Cromatografa:

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. a) Retencin. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un soporte slido. b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas. El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil, recibe el nombre de elucin. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

TIPOS DE CROMATOGRAFA.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido. b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido anclado a un soporte slido. c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas. d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil un gas. Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre. a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas. c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil.

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN La adsorcin es la propiedad que tienen ciertos slidos de aumentar la concentracin en su superficie de otras sustancias. La separacin se debe a las diferencias de adsorcin de los componentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un slido polar de gran superficie (adsorbente). La fase mvil puede ser un gas o un lquido dando lugar a la cromatografa gas-slido (CGS) o lquido-slido (CLS). El grado de adsorcin vara segn la naturaleza y superficie especfica de los adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre molculas adsorbidas y el adsorbente han de ser dbiles para que su fijacin sea reversible, las uniones

son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrgeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente y de los solutos han de ser opuestas. Cromatografa lquido-slido (CLS). La fase estacionaria est constituida por un slido polar poroso y que esta finamente granulado. La superficie especfica contiene centros polares aptos para la adsorcin de las molculas polares presentes en la fase mvil. Al disminuir el tamao de las partculas, el nmero de centros activos por unida es mayor, y la capacidad de adsorcin se incrementa. El adsorbente ms utilizado es gel de slice aunque tambin se emplea almina activada. En el caso del gel de slice la interaccin se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales polares de los compuestos orgnicos. La fase mvil est constituida por un disolvente en el que los componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase mvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporcin del disolvente ms polar.La retencin se realiza en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar (S) y las molculas de la fase mvil (M) por adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. As las molculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados por las molculas polares presentes en la fase mvil. Los tiempos de retencin y la selectividad en la separacin dependern de la polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) y la naturaleza de los disolventes que componen la fase mvil (M).

Cromatografa en capa fina.

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. La relacin entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor). Rf= Distancia recorrida por el compuesto Distancia recorrida por el disolvente La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo.

La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador es un compuesto que ha de reaccionar con los compuestos analizar de forma que se obtenga una mancha coloreada a simple vista. Los reveladores ms usados son: cido fosfomolibdico (para compuestos fcilmente oxidables) Yodo (para compuestos aromticos e insaturados) Ninhidrina (para aminocidos, aminas y aminoazucares) Permanganato potsico (compuestos insaturados o fcilmente oxidables)

Cromatografa en columna.
Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retencin. El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm, slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida. Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las siguientes; a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura del adsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a separar. b) Eleccin del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena separacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de etilo.

Procedimiento experimental
- CROMATOGRAFA EN COLUMNA (OBTENCIN DE CAROTENOIDES Y PIGMENTOS)

Separacin de carotenoides
1. Pesar 1.0 g de chile guajillo seco, eliminando las semillas, cortarlo en trozos pequeos y agregar 10 mL de una mezcla de tolueno-ter de petrleo 1:1; macerar en el mortero y dejar reposar por 10 minutos; decantar el extracto orgnico y concentrar en bao Mara hasta un volumen de 1 mL (en campana de extraccin). Durante el periodo de reposo de la muestra empacar la columna. Para la preparacin de la columna: se toma una columna de vidrio de 20 cm de longitud por 1.5 cm de dimetro (en caso extremo se puede sustituir por una bureta), se sujeta en el soporte con las pinzas. 2. Se revisa que la llave y funcione correctamente (que no halla fugas) y se mantiene en posicin de cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeo trozo de algodn ayudndose con la varilla de vidrio, se agregan 3 mL de la mezcla eluyente (Tolueno-ter de petrleo, 1:1), se presiona suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensin de 8g de gel de Slice 60, 63-200 micras en 50 60 ml de mezcla eluyente y se agita durante 5 minutos para eliminar las burbujas. 3. A travs del embudo se vierte la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme. Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la gel de Slice. Se podra haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que no queden espacios vacos, y luego pasarle disolvente. Abriendo la llave de paso al mismo tiempo; dejar que pase el eluyente hasta que quede un nivel de 1 mL arriba del adsorbente, cerrar la llave y agregar el extracto de Capsicum con ayuda de pipeta Pasteur. Abrir la llave y drenar la columna con Tolueno-ter de petrleo (1:1). 4. Observar la separacin de los pigmentos a medida que se eluye la columna, y recolectarlos en tubos de ensayo o matraces Erlenmeyer de 25 mL para su posterior anlisis cromatogrfico. 5. La separacin del extracto tambin se puede hacer por cromatografa en capa fina, usando en este caso una placa de silica gel de 20 x 20, se aplica el extracto en forma de banda 6. Hacer el mismo procedimiento en otra columna utilizando los extractos de espinaca o acelga obtenidos en la sesin prctica anterior. Debes de re-disolver previamente tu extracto seco en ter etlico.

Anlisis cromatogrfico.
Una vez que se tiene las fracciones de cada columna, se corren cromatografas en capa fina para identificar los componentes obtenidos, se determinan los valore de Rf.

RESIDUOS Y SU MANEJO
Retirar los trozos de material biolgico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgnicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Slica gel. Se retira de la columna empleando una corriente de aire y recibindolas sobre una toalla de papel se depositan en el recipiente de los residuos de soportes cromatogrficos para su posterior limpieza. Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los contienen y se depositan en frascos etiquetados

Separacin de los pigmentos de la hoja de espinaca mediante cromatografa en capa fina

Introduccin
La cromatografa en capa fina (CCF) es una forma de cromatografa de adsorcin slido-lquido que constituye una tcnica importante en Qumica Orgnica para el anlisis rpido de muestras que en algunos casos puede estar en el rango de los 10-9 g. Frecuentemente se usa para el seguimiento de la evolucin del progreso de una reaccin, o para el control y seguimiento de las separaciones que se producen mediante una cromatografa en columna preparativa. Para realizar el anlisis de una muestra por CCF se utiliza un adsorbente slido como gel de slice (SiO2. H2O) o almina (Al2O3), unido a una placa rectangular de vidrio o plstico. El adsorbente sirve de fase estacionaria. La muestra se aplica en disolucin con un capilar de vidrio en un extremo de la placa, pero no sobre el mismo borde. A continuacin se introduce la placa en un tanque cerrado conteniendo un disolvente o mezcla de disolventes (fase mvil), de manera que la placa quede apoyada sobre el fondo y el punto con la muestra, por encima del nivel del lquido. El tanque contiene una atmsfera saturada en el disolvente para lo cual se introduce un trozo de papel de filtro que debe. La fase mvil asciende por capilaridad, de forma que se produce el mayor o menor avance de los componentes de la mezcla, segn su polaridad. Procedimiento

a. Preparacin de la muestra
1. En un mortero, machacar una hoja de espinaca con una mezcla de 4 ml de hexano y 2 ml de etanol. 2. Con una pipeta Pasteur transferir el extracto a un tubo de ensayo y agitar con mucha suavidad con una cantidad igual de agua, evitando la formacin de emulsiones. 3. Eliminar la fase acuosa con ayuda de una pipeta Pasteur, y el lavar sucesivamente dos veces con 2 ml de agua para eliminar el etanol. 4. Transferir la fase orgnica a un tubo de ensayo y aadir con una esptula sulfato sdico anhidro para eliminar el agua.

b.- Preparacin de la placa de cromatografa.

1. Marcar la placa, con ayuda de un lpiz los puntos en donde se va depositar la muestra (tres puntos). 2. Con un capilar, tomar un poco de la disolucin orgnica conteniendo los pigmentos y pinchar la placa de cromatografa en los tres puntos con concentraciones diferentes. 3. Para evitar que la mezcla difunda por la placa, vaciar el contenido del capilar poco a poco sobre el punto, y soplar suavemente cada vez, para secar el disolvente.

c.- Desarrollo de la placa

Preparar varias mezclas de disolventes, desarrollar las placas. Preparar unos 10 ml de eluyente cada vez, empezando por una mezcla de Hexano/Acetona 7:3