fast berührt. Eintauchen von der Seite beobachten -- Abstand der Frontlinse vom Objektträger etwa 0,1 mm Während man durch das Okular blickt wird der Kreuztisch langsam mit dem Feintrieb bewegt.

( -- TIPP: Bewegen Sie den Kreuztisch dabei leicht wechselweise von rechts nach links -- ) Sobald das Bild erscheint, wird scharf eingestellt. Dieses Vorgehen verhindert Beschädigungen von Objekt und Objektiv und ist infolgedessen stets anzuwenden. Nach Gebrauch ist das Immersionsobjektiv mit Linsenreinigungspapier und Mikroskop-Reinigungsflüssigkeit zu reinigen.

Achtung: Alkohol und Spiritus dürfen in keinem Fall verwendet werden!

und Spiritus dürfen in keinem Fall verwendet werden! Abb. 2.3: Labormikroskop mit Phasenkontrasteinrichtung

Abb. 2.3: Labormikroskop mit Phasenkontrasteinrichtung (Zeiss)

Die häufigsten Störungen beim Mikroskopieren und ihre Ursachen:

-- Das mikroskopische Bild ist schwarz. -- Mikroskopierlampe nicht eingeschaltet -- Mikroskopierlampe oder Sicherung im Mikroskop durchgebrannt -- Regeltransformator defekt -- Zuleitungskabel nicht richtig eingesteckt oder defekt -- Netzsicherung durchgebrannt oder Stromnetz ausgefallen -- Irisblende des Kondensors nicht ganz geöffnet (bei Phasenkontrast)

-- Das Sehfeld ist ungleichmäßig oder nur teilweise ausgeleuchtet. -- Objektrevolver oder Ringblendenrevolver nicht eingerastet -- Wechselkondensor nicht ganz eingeschoben -- Filterhalter unter dem Kondensor oder vor der Mikroskopierleuchte nicht bis zum Anschlag ein- geschwenkt -- Kondensorfrontlinse je nach benutztem Objektiv nicht (oder nicht völlig) ein- bzw. ausgeklappt -- Kondensor nicht zentriert oder nicht in der richtigen Höhe -- Leuchtfeldblende zu stark geschlossen -- Mikroskopierlampe nicht fest in der Fassung -- Mikroskopierlampe nicht zentriert.

-- Das Bild ist kontrastarm. -- Objektivlinse verschmutzt -- Kondensorblende zu weit geöffnet -- Leuchtfeldblende zu weit geöffnet Bei starken Trockenobjektiven außerdem:

-- Deckglas vergessen -- Deckglas zu dick oder zu dünn -- zu viel Einschlussmittel Bei Immersionsobjekten außerdem:

-- Immersionsöl vergessen -- Öltropfen zu klein: Ölverbindung zwischen Objektivfrontlinse und Deckglas abgerissen -- Objektivfrontlinse durch alte Ölrückstände verunreinigt -- Deckglas von falscher Dicke oder Brechzahl verwendet.

-- Das Präparat lässt sich nicht scharfstellen. -- Objektträger mit dem Deckglas nach unten auf den Objekttisch gelegt -- zwei Deckgläser aufgelegt -- Deckglas viel zu dick -- viel zu viel Einschlussmittel -- Feineinstellung am Anschlag Bei Immersionsobjekten außerdem:

-- Immersionsöl vergessen -- Öltropfen zu klein: Ölverbindung zwischen Objektivfrontlinse und Deckglas abgerissen -- Objektivfrontlinse durch alte Ölrückstände verunreinigt.

-- Starke Unschärfe nach Objektivwechsel. -- Objektiv nicht ganz in den Revolver eingeschraubt -- vor dem Wechsel Objekttisch gesenkt.

-- Unbewegliche, unscharfe Flecken oder Schatten im Bild. (wandern beim Verschieben des Präparats nicht mit) -- Staub oder Schmutz auf den optischen Flächen.

-- „Mückensehen“ („Mouches volantes“) (unscharfe Flecken oder Fäden, die bei Änderung der Blickrichtung mitwandern) -- feine Trübungen im Glaskörper oder Schlieren in der Kammerflüssigkeit des Auges, die die Netzhaut verschattet.

2.4

Herstellung von Nährböden

Für das Praktikum gibt es fast alle Medien fertig gemischt als Trockenmedien. Hierbei handelt es sich um dehydrierte Produkte in Pulver- oder Granulatform, die zum Teil stark hygroskopisch sind. Diese Medien sind nach Lösen und Sterilisieren gebrauchsfertig, jedoch erfolgt die Zubereitung strikt nach den Packungsvorschriften der Hersteller.

Im Folgenden werden die grundsätzlichen Schritte der Herstellung eines Trockenmediums beschrieben. (Abweichungen ergeben sich aus der Zielsetzung einer Untersuchung, sie sind der entsprechenden Versuchsvorschrift zu entnehmen.)

-- Grundsätzlich müssen alle Geräte, die zum Zubereiten der Medien benutzt werden, gründlich gereinigt werden. Fabrikneue Gefäße werden erst mit verdünnter Salzsäure gereinigt und anschließend mit destilliertem Wasser gespült. -- Zur Nährbodenherstellung ist grundsätzlich sauberes, frisch destilliertes oder vollentsalztes Wasser zu verwenden. -- Die zur Entnahme des Trockenmediums benutzten Metallspatel oder Apothekerlöffel sollten vor Gebrauch in Ethanol getaucht und abgeflammt werden.

a) Lösen des Trockennährmediums

-- Zu der abgewogenen Trockennährbodenmenge gibt man etwa die Hälfte der erforderlichen Wassermenge zu;

dann schüttelt man das Ansatzgefäß bis eine homogene Suspension entstanden ist. -- Nun gibt man die restliche Wassermenge so zu, dass die an der Innenwand des Gefäßes anhaftenden Bestandteile abgespült werden.

-- Enthalten die Medien Agar-Agar oder Gelatine, so müssen sie zum Lösen erhitzt werden, dies erfolgt z.B. im Wasserbad für ca. 15 Minuten bei 100°C, durch Aufkochen auf einem heizbaren Magnet- rührer o.ä. Wichtig: Nährböden dürfen nicht mehr als unbedingt nötig erhitzt werden! -- Nährmedien ohne Agar-Agar oder Gelatine sind bereits bei leichter Erwärmung lösbar.

-- Anschließend wird das Glasgefäß mit einer überlappenden Aluminiumfolie verschlossen und beschriftet (gegebenenfalls Kippautomat aufsetzen). Man achtet darauf, dass die zu sterilisierenden Ansätze nie mehr als die Hälfte des Volumens des Ansatzgefäßes ausmachen.

b) Einstellung des pH-Wertes

-- Bei gekauften Trockennährmedien kann auf eine pH-Einstellung bzw. -Korrektur meist verzichtet werden, durch die standardisierte Rezeptur garantiert der Hersteller pH-Schwankungen in engen Grenzen. -- Bei selbst hergestellten Nährsubstraten muss eine pH-Einstellung vor, manchmal auch nach der Sterilisation erfolgen. -- Die Messung und eventuell erforderliche Korrektur des pH-Wertes erfolgt bei festen Nährböden in geschmolzenen Zustand bei ca. 45°C, bei flüssigen Medien bei Raumtemperatur; grundsätzlich ist darauf zu achten, dass das Medium gelöst ist. -- Zum Einstellen des pH-Wertes verwendet man entweder eine 1 N NaOH oder zum Säuern eine 1 N HCl.

pH-Einstellung siehe: Umgang mit einem pH-Meter.

c)

Sterilisation

Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven. Hier erfolgt eine Hitzeabtötung von vegetativen und versporten Formen von Keimen in gespannten Dampf.

Bedienungsanleitung: AUTOKLAV (alt)

-- ca. 1,5 Liter A.dest. bis zum unteren Rand der Metallplatte in den Autoklav geben

-- Heizung auf Stufe 1 zum Vorheizen

-- alle Ventile geöffnet; Deckel geschlossen, jedoch nicht zugedreht

-- unteres Ventil (am Schlauch) schließen: darauf achten, dass der Auffangeimer leer ist

-- Sterilisiergut in den Autoklaven stellen

-- Deckel fest verschließen

-- Heizung auf Stufe 3 stellen (Kontrolllampe beachten - bei Versagen: Überlastungsschutzknopf wieder einrasten)

-- wenn Temperatur von 100° Grad Celsius erreicht ist, oberes Ventil schließen

-- bei 120° Grad Celsius oder 1bar Druck beginnt die Sterilisationszeit von 15 bis 29 Minuten (Uhr stellen),Heizung auf Stufe 1 zurückstellen

-- nach 15 bis 20 Minuten: Heizung abstellen; der Autoklav muss bis auf ca. 95° Grad Celsius abgekühlt sein bevor er geöffnet wird

-- unteres Ventil öffnen und warten, bis alles Wasser ausgetreten ist

-- Ventil am Deckel öffnen, Deckel vorsichtig öffnen und Sterilisationsgut entnehmen.

Nach dem Sterilisieren werden die Gefäße direkt aus dem Autoklaven genommen, unter kaltem Wasser rasch abgekühlt und in ein Wasserbad (55°C) gestellt.

(siehe Anhang 5.7)

d) Platten gießen

-- Die Petrischalen werden zwischen 45°C und 55°C gegossen. Höhere Gießtemperaturen führen zu einer unerwünschten Kondenswasserbildung an den Schalendeckeln.

-- Eventuell auftretende Luftblasen werden durch kurzes Befächeln mit der Bunsenbrennerflammenspitze (Vorsicht bei Plastikpetrischalen) beseitigt.

-- Die Nährböden bei Raumtemperatur erstarren lassen, unterhalb 45°C werden die Nährböden fest.

-- Die erstarrten Platten werden in umgekehrter Stellung gelagert.

-- Vor Verwendung können feuchte Agar-Oberflächen bei ca. 40°C im Brutschrank (30 Minuten) getrocknet werden, dazu wird der Bodenteil der Petrischale mit der Innenseite nach unten auf den daneben liegenden Deckel aufgesetzt.

2.5 Sterile-Werkbank

Regeln für das Arbeiten an der Sterilen-Werkbank:

-- Fenster und Türen des Labor sind geschlossen zu halten, eventuell vorhandene Raumbelüftung oder Klimaanlagen abzustellen.

-- Der Ventilator der Werkbank wird mindestens 15 min vor Arbeitsbeginn eingeschaltet; er darf während der Arbeitspause nicht abgeschaltet werden.

-- Während dieser Anlaufzeit desinfiziert und reinigt man alle Flächen des Arbeitsbereichs gründlich mit einem fusselfreien Tuch, das mit einem Flächendesinfektionsmittel, z.B. 70%igem Ethanol, getränkt ist. Gelegentlich sollte man auch das Schutzgitter mit dem Staubsauger vorsichtig absaugen.

-- Man bringt alle benötigten Geräte vor Arbeitsbeginn in den Arbeitsraum; zuvor wischt man sie ebenfalls sorgfältig mit Alkohol ab.

-- Auf der Arbeitsfläche der Werkbank dürfen nur die unbedingt erforderlichen Geräte aufgestellt werden, da sich an solchen Hindernissen Wirbel bilden, die eine Streuung von Aerosolen bewirken können.

-- Die Luftabsaugschlitze am vorderen und hinteren Rand der Arbeitsfläche dürfen nicht zugestellt werden.

-- Nicht mehr benötigte Geräte sowie Abfälle stellt man sofort auf eine Ablage außerhalb des Arbeitsbereichs.

-- In der Werkbank sollte man möglichst keinen Brenner benutzen, auf keinen Fall aber einen einfachen Bunsenbrenner, da die durch die Flamme erzeugte Aufwärtsströmung den LF-Luftstrom stark beeinträchtigt. (Ähnliches gilt für alle anderen Wärmequellen und für Geräte mit starker Eigenbewegung, wie „Whirlimixer“, Rührer oder Zentrifugen.) Man arbeite nach Möglichkeit mit vorsterilisierten Einmalimpfgeräten aus Kunst- stoff. Falls erforderlich, verwende man einen elektrisch zündenden Sicherheitsbrenner. Die Arbeitsflamme darf nur dann brennen, wenn sie wirklich benötigt wird.

-- Bleistift und Papier gehören nicht in den sterilen Arbeitsbereich.

-- An der Werkbank dürfen sich nicht mehr Personen aufhalten als unbedingt erforderlich.

-- An der Werkbank sollte man einen langärmligen Schutzkittel mit dicht schließenden Bündchen sowie Handschuhe tragen, die möglichst wenig Fasern abgeben.

-- An Sicherheitswerkbänken darf man nur dann arbeiten, wenn sich die Frontscheibe in Arbeitsstellung befindet; sie darf auf keinen Fall weiter geöffnet werden.

-- Der Kopf ist aus dem sterilen Raum herauszuhalten. Beim Sprechen, Husten oder Niesen sollte man sich unbedingt von der Werkbank wegdrehen.

-- Man passiere nicht öfter als unbedingt nötig den Luftvorhang über der Arbeitsöffnung.

-- Man lege die Unterarme nicht auf die Arbeitsplatte auf; die vorderen Lüftungsschlitze dürfen nicht verdeckt werden.

-- Die Hände sollen sich möglichst immer in Luftstromrichtung hinter den kritischen Objekten oder Prozessen (stromaufwärts) befinden. Man sollte im sterilen Bereich auch nie von oben, sondern immer von der Seite oder von unten greifen.

-- Man bewege sich an der Werkbank ruhig und überlegt. Man vermeide schnelle und hastige Bewegungen im Arbeitsbereich sowie starke Raumluftbewegungen vor der Arbeitsöffnung, z.B. durch vorbeigehende Personen oder durch das Öffnen und Schließen von Türen.

-- An der Werkbank darf nicht gearbeitet werden, wenn optische oder akustische Signale eine Störung anzeigen.

-- Nach Arbeitsende und Entfernung sämtlicher Geräte aus dem Arbeitsraum wird der Arbeitsbereich erneut desinfiziert und gereinigt. Der Ventilator soll noch etwa 5 min weiterlaufen.

gereinigt. Der Ventilator soll noch etwa 5 min weiterlaufen. Abb. 2.4: Sterile-Werkbank mit vertikaler

Abb. 2.4: Sterile-Werkbank mit vertikaler Lamminar-Flow-Luftströmung (Sicherheitswerkbank der Sicherheitsklasse 2). Schematisch. A Seitlicher Längsschnitt. B Vorderansicht

3.0

Allgemeine mikrobiologische Methoden:

3.1 Risikogruppen von Bakterien und Pilzen

Tab. 3.0: Eingruppierung von Bakterien und Pilzen in Risikogruppen 1) (Auswahl)

von Bakterien und Pilzen Tab. 3.0: Eingruppierung von Bakterien und Pilzen in Risikogruppen 1 ) (Auswahl)

Tab. 3.0: Fortsetzung

Tab. 3.0: Fortsetzung 37
Abb. 3.0: Warnzeichen „Biogefährdung“ zur Warnung vor infektiösen Agenzien (schwarzes Symbol auf gelbem Grund; nach

Abb. 3.0: Warnzeichen „Biogefährdung“ zur Warnung vor infektiösen Agenzien (schwarzes Symbol auf gelbem Grund; nach DIN 58956 Teil 10)

Für den Umgang mit unbekannten, möglicherweise pathogenen Mikroorganismen sowie mit Mikroorganismen der Risikogruppe 2 (s. Tab.3.0) kommen zu den Grundregeln des sterilen Arbeitens noch Sicherheitsmaßnahmen der Schutzstufe 2 hinzu:

- Der Arbeitsraum sowie die Sicherheitswerkbank, Kühlschränke, Behälter, Kulturen und Geräte, von denen eine Infektionsgefahr ausgeht, sind mit dem Warnzeichen „Biogefährdung“ (Abb.3.0) auffällig zu kennzeichnen.

- Alle Flächen des Arbeitsraums müssen täglich desinfiziert werden.

- Die Schutzkleidung darf nicht außerhalb des Sterilbereichs getragen werden.

- Beim Arbeiten sind kräftige, dunkelgefärbte Schutzhandschuhe aus Latex zu tragen.

- Arbeiten, bei denen erregerhaltige Aerosole auftreten können (und das gilt für fast alle Arbeiten mit Mikroorganismen ), müssen in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 durchgeführt werden. Dasselbe gilt, wenn mit hohen Erregerkonzentrationen gearbeitet wird oder mit Erregern, die über Atemwege infizieren.

- Zum Ausglühen der Impföse oder –nadel verwende man einen Brenner mit Spritzschutzglocke, oder man arbeite mit vorsterilisierten Einmalimpfgeräten aus Kunststoff.

- Man verwende vorzugsweise Einwegartikel.

- Kontaminierte Geräte und Gefäße sowie mikroskopische Präparate werden sofort nach Gebrauch in ein Desinfektionsbad eingelegt und anschließend – wenn es das Material zulässt – autoklaviert. Erst danach werden sie gereinigt oder entsorgt. Entsprechendes gilt für kontaminierte Kleidung.

- Bei einem Hautkontakt mit lebendem Material ist die betroffene Hautfläche sofort zu desinfizieren; dazu müssen an den Waschbecken Dosierspender mit einem Händedesinfektionsmittel zur Verfügung stehen.

- Wird Mikroorganismensuspension verschüttet oder durch Glasbruch freigesetzt, so muss der kontaminierte Bereich sofort gesperrt und desinfiziert werden.

- Kulturen und infektiöses Material in Glasgefäßen oder Petrischalen sollen in bruchfesten, flüssigkeitsdichten Behältern bebrütet, transportiert und aufbewahrt werden.

- Nicht mehr benötigte Kulturen und erregerhaltiger Abfall müssen gefahrlos gesammelt und durch Autoklavieren (121°C, 30min) unschädlich gemacht werden.

3.2 Identifizierung (Bestimmen) von Bakterien

(siehe Anhang 5.5)

3.2 Identifizierung (Bestimmen) von Bakterien (siehe Anhang 5.5) 39
40
41
42
42
42
Tab. 3.1: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten Erklärung: M. = Micrococcus S. = Streptococcus E. =
Tab. 3.1: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten Erklärung: M. = Micrococcus S. = Streptococcus E. =

Tab. 3.1: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten

Erklärung:

M.

= Micrococcus

S.

= Streptococcus

E.

= Escherichia

Se.

= Serratia

Chr.= Chromatium (neu = Janthinobacterium lvidium, alt = Chromobacterium lvidium )

B.

= Bacillus

Str.

=

Streptomyces

3.3

Mikroskopie fixierter und gefärbter Bakterien

Die geringen Dimensionen von Bakterienzellen und der schwache Kontrast zwischen Medium und Zellen, der auf den fast gleichen Brechungsindex zurückzuführen ist, bewirken, dass nur wenige Details im Lichtmikroskop wahrgenommen werden können. Zur besseren Darstellung werden daher die Bakterien vor der mikroskopischen Untersuchung fixiert und gefärbt.

Fixierung:

Lebende Zellen nehmen Farbstoffe nur in kleinen Mengen auf, daher werden in der Regel nur fixierte Zellen gefärbt. Die Bakterien werden durch die Fixierung strukturschonend abgetötet; das Probematerial haftet durch Protein-Denaturierung am Objektträger-Glas fest. Das Präparat ist gleichzeitig haltbar gemacht worden.

Färbung:

Die Färbung von Bakterien dient verschiedenen Zwecken:

-- Kontrastierung der Zellen durch einheitliches Anfärben (z.B. Methylenblau-Färbung) -- Unterscheidung verschiedener Bakteriengruppen -“Differenzierung“ (z.B. Gram-Färbung) -- Darstellung spezifischer Strukturen (Geißel-, Sporen- und Kapseldarstellung) Die verwendeten Farbstoffe besitzen in der Regel eine besondere Affinität zu bestimmten Zellbestandteilen. Die am häufigsten angewandten Farbstoffe sind Salze basischer Anilinfarbstoffe ( z.B. Methylenblau, Kristallviolett, Safranin). Sie geben in wässriger Lösung gefärbte Kationen des Farbstoffes ab, die mit sauren Gruppen von Zellbestandteilen (z.B. Carboxyl- und Phosphatgruppen) Salze bilden, indem sie Ionen mit geringerer Affinität ersetzen. Das Kation des Methylenblau kann z.B. K + und Ca 2+ verdrängen. Als saure Farbstoffe werden u.a. Eosin und Kongorot verwendet.

3.3.01 Herstellung eines gefärbten Ausstrichpräparates mit Methylenblau

Material:

-- Methylenblau nach LÖFFLER Lösung A: Methylenblau 0,3 g, Ethanol (96%) 10ml Lösung B: KOH Lösung (0,01%) 100 ml Gebrauchslösung: 10 ml Lösung A und 100 ml Lösung B mischen. -- Fettfreie Objektträger, Färbetrog, Fön, Spritzflasche, Impföse, Zahnstocher, Bunsenbrenner Arbeitsgang:

-- Rachenabstrich, Hefen, Plaquematerial, versch. Bakterienkulturen

a) Einen kleinen Tropfen Wasser auf den fettfreien Objektträger bringen.

- nur absolut fettfreie Objektträger erlauben eine getrennte Lage der ausgestrichenen Bakterien, sie verhindern ein Zusammenfließen und Verklumpen; Entfettung erfolgt z.B. mit Ethanol.

und Verklumpen; Entfettung erfolgt z.B. mit Ethanol. b) Mit dem Zahnstocher und der sterilen Impföse etwas

b) Mit dem Zahnstocher und der sterilen Impföse etwas Bakterienmaterial entnehmen.

c) Bakterien in Tropfen verrühren und ausstreichen.

d) Ausstrich trocknen lassen.

e) Hitzefixierung: Ausstrich mit Bakterienmaterial nach oben 3 x durch die Nichtrauschende-Flamme ziehen.

- Die Hitzefixierung muss mit einem vollständig trockenen Objektträger durchgeführt werden, da sonst durch kochendes Wasser Strukturen zerstört werden.

f) Ausstrich auf Färbetrog legen und ca. 5 Minuten mit reichlich Färbelösung bedeckt halten.

g) Färbelösung mit Wasser abspülen bis keine Farbwolke mehr sichtbar ist.

h) Objektträger trocknen lassen.

i) Mikroskopieren ohne Deckglas mit dem Ölimmersionsobjektiv.

j) Zeichnen des mikroskopischen Bildes in genauen Proportionen.

3.3.02 Negativ-Darstellung von Mikroorganismen

Bei dieser Darstellung wird der Kontrast nicht durch Anfärben der Mikroorganismen selbst erzielt, sondern die Umgebung wird „verdunkelt“. Dies erreicht man durch schwarze Farbstoffe, die nicht in Mikroorganismen eindringen. Geeignet ist z.B. chinesische Tusche (= Suspension von kleinsten Rußpartikeln), deren Kohlenstoffteilchen wesentlich kleiner sind als Bakterien, die aber nicht in diese eindringen.

Bakterienformen und die typische Lagerung von Zellen (Ketten, Pakete lassen sich im Tuschepräparat gut darstellen.

), aber auch Schleimhüllen und Schleimkapseln

Material:

Verschiedene Bakterienkulturen, chinesische Tusche (Scribtol)

Arbeitsgang:

a) Einen kleinen Tuschetropfen seitlich auf den Objektträger bringen.

b) Mit steriler Impföse Bakterienmaterial entnehmen.

c) Bakterienmaterial im Tuschetropfen homogen suspendieren.

d) Ausstrichglas an den Tropfen führen (Ausstrichwinkel ca. 45°) und Material über Objektträger ausstreichen.

Der nun zwischen Objektträger und Ausstrichglas haftende Tropfen wird durch gleichmäßiges Nachziehen ausgestrichen. Zu dicke Ausstriche entstehen bei zu großem Winkel und schnellem Ausziehen, zu dünne Ausstriche bei kleinem Winkel und langsamen Ausziehen.

(Randzone nicht mit Untersuchungsmaterial kontaminieren.)

dünne Ausstriche bei kleinem Winkel und langsamen Ausziehen. (Randzone nicht mit Untersuchungsmaterial kontaminieren.) 45
e) Ausstrich trocknen lassen. f ) Mikroskopieren ohne Deckglas bei offener Kondensorblende, Ölimmersion verwenden.

e) Ausstrich trocknen lassen.

f ) Mikroskopieren ohne Deckglas bei offener Kondensorblende, Ölimmersion verwenden.

Ergebnis: Auf dunklem Untergrund erscheinen die Bakterienzellen leuchtend hell. Die günstigste Schichtdicke muss durch Kontrolle des gesamten Ausstrichs gefunden werden.

3.3.03 Sporenfärbung

Endosporen (eine Spore/Zelle) sind bisher nur bei Vertretern der Gattung Bacillus (aerob oder fakultativ anaerob), Clostridium (obligat anaerob) sowie bei Desulfotomaculum (Sulfatreduzierer), Sporosarcinaurea (obligate kokkoide Harnstoffverwerter) und Sporolactobacillus (Milchsäurebakterium) festgestellt worden. Die Gattungen wurden in der Familie der Bacillaceae zusammengefasst, obwohl sie wahrscheinlich polyphyletisch entstanden sind.

Sporen sind Dauerformen, um physiologisch ungünstige Bedingungen zu überleben. Aufgrund der undurchlässigen Sporenwand und des geringen Wassergehaltes nehmen Sporen basische oder saure Farbstoffe kaum an. Sporen erscheinen infolgedessen als farblose, ovale Areale in der violett- oder rotgefärbten Sporenmutterzelle (Sporangium, vegetative Zelle). Ein solcher indirekter Nachweis von Sporen ist allerdings nicht ausreichend, da auch Reservesubstanzen Farbstoffe schlecht aufnehmen können. Eine direkte Färbung von Sporen gelingt jedoch nur, wenn die Sporenwand durch Erhitzen aufgeweicht und für Farbstoffe durchlässiger gemacht wird.

Sporenfärbung mit Malachitgrün - Safranin:

Durchführung mit älteren Kulturen einiger Bacillus-Arten auf Standard-I-Agar.

a) Hitzefixierten Ausstrich herstellen.

b) In Objektträgergröße Filterpapier auflegen und mit Malachitgrünlösung (5 g / 100 ml A.dest.) bedecken und fächelnd bis kurz vor Siedebeginn („Dampfen“) gut 5 Minuten erhitzen; das Präparat darf nicht eintrocknen, deshalb bei Bedarf Malachitgrünlösung nachgeben.

c) Das Papier wird mit der Pinzette entfernt und das Präparat vorsichtig mit Wasser abgespült.

d) Zur Gegenfärbung lässt man die Safraninlösung ( 5 g / 100 ml A.dest. ) 5 Minuten einwirken.

e) Vorsichtig abspülen, trocknen und mit Ölimmersion mikroskopieren.

Ergebnis: Spore – grün, Sporangium - rot

Sporenfärbung mit Karbolfuchsin - Methylenblau:

a) Hitzefixierten Ausstrich herstellen.

b) Karbolfuchsin auftropfen und den Ausstrich über der Sparflamme bis zur Blasenbildung ca. 2 Minuten leicht erhitzen.

c) Abspülen mit Wasser.

d) 1 Minute entfärben mit 10%iger Natriumsulfitlösung.

e) Abspülen mit Wasser.

f) ca. 1 Minute Gegenfärbung mit Methylenblau.

g) Vorsichtig abspülen, trocknen und mit Ölimmersion mikroskopieren.

Ergebnis: Spore – rot, Sporangium - blau

Achtung: R- und S-Sätze beachten!

3.3.04 Färbung von Zellinhaltsstoffen

I. Nachweis von Volutin:

Volutinkörnchen sind aus langkettigen Polyphosphaten bestehende Zelleinschlüsse (Speicher-Granula) in Bakterien, Pilzen und Cyanobakterien; sie dienen hauptsächlich als Phosphatreservestoff, die Verwertung als Energiequelle ist umstritten. Volutin wurde nach Spirillum volutans benannt, aus dem es zuerst isoliert wurde. Die langkettigen, stark lichtbrechenden Volutingranula erscheinen in Anwesenheit von Methylenblau dunkelblau gefärbt.

Material:

Methylenblau 1%ig in Ethanol 96%ig, Schwefelsäure 2%ig, Grams Jodlösung, Candida sp., Corynebacterium flavescens oder Mycobacterium phlei

Arbeitsgang:

a) Ein vorsichtig fixiertes Präparat wird 1-2 Minuten mit Methylenblau gefärbt, abgespült, vorsichtig abgetupft und mit einem Deckglas versehen.

b) Mit einem Filterpapierstreifen wird die Schwefelsäure durchgesaugt.

Achten Sie darauf, dass niemals Teile des Mikroskopes mit Säure in Berührung kommen!

c) Nach Entfärben des Präparates wird auf gleiche Weise mit Wasser durchgespült.

d) Grams Jodlösung durchsaugen und mit Ölimmersionsobjektiv mikroskopieren.

Ergebnis: Volutingranula = dunkelblau, Zelle = gelb

II. Nachweis von Glycogen:

Glycogen („tierische Stärke“) ist ein stark verzweigtes Polysaccharid aus 1,4/1,6 glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen. Es dient den verschiedenen Bakterien, Hefen und Pilzen als Energiespeicher. Glycogen ist in seiner Struktur dem Amylopektin sehr ähnlich, gibt aber mit Jodlösung eine braune statt blaue Farbe.

Material:

Lugolsche Lösung (J-JK) (oder Grams Jodlösung), Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe): eine 40 Stunden alte Schüttelkultur in Standard-I-Nährlösung.

Arbeitsgang:

a) Ein Tropfen der Kulturflüssigkeit wird mit der Impföse entnommen und mit einem Tropfen Lugolscher Lösung auf dem

Objektträger vermischt.

b) Ein Deckglas wird aufgelegt und das Präparat mit Ölimmersion mikroskopiert.

Ergebnis: Glycogeneinschlüsse rötlich bis braun

III. Nachweis von fettartigen Speichersubstanzen:

Fettartige Speichersubstanzen sind als Tröpfchen oder Granula bei Mikroorganismen mit lipophilen Farbstoffen wie Sudanschwarz leicht nachweisbar. Zur Fettspeicherung kommt es besonders bei einem hohen C/N Quotienten der Nährstoffe. Vor allem Hefen speichern fettartige Substanzen und können bis zu 80% ihres Trockengewichts aus Triglyceriden bestehen.

Material:

Sudan-Schwarzlösung: 0,3 g werden in 100 ml Ethanol (70%ig) gelöst. Bacillus megaterium, Bäckerhefe

Arbeitsgang:

a) Ein wenig Kulturmaterial wird mit der Öse in einem Tröpfchen Wasser auf dem Objektträger verrieben.

b) Einen Tropfen Sudanschwarz aufbringen und mit der Öse gut vermischen.

c) Deckglas auflegen und mit Ölimmersionsobjektiv mikroskopieren.

Ergebnis: Fetttröpfchen blau bis grau

3.3.05

Der Katalase-Nachweis

Bei aeroben Wachstum entsteht im Stoffwechsel u.a. Wasserstoffperoxyd (H 2 O 2 ), das für die Zelle jedoch toxisch ist. Die meisten cytochrombildenden aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien besitzen zur Entgiftung das Enzym Katalase, das Wasserstoffperoxyd in Wasser und Sauerstoff spaltet.

Anwendung:

2H 2 O 2

--------------------

2H 2 O + O 2

Mit Hilfe dieses Testes lassen sich Katalase-besitzende Bakterien schnell ermitteln; er dient als Hilfsmittel bei der Unterscheidung verschiedener Bakteriengattungen, wie z.B.:

Bacillus (+) von Clostridium (-) Mikrococcus (+) und Staphylococcus (+) von Streptococcus (-)

Durchführung:

und Staphylococcus (+) von Streptococcus (-) Durchführung: Man gibt einen Tropfen einer 3-5%igen H 2 O

Man gibt einen Tropfen einer 3-5%igen H 2 O 2 -Lösung zu einer zu prüfenden Bouillonkultur (A), auf eine mittels Impföse auf einen Objektträger übertragene Kolonie (B) oder auf eine Agarplatten-Kolonie (C). Das sofortige Auftreten feinster Gasblasen ist mit bloßem Auge gut zu erkennen.

Hinweis:

-- Platin- oder eisenhaltige Impfösen dürfen nicht mit H 2 O 2 in Berührung kommen. -- Zu prüfende Kolonien sollen nicht älter als 24 Stunden sein. -- Der Test soll nicht auf Blutagarplatten durchgeführt werden, da Erythrocyten ebenfalls Katalase enthalten falschpositives Ergebnis!

3.3.06 Oxidase-Nachweis

3.3.06 Oxidase-Nachweis 50

3.3.07 Gramfärbung

Grundlagen:

Ein wichtiges taxonomisches Kriterium in der Bakteriensystematik ist das Verhalten der Zellen bei der Gram-Färbung. Diese von dem dänischen Bakteriologen Gram eingeführte Färbemethode unterteilt die Bakterien in zwei große Gruppen, in die gramnegativen und grampositiven Bakterien. Diese Gruppen unterscheiden sich grundlegend im molekularen Aufbau und in der Zusammensetzung der Zellwand. Das Prinzip der Färbung ist es, die zunächst mit Karbolgentianaviolett gefärbte Zelle einer Beizung mit Jodlösung zu unterziehen, wobei sich der Farblack ausbildet. Beim anschließenden Auswaschen dieses Farblacks mit Alkohol halten die grampositiven Bakterien den Farbstoff erheblich fester als die gramnegativen, die bereits nach 20 – 30 sec. völlig entfärbt sind. Die Färbung ergibt nur dann reproduzierbare Ergebnisse, wenn man die angegebenen Vorschriften genau einhält. Die Bakterien sollten möglichst in der logarithmischen Wachstumsphase stehen, je nach Alter und Ernährungszustand können sich viele Arten auch „gram variabel“ verhalten. Um Unsicherheit in der Beurteilung der Färbung auszuschließen, kann man eine Kontrolle vornehmen:

Auf ein und demselben Objektträger streicht man auf dem linken Drittel einen gram(+), auf dem rechten Drittel einen gram(-) Bakterienstamm aus und den zu untersuchenden Stamm in der Mitte. Ist die Färbung bei den Kontrollstämmen einwandfrei ausgefallen, so kann auch das färberische Verhalten des zu prüfenden Stammes sicher beurteilt werden. Zumindest sollte der zu prüfende Stamm auf einem Objektträger zweimal aufgebracht und fixiert werden, wobei einmal die gesamte Gram-Färbung und einmal nur die Gegenfärbung mit Karbolfuchsin (Grams Safranin) durchgeführt werden.

mit Karbolfuchsin (Grams Safranin) durchgeführt werden. Abb. 3.1: Objektträger mit einem gram(+) und gram(-)

Abb. 3.1: Objektträger mit einem gram(+) und gram(-) Organismenstamm sowie einen unbekannten Präparat

Arbeitsgang:

1.)

Objektträger entfetten

2.)

Hitzefixierten Ausstrich herstellen

3.)

Durch Faltenfilter Karbolgentianaviolett (oder frisch filtrierte Farbstofflösung) auftropfen bis der Ausstrich

4.)

vollkommen bedeckt ist (Präparation auf Färbebank bzw. Färbeschale) Nach ca. 3 min. die Färbelösung abgießen (nicht mit Wasser abspülen)

5.)

Lugolsche Lösung aufgießen

6.)

Nach einer Minute Lösung abgießen

7.)

96% igen Ethanol aufgießen bis kein Farbstoff mehr ausgewaschen wird

8.)

Waschen mit Wasser (einige Sekunden)

9.)

Ausstrich mit Karbolfuchsin (Grams Safranin), nach 15 bis 30 Sekunden abgießen

10.) Mit Leitungswasser spülen 11.) Mit Aqua dest. nachspülen 12.) Trocknen lassen 13.) Mit Ölimmersion mikroskopieren

3.3.08 Unterscheidung gramnegativer und -positiver Bakterien mittels KOH-Test

Methode:

Durch Behandlung von Bakterienkoloniematerial mit Kalilauge kommt es bei gramnegativen Keimen vermutlich zur Zerstörung der Zellwand und damit bedingt zur Freisetzung der DNS. Diese Freisetzung führt beim Verrühren von Koloniematerial mit KOH-Lösung zur Schleimbildung (Fadenziehen), es liegt eine positive Reaktion vor. Die wichtigste Färbung für eine Bakterieneinteilung hinsichtlich gramnegativer und grampositiver Stämme ist jedoch die Gramfärbung. Der KOH-Test soll und kann die Gramfärbung keinesfalls ersetzen, ist aber bei zweifelhaften Gramfärbungen eine zusätzliche Hilfe; auch als Schnellverfahren für eine grobe Übersichtsuntersuchung bietet dieser Test einen ausreichenden Aussagewert. Für den KOH-Test muss allerdings ausreichendes Material (stecknadelkopfgroß) zur Verfügung stehen, bei kleinen Kolonien (stichgroß) versagt der Test.

Arbeitsgang:

a) Koloniematerial und 1 - 2 Tropfen 3%ige KOH-Lösung auf einen Objektträger bringen und 5 - 10 Sekunden verrühren;

b) nun hebt man die Impföse oder Nadel vorsichtig vom Tropfen ab;

c) kommt es zur Schleimbildung bzw. zum Fadenziehen (s. Abb. unten), so liegt eine positive Reaktion vor, die Kolonie ist gramnegativ oder verdächtig gramnegativ.

(s. Abb. unten), so liegt eine positive Reaktion vor, die Kolonie ist gramnegativ oder verdächtig gramnegativ.

3.3.09 Aminopeptidase-Test

3.3.09 Aminopeptidase-Test 53

3.3.10 Geißelfärbung nach LEIFSON

Einleitung:

Die sehr feinen Geißeln der Bakterien (10-20 nm) können nur durch Beizen und Anfärben lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden. Das Beizen mit dem Gerbstoff Tannin bewirkt eine starke Aufquellung der Geißelproteine. Mit basischem Fuchsin färbt man dann die Geißel rot und macht sie so mikroskopisch sichtbar. Eine Gegenfärbung mit 1%iger, leicht alkalischer Methylenblaulösung kann sich noch anschließen. Man sollte immer mehrere Präparate anfertigen und sie unterschiedlich lange färben. Die Geißeln können bei schwacher Färbung leicht übersehen werden. Jedes Präparat sollte also gründlich untersucht werden.

Material:

ÜN-Schrägagarkulturen (25°C) von begeißelten Bakterien (z.B. Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Bacillus megaterium u.a.), je Ausstrichpräparat etwa 1 ml Farbbeize nach LEIFSON (s.u.), Leitungswasser, 25 ml Becherglas, drei 5ml-Messpipetten, fettfreier Objektträger, Glastrichter, Tropfpipette, Färbewanne, Brenner, Öse und Immersionsöl.

Farbbeize nach LEIFSON:

Gleichgroße Mengen der folgenden Lösungen in dem Becherglas zusammengeben (1:1:1).

A 1,5%ige wässrige NaCl-Lösung

B 3%ige wässrige Tanninlösung

C 1,2% basisches Fuchsin in Ethanol

Arbeitsgang:

a) einen Tropfen Leitungswasser auf den Objektträger pipettieren

b) eine Öse voll Bakterienmaterial aus dem unteren (sehr feuchten Teil) der Schrägagarkultur entnehmen und ohne Rühren in den Wassertropfen übertragen, so dass gerade eine leichte Trübung zu erkennen ist.

c) die Suspension durch leichte Kippbewegungen über den Objektträger verteilen

d) Präparat lufttrocknen (keine Hitzefixierung!)

e) auf den gerade noch feuchten Ausstrich durch das Papierfilter Farbbeize auftropfen und etwa 10 Minuten einwirken lassen (Zeiten variieren)

f) vorsichtig mit Leitungswasser spülen, lufttrocknen

g) bei Ölimmersion und guter Abblendung mikroskopieren

Ergebnis:

Die Zellkörper sind rot gefärbt und dünne Fäden ( Geißeln) sind in der Umgebung der Zellen zu erkennen. Die Geißeln sind je nach Organismus entweder polar oder peritrich angeordnet.

Anmerkung:

Zum Spülen eignet sich hartes (leicht alkalisches) Leitungswasser besser als das leicht saure dest. Wasser (CO 2 -haltig).

3.3.11

Nachweis der Beweglichkeit

Gelegentlich kann bei der Keimdifferenzierung die Feststellung der Beweglichkeit von Bedeutung sein. Die Beweglichkeit der Bakterien wird durch eine oder mehrere Geißeln (polar oder peritrich) ermöglicht. Fimbrien dienen hingegen der Haftung an Oberflächen (Bodenkolloide, Epithelien) und Pili vorwiegend der parasexuellen Genübertragung (DNS-Transfer durch Konjugation).

Geißeln sind im Lichtmikroskop nicht sichtbar (10 - 30 nm im Durchmesser). Erst nach Quellung und Beizfärbung lassen sie sich färben und mikroskopisch nachweisen. Die Art der Begeißelung ist jedoch für die taxonomische Einordnung von Bakterien von großer Bedeutung.

Material:

Bouillonkultur (möglichst 48 Stunden alt), frische Schweine-Jauche, Heu-Aufguss, Hohlschliff-Objektträger.

Arbeitsgang:

a) Ein sauberes aber nicht entfettetes Deckglas wird in der Mitte mit einem kleinen Tropfen Bouillonkultur oder einer frischen Jauche oder Heuaufgussprobe versehen.

b) Der Rand des Hohlschliffobjektträgers wird an vier Punkten mit Vaseline versehen.

c) Nun wird der Objektträger leicht gegen das Deckglas gedrückt, dann Deckglas mit Objektträger rasch drehen; der Tropfen hängt nun frei in der Schliffkammer des Objektträgers.

d) Zunächst wird mit dem Objektiv (40x) der Rand des betreffenden Tropfens gesucht; dann wird Immersionsöl aufgebracht und mit dem Ölimmersionsobjektiv (100x) mikroskopiert.

Beurteilung:

Eine Eigenbewegung (aktiv) liegt dann vor, wenn die Organismen sich von ihrem anfänglichen Standort wegbewegen, und in das Gesichtsfeld eintreten oder es wieder verlassen. Falsche Resultate können vorgetäuscht werden durch BROWN`sche Molekularbewegung (passiv) oder Strömungen innerhalb der Bakteriensuspension bzw. Verdunstung am Deckglasrand.

Molekularbewegung (passiv) oder Strömungen innerhalb der Bakteriensuspension bzw. Verdunstung am Deckglasrand. 55

3.3.12

Lactobacillus spec.

Einleitung:

Lactobacillen, Familie Lactobacillaceae, sind grampositive, katalasenegative, unbewegliche Stäbchen,die keine Sporen bilden und häufig in Ketten auftreten. Sie stellen komplexe Nährstoffansprüche (Wuchsstoffe, Aminosäuren) und sind dementsprechend auf reinen Mineralsalzmedien nicht zu kultivieren. Zum Energiegewinn sind sie auf Kohlenhydrate angewiesen, bei deren Abbau Milchsäure gebildet wird.

Sie sind weit verbreitet in der Natur und finden sich besonders auf Pflanzenmaterial, in Milch und Milchprodukten sowie im Verdauungstrakt vieler Tiere.

In der Lebensmittel- und Getränkeindustrie spielen sie eine zwiespältige Rolle, denn einerseits sind sie als Schädlinge gefürchtet, andererseits leisten sie gute Dienste als Kulturorganismen bei der Herstellung von Milchprodukten, Käse, Brot, Sauerkraut etc.

Zur Isolierung lässt sich die ausgeprägte Säuretoleranz ebenso benutzen, wie die spezifische Toleranz gegen Acetat, das als Selektionsfaktor in ROGOSA-Agar enthalten ist. Anaerobe Bebrütung erhöht die Selektivität.

Arbeitsgang:

a) Material: Sauerkraut

b) Quadrantenausstrich auf ROGOSA-Agar; drei Tage anaerob bei 37 C bebrüten

c) mikroskopische und makroskopische Kontrolle

d) Reinzucht geeignet erscheinender Kolonien durch erneuten Quadrantenausstrich auf ROGOSA-Agar

e) erneute Kontrolle, KOH-Test, Katalase-Test, GRAM-Färbung

f) Stammkultur (Stichkultur in ROGOSA-Agar)

ROGOSA-Agar:

Wirkungsweise:

Durch die hohe Acetatkonzentration und den niedrigen pH-Wert wird die Begleitflora in gewissem Umfang unterdrückt. Geringe Mengen an Mangan, Magnesium und Eisen gewährleisten ein optimales Wachstum der Lactobacillen.

Zubereitung:

74,5g/Liter des ROGOSA-Agar auf dem heizbaren Magnetrührer lösen und 2-3 Minuten aufkochen, mit Essigsäure 96%ig (1,3ml/Liter Medium) auf pH 5,5 (s.u.) einstellen. Das Nährmedium für die Petrischalen wird nicht autoklaviert. Zur Entnahme des Mediums für die Stichkultur wird das Nährmedium im Kolben auf dem Magnetrührer so gerührt, dass die Agar-Partikel in der Schwebe bleiben, dann entnimmt man mit der Pipette (Mundstück nach unten) Portionen zu 10ml und überführt sie in die Reagenzgläser, der Nährboden in dem RG wird 10 Minuten bei 120°C sterilisiert, bevor man ihn senkrecht stehend erstarren lässt.

Zusammensetzung (g/Liter):

Pepton aus Casein 10,0; Hefeextrakt 5,0; D (+) - Glucose 20,0; Kaliumdihydrogenphosphat 6,0; Ammoniumcitrat 2,0; Tween 80 1,0; Natriumacetat 15,0; Magnesiumsulfat 0,575; Eisen(II)-sulfat 0,034; Mangansulfat 0,12; Agar-Agar 15,0.

pH-Wert-Einstellung siehe: Umgang mit einem pH-Meter

3.3.13

Micrococcus spec.

Einleitung:

Die Bakterien der Gattung Micrococcus sind katalasepositive, unbewegliche Kokken, die in der Luft, der Erde, in Oberflächenwasser und auf der Haut von Mensch und Tier vorkommen. Durch Zellteilung in mehreren Ebenen entstehen Tetraden, „Pakete“ oder unregelmäßige Zellklumpen. Die Kolonien sind gelb, gelbgrün oder orange gefärbt (gelbe oder rote „Luftkokken“). Infolge ihrer auffälligen Koloniefarbe und ihres Auftretens in relativ dünn besiedelten Standorten (Luft, sauberes Oberflächenwasser) bedarf es keiner besonderen Anreicherungstechniken um Micrococcus zu isolieren. In der Regel bringen „Luftplatten“ mit Vollmedium (Standard-I-Agar) den gewünschten Erfolg. Isoliert werden sollen Mikrokokken, die früher als „Sarcinen“ bezeichnet wurden und sich durch auffallend gelbe Kolonien und Wachstum in „Paketen“ auszeichnen.

Arbeitsgang:

a) Petrischalen mit Standard-I-Agar bis zu eine Stunde an verschiedenen Standorten geöffnet aufstellen

b) Platten verschließen und 2-3 Tage bei 28°C „auf dem Kopf“ bebrüten

c) Makroskopische und mikroskopische Kontrolle

d) Reinzucht ausgewählter Kolonien durch Quadrantenausstrich auf Standart-I-Agar

e) Erneute Kontrolle, KOH-Test, Katalase-Test

f) Stammkultur auf Standart-I-Schrägagar (s. Abb. unten)

f) Stammkultur auf Standart-I-Schrägagar (s. Abb. unten) Für ein Schrägagarröhrchen werden die mit etwa 5-7 ml

Für ein Schrägagarröhrchen werden die mit etwa 5-7 ml gefüllten, sterilisierten Röhrchen so auf ein Schlauch gelegt, dass der Agar schräg erstarrt. Die auf diese Weise erzielte Oberfläche sollte zum Kultivieren von Mikroorganismen möglichst groß sein. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass der Agar vor dem Erstarren nicht bis zum Stopfen läuft, da dadurch die Kontaminationswahrscheinlichkeit vergrößert wird.

3.3.14

Streptococcus spec.

Einleitung:

Die Mundhöhle wird von einer außerordentlich komplexen Keimflora besiedelt. Zur Normalflora gehören u.a. Streptokokken, die hier ein harmloses Leben als Kommensalen führen. Sie neigen jedoch dazu sich an den Zähnen festzusetzen (Speisereste zwischen den Zähnen und besonders Zucker dienen als gute Nahrungsquelle) und die sog. Plaques zu bilden. Neben St. sanguis, St. mitis und St. milleri sind es vor allem St. mutans und St. salivarius, die große Schleimmengen produzieren, die besonders wegen ihrer klebrigen Konsistenz das Festhaften an den Zähnen erleichtert. Werden diese Plaques nicht regelmäßig entfernt, so können die Bakterien mit Hilfe von Mineralien aus dem Speichel Zahnstein bilden. Außerdem scheiden die Streptokokken Säuren aus, die den Zahnschmelz angreifen und zu kariösen Veränderungen führen.

Arbeitsgang:

a) Herstellung von zwei HTS-Agar

b) Mit dem Zahnstocher Plaquematerial entnehmen

c) Plaquematerial in einen Tropfen steriler 0,9%iger NaCl-Lösung auf Objektträger suspendieren

d) Platten mit Suspension im Dreizehnstrichverfahren beimpfen

e) Platten bei 37°C anaerob drei Tage bebrüten

f) Auswertung der Platten (Koloniemorphologie, KOH-Test, Katalase-Test, GRAM-Färbung)

HTS Medium:

A

dest.

1000 ml

Hefeextrakt

5 g

Tryptophan

10 g

Saccharose

50 g

KH 2 PO 4

3 g

Gelatine

10 g

Agar

15 g

pH 7,2 (Einstellung mit 1N Essigsäure und 1N NaOH)

3.3.15 Actinomyceten

Einführung:

Actinomyceten sind grampositive im Boden vorkommende Bakterien, deren auffälligstes Merkmal das mycelartige Wachstum ist. Über lange Zeit war unsicher, ob eine phylogenetische Verwandtschaft zu den Bakterien oder Pilzen besteht. Ihre prokaryotische Zellstruktur, die Beschaffenheit der Zellwand (Murein), ihr Stickstoffmetabolismus und ihre Sensibilität gegen bakterienspezifische Antibiotika und gegen Phagen lassen keinen Zweifel an ihrer Zugehörigkeit zu den Bakterien. Das Mycel wird entweder als Luft- oder Substratmycel ausgebildet, es ist verzweigt und septiert, wobei die einzelnen Hyphen einen Durchmesser von 1 µ haben. Alterndes Mycel zerfällt in stäbchenförmige Zellen. Die an den Enden des Luftmycels abgeschnürten Sporen unterscheiden sich von den Endosporen der Bacillaceae durch eine nur mäßige Hitzeresistenz, sie weisen aber gegenüber vegetativen Bakterienzellen eine erhöhte Phenolresistenz auf, was zur Isolierung ausgenutzt werden kann.

Arbeitsgang:

10 g trockene, fein gesiebte Gartenerde und 10 ml Leitungswasser

30 Minuten schütteln

1:10 verdünnen

0,1 ml

0,1 ml

parallel in 10 ml Phenollösung (1g Phenol/140ml H 2 O) geben

15 Minuten Raumtemperatur

je 1ml in 100ml verflüssigten und auf 50°C temperierten Stärke-Casein-Agar geben und gut vermischen

Platten zu 20 ml gießen

1 Tropfen Biphenyl-Lösung in Deckel geben,

1 Woche bei 28°C „auf dem Kopf“ bebrüten

Täglich auf kalkig graue Kolonien mit 1-5 mm Ø kontrollieren

falls positiv, mikroskopische Kontrolle

etwas Luftmycel abimpfen und durch Quadrantenausstrich auf Yeastextrakt-Glukose-Agar reinzüchten

Kontrolle

Stammkultur / Yeastextrakt-Glucose-Agar

Yeastextrakt-Glucose-Agar:

g je Liter dest. H 2 O

Stärke-Casein-Agar:

Hefeextrakt

10

10

Stärke löslich

Glukose

10

0,3

Casein

Agar

15

2

KNO 3

 

2

NaCl

2

K 2 HPO 4

0,05

MgSO 4

0,02

CaCO 3

0,01

FeSO 4 .7H 2 O

20

Agar

3.3.16 Anreicherung und mikroskopische Untersuchung von Schimmelpilzen

Einleitung:

Die Gruppe der „Schimmelpilze“ umfasst keine systematisch abgegrenzte Pilzgruppe; vielmehr ist dies eine Bezeichnung für Pilze aus verschiedenen taxonomischen Gruppen, die sehr schnell auf Substraten (in erster Linie auf Lebens- und Futtermitteln) ein mit dem Auge sichtbares watteartiges Mycel („Schimmel“) ausbilden und durch die Fruktifikationsorgane (Sporangien, Konidien) auffallend gefärbt sind.

Im Praktikum werden einige typische Vertreter der Schimmelpilze vorgestellt, wobei einige wichtige Verhaltensweisen zu beachten sind:

I. Die mit Schimmelpilzen angereicherten Petrischalen bleiben grundsätzlich geschlossen.

II. Die zur mikroskopischen Kontrolle notwendigen Entnahme von Mycel erfolgt nur in der Sterilbank (SK2) unter Aufsicht des Fachlehrers.

Die mikroskopische Untersuchung einer Reinkultur sollte auf drei verschiedenen Wegen erfolgen:

a) Objektträgerpräparat:

-- Auf einen Objektträger gibt man einen Tropfen Lactophenol-Baumwollblau*). -- Vom Rand der Pilzkolonie wird mit einer Nadel etwas Agar mit Pilzmaterial herausgehoben und auf den Tropfen gelegt. -- Nun gibt man einen Tropfen Ethanol auf das Pilzmaterial und legt ein Deckglas auf. -- Über der Sparflamme des Brenners wird der Objektträger hin- und hergeschwenkt, bis der Agar geschmolzen ist, d.h. bis der Objektträger flach auf dem Deckglas liegt. -- Mikroskopiert wird bei 100 - 400facher Vergrößerung.

*) Lactophenol-Baumwollblau:

Phenol

5 g

Milchsäure

5 g

Glycerin

5 g

Anilinblau

0,1 g

Aqua dest.

10 ml

b) Klebebandpräparat

-- Auf einen Objektträger wird ein Tropfen Lactophenol-Baumwollblau gegeben. -- Mit einem breiten durchsichtigen und klaren Klebeband wird vorsichtig mit der Klebeseite die Kolonie (Randbereich) vom festen Medium abgedrückt und das Klebeband auf den Objektträger „geklebt“ und

mikroskopiert.

c) Zupfpräparat

-- Ein Teil des Mycels und der Vermehrungsorgane wird mit zwei Nadeln (Pinzette) vom festen Medium

vorsichtig abgezupft und in einem Tropfen Lactophenol-Baumwollblau, mit einem Deckglas bedeckt, mikroskopiert.

I.

Penicillium spec.

Einleitung:

Schimmelpilze der Gattung Penicillium (Pinselschimmel) gehören zu den am häufigsten vorkommenden Pilzen und sind deshalb leicht zu isolieren. Die Konidien sind überall in der Luft und in der Erde zu finden. Sie spielen eine Rolle als Lagerschädlinge in der Lebensmittelindustrie (z.B. Penicillium expansum), als Antibiotika- Produzenten (Penicillium chrysogenum) in der Biotechnologie und als Kulturorganismen bei der Käseherstellung (Penicillium roqueforti, Penicillium camenberti).

Arbeitsgang:

a) Bodenproben, Brot oder Käse ca. 10 g in 50 ml Leitungswasser suspendieren

b) 1 - 2 Tropfen in Petrischale geben und mit ca. 20 ml verflüssigtem Malzextrakt-Agar*) von 50°C vermischen

c) bei 28°C bebrüten und täglich auf Entwicklung von Penicillium-Kolonien prüfen

d) makroskopische und mikroskopische Kontrolle

*) Malzextrakt-Agar (ME-Agar):

(g je Liter Aqua dest.)

Malzextrakt

30

Pepton

5

Agar

15

Nach der Sterilisation werden die Erlenmeyerkolben im Wasserbad auf 50 – 55°C temperiert; pro Kolben (Inhalt 100 ml) werden 0,12 ml 10 %ige Milchsäure zugesetzt (pH 5,3), ohne Schaumbildung vorsichtig vermischen.

(pH 5,3), ohne Schaumbildung vorsichtig vermischen. Abb. 3.1: Sporenträger von Aspergillus, Penicillium und von

Abb. 3.1: Sporenträger von Aspergillus, Penicillium und von Gattungen der Familie Mucoraceae (von links; schematisch)

II.

Mucor mucedo

Einleitung:

Mucoraceen findet man häufig auf reifen, faulenden Früchten, feuchtem Schwarzbrot, Pferdeäpfeln, in der Luft und im Boden. Sie lassen sich leicht in einem synthetischen Nährmedium (MSM = Mucor-synthetic-medium *) kultivieren, das als Stickstoffquelle Asparagin enthält. Dem spezifischen Wuchsstoffbedürfnis trägt ein Thiaminzusatz Rechnung. Mit Hilfe des MSM lassen sich Mucoraccen leicht aus der Natur isolieren.

Arbeitsgang:

10 g Erde in 50 ml Leitungswasser suspendieren 1 Tropfen in sterile Petrischale geben

ca. 20 ml sterilisierten und auf 50°C temperierten

MSM-Agar zugeben und vorsichtig mischen

makroskopische und mikroskopische Kontrolle

Brot mit etwas sterilem Wasser anfeuchten auf angefeuchtetes Filterpapier in ein Glas legen täglich kontrollieren, ob lockerer grauer Rasen entstanden ist mikroskopische Kontrolle

*) MSM-Agar:

Glucose Asparagin KH 2 PO 4 MgSO 4 Thiamin Agar

(g je Liter Aqua dest.)

40,00

2,00

0,50

0,25

0,50

15,00

III. Endomyces lactis (Milchschimmel)

Einleitung:

Endomyces lactis ist eigentlich kein Schimmelpilz im engeren Sinne. Der Pilz wird normalerweise zu den Hefen gezählt, obwohl er keine hefeartige Sprossung zeigt. E.lactis ist stets zu finden auf altem Quark, saurer Milch und Yoghurt, wo er einen weißen samtartigen Überzug bildet. Er ist ein typischer Begleiter milchsaurer Gärungen (Sauerkraut, saure Gurken), wo er die von den Milchsäurebakterien produzierte Milchsäure assimiliert Dies kann zum Anstieg des pH-Wertes und damit zu einer Gefährdung der Haltbarkeit führen.

Arbeitsgang:

Quark

Öse

Ausstrich auf ME-Agar

2-3 Tage bei 28°C bebrüten

makroskopische und mikroskopische Kontrolle

3.3.17

Saccharomyces - Hefen

Einführung:

Hefen der Gattung Saccharomyces sind die Hauptverursacher der alkoholischen Gärung. Sie kommen vor allem auf und in zuckerhaltigen Substraten vor, von denen ihre Isolierung relativ einfach gelingt. Zur Anreicherung nutzt man einerseits ihre Gärfähigkeit, die ihnen unter O 2 -limitierten Bedingungen Vorteile gegenüber Schimmelpilzen und den meisten anderen Hefen bringt und andererseits ihre im Vergleich zu Bakterien höhere Säuretoleranz aus. Diese Voraussetzungen sind in Gäransätzen mit pH-Wert - 4,5 gegeben. Da auf diesem Wege aber keine sichere Unterdrückung anderer gärfähiger Hefen gewährleistet ist, ist eine nähere Charakterisierung über die typische Ascosporenbildung auf Acetat-Agar *) und die fehlende Pseudomycelbildung auf Kartoffelwasser-Agar **) erforderlich.

*)

Acetat-Agar:

( g je Liter)

 

Natriumacetat

5

KCl

10

Agar

20

**) Kartoffelwasser-Agar:

 

Kartoffelwasser

230 ml

Leitungswasser

770 ml

Glukose

20 g

Agar

20 g

Kartoffelwasser: 300 g gewaschene und geschälte Kartoffeln werden sehr klein geschnitten und in 300 ml Leitungswasser mehrere Stunden im Kühlschrank eingeweicht. Dann wird durch ein Tuch filtriert und das Filtrat eine Stunde autoklaviert.

Arbeitsgang:

a) Probe von Oberfläche einer Frucht

b) Standkultur-ME-Bouillon (pH=4,0) drei Tage bei 28°C

c) Dreizehnstrichverfahren auf ME-Agar (pH=4,0), 1-2 Tropfen Biphenyl-Lösung in den Deckel, 2-3 Tage „auf dem Kopf“ bebrüten bei 28°C

d) makroskopische und mikroskopische Kontrolle

e) drei verschiedene Einzelkolonien

f) drei Stammkulturen auf ME-Schrägagar

g) mit den Stammkulturen werden zur Differenzierung folgende Untersuchungen durchgeführt:

I. Gärfähigkeit:

II. Askosporenbildung:

III. Pseudomycelbildung:

-- RG mit ME-Bouillon / Durham-Röhrchen beimpfen -- drei Tage bei 28°C

-- 5 ml ME-Bouillon in Zentrifugenröhrchen beimpfen -- zwei Tage bei 28°C -- abzentrifugieren -- Bodensatz auf Acetat-Agar, 5-7 Tage bei 28°C, mikroskopieren

-- Kartoffelwasser-Agar punkt- und strichförmig beimpfen, Punkt mit Deckglas abdecken -- 4 Tage bei 28°C, mikroskopieren

3.3.18

Einführung in die mikrobiologische Diagnostik mit Hilfe verschiedener Nährmedien

Einführung:

Die Nährstoffansprüche von Mikroorganismen sind sehr unterschiedlich. Kennt man die Nährstoffansprüche bestimmter Mikroorganismen und auch die damit verbundenen Stoffwechselleistungen, so kann man z.B. mit Hilfe verschiedener Nährmedien verschiedene Keime sicher differenzieren.

Im Folgenden sollen die unterschiedlichen Nährstoffansprüche und Stoffwechselleistungen am Beispiel von vier Bakterienarten (Bacillus subtilis, Escherichia coli K 12, Micrococcus luteus, Enterococcus casseliflavus) mit Hilfe verschiedener Nährmedien werden verwendet: (Zubereitung und Zusammensetzung sind den u.g. Ausführungen zu entnehmen).

Blut-Agar:

Nährmedium zur Isolierung und Züchtung verschiedener anspruchsvoller, vor allem pathogener Mikroorganismen und zur Bestimmung von deren Hämolyseformen. a-Hämlyse: Um die Kolonien herum findet man grüne bis grüngelbliche, trübe Höfe, die dadurch zustande kommen, dass das Hämoglobin zu Methämoglobin und Sulfhämoglobin umgewandelt ist; die Erythrozytenmembran ist weitgehend erhalten. b-Hämolyse: Bei der b-Hämolyse kommt es zu einer vollständigen Auflösung der Erythrozytenmembran und zu einer Verdauung des Hämoglobins; dadurch entstehen um die b-hämolytischen Kolonien durchsichtige, ungefärbte Höfe.

Brolac-Agar (Bromthymolblau-Lactose-Agar):

Hemmstofffreier Selektivnährboden zur Trennung Lactose-positiver Kolonien von Lactose-negativen, insbesondere bei der Diagnostik von Enterobacteriaceae. Wirkungsweise: Brolac-Agar enthält Lactose, deren Abbau zu Säure einen Umschlag des pH-Indikators Bromthymolblau nach gelb bewirkt. Alkalisierung bewirkt Umschlag nach blau.

Calcium-Caseinat-Agar:

Selektivagar zum Nachweis und zur Keimzahlbestimmung von proteinabbauenden Mikroorganismen (Proteolyten) in Nahrungsmittel und anderem Untersuchungsmaterial. Wirkungsweise: Der Nährboden enthält Casein, welches von Proteolyten abgebaut werden kann. Als Folge davon entstehen um die Kolonien klare Höfe im sonst trüben Medium (zur Verstärkung der Trübung kann vor dem Erhitzen ca. 5g - 10g / Liter Magermilchpulver zugesetzt werden - zum besseren Erkennen der Höfe können die Platten mit 5 - 10%iger Essigsäure überflutet werden).

ENDO-C-Agar:

Selektivnährboden zum Nachweis und zur Isolierung fäkaler E.coli und Coliformer in den verschiedensten Materialien nach ENDO (1904). Wirkungsweise. Natriumsulfit und Fuchsin hemmen grampositive Bakterien. E.coli und Coliforme verwerten Lactose unter Bildung von Aldehyd und Säure; Aldehyd wiederum setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfit-Verbindung frei, welches dann sie Kolonien rot anfärbt. Bei E.coli ist diese Reaktion so intensiv, dass Fuchsin auskristallisiert und dadurch den Kolonien einen grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. (Durch Sauerstoffeinwirkung wird der ausgegossene Nährboden infolge Oxydation des Sulfits allmählich rot und dadurch unbrauchbar - Petrischalen mit Parafilm verschließen - Nährboden nur wenige Tage haltbar)

Plate-Count-Agar (Caseinpepton-Glucose-Hefeextrakt-Agar):

Hemmstoff- und indikatorfreier Nährboden zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl in Milch, Milchprodukten, Wasser und anderen Materialien.

Die Beschreibung der o.g. Nährböden ist dem „Nährböden Handbuch“ der Firma E.Merck/Darmstadt entnommen.

Arbeitsgang:

 

pro Gruppe werden 16 Nährböden nach folgendem Muster hergestellt

 
 

 

4x

4x

4x

4x

Brolac-

Calcium-

ENDO-C-

Plate-

Agar

Caseinat-

Agar

Count-

 

Agar

Agar

 

 

nach dem Gießen Platten trocknen

 
 

 

im Dreizehnstrichverfahren wird jeweils eine Plattengruppe mit dem gleichen Keim beimpft

 
 

 

zusätzlich wird pro Keim eine Blut-Agar-Platte beimpft

 

 

für die Gasbildung benötigt man pro Keim 2 Reagenzgläser mit je ca. 8 ml Medium (8 ml Plate-Count-Agar, 8 ml Brolac-Agar); das Medium wird nach dem Autoklavieren im Wasserbad auf 50°C abgekühlt und dann mit je 1 ml der entsprechenden Bakteriensuspension vermischt

 

 

die Medien werden anschließend 24 Stunden bei 37°C bebrütet

Aufgaben:

1.) Ermitteln Sie die Koloniemorphologie der vier Bakterienarten für jeden Nährboden (siehe Auswertungsblatt).

2.) Ermitteln Sie die verschiedenen Stoffwechselleistungen der vier Bakterienarten (siehe Auswertungsblatt) und erklären Sie diese mit Hilfe der Veränderungen am Nährsubstrat.

3.) Wie ist das Gramverhalten der vier Bakterienarten?

Koloniemorphologie von Bacillus subtilis auf:

 

Blut-Agar

Brolae-Agar

Calcium-

ENDO-C-Agar

Plate-Count-

Caseinat-Agar

Agar

Koloniegröße

         

Oberfläche

         

Kolonierand

         

Profil

         

Transparenz

         

Farbe

         

Koloniemorphologie von Escherichia coli K 12 auf:

 

Blut-Agar

Brolae-Agar

Calcium-

ENDO-C-Agar

Plate-Count-

Caseinat-Agar

Agar

Koloniegröße

         

Oberfläche

         

Kolonierand

         

Profil

         

Transparenz

         

Farbe

         

Koloniemorphologie von Micrococcus luteus auf:

 
 

Blut-Agar

Brolae-Agar

Calcium-

ENDO-C-Agar

Plate-Count-

Caseinat-Agar

Agar

Koloniegröße

         

Oberfläche

         

Kolonierand

         

Profil

         

Transparenz

         

Farbe

         

Koloniemorphologie von Enterococcus casseliflavus auf:

 
 

Blut-Agar

Brolae-Agar

Calcium-

ENDO-C-Agar

Plate-Count-

Caseinat-Agar

Agar

Koloniegröße

         

Oberfläche

         

Kolonierand

         

Profil

         

Transparenz

         

Farbe

         

Stoffwechselleistungen verschiedener Bakterienarten:

 

Stoffwechselleistung

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Micrococcus

Enterococcus

K 12

luteus

casseliflavus

 

Lactoseabbau unter Säurebildung

       

1

(Brolae - Agar)

 

Eiweißaufbau unter Bildung klarer Spaltprodukte

       

2

(Calcium-Caseinat-Agar)

 

Anhäufung reaktiver Aldehydgruppen beim

       

3

Kohlenhydratabbau (ENDO-C- Agar)

 

Gasbildung beim

       

4

Kohlenhydratabbau (Plate-Count-Agar 50°C)

 

Gasbildung beim Lactoseabbau

       

5

(Brolae-Agar 50°C)

 

-Hämolyse

       

6

(Blut-Agar)

 

-Hämolyse

       

7

(Blut-Agar)

8

Katalaseaktivität

       

9

Gramverhalten

       

4.0 Versuchsanleitungen:

4.01 Mikroorganismen der Luft, der Haut und an Gebrauchsgegenständen

Einleitung:

Die uns umgebende Luft enthält eine Vielzahl der verschiedensten Mikroorganismen. Neben typischen Luftbakterien und Lufthefen können sich auch alle möglichen andere Bakterien (z.B. Bodenbakterien) in der Luft nachweisen lassen, vor allem, wenn sie durch Wind aufgewirbelt worden sind. Die ständige Anwesenheit von Mikroorganismen in unserer unmittelbaren Umgebung, also auch am Arbeitsplatz im Labor, erfordert besondere Arbeitstechniken beim mikrobiologischen Arbeiten, um Verunreinigungen durch normalerweise unerwünschte Luftbakterien zu vermeiden. Typische Luftbakterien bilden häufig charakteristisch gefärbte Kolonien (rot-orange-gelb). Die Färbung kommt durch Carotinoide zustande, die in der Cytoplasmamembran sitzen und das Luftbakterium somit vor der UV-Strahlung schützen.

Versuchsziel:

Es soll eine quantitative und qualitative Erfassung der Luftkeime vorgenommen werden. Gleichzeitig soll mit diesem Versuch gezeigt werden, wie notwendig steriles arbeiten ist, dies betrifft auch die Kontamination mit Keimen an Gegenständen.

Arbeitsgang:

Pro Person werden fünf Platten (jede Petrischale wird mit 20 ml Medium gefüllt) mit Standard-I-Nähragar benötigt. Drei Platten werden 5, 15, und 30 min lang an der Luft ausgesetzt. Von jeder Gruppe (2 Personen) wird der Versuch sowohl im Freien , als auch im Laborraum durchgeführt. Nach der entsprechenden Öffnungszeit wird die Platte wieder verschlossen, beschriftet und bis zum nächsten Praktikumstag bei 28°C umgekehrt( Deckel nach unten) bebrütet. Eine Platte wird für einen Hautabdruck (z.B. mit gewaschenem, ungewaschenem oder desinfiziertem Finger) und die 5. Platte für den Abdruck von Gebrauchsgegenständen (z.B. verschiedene Geldstücke) benutzt. Jede Bakterienzelle bzw. Pilzspore, die auf den Nährboden gelangt ist, hat nach ein- bis mehrtägiger Bebrützeit eine Kolonie gebildet, die man mit bloßem Auge erkennen kann, da sie aus ca. 10 9 – 10 12 Zellen besteht.

Zusammensetzung Standard-I-Nähragar:

Pepton 15,0; Hefeextrakt 3,0; Natriumchlorid 6,0; D (+) Glucose 1,0; Agar-Agar 12,0; pH 7,5 +/- 0,2 bei 25°C.

Vorbereitungen:

1)

Berechnung der herzustellenden Menge Standard-I-Nähragar pro Gruppe

2)

Ansetzen des Standard-I-Nähragar im Erlenmeyerkolben mit Schliff für jede Gruppe

3)

pH-Einstellung

4)

Autoklavieren mit aufgesetzten 20 ml Kippautomaten

5)

Abkühlung im Wasserbad

6)

Gießen des Nährbodens in sterile Petrischale

7)

Erstarren lassen und u.U. im Trockenschrank die Petrischalen bei 40-50°C trocknen

8)

Inkubation

9)

Bebrütung im Brutschrank (28°C)

8) Inkubation 9) Bebrütung im Brutschrank (28°C) Abb. 4.0: Trocknen von Agarplatten (Lagerung der

Abb. 4.0: Trocknen von Agarplatten (Lagerung der Petrischalen im Brutschrank)

Auswertung:

1)

quantitativ: Zählen Sie die auf jeder Luftfangplatte vorhandenen Kolonien. Tragen Sie ihr Ergebnis und die anderen

2)

Ergebnisse ihres Kurses in einer Tabelle zusammen und bilden Sie den Mittelwert, falls für den gleichen Standort mehrere Werte vorliegen. Nehmen Sie eine graphische Darstellung ihrer Ergebnisse vor, indem Sie je eine Kurve für den Standort "Labor“ und "Draußen“ zeichnen. qualitativ: Wählen Sie sich sechs verschiedene Kolonien (möglichst gefärbte) von den Luftfangplatten aus und beschreiben Sie die Koloniemorphologie. Dabei sind auf folgende Punkte zu achten: Farbe, Koloniegröße, Oberfläche, Profil, Kolonieform, Kolonierand, Konsistenz, Geruch (siehe Kriterien für eine Koloniebeschreibung). Mikroskopieren Sie ferner die beschriebenen Kolonien und achten Sie dabei auf Zellform, Zellaggregat und Zellgröße. Beschreiben Sie ferner die Hautabdrücke und die Abdrücke von Gebrauchsgegenständen (z.B. konfluierende Kolonien, verschiedene Kolonien, Anzahl usw.)

Für dieses Praktikum ist ein ausführliches Protokoll anzufertigen! Außerdem sind folgende Fragen zu beantworten:

1)

Welche Grundformen lassen sich bei Bakterienzellen unterscheiden, und in welchen Zellverbänden können diese

2)

Grundformen auftreten? Warum sind UV-Strahlen für Mikroorganismen besonders gefährlich?

3)

Welche prinzipiellen Unterschiede bestehen zwischen einer Hefe- und einer Bakterienzelle?

bestehen zwischen einer Hefe- und einer Bakterienzelle? Tab. 4.0: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten Erklärung:

Tab. 4.0: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten

Erklärung:

M.

= Micrococcus

S.

= Streptococcus

E.

= Escherichia

Se. = Serratia

Chr.= Chromatium (neu = Janthinobacterium lividium, alt = Chromobacterium lividium )

B.

= Bacillus

Str.

= Streptomyces

70

70

Abb. 4.1: Wuchsformen von Bakterien 71

Abb. 4.1: Wuchsformen von Bakterien

Abb. 4.1: Wuchsformen von Bakterien 71
Abb. 4.1: Wuchsformen von Bakterien 71

4.02 Gewinnung von Reinkulturen der Luftfangplatten(Techniken zum fraktionierten Ausstrich von Mikroorganismen)

Einleitung:

Will man gezielte mikrobiologische oder biochemische Versuche durchführen, so ist es notwendig, mit einer ganz bestimmten Bakterienart, oft sogar mit einem einzigen Stamm, zu arbeiten. Dieser Stamm darf nur Bakterien mit dem gleichen Erbgut enthalten. Es gibt mehrere Methoden (siehe Abb.4.2), wie man eine Reinkultur herstellen kann, bzw. eine einmal hergestellte Reinkultur reinhalten kann. Die endgültige Isolierung einer Reinkultur von Mikroorganismen erfolgt, bis auf wenige Ausnahmen, auf oder in festen Nährböden. Sie beginnt mit der Abtrennung einer Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle hervorgehende Kolonie von anderen Zellen oder Kolonien getrennt bleibt.

Versuchsziel:

Es soll gezeigt werden, wie man aus einer Mischkultur mit Hilfe verschiedener fraktionierter Ausstrichverfahren (siehe Abb. 4.2, 4.3, 4.4 u. 4.5) eine Reinkultur herstellt.

Arbeitsgang:

1. Praktikumstag:

-- Pro Person werden sechs Standard-I-Agar-Platten mit je 20 ml gegossen.

Standard-I-Agar:

( g pro Liter )

Pepton

15,0

Hefeextrakt

3,0

Natriumchlorid

6,0

D (+) – Glucose

1,0

Agar – Agar

12,0

pH: 7,5 +/- 0,2

-- Von einer Mischkultur der Luftfangplatte wird mit der Impföse, die vorher im Bunsenbrenner durch Rotglühen sterilisiert wurde, etwas Material entnommen und nach den schematisch dargestellten Methoden auf den Standard-I-Agar-Platten ausgestrichen -- Gegebenenfalls wird mit der sterilen Impföse künstlich eine Mischkultur erzeugt, indem nacheinander von isoliert liegenden, deutlich unterschiedlichen (Farbe) Kolonien wenig Material entnommen wird und dann gemeinsam ausgestrichen wird. -- Die Impföse muss nach Vorschrift ausgeglüht werden. -- Bebrütung der Platten umgekehrt bei 28°C.

2. Praktikumstag:

-- Überprüfen der Platten. Liegt eine Reinkultur vor?

Typische Fehler sind:

-- Die Impföse wurde nicht parallel zum Nährboden gehalten und dieser daher „gepflügt“. -- Die Impföse wurde nicht genügend sterilisiert und daher keine Vereinzelung der Bakterien erzielt. -- Durch unsteriles Arbeiten erfolgt eine Verunreinigung mit Luftkeimen.

Versuchsauswertung:

-- Beschreiben Sie, an welcher Stelle der Ausstrichplatten eine Vereinzelung der Kolonie vorliegt. -- Beschreiben Sie das makroskopische und mikroskopische Bild der von Ihnen isolierten Bakterien und vergleichen Sie mit der Luftfangplatte. -- Führen Sie mit einer Reinkultur eine Gramfärbung durch und beimpfen Sie damit ein Schrägagarröhrchen.

Abb. 4.2: Ausstrichmethoden 73

Abb. 4.2: Ausstrichmethoden

Abb. 4.3: Ausstreichen von Mikroorganismensuspension mit der Impföse auf einer Agarplatte Abb. 4.4: Agarplatte mit

Abb. 4.3: Ausstreichen von Mikroorganismensuspension mit der Impföse auf einer Agarplatte

mit der Impföse auf einer Agarplatte Abb. 4.4: Agarplatte mit Verdünnungsausstrich nach dem

Abb. 4.4: Agarplatte mit Verdünnungsausstrich nach dem 13-Strich-Verfahren. (A) Ausstrichschema. (B) Aussehen des Ausstrichs nach der Bebrütung und der Entwicklung von Kolonien.

Abb. 4.5: Darstellung des Arbeitsganges zur Gewinnung einer Einzelkolonie 75

Abb. 4.5: Darstellung des Arbeitsganges zur Gewinnung einer Einzelkolonie

Abb. 4.5: Darstellung des Arbeitsganges zur Gewinnung einer Einzelkolonie 75

4.03 Herstellung und Beimpfen eines Schrägagarröhrchens

Einleitung:

Schrägagarröhrchen sind Reagenzgläser mit Nährlösung und Agar, die in Schräglage erstarren. Man verwendet sie, wenn man Mikroorganismen für längere Zeit aufbewahren will. Dies gilt zum Beispiel für sogenannte „Stammkulturen“. Normale Petrischalen sind für längeres Aufbewahren ungeeignet, da sie sehr schnell austrocknen. In Reagenz- gläsern ist die Agarschicht erheblich dicker. Sie können daher erheblich länger (mindestens ein halbes Jahr) verwendet werden, wenn man die Stammkulturen im Kühlschrank aufbewahrt (bei 4°C). Agarböden sind maximal 4-5 Wochen haltbar. In den modernen Stammkultursammlungen werden Bakterien gefriergetrocknet und können dann unbegrenzt bei –20°C aufbewahrt werden. Man hat errechnet, dass man Bakterien, wenn man sie bei Temperaturen in der Nähe des absoluten Nullpunkts aufbewahrt, Millionen Jahre in lebensfähigem Zustand halten kann. Es gibt große Stammsammlungen, bei der jederzeit alle gewünschten Bakterienstämme angefordert werden können. In Deutschland ist es die DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Göttingen).

Versuchsziel:

Es sollen Schrägagarröhrchen hergestellt werden, und die in Versuch 4.2 isolierte Reinkultur zur Stamm- kultur gemacht werden. Im nächsten Halbjahr soll demonstriert werden, dass die Bakterien noch lebensfähig sind.

Arbeitsgang:

-- Herstellung von zwei Schrägagarröhrchen pro Person mit je ca. 5 ml Standard-I-Agar. -- Zum Erstarren legt man die Reagenzgläser einfach auf einen Bunsenbrennerschlauch. -- Die Reinkultur aus Versuch 4.2 wird in der auf der Abbildung dargestellten Art mit der vorher sterilisierten Impföse ausgestrichen. -- Falls sich in den Reagenzgläsern Kondenswasser abgesetzt hat, kann dies vorher vorsichtig entfernt werden. -- Die Schrägagarröhrchen werden 1-2 Tage bei 28°C inkubiert. -- Nach der Kontrolle, ob die Bakterien gewachsen sind, werden die Röhrchen in den Kühlschrank gestellt.

sind, werden die Röhrchen in den Kühlschrank gestellt. Abb. 4.6: Schrägagarröhrchen während des Erstarren des

Abb. 4.6: Schrägagarröhrchen während des Erstarren des Agars

Abb. 4.6: Schrägagarröhrchen während des Erstarren des Agars Abb. 4.7: Beimpfen eines Schrägagarröhrchens 76

Abb. 4.7: Beimpfen eines Schrägagarröhrchens

4.04 Isolierung von Streptokokken aus Zahnbelag

Einleitung:

Streptococcus salivarius ist ein Milchsäurebakterium, das zur normalen Mundflora eines gesunden Menschen gehört. Dort führen die Bakterien normalerweise ein harmloses Leben als Kommensalen des Menschen. Sie neigen jedoch dazu, sich an den Zähnen festzusetzen (dort finden sie die besten Nahrungsquellen in Speiseresten, die sich zwischen den Zähnen festsetzen) und die sogenannten Plaques zu bilden. Vor allem Streptococcus salivarius bildet enorme Schleimmengen, die wegen ihrer klebrigen Konsistenz das Festhaften an den Zähnen erleichtern. Werden diese Plaques nicht regelmäßig entfernt, so kann das absterbende Bakterienmaterial verhärten und zu Zahnsteinbildung führen. Außerdem scheiden die Streptococcen Milchsäure aus, die den Zahnschmelz angreifen kann. Die Folgen können Parandontitis und Karies sein.

Versuchsziel:

Aus eigenem Zahnbelag soll Streptococcus (saliva = Speichel; salivarius = schleimig) isoliert und mikroskopiert werden!

Achtung!

Aufgrund der Problematik einiger antibiotikaresistenten Stämme von Staphylococcus aureus (MRSA) wird eine Reinkultur der DSMZ benutzt. (MRSA = mehrfach- und gegen Methicillin resistenter Staphylococcus aureus)

Arbeitsgang:

1. Praktikumstag:

Gruppenweise werden 4 Platten HTS-Agar hergestellt. Charakteristisch für diesen Nährboden ist neben dem Hefeextrakt, Trypton und der hohen Saccharosekonzentration die Gelatine.

HTS-Nährmedium:

Aqua dest. Hefeextrakt Trypton Saccharose KH 2 PO 4 Gelatine Agar

1000

5

10

50

3

10

15

pH 7,2 einstellen

ml

g

g

g

g

g

g

Mit einem Zahnstocher wird etwas Plaque-Material entnommen, wobei v.a. die hinteren Backenzähne sehr ergiebig sind, da sie von der Zahnbürste schwerer zu erreichen sind. Dieses Plaque-Material wird in einem Tropfen steriler, ¼-starker Ringerlösung verrieben, bis es sich suspendiert hat. Mit der sterilen Impföse wird ein Tropfen entnommen und nach der 13 Strichmethode auf dem HTS-Boden ausgestrichen. Die Platten werden bei 37°C (Mundtemperatur) inkubiert.

Auswertung:

2. Praktikumstag: