Genética Molecular

MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS
Captulo 1 - O FLUXO DE INFORMAO VIA MOLDES

Os cidos Nuclicos
Toda a informao que uma clula necessita durante a sua vida e a de seus descendentes, est organizada em forma de cdigo nas fitas dos cidos nuclicos que constituem os armazenadores e transmissores de informao nos seres vivos. Esta informao traduzida em protenas permite que a clula execute todo o trabalho necessrio sobrevivncia do organismo. Existem dois tipos de cidos nuclicos: cido desoxirribonuclico ou DNA e cido ribonuclico ou RNA. Ambos so polmeros lineares de nucleotdios conectados entre si via ligaes covalentes denominadas ligaes fosfodister. Os nucleotdios, unidades bsicas dos cidos nuclicos, so constitudos de:

Uma base nitrogenada (anel heterocclico de tomos de carbono e nitrognio); Uma pentose (acar com cinco carbonos); Um grupo fosfato. As bases nitrogenadas so de dois tipos: pricas e pirimdicas.
Adenina (A) e Guanina (G) so purinas. Timina (T), Citosina (C) e Uracil (U) so pirimidinas.
As purinas so constitudas de dois anis fundidos de 5 e 6 tomos e as pirimidinas de um nico anel de 6 tomos. Apenas quatro tipos diferentes de bases so encontrados em um dado polmero de cido nuclico. No DNA as bases constituintes so A, G, C, e T enquanto no RNA so A, G, C e U. Uracil e Timina so molculas bastante relacionadas, diferindo apenas pelo grupo metila encontrado no tomo C5 do anel pirimdico da Timina (Figura 1.1).
Relao Oxignio Dissolvido e Saturao de Oxignio mg/L % 9 100 8 Figura 1. 1. Purinas e pirimidinas so bases nitrogenadas. Os nmeros identificam a posio nos anis 7 heterocclicos (mais de uma espcie de tomo). a presena 80 tomos de nitrognio que d a estas dos 6 60 molculas seu carter bsico. 5 4 40 Dois tipos de pentoses so encontrados nos cidos nuclicos: ribose e 2-desoxirribose (Figura Ago Out Fev Abr Ago 1.2). Diferem umaDez outra pela presena Jun ausncia do grupo hidroxila no C 2' da pentose. da ou 2002
Oxignio Dissolvido
2003 Cristina M. Bonato

Saturao de oxignio
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS baseado nesta caracterstica que os cidos nuclicos recebem o nome RNA (ribose) ou DNA (desoxirribose). A pentose o elo de ligao entre a base e o grupo fosfato. De um lado, o Nitrognio 9 das purinas ou o Nitrognio 1 das pirimidinas liga-se ao C1' da pentose e, de outro lado, o grupo carboxila do tomo de C5' da pentose participa da ligao ster com o grupo fosfato.
Figura 1. 2. Ribose e 2-desoxirribose. Os tomos de carbono so numerados como indicado. O grupo hidroxila est ausente no C2' da desoxirribose. atravs do C1' que o acar conecta-se com a base nitrogenada. No DNA o acar sempre uma desoxirribose e no RNA sempre uma ribose.
Mais de um grupo fosfato pode estar ligado posio 5' do nucleotdio. As ligaes de alta energia entre o primeiro (a) e o segundo (b) e entre o segundo (b) e o terceiro (g) grupos fosfato geram energia quando hidrolisadas. Os nucleosdios trifosfato 5' so precursores na sntese de cidos nuclicos. Denomina-se nucleosdio combinao da pentose com a base nitrogenada. Dependendo do nmero de fosfatos adicionados ao nucleosdio ele denominado nucleosdio monofosfato, difosfato ou trifosfato. A nomenclatura dos monmeros dos cidos nuclicos est descrita na Tabela 1.1. As diferenas entre RNA e DNA, todavia, no se restringem aos tipos de monmeros constituintes. Na maioria das vezes o DNA apresenta-se como uma longa hlice dupla com uma estrutura secundria regular e simples, enquanto os RNAs so, geralmente, molculas de fita nica bem menores que o DNA apresentando uma enorme diversidade de estruturas secundrias. Estas caractersticas estruturais esto relacionadas s funes destas duas macromolculas na clula. Tabela 1. 1. Nomenclatura dos monmeros dos cidos nuclicos Base Adenina Guanina Citosina Timina Uracil Nucleosdio adenosina guanosina citidina timidina uridina Nucleotdio cido adenlico cido guanlico cido citidlico cido timidlico cido uridlico RNA AMP GMP CMP UMP DNA dAMP dGMP dCMP dTMP -
A letra "d" utilizada para indicar que o acar a desoxirribose. A molcula de DNA uma dupla hlice cujas cadeias esto unidas por pontes de hidrognio estabelecidas entre purinas e pirimidinas complementares. Adenina sempre pareia com Timina (A = T) e Guanina com Citosina (G = C). O modelo de dupla hlice (Figura 1.3), proposto por Watson e Crick (1953a), pautava-se nas fotografias de difrao de raio X das fibras de DNA feitas por Rosalind Franklin no laboratrio de Maurice Wilkins (Cavendish Institute, Cambridge, UK)e nas razes entre as bases, descritas por Chargaff.
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Figura 1. 3. Modelo da dupla hlice de DNA. A orientao das duas fitas antiparalela. As fitas so mantidas unidas por pontes de hidrognio entre bases complementares as quais se posicionam perpendicularmente ao eixo acar-fosfato de cada fita. Interaes hidrofbicas e de van der Waals contribuem para a estabilidade da hlice. Uma volta da hlice constituda de 10 nucleotdios (3,4 nm). Cada nucleotdio tem 0.34 nm ou 3,4 Angstrons ().
A estabilidade e regularidade estrutural da molcula de DNA, deve-se principalmente ao fato dos anis de desoxirribose no possuirem grupos hidroxila no C 2'. Os grupos hidroxila tanto do C2' como C3' so muito reativos e podem participar de uma srie de ligaes pouco usuais permitindo uma variedade enorme de conformaes para a molcula de cido nuclico. Tal variedade, no seria uma caracterstica desejvel para uma molcula que tem armazenado e transmitido a informao gentica durante estes milhes de anos de evoluo. O exerccio de tal funo exige estabilidade e regularidade. J o RNA, constitudo de riboses , por isto mesmo, muito mais reativo e flexvel. Alm disto, o fato de ser fita simples permite um emparelhamento intramolecular de bases, gerando estruturas bastante complexas. Ao adquirir diferentes conformaes numa estrutura tridimensional, as molculas de RNA podem, inclusive, apresentar stios ativos que catalisem reaes qumicas da mesma forma que as enzimas proticas, nossas velhas conhecidas. As enzimas de RNA so denominadas ribozimas e apesar de exibirem funo cataltica so menos versteis que as enzimas proticas, uma vez que possuem menos grupos funcionais. A existncia de RNA cataltico foi demostrada por Thomas Cech (1984) quando estudava a remoo de introns nas molculas precursoras de rRNA em Tetrahymena (um protozorio ciliado). a grande flexibilidade dos RNAs que lhes permite executar uma atividade fundamental na clula, qual seja, a de interpretar o cdigo contido na linguagem de nucleotdios e descodific-lo para a linguagem de aminocidos. A molcula de RNA o intermedirio no fluxo de informaes dentro da clula, do DNA s protenas.
O Dogma Central e os Moldes

Desde meados da dcada de 50 j se pensava na hiptese do DNA constituir-se num molde para a sntese de molculas de RNA, as quais, por sua vez, devido a sua mobilidade e flexibilidade Cristina M. Bonato 3
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS acoplar-se-iam aos ribossomos e dirigiriam a sntese de protenas. Baseado neste raciocnio, Francis Crick props em 1956 o dogma central da biologia, salientando o fluxo unidirecional da informao: do DNA protena.
Para compreender este fluxo utilizamos a idia de moldes. O DNA serviria de molde para a sntese de novas molculas de DNA (duplicao) e, ao mesmo tempo, para a sntese de molculas de RNA (transcrio). Por outro lado algumas destas molculas de RNA, que denominamos RNA mensageiros (mRNA), poderiam servir de molde para a sntese de protenas (traduo), que ocorre nos ribossomos. Nesta proposta, jamais as protenas servem de molde sntese de cidos nuclicos ou de outras molculas de protena. Esta hiptese tem sido confirmada no decorrer de quase quatro dcadas de pesquisa. A proposta original, todavia, foi ampliada nos ltimos anos com a descoberta, em 1970, da enzima transcriptase reversa por Temin & Mizutani de um lado e, de outro, por Baltimore. Ficou, ento, esclarecido, que possvel sintetizar DNA utilizando-se RNA como molde. Um pouco antes disto, por volta de 1965, Spiegelman & Haruna haviam demostrado que o RNA tambm podia servir de molde sntese de outras molculas de RNA. Isto foi possvel graas ao isolamento da enzima replicase codificada por um vrus infeccioso cuja informao gentica est contida numa molcula simples de RNA. Estes novos conhecimentos permitiram que o dogma central se ampliasse sem, contudo, perder a unidirecionalidade, ou seja, de cido nuclico para protena.
Sintetizando DNA
A sntese "in vivo" de uma molcula de cido nuclico depende sempre da existncia de um molde complementar e de mquinas proticas especficas que adicionem os monmeros ao polmero nascente. Como funcionaria um molde? No caso dos cidos nuclicos a complementaridade de bases permite facilmente a utilizao de moldes. Esta complementaridade est baseada no fato de que possvel estabelecer pontes de hidrognio entre G e C, A e T ou A e U, ou seja, purinas emparelham com pirimidinas (Figura 1.4).
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Figura 1. 4. O pareamento entre bases complementares envolve a formao de duas pontes de hidrognio entre A e T ou de trs pontes de hidrognio entre G e C.
A noo de complementaridade est claramente expressa nos pargrafos abaixo retirados da publicao feita por Watson e Crick em 1953 logo aps a proposta do modelo da dupla hlice: ... "If the actual order of the bases on one of the pairs of chains were given, one could write down the exact order of the bases on the other one, because of the specific pairing. Thus one chain is, as it were, the complement of the other, and it is this feature which suggests how the deoxyribonucleic acid molecule might duplicate itself. Previous discussions of self-duplication have usually involved the concept of a template, or mould. Either the template was supposed to copy itself directly or it was to produce a "negative", which in its turn was to act as a template and produce the original "positive" once again. In no case has it been explained in detail how it would do this in terms of atoms and molecules. Now our model for deoxyribonucleic acid is, in effect, a pair of templates, each of which is complementary to the other. We imagine that prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separate. Each chain then acts as a template for the formation onto itself of a new companion chain, so that eventually we shall have two pairs of chains, where we only had one before. Moreover, the sequence of the pairs of bases will have been duplicated exactly;" . No momento da polimerizao, cada nucleosdio trifosfatado adicionado cadeia nascente, a qual est pareada com a fita molde. A adio de cada nucleotdio feita atravs do estabelecimento de uma ligao ster entre a hidroxila terminal 3' da pentose e o grupo fosfato do nucleotdio ingressante. A energia armazenada no nucleosdio trifosfatado utilizada pela polimerase para catalisar a reao que resulta na adio de um nucleosdio monofosfato cadeia e conseqente liberao de um pirofosfato que ser posteriormente quebrado em ons fosfato por pirofosfatases (Figura 1.5).
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Figura 1. 5. A sntese dos cidos nuclicos ocorre com a adio de nucleotdios ao terminal 3'-OH da cadeia nascente de sorte que a sntese sempre no sentido 5' 3'. O precursor da sntese um ncleo-sdio trifosfatado que perde os fosfatos g e b, durante a durante a reao, na forma de pirofosfato (2 Pi).
A nova molcula adicionada deixa sempre exposto um terminal 3'OH para receber o prximo nucleotdio. Assim, a posio 5' de uma pentose est conectada posio 3' da prxima pentose, via um grupo fosfato. A cadeia, cuja espinha dorsal so as molculas de acar-fosfato, cresce no sentido 5' 3'. As bases nitrogenadas fixam-se perpendicularmente ao esqueleto acar-fosfato. Durante a sntese de DNA as enzimas envolvidas so DNA polimerases enquanto na sntese de RNA as enzimas envolvidas so RNA polimerases. Estas enzimas so mquinas proticas, constitudas de vrias subunidades que executam funes especficas durante os processos de polimerizao. As polimerases so especficas para desoxirribonucleotdios ou ribonucleotdios. Sempre que tivermos uma seqncia de desoxirribonucleotdios 5' ATCGAAG 3' como molde, ser sintetizada, com absoluta preciso, a seqncia da fita complementar 5'CTTCGAT 3', desde que a enzima catalisadora seja uma DNA polimerase ou ento, a fita 5' CUUCGAU 3' se a enzima catalisadora for uma RNA polimerase. Em qualquer dos casos a adio de nucleotdios cadeia nascente obedece a ordem da seqncia de nucleotdios na cadeia molde. importante salientar que tanto no caso da sntese de DNA como de RNA as cadeias nascentes e o molde correm em direes opostas ou anti-paralelas (Figura 1.6).
Figura 1. 6. Duplicao do DNA. Cada nucleotdio adicionado utilizando-se a energia armazenada nas ligaes fosfato dos nucleosdios trifosfatados. A cadeia molde e a cadeia nascente so antiparalelas. A sntese depende da especificidade do emparelhamento das bases.
Sintetizando Protena
A sntese "in vivo" de uma cadeia polipeptdica tambm depende de um molde: a molcula de mRNA. Denomina-se RNA mensageiro (mRNA), o RNA transcrito a partir de uma seqncia de DNA capaz de codificar uma protena. Para que o RNA sirva de molde para a sntese de protenas, necessrio um descodificador ou molcula adaptadora capaz de "ler" o cdigo gentico. Esta molcula um RNA especial, o RNA transportador (tRNA) cuja cadeia polinucleotdica de 75 a 85 nucleotdios apresenta uma estrutura secundria peculiar na forma de trevo, ilustrada na Figura 1.7. interessante notar que h 6 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS um pareamento interno entre as bases desta fita simples formando hastes que sustentam alas onde se encontram as seqncias de nucleotdios no emparelhadas. Alguns nucleotdios apresentam bases modificadas. A modificao das bases ocorre aps a sntese do tRNA.
Figura 1. 7. A) Estrutura secundria de um tRNA. A posio do anticdon e do brao aceptor de aminocido esto indicadas. B) Estrutura tridimensional determinada por difrao de Raio X.
Estas estruturas de haste e haste/alas so os braos da molcula:

Brao aceptor - haste que termina numa seqncia, no emparelhada, CCA 3'OH na qual se ligar o aminocido especfico deste tRNA. Brao do anti-cdon - encontrado na posio oposta do brao aceptor, contm uma trinca central de nucleotdios especfica para cada tipo de tRNA a qual reconhece a trinca complementar no mRNA. A trinca do mRNA denominada cdon e a do tRNA denominada anti-cdon.
Cada cdon uma trinca de nucleotdios que corresponde a um nico tipo de aminocido . Alguns cdons no correspondem a nenhum aminocido. Estes so chamados cdons de terminao O cdon AUG especifica metionina que geralmente inicia a sntese protica (veja aqui o Cdigo Gentico). Tal sistema de descodificao permite que um mRNA seja utilizado como molde para a sntese de um polipeptdio. A ligao dos tRNAs ao seu aminocido especfico, depende da ao das enzimas aminoaciltRNA sintetases que ativam cada aminocido ligando-o corretamente ao tRNA especfico (Figura 1.8). Do contato entre a enzima e o tRNA participam os braos do anti-cdon e a haste D. Logo, numa dada clula devem existir, no mnimo, 20 tipos de aminoacil-tRNA sintetases. Todavia, como o cdigo degenerado este nmero pode subir para 40 ou 50. As aminoacil tRNA sintetases tambm so molculas adaptadoras.
Figura 1. 8. A enzima aminoacil-tRNA sintetase acopla um aminocido particular ao seu tRNA correspondente. O tRNA carregado dirige-se ao ribossomo onde, via complementaridade de bases, reconhecer o cdon apropriado no mRNA. O tRNA especfico recebe a notao do aminocido correspondente.
O "entendimento" do cdigo gentico requer, portanto, duas molculas adaptadoras: as enzimas aminoacil-tRNA sintetases, que ligam um aminocido particular ao seu tRNA correspondente e a molcula de tRNA propriamente dita que se liga ao cdon apropriado no mRNA, atravs de pareamento com o anti-cdon.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O processo de sntese de polipeptdios usando como molde os mRNAs denominado traduo e ocorre nos ribossomos em presena do mRNA, dos tRNAs carregados e de uma srie de outros fatores acessrios e enzimas especficas utilizando energia proveniente da hidrlise do GTP. Os ribossomos so partculas compostas de duas subunidades. A subunidade grande (L, do ingls, Large) e a subunidade pequena (S, do ingls Small). Cada subunidade ribossmica constituda de um conjunto especfico de protenas e de molculas de RNA ribossmico (rRNA).
Figura 1. 9. Mecanismo de adio de um nico aminocido cadeia nascente de polipeptdio durante a traduo do mRNA. O aminocido 6 carregado pelo seu respectivo tRNA est sendo adicionado. Os aminocidos de 1 5 j fazem parte do polipeptdio. O tRNA vazio, de anti-cdon CCC, complementar ao cdon GGG (aa4) est abandonando o ribossomo. O stio do ribossomo que recebe o tRNA carregado denominado stio A. O stio onde se liga o tRNA carregando a cadeia polipeptdica (peptidil-tRNA) denominado stio P.
Quando uma mensagem (mRNA) acopla-se subunidade ribossmica pequena, juntamente com o tRNA iniciador (tRNAMet), est dado o passo inicial para a sntese da cadeia polipeptdica codificada no mRNA. Uma leitura cuidadosa desta mensagem ser feita por tRNA sucessivos, carregando os aminocidos adequados (Figura 1.9). Aqui, a molcula de mRNA ser utilizada como molde para a construo do polipeptdio nascente. A reao fundamental no processo de sntese protica a formao da ligao peptdica entre o grupo carboxila no final da cadeia nascente e o grupo amino livre de um aminocido ingressante.Logo, o sentido de sntese da cadeia polipeptdica do terminal amino ao terminal carboxila colinear leitura da mensagem a qual sempre feita do terminal 5' para o terminal 3' da molcula de mRNA. Todos os processos delineados acima, tais como duplicao do DNA, transcrio e traduo, so executados por mquinas proticas especializadas que podero ser estudados com mais detalhes nos captulos especficos.
GUIA DE ESTUDO Qual a caracterstica do DNA que contribui para a enorme estabilidade e regularidade da molcula de DNA? 8 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Discuta o dogma central da biologia. Como a idia de molde complementar se adequa sntese dos cidos nuclicos e sntese de protenas? Qual a funo das aminoacil tRNA sintetases? Defina cdon, anti-cdon, mRNA, tRNA e rRNA. Compare as funes da transcriptase reversa, replicase e DNA polimerase. Aprenda a utilizar a tabela de Cdigo Gentico indicando a seqncia de aminocidos correspondente ao mRNA abaixo: 5' AUG CUG AAU CAA CGC GGC GAC GCU UCU UAC CCC UUU UAG 3'.
Captulo 2 LEIS DA GENTICA

As Leis de Mendel
Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Desde o incio do sculo j se sabia que unidades funcionais discretas, responsveis pela hereditariedade, estavam localizadas nos cromossomos, dentro do ncleo de clulas eucariticas. O comportamento dos cromossomos durante os estgios de diviso celular, mitose e meiose, mimetizava o comportamento destas unidades funcionais, indicando que os traos hereditrios em eucariotos deveriam fazer parte dos cromossomos. Os traos hereditrios podem ser definidos pela sua habilidade de passarem de uma gerao a outra de maneira previsvel. As regras bsicas de transmisso de informao gentica de uma gerao a outra haviam sido estabelecidas por Gregor Johann Mendel, em 1866, com a publicao do artigo "Experiments in Plant Hybridization", pela Sociedade de Histria Natural de Brno (ento, Brnn, ustria). Todavia, a comunidade cientfica da poca no foi capaz de absorver suas idias que se opunham noo generalizada de que a herana resultava de uma mistura difusa de substncias, responsveis por variaes contnuas como as observadas em relao altura, longevidade, etc. O que Mendel fez, essencialmente, foi cruzar plantas com caractersticas singulares distintas e observar a distribuio destas caractersticas nas geraes subseqentes. Escolheu para estudo a ervilha de jardim Pisum sativum porque era fcil de cultivar; tinha ciclo de vida curto; a polinizao da planta podia ser controlada; apresentava 7 caractersticas bem definidas: cor da flor (violeta ou branca); cor da semente (amarela ou verde); textura da semente (lisa ou rugosa); cor da vagem (amarela ou verde); forma da vagem (inflada ou com constries); disposio das flores e vagens (axial ou terminal) e comprimento do caule (padro ou ano). Mendel demonstrou que as diferentes caractersticas da ervilha eram controladas por fatores, os quais eram herdados como unidades discretas. Postulava que, num organismo diplide (2n) como a ervilha, para cada caracterstica analisada, dois fatores estariam envolvidos. P. ex., em relao caracterstica cor, as sementes da ervilha poderiam ser amarelas ou verdes, dependendo dos fatores presentes na planta e da interao entre eles. Se apenas os fatores que determinam a cor amarela estivessem presentes, a semente seria amarela. Se apenas os fatores que determinam a cor verde estivessem presentes, a semente seria verde. Atualmente, estes fatores so denominados genes e as formas alternativas existentes numa populao recebem o nome de alelos. Durante a meiose, processo pelo qual so produzidas as clulas reprodutivas ou gametas (n), os alelos se separam (segregam) um do outro. Aps o trmino do processo, os gametas produzidos possuem apenas um dos alelos para cada uma das caractersticas analisadas. As formas allicas surgem numa populao em decorrncia de alteraes ocorridas nos genes. A nova forma mutada pode ser herdada e assim se estabelecer na populao. Em geral, o alelo mais frequente numa populao denominado selvagem e o alelo alterado denominado mutante. Para realizar suas anlises Mendel estabeleceu linhagens puras para cada uma das caractersticas que havia escolhido. Numa linhagem pura, quando a planta auto polinizada, produz uma prognie idntica a si prpria, ou seja, com as mesmas caractersticas originais. Linhagens puras produzem apenas um tipo de gameta. Considere-se, por exemplo, a cor da semente. Numa linhagem pura de sementes amarelas todos os gametas produzidos contero o alelo que determina a cor amarela e que ser denominado A. J a linhagem pura verde, s produzir gametas contendo o alelo que determina a cor verde, denominado a. Aos atributos observveis de um organismo, como cor, tamanho, forma, etc., denomina-se fentipo. Ao conjunto de alelos que determinam tais aspectos fenotpicos, denomina-se gentipo.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quando Mendel cruzou linhagens parentais puras (P) de sementes amarelas, produtoras de gametas tipo A, com linhagens parentais puras de sementes verdes, produtoras de gametas tipo a, a primeira gerao resultante, denominada gerao F1, apresentava fentipo amarelo e gentipo hbrido (Aa), pois resultava da fuso dos gametas A e a (Figura 2.1). O fato de todos os indivduos F1 serem amarelos indicava que o alelo amarelo era completamente dominante sobre o verde. Em funo disto, o alelo verde foi considerado recessivo, uma vez que s era notado na ausncia do outro, ou seja, no se expressava no hbrido.
Figura 2. 1. Segregao dos alelos. Razes fenotpica e genotpica em F2.
Quando os dois alelos so idnticos, isto , gentipo AA ou aa dizemos que o indivduo em questo homozigoto para aquele gene. Quando os alelos so diferentes, gentipo Aa, dizemos que heterozigoto. Portanto, cada planta contem um par de genes governando um trao fenotpico particular, sendo cada alelo proveniente de um dos pais e transmitido de gerao gerao, como unidade individual, atravs dos gametas. Os diferentes tipos de gametas da gerao F1 iro se combinar aleatoriamente produzindo, na gerao F2, fentipos amarelos e verdes, na proporo 3:1 e 3 tipos de gentipos, AA : Aa : aa, na proporo 1:2:1. A lei da segregao dos alelos constitui o primeiro princpio de Mendel.
Testando a Lei de segregao
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A forma mais simples de testar a hiptese de segregao dos fatores, proposta por Mendel, proceder a uma auto-fertilizao da gerao F2, produzindo a gerao F3. Pela regra da segregao seria possvel predizer as freqncias das classes fenotpicas resultantes. A Figura 2.2 esquematiza os cruzamentos e as propores de cada gerao e representa o ponto central da proposta de Mendel sobre o comportamento dos alelos.
Figura 2. 2. Auto-fertilizao de F2.
Outra maneira de testar a hiptese de Mendel efetuar o cruzamento teste (testcross). Este teste consiste em cruzar o organismo em questo com um homozigoto recessivo. Neste cruzamento o fentipo da prognie ser determinado pelos alelos do parental que no seja o homozigoto recessivo (Figura 2.3). Outro teste o do retrocruzamento (backcross), onde o organismo em questo cruzado com um dos parentais. Assim, algumas vezes, o cruzamento teste um backcross. As principais concluses tiradas por Mendel relativas a cruzamentos monohbridos foram: Para cada uma das caractersticas estudadas a ervilha contem dois determinantes hereditrios (alelos); Para cada par de alelos, os membros do par podem ser idnticos (AA ou aa) ou diferentes (Aa); Cada clula reprodutiva (gameta) contem somente um dos alelos de cada par (A ou a); Na formao dos gametas os alelos se separam de sorte que a probabilidade de se formar um gameta A igual a de formar um a (1:1); A unio das clulas reprodutivas masculina e feminina um processo aleatrio que rene os alelos em pares; Duas plantas com o mesmo fentipo podem diferir em seus gentipos; Os hbridos da gerao F1 s expressam a caracterstica dominante; Na gerao F2 a caracterstica recessiva reaparece. A razo dominante:recessivo 3:1. 12 Cristina M. Bonato
Figura 2. 3. Cruzamento teste
Dominncia Parcial
A dominncia completa de um alelo sobre outro no um fenmeno universal. Em alguns casos, o fentipo que se observa no heterozigoto diferente do fentipo dos parentais, apresentando caractersticas intermedirias entre os homozigotos dominante e recessivo. Quando os alelos comportam-se desta maneira diz-se que ocorre dominncia parcial ou incompleta. Um exemplo a cor das ptalas das flores de Mirabilis jalapa. Quando linhagens puras de ptalas vermelhas so cruzadas com linhagens puras de ptalas brancas, a prognie em F1 apresenta ptalas rosas. Autocruzamento de F1 gera plantas com ptalas vermelhas, rosas e brancas na razo fenotpica 1:2:1 que corresponde razo genotpica de 1:2:1 (Figura 2.4). Nas plantas com flores vermelhas os dois alelos presentes so funcionais e codificam uma enzima que participa da via metablica para produo do pigmento vermelho. Nas plantas com flores brancas ambos alelos esto mutados e no h produo de pigmento, resultando em ptalas brancas. No heterozigoto apenas um alelo est funcional, de sorte que produzido metade do pigmento encontrado nas plantas de ptalas vermelhas o que resulta em plantas com ptalas rosas. Dominncia incompleta, em geral observada quando o trao analisado pode ser medido numa escala contnua, como por exemplo, quantidade de enzima produzida, altura, peso, etc., diferente de uma condio tudo ou nada, como sementes lisas ou rugosas.
Figura 2. 4. Dominncia parcial ou incompleta na herana da cor da ptala da flor em M. jalapa. Em F2 as propores fenotpica e genotpica so idnticas: 1:2:1.
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Codominncia
Um outro caso de ausncia de dominncia completa o de codominncia. Neste caso, o fentipo do heterozigoto no se encontra em algum ponto na faixa entre os dois fentipos parentais, como no exemplo de dominncia parcial. Na codominncia, os dois alelos so funcionais e expressam-se simultaneamente. Este o caso do grupo sangneo ABO no ser humano. Na populao existem quatro tipos de fentipos (A, B, AB e O), produzidos por trs alelos: A, B, e O. Na superfcie das clulas vermelhas do sangue (eritrcitos) so encontrados mucopolissacardeos cujos acares terminais so modificados diferentemente em indivduos A ou B, pela ao das enzimas codificadas, respectivamente, nos alelos IA ou IB (Figura 2.5). As enzimas que provocam estas modificaes so galoctosiltransferases especficas. Em indivduos do tipo O produzida uma enzima no funcional, incapaz de modificar o substrato, de sorte que o alelo IO recessivo aos alelos IA ou IB. Indivduos do grupo sangneo AB produzem os dois tipos funcionais da enzima fazendo, portanto, os dois tipos de modificao no substrato, o que caracteriza o fenmeno de codominncia. As estruturas A ou B expostas na superfcie dos eritrcitos funcionam como antgenos. Antgenos so substncias estranhas ao organismo, que induzem o sistema imune produzir anticorpos. Os anticorpos so protenas que se ligam aos antgenos inativando-os e/ou destruindo as clulas que os apresentam. Indivduos tipo A produzem anticorpos contra indivduos tipo B (anti-B) e indivduos B, produzem anticorpos contra A (anti-A). Indivduos O, que no produzem nem antgeno A nem antgeno B, produzem anticorpos anti-A e anti-B. Indivduos AB, que produzem os dois tipos de antgenos, no produzem anti-A nem anti-B. Nas transfuses de sangue necessrio considerar os antgenos e anticorpos para evitar que se agreguem. Indivduos com sangue tipo A produziro anticorpos anti-B e, portanto, no podem receber sangue nem de B, nem de AB. Indivduos tipo B produziro anticorpos anti-A e, portanto, no podem receber sangue nem de A, nem de AB Indivduos tipo O so doadores universais, porque no possuem antgenos, mas s podem receber sangue de indivduos tipo O. Indivduos AB s podem doar sangue para indivduos AB mas so receptores universais (Tabela 2.1).
Tabela 2. 1. Tipos sangneos ABO Tipo Sangneo (correspondente ao tipo de antgeno) O A B AB Anticorpos (no soro) Anti-A e Anti-B Anti-B Anti-A nenhum IOIO IAIA ou IAIO IBIB ou IBIO IAIB Gentipo
O sistema ABO um sistema de mltiplos alelos, ou seja, na populao existem mais de dois tipos de alelos para o mesmo locus gnico. Os alelos IA e IB so dominantes sobre o alelo IO, mas codominantes entre si. Muitos outros exemplos de mltiplo alelismo existem na natureza. Na 14 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS verdade, o alelismo mltiplo a regra e no a exceo. Tais situaes de mltiplos alelos na populao so descritas como polimorfismo.
Figura 2. 5. Funes dos alelos IA, IB e IO. O alelo IA codifica a enzima a-3-N-acetil-Dgalactosaminiltransferase que transfere acetilgalactosamina para a estrutura H. O alelo IB codifica a-3-Nacetil-D-galactosiltransferase que transfere galactose para a estrutura H. O alelo IO codifica uma protena no funcional, de sorte que a estrutura H no modificada.
Segregando Dois ou Mais Genes

Ao analisar o comportamento conjunto de duas caractersticas fenotpicas diferentes, p. ex., cor (verde ou amarela) e forma das sementes (lisa ou rugosa), Mendel observou que a segregao dos fatores que determinavam a cor era independente da segregao dos fatores que determinavam a forma (segregao independente). Neste caso a prognie F1, hbrida para duas caractersticas (dibrida), apresentava o fentipo liso, amarelo indicando que liso era dominante sobre o rugoso e que amarelo era dominante sobre verde. Quando Mendel auto fecundou F1 observou 4 tipos de fentipos para as sementes nas seguintes propores: 9/16 amarelo liso 3/16 verde liso 3/16 amarelo rugoso 1/16 verde rugoso Esta distribuio refletia a segregao independente de cada uma das duas caractersticas, cor e forma da semente em F2: 9:3:3:1. Na Figura 2.6 est esquematizada, no quadrado de Punnet, a segregao dos pares de alelos que determinam cor (A, a) e forma (L, l) das sementes na gerao F2. A combinao aleatria dos 4 tipos de gametas produzidos pela auto fecundao de F1 produzir os zigotos da gerao F2. Na construo do quadrado de Punnett assume-se que os 4 tipos de gametas so produzidos por cada pai em quantidades iguais e, portanto, cada categoria de descendente igualmente provvel. Como existem 16 categorias, a razo de cada uma 1/16. Ao se agrupar os descendentes por fentipos, observa-se a distribuio 9:3:3:1 citada acima. Isto ocorre porque a segregao dos Cristina M. Bonato 15
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS alelos para estas duas caractersticas independente uma da outra e existe dominncia completa entre os alelos de um mesmo gene. A lei de segregao independente dos alelos de diferentes genes o segundo princpio de Mendel.
Figura 2. 6. Quadrado de Punnett da gerao F2, mostrando o cruzamento entre linhagens heterozigotas para duas caractersticas (dibridas): cor e forma das sementes. As letras A e L referemse aos alelos dominantes os quais determinam, respectivamente, a cor amarela e a forma lisa. As letras a e l referem-se aos alelos recessivos os quais, em homozigose so responsveis, respectivamente, pela cor verde e forma rugosa.
Testando a Lei de Segregao Independente

Realizando-se o cruzamento teste AaLl x aall, podemos predizer que sero gerados quatro tipos de fentipos na proporo 1:1:1:1, correspondendo, justamente, proporo 1:1 de uma par de alelos, multiplicada pela proporo 1:1 do outro par. Um bom exerccio calcular quantos tipos de gametas seriam produzidos, na gerao F1, para o caso de 3 genes com segregao independente. Considere o cruzamento de AA BB CC com aa bb cc, gerando F1 Aa Bb Cc. Como os alelos de cada par se separam e os 3 genes so independentes, sero produzidos 8 tipos de gametas F1 os quais, ao se auto cruzarem podem produzir 64 (8 x 8) tipos de categorias entre os descendentes F2. Neste caso, a razo de cada categoria 1/64 e o nmero de fentipos diferentes na gerao F2, no caso de dominncia completa, ser 8. Caso no haja dominncia, as razes fenotpicas e genotpicas sero iguais (Tabela 2.2). Tabela 2. 2. Auto-fertilizao multi hbrida (n = nmero de genes segregando 2 alelos cada) Monohbrido Dibrido Tribrido Regra n=1 n=2 n=3 Geral N de gentipos dos gametas F1 2 4 8 2n 16 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Proporo de homozigotos recessivos em F2 N de tipos fenotpicos em F2 sob dominncia completa N de tipos fenotpicos em F2 sob dominncia incompleta 1/4 2 3 1/16 4 9 1/64 8 27 (1/2)2n 2n 3n
Se bem que as regras que governam a transmisso de caractersticas de pais para filhos tenham sido definidas no trabalho de Mendel, suas idias s passaram a ser aceitas cerca de 30 anos mais tarde quando, em 1900, foram recolocadas por Correns, Tschermak & de Vries, num momento em que o desenvolvimento do conhecimento celular permitia a aceitao de suas propostas. Nesta poca os cromossomos j haviam sido descobertos e muito se aprendera acerca dos movimentos cromossmicos durante o processo de diviso celular. Em 1903, Walter Sutton prope a teoria cromossmica da herana sugerindo que os genes estavam localizados nos cromossomos, baseado na semelhana de comportamento entre a segregao dos alelos e a dos cromossomos durante a meiose.
Os Genes Encontram-se nos Cromossomos

Em 1910 Thomas Hunt Morgan demonstra que os genes encontram-se nos cromossomos ao analisar o padro de herana do olho branco na mosca de frutas Drosophila melanogaster. Na maioria da populao o olho das moscas vermelho e, portanto este considerado o trao selvagem. Olho branco mutante. Ao cruzar fmeas selvagens (olho vermelho) com machos mutantes (olho branco), Morgan observou que na gerao F1 todos os indivduos apresentavam o fentipo selvagem, o que demonstrava a recessividade do alelo para olho branco. Na gerao F2, metade dos machos tinham olho vermelho e a outra metade olho branco. Todas as fmeas tinham olho vermelho. De alguma forma esta caracterstica estava ligada ao sexo, uma vez que somente entre os machos surgiram moscas de olho branco. Morgan, ento, fez o retrocruzamento das fmeas hbridas de F1 (olho vermelho) com os machos parentais (olho branco). Apareceram fmeas de olho branco e vermelho assim como machos de olho branco e vermelho, na proporo 1:1:1:1, indicando que o fentipo olho branco no era caracterstico apenas dos machos. Ao realizar o cruzamento recproco, isto , fmea de olho branco x macho de olho vermelho, Morgan verificou que todas as fmeas da prognie tinham olho vermelho e todos os machos, olho branco, um resultado bastante diferente de seu recproco (Figura 2.7).
Retrocruzamento
Cruzamento Recproco
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Figura 2. 7. Cruzamentos em Drosfila analisando a segregao do alelo para olho de cor branca.
Cromossomos Sexuais
Nos experimentos realizados por Mendel, no importava se o alelo mutante estava no macho ou na fmea. Os cruzamentos recprocos sempre davam o mesmo resultado. Com a cor do olho da Drosfila isto no aconteceu. Morgan percebe, ento, que o alelo para a cor branca do olho deveria estar ligado ao cromossomo X, uma vez que este cromossomo transmitido num padro diferente entre machos e fmeas: o macho (XY) s transmite seu cromossomo X para as filhas. A fmea (XX) transmite o X para ambos os sexos. Os cromossomos X e Y constituem os cromossomos sexuais, distinguindo-se dos outros pares de cromossomos denominados autossomos. As caractersticas analisadas por Mendel encontravam-se em autossomos. Na Figura 2.8 est esquematizada a interpretao que Morgan deu ao padro de herana do olho branco. Os resultados indicavam que os alelos para cor do olho segregavam juntamente com o cromossomo sexual X e que o alelo vermelho era dominante sobre o alelo branco. A partir do momento que se constatou que um gene ocupa uma posio no cromossomo, esta posio passou a ser denominada locus gnico. O cromossomo Y, homlogo parcial de X, no teria um locus equivalente para a cor de olho. Uma vez que os machos s possuem uma cpia do cromossomo X, no podem ser considerados nem homozigotos nem heterozigotos para o locus em questo. O termo hemizigoto utilizado para genes ligados ao X nos machos. Nesta situao, uma nica cpia do alelo recessivo determina o fentipo, fenmeno denominado pseudo dominncia. Genes que se encontram no cromossomo X so denominados genes ligados ao X. Um exemplo humano de padro de herana ligada ao X a hemofilia A, uma desordem severa de coagulao do sangue determinada por um alelo recessivo. Indivduos afetados no produzem a protena coagulante fator VIII e aps ferimentos leves, sangram muito. CRUZAMENTO F1: todos os indivduos tem fentipo selvagem conferido pelo alelo + localizado no cromossomo X da fmea. F2: todas as fmeas tem fentipo selvagem. Metade dos machos selvagem, metade mutante CRUZAMENTO RECPROCO F1: todas as fmeas tem fentipo selvagem conferido pelo alelo + localizado no cromossomo X do macho. Todos os machos tem fentipo mutante conferido pelo alelo w localizados nos cromosssomos X da fmea. 18 Xw Y X+ Y X+X+ x XwY X+ X+Xw X+Y X+ X+X+ X+Y XwXw x X+Y Xw X+Xw XwY X+ Cristina M. Bonato
X+ X+Xw X+Y Xw X+Xw XwY Xw X+Xw XwY Xw
X+ Y
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS F2: 50% das fmeas tem fentipo selvagem, 50% fentipo mutante. 50% dos machos selvagem, 50% mutante Xw Y X+Xw X+Y XwXw XwY
Figura 2. 8. Padro de herana do olho branco em Drosophila.
Ligao
Se os genes esto linearmente localizados nos cromossomos, ento os alelos de diferentes genes, dispostos num dado cromossomo, sempre segregariam juntos, constituindo um grupo de ligao. Assim, a segregao independente da forma e da cor das sementes analisadas por Mendel, informa que estes loci estavam localizados em diferentes cromossomos ou grupos de ligao. Os pares de cromossomos que contem os mesmos loci gnicos so denominados cromossomos homlogos. Regra geral: somente genes localizados em diferentes cromossomos apresentam segregao independente; genes localizados no mesmo cromossomo tendem a segregar juntos. Todavia, a ligao no completa. Isto porque, durante a meiose, quando os cromossomos homlogos pareiam, podem trocar partes entre si (recombinao), mesmo que seja numa freqncia baixa. Este processo implica em quebra e reunio de segmentos do DNA com a participao de um conjunto de protenas especializadas nos processos de recombinao. Quando ocorre esta troca de segmentos entre homlogos, os alelos a localizados passam a apresentar uma independncia relativa, o que resulta no surgimento de recombinantes. Quanto maior a distncia entre dois loci, maior a probabilidade de ocorrer quebra e reunio e maior a freqncia de recombinantes na populao. Sturtvent utilizou-se deste fenmeno para localizar a posio relativa dos genes nos 4 cromossomos de Drosophila, ou seja, para construir o mapa gentico de Drosophila, demonstrando que os cromossomos so estruturas lineares no ramificadas. Atualmente, com a automatizao do sequenciamento dos genomas, a posio dos genes nos cromossomos, determinada nesta poca, tem sido geralmente confirmada. Apesar da posio dos genes nos cromossomos ser fixa, constituindo os grupos de ligao caractersticos de cada espcie, alguns elementos genticos no possuem uma localizao fixa, podendo mover-se de um local a outro genoma sem que isto implique em afetar a arquitetura dos cromossomos envolvidos. Quando estes elementos genticos saltam de um ponto a outro, em geral, afetam o funcionamento dos genes no qual se inseriram, constituindo uma das causas importantes de variao entre genomas individuais. Este fenmeno foi inicialmente observado e analisado de 194251, por Barbara McClintock, ao realizar anlises genticas do milho. Tais seqncias mveis so denominadas elementos transponveis ou transposons. Apesar dos grandes avanos ocorridos no incio do sculo, a natureza qumica dos fatores hereditrios ainda no estava definida. Seriam protenas ou cidos nucleicos? Durante muito tempo acreditou-se que as protenas seriam as depositrias da informao gentica transmitida de gerao gerao, baseado no fato de serem molculas bastante complexas e de haver um nmero quase ilimitado de combinaes possveis com os 20 diferentes aminocidos. Somente em 1944 foi demonstrado cabalmente por Avery, MacLeod & McCarty, que o material gentico era o cido desoxirribonucleico. Ainda foi necessrio esperar quase 10 anos para que a estrutura Cristina M. Bonato 19
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS desta molcula fosse finalmente desvendada por Watson & Crick (1953), com a colaborao fundamental de Rosalin Franklin e Maurice Wilkins. Portanto, mais de 80 anos se passaram desde a proposio de Mendel sobre as regras da hereditariedade at o conhecimento da molcula depositria da informao gentica nos seres vivos do Planeta Terra.
Guia de Estudo
Para desenvolver linhagens puras de plantas de ervilha altas, um estudante cruzou duas plantas altas. Todos os 200 descendentes deste cruzamento (F1) eram altos. Na gerao F2, todos eram altos, tambm. O estudante ento, cruzou duas plantas altas de F2 e produziu a gerao F3 onde todos eram altos. Todavia, ao cruzar duas plantas altas de F3, produziu plantas ans na gerao F4. Isto no poderia ser encarado como mutao, porque uma proporo razovel da populao era an. Explique o que aconteceu e prediga que proporo da gerao F4 era an (de Zwicker, 1996). Defina dominncia completa, parcial, pseudodominncia e codominncia. Mendel cruzou plantas altas de ervilha, com plantas ans. A gerao F1 era toda alta. Quando auto-cruzadas para produzirem a gerao F2, obteve-se uma proporo de 3:1 (altas:ans). D os gentipos, fentipos e propores relativas da gerao F3 resultante do auto-cruzamento de F2 (de Tamarin, 1996). Defina grupo de ligao. A cegueira para cor vermelha-verde (daltonismo), em humanos, causada por alelos recessivos ligados ao X. Uma mulher daltnica casa-se com um homem que tem viso normal para cores. Que proporo de seus filhos e filhas espera-se que seja daltnica? Uma mulher normal para viso de cores, cujo pai era daltnico, casa-se com um homem normal. Que proporo de seus filhos e filhas espera-se que seja daltnica?
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Captulo 3 NATUREZA DO GENE

O DNA o Material Gentico
Trabalhando com Streptococcus pneumoniae, uma bactria que causa pneumonia no ser humano mas letal ao camundongos, Griffith mostrou, em 1928, que uma variante no patognica da bactria poderia transformar-se em patognica desde que entrasse em contato com uma variante patognica morta pelo calor. Portanto, as bactrias mortas liberavam algum fator no meio, capaz de transformar uma bactria no patognica em uma patognica. Para demonstrar a transformao, Griffith utilizou duas linhagens de S. pneumoniae: uma patognica que formava colnias lisas (S) em meio nutriente slido e uma no patognica que formava colnias rugosas (R). A linhagem S produz colnias lisas porque suas clulas so envolvidas por uma capa de polissacardeo. Camundongos infectados com esta linhagem morrem. A linhagem R no tem efeito patognico no camundongo porque suas clulas so rapidamente destrudas pelas clulas brancas do sangue, o mesmo no acontecendo com as clulas da linhagem S, protegidas pela capa de polissacardeos. Quando clulas da linhagem S eram mortas pelo calor e depois inoculadas no camundongo, no causavam bacteremia (infeco bacteriana). Clulas vivas da linhagem R tambm no causavam bacteremia, pois esta linhagem no patognica. Porm, ao inocular no camundongo, clulas S mortas juntamente com clulas R vivas, os camundongos desenvolviam uma bacteremia idntica quela observada quando infectados com a linhagem S viva (Figura 3.1).
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Figura 3. 1. Experimento de Griffith com linhagens patognicas (S) e no patognicas (R) de S. pneumoniae inoculadas em camundongo.
Que componente da clula S morta teria sido responsvel pela transformao ocorrida? O experimento de Griffith no respondeu esta questomas demonstrou a possibilidade de transformao. Dezesseis anos mais tarde, Avery e colaboradores, analisaram o fenmeno de transformao in vitro, ou seja, observaram a variao de morfologia das colnias (lisa ou rugosa) em placas de Petri, sem inocular no camundongo e testaram a capacidade de diferentes macromolculas transformarem clulas R em S. Demonstraram, ento, que a capacidade transformante das clulas S mortas seria perdida se o extrato fosse tratado com enzimas que destrussem o DNA (DNases). Para realizar este ensaio, preparam um extrato de clulas S mortas e separaram as diferentes classes de molculas existentes no extrato: DNA, RNA, protenas, polissacardeos e lipdios. A seguir, testaram a capacidade transformante de cada uma delas separadamente (Figura 3.2).
Figura 3. 2. Transformao de clulas R em S com molculas de DNA isoladas de extrato de clulas S demonstrando que o DNA o material gentico. Os outros componentes celulares testados no transformaram clulas R em clulas S.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Estes testes demonstraram que os polissacardeos no transformavam as clulas rugosas, apesar da capa de polissacardeos estar envolvida na patogenicidade. Protenas, lipdios ou RNA, tambm no possuam capacidade transformante. Somente o DNA induzia a transformao das clulas R. Como contra prova, o extrato bruto foi colocado em presena de enzimas degradativas. Os extratos das clulas S mantinham sua capacidade transformante aps tratamento com enzimas que degradavam protenas, lipdios, polissacardeos ou RNA. Todavia, quando tratavam o extrato das clulas S com DNAses, o extrato perdia sua capacidade transformante, ou seja no transformava mais clulas R em clulas S, uma vez que no mais apareciam colnias lisas. Desta forma foi possvel deduzir que o DNA era o agente responsvel pelo desenvolvimento da capa de polissacardeos e pela patogenicidade a ela associada. Assim, o fenmeno de transformao refere-se alterao gentica de uma clula provocada pela incorporao e expresso de DNA estranho clula. O trabalho de Avery, MacLeod e McCarty (1944) foi a primeira evidncia experimental de que o DNA era o material gentico: o DNA transformava clulas tipo R em clulas tipo S. Posteriormente, Hershey & Chase (1952) trabalhando com o bacterifago T2, demonstraram o papel do DNA na produo de novos fagos durante o processo infeccioso. Uma vez que os fagos so estruturas muito simples, constituindo-se basicamente de uma capa protica envolvendo uma molcula de cido nuclico, os pesquisadores aproveitaram-se disto marcando radiativamente os componentes protico ou nuclico e medindo a radiatividade intra e extra celular aps infeco das bactrias Escherichia coli pelos fagos marcados (Figura 3.3). Este experimento apenas corroborou os dados iniciais de Avery et al. (1944) ao demontrar que, tambm em vrus, o DNA, e no as protenas, era o material gentico.
Figura 3. 3. Experimento de Hershey & Chase usando bacterifago T 2 marcado com 32P ou 35S. Uma vez que grande parte do 35S ser incorporado em protenas (cistena, metionina), as novas partculas fgicas tero sua capa protica marcada. Quando estas partculas infectam bactrias E. coli no marcadas, ento a marcao 35S detectada praticamente apenas no meio extracelular. Por outro lado, como grande parte do 32P incorporado nos cidos nucleicos, as novas partculas fgicas tem DNA marcado. Ao infectarem E. coli no marcada, a marcao 32P encontrada intracelularmente e em uma frao das novas partculas fgicas recm montadas.
Atualmente, o desenvolvimento cientfico e tecnolgico tem permitido a incorporao e expresso de DNA estrangeiro em diferentes organismos. Bactrias podem expressar genes tpicos Cristina M. Bonato 23
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS de eucariotos como os que codificam o fator VIII de coagulao do sangue ou a insulina e cuja produo em grande escala de enorme interesse medicina. Quando clulas eucariticas so transformadas o processo denominado transfeco porque o termo transformao j era utilizado para significar crescimento canceroso. Os eucariotos (animais ou plantas) que incorporam DNA estrangeiro na linhagem germinativa so denominados transgnicos. Na Figura 3.4A, um experimento realizado em 1982 por Palmiter, Brinster e colaboradores, mostra um camundongo transgnico que recebeu e expressou o gene que codifica hormnio de crescimento de rato, ao lado de um camundongo no transgnico. Na Figura 3.4B, Wood (1989) transfecta uma planta de fumo (tabaco) com o gene da luciferase de vaga-lume. A luciferase catalisa a oxidao ATP-dependente de luciferina, o que leva a emisso de luz. Se as plantas transfectadas forem aguadas com luciferina elas se tornam luminescentes. Tanto o camundongo como a planta receberam DNA exgeno que se incorporou e se expressou provocando alterao fenotpica no organismo transgnico. Assim, atualmente, a demonstrao de que os cidos nuclicos so os armazenadores da informao gentica facilmente verificada nos experimentos de transferncia de genes de um para outro organismo, mesmo entre indivduos to dspares quanto uma planta de fumo e um vagalume ou uma bactria e o ser humano.
Figura 3. 4. Organismos transgnicos. A) camundongo transfectado com o gene para hormnio de crescimento de rato. B) planta de tabaco transfectada com o gene para luciferase de vagalume.
O RNA Como Material Gentico

Em alguns vrus, o RNA o material gentico. Este o caso do vrus TMV (do ingls, Tobacco Mosaic Virus) que infeta as plantas de fumo e constitudo de uma nica molcula de RNA empacotada numa estrutura helicoidal formada por milhares de cpias de um nico tipo de protena. Em 1955, Fraenkel-Conrat & Williams mostraram que os componentes proticos e nuclicos do vrus podiam ser separados in vitro e a partcula reconstituda com os componentes trocados. Valendo-se disto, Fraenkel-Conrat & Singer (1957) reconstituram partculas virais a partir de duas linhagens diferentes. Quando as partculas reconstitudas infectavam uma planta, as novas partculas fgicas apresentavam a capa de protena do tipo originalmente associado ao RNA (Figura 3.5) demonstrando que o RNA e no a protena era o material gentico.
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Figura 3. 5. TMV, vrus do mosaico de tabaco. A informao gentica est codificada numa molcula de RNA.
As evidncias acima mostram que o DNA o material gentico e que, em alguns vrus, o RNA o material gentico.
Prion: Uma Partcula Protica Infecciosa e Hereditria

Todos os exemplos de infeco, seja de bactrias, fagos, fungos ou parasitas, dependem da existncia de uma molcula de cido nuclico. Existe, porm, um tipo de doena infecciosa cujo agente infeccioso uma protena, sem participao de DNA ou RNA. Alm disto esta doena tambm apresenta carter hereditrio sendo transmitida de gerao a gerao como trao autossmico dominante. Este tipo de doena, com formas diferentes de manifestao nos seres humanos e animais, fatal. A partcula protica infecciosa, denominada Prion. A protena infecciosa tem uma conformao diferente da protena celular normal. A forma normal, denominada PrPc, encontrada, predominantemente, na superfcie dos neurnios, ligada a uma ncora fosfolipdica glicoinositol; sensvel proteases e possivelmente, est envolvida em funes sinpticas. A protena infectiva, denominada PrPSc, encontra-se na forma de agregados no sistema endossomo-lisossomo, caracterizando-se pela alta resistncia temperaturas elevadas e ao de proteases. Na estrutura da protena normal prevalecem alfa-hlices (42%), quase sem lminas beta. Na estrutura da protena infecciosa prevalecem lminas beta (43%), com 30% de alfahlices. As doenas causadas por prion resultam em desordens degenerativas do sistema nervoso central, conhecidos como encefalopatias espongiformes transmissveis TSE, do ingls, Transmissible Spongiform Encephalopaties). Caracterizam-se pela perda de controle motor, demncia, paralisia e finalmente a morte, geralmente antecedida por pneumonia. Os prions afetam diferentes regies do crebro. A morte das clulas nervosas infectadas d ao crebro a aparncia de uma esponja, da o nome genrico da doena, encefalopatia espongiforme. Os sintomas de cada tipo de doena dependem da regio do crebro que foi afetada. No ser humano, o prion pode causar doenas como Creutzfeldt-Jakob (CJD), Sndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), Insnia Familiar Fatal (FFI), Kuru e Sndrome de Alpers. Em carneiros, o prion causa uma doena denominada scrapie e no gado, a encefalopatia bovina espongiforme, BSE (do ingls Bovine Spongiform Encephalopatie), recentemente referida como a doena da vaca louca. As TSE desenvolvem-se muito vagarosamente e podem surgir, possivelmente, via: Cristina M. Bonato 25
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Transmisso horizontal: p. ex., do carneiro para a vaca; da vaca para o homem ou do homem para o homem, atravs da dieta ou procedimentos mdicos; Transmisso vertical (hereditria): uma mutao no gene PrP transmitida de pais para filhos, como um carter autossmico dominante; Surgimento espontneo: a protena muda da conformao no infecciosa para a infecciosa. A idia de que o agente infeccioso responsvel por esta doena era uma protena foi aventada pela primeira vez em 1966, por Tikvah Alper, ao observar que a radiao ultra-violeta, capaz de destruir cidos nucleicos, no destrua a infectividade do scrapie. Em 1967 J. S. Griffith props que a infectividade do scrapie poderia ser resultante de uma conformao alterada da protena normal. Estas idias s foram desenvolvidas alguns anos mais tarde por Stanley Prusiner que se props, juntamente com vrios colaboradores, a explicar como uma protena capaz de transmitir uma doena quando ingerida. S. Prusiner, que recebeu o Prmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1997 por sua contribuio no estudo das doenas provocadas por prions, sugeriu que a protena infecciosa reconhecia a protena normal e induzia uma modificao conformacional nesta protena tornando-a tambm infecciosa. Portanto, somente indivduos que produzam a forma normal da protena (PrPc) podem ser infectados, pois a propagao da PrPSc depende da presena da PrPc. As protenas com conformao alterada agregam-se formando longos filamentos que se depositam em organelas citoplasmticas provocando danos ao tecido nervoso e finalmente, a morte do indivduo. A real funo das formas normais desta protena ainda no est totalmente esclarecida. As estruturas dos prions podem ser visualizadas nos sites indicados abaixo.
Os Genes Governam a Expresso das Protenas

Como os genes controlam as caractersticas fenotpicas dos organismos? A primeira sugesto respeito foi feita pelo mdico Archibald Garrod (1909), em seu trabalho sobre erros inatos do metabolismo, ao estabelecer uma conexo entre genes e enzimas. Garrod estudava uma desordem metablica benigna denominada alkaptonria que provoca artrite tardiamente no adulto mas que pode ser detectada desde o nascimento, pela cor escura da urina exposta ao ar, particularmente aps ingesto de alimentos ricos em fenilalanina ou tirosina. Num estudo familiar demonstrou que esta desordem resultava de um trao recessivo herdado no padro mendeliano e que a cor escura da urina decorria da alta concentrao, nos indivduos afetados, de cido homogentsico, que escurece ao ser oxidado. Concluiu que os afetados no possuam uma enzima capaz de metabolizar esta substncia resultando em interrupo da via metablica e, conseqentemente, acmulo de cido homogentsico (Figura 3.7).
Fenilalanina Fenilalanina Hidroxilase Tirosina Tirosina Aminotransferase cido Homogentsico Homogentisato desoxigenase Hidroxifenil Piruvato Hydroxifenilpiruvato Desoxigenase
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CO2 + H2O
Figura 3. 7. Via metablica de degradao da fenilalanina. A ausncia da enzima homogentisato desoxigenase interrompe a via, provocando acmulo de cido homogentsico que excretado na urina.
Em 1941, trs dcadas aps a publicao de Garrod, George Beadle & Edward Tatum, trabalhando com esporos do fungo filamentoso Neurospora crassa, mostram, novamente, existir correlao entre uma mutao e a ausncia de uma atividade enzimtica especfica. O intenso trabalho destes pesquisadores utilizando mutantes para desvendar os passos das vias metablicas de um organismo une, naquele momento, os campos da Gentica e da Bioqumica. Esporos selvagens de Neurospora podem crescer muito bem em um meio mnimo, ou seja, em um meio onde as nicas fontes de carbono e nitrognio so glicose e amnia e que contem ainda alguns sais e cidos orgnicos alm da vitamina biotina. Isto significa que as clulas de Neurospora possuem informao gentica para sintetizar todos os aminocidos, bases, vitaminas e tantas outras biomolculas necessrias a sua sobrevivncia. Ao tratar uma populao selvagem de Neurospora com radiao X, Beadle & Tatum conseguiram isolar uma srie de indivduos que haviam perdido a capacidade de crescer em meio mnimo. Analisaram, ento, qual a deficincia destes mutantes, complementando o meio mnimo com aminocidos, bases ou vitaminas. Localizaram, desta forma, grupos de indivduos que necessitavam, p. ex., de arginina para crescer, ou seja, que haviam perdido a capacidade de sintetizar arginina. Mutantes que requerem a adio de um nutriente especfico ao meio de crescimento so denominados auxotrficos e apresentam deficincia enzimtica em algum passo da via biossinttica daquela substncia. Utilizando o grupo de mutantes deficientes em arginina, Beadle & Tatum puderam deduzir qual a via metablica para sntese de arginina. Inicialmente, atravs de cruzamentos entre os diversos mutantes obtidos, para arginina, identificaram 3 loci gnicos localizados em cromossomos diferentes: arg-1, arg-2, arg-3. Como sabiam a estrutura da molcula de arginina, podiam inferir que tipos de molculas teriam sido seus precursores, tais como citrulina e ornitina. Quando ornitina era colocada no meio, somente o mutante arg-1 crescia. Na presena de citrulina, os mutantes arg-1 e arg-2 cresciam. O mutante arg-3 s crescia na presena de arginina (Tabela 3.3).
Tabela 3. 3. Crescimento de mutantes arg em meio mnimo suplementado com ornitina, citrulina ou arginina. Ornitina Citrulina Arginina arg-1 + + + arg-2 + + arg-3 +
Isto indicava uma hierarquia de eventos. Como o mutante arg-3 no consegue sintetizar arginina na presena de nenhum dos dois precursores, deve apresentar uma mutao na enzima que transforma um precurssor (ornitina ou citulina), em arginina. J o mutante arg-2 que consegue sintetizar arginina na presena de citrulina, mas no de ornitina, indica que a citrulina o precursor imediato da arginina e tem uma deficincia no passo da via que converte ornitina em citrulina. O mutante arg-1 capaz de sintetizar arginina em presena tanto de ornitina como citrulina, seria deficiente num passo anterior, que convertesse uma molcula precursora em ornitina. Cada um destes passos catalisado por enzimas especficas. Uma mutao em um dado gene interfere na produo de uma dada enzima. A deficincia na enzima provoca um bloqueio na via metablica. O bloqueio pode ser superado se suprirmos as clulas com o composto que seria formado se no ocorresse o bloqueio. O modelo proposto por Beadle e Tatum ficou conhecido como a hiptese um gene - uma enzima e lhes valeu o prmio Nobel de Fisiologia e Medicina, em 1958, juntamente com Joshua Lederberg. Mostravam que os genes eram responsveis pelas funes enzimticas e que cada gene controlava uma enzima especfica. Cristina M. Bonato 27
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Posteriormente, com o avano do conhecimento acerca do que seriam os genes, a hiptese um gene - uma enzima mostrou-se pouco abrangente, na medida em que restringia a definio de gene de uma atividade enzimtica. Atualmente podemos considerar o gene como qualquer segmento de DNA utilizado como molde para sntese de um RNA funcional.
Guia de Estudo
Como foi demonstrado que o DNA o material gentico? Compare as concluses tiradas a partir do experimento de Griffth com aquelas tiradas a partir do experimento de Avery et al. Como foi demonstrado que o RNA, em alguns casos, poderia ser o material gentico? O que so prions? Como funcionam? O que so mutantes auxotrficos? Porque indivduos com alkaptonria apresentam a urina escura? O que significa a hiptese, um gene-uma enzima? Qual a funo da luciferase? Como os prions esto relacionados com o Dogma Central da Biologia? Relate a evoluo do conceito de gene. Uma geneticista estudando a via de sntese da fenilalanina em Neurospora isolou vrios mutantes que requeriam fenilalanina para crescer. Ela testou o crescimento de cada um dos tres mutantes em meios de cultivo diferentes, contendo cada uma das substncias que poderiam fazer parte desta via metablica (tabela abaixo). O sinal + indica crescimento e o sinal - indica ausncia de crescimento. Em que posio da via se encontra cada uma das substncias testadas?
Substncias Linhagem Selvagem Mutante 1 Mutante 2 Mutante 3 Fenilpiruvato + + + Prefenato + + Corismato + Fenilalanina + + + +
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Captulo 4 ESTRUTURA DO DNA

A Molcula de DNA
Em 1953, Watson & Crick propuseram que a molcula de DNA era constituda de uma dupla hlice de cadeias polinucleotdicas antiparalelas interconectadas pela energia cooperativa de muitas pontes de hidrognio que se estabeleciam entre bases complementares, pricas e pirimdicas, dos nucleotdios. Em seu modlo, as bases projetavam-se para o interior da hlice a partir dos esqueletos externos de aucar-fosfato (Figura 4.1).
Figura 4. 1. A dupla hlice. O dimetro constante de 20 da dupla hlice decorrente do emparelhamento de uma base prica com uma pirimdica. Cada volta completa da hlice engloba cerca de 10 nucleotdios, com comprimento de 34 .
A proposta da dupla hlice baseava-se em tres pontos: Na natureza qumica dos componentes do DNA (desoxirribonucleotdios); Nos dados de difrao de Raio X coletados por Rosalind Franklin & Maurice Wilkins; Nas relaes entre as bases, estabelecidas por Erwin Chargaff. Com estas informaes disponveis, Watson & Crick construram modelos moleculares, confeccionados em arame, na tentativa de encontrar aquele que se adequasse aos dados de difrao de Raio X, complementaridade de bases e a estrutura qumica de cada base.
Difrao de Raio X
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Para analisar a estrutura do DNA, R. Franklin, no laboratrio de M. Wilkins, utilizava o mtodo de difrao de Raio-X. Em um cristal as molculas esto arranjadas ordenadamente. Assim, quando um feixe de Raio-X atinge um cristal, espalha-se ordenadamente de acordo com um padro que reflete a estrutura do cristal. A imagem do padro de espalhamento fixada em um filme fotogrfico impressionado pelos Raios-X. Na Figura 4.2, o padro de espalhamento do feixe de Raio-X atravessando um cristal de DNA indica que: A molcula uma hlice (padro em cruz no centro) As bases (reas escuras) dispem-se perpendicularmente ao eixo principal da molcula.
Figura 4. 2. Imagem produzida por um feixe de Raio X atravessando um cristal de DNA (Franklin & Gosling, 1953).
As Razes de Chargaff
Erwin Chargaff (1950) desenvolveu uma tcnica para medir a quantidade de cada tipo de base presente no DNA de diferentes espcies. Seus dados mostraram que a quantidade relativa de um dado nucleotdio podia ser diferente entre as espcies, mas sempre, a quantidade de adenina era igual a de timina e a quantidade de guanina era igual a de citosina. Em todos os organismos estudados verificava-se a razo 1:1 entre bases pricas e pirimdicas: A + G = T + C. Todavia, a quantidade relativa de cada par AT ou GC podia variar bastante de organismo para organismo, de sorte que a razo A+T/G+C era caracterstica da espcie analisada (Tabela 4.1). Estas relaes entre as bases so, atualmente, denominadas Razes de Chargaff. Tabela 4. 1. Bases de DNA de diversas origens
Organismo EcoliK12 Sreptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Leveduras Homo sapiens Adenina Timina Guanina Citocina A+T/G+C 26 29,8 15,1 31,3 30,3 23,9 31,6 14,6 32,9 30,3 24,9 20,5 34,9 18,7 19,5 25,2 18 35,4 17,1 19,9 1,0 1,59 0,42 1,79 1,53
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Methanococcus jannaschii Archaeoglobus fulgidus 34,4 25,8 34,1 25,6 15,5 24,2 15,8 24,3 2,18 1,05
Hlices Antiparalelas
Qual a estrutura possvel? Os dados de difrao mostravam que o dimetro da hlice, cerca de 20 , mantinha-se constante em toda sua extenso. Isto s seria possvel se purinas sempre emparelhassem com pirimidinas. Duas purinas emparelhadas aumentariam o dimetro enquanto duas pirimidinas emparelhadas diminuiriam o dimetro da hlice. Adenina e Timina podiam estabelecer facilmente duas pontes de hidrognio entre si, da mesma forma que Guanina e Citosina podiam estabelecer facilmente trs pontes de hidrognio entre si e estes eram os pares propostos por Chargaff. Todavia, o estabelecimento das pontes de hidrognio entre as bases complementares das duas hlices somente se adequou perfeitamente aos dados de difrao quando o modelo foi construdo com as hlices invertidas uma em relao a outra. Para isto necessrio considerar que as fitas de DNA tem polaridade. Ou seja, uma das extreminadades da fita tem um fosfato 5' e a outra tem um grupo hidroxila 3' (Figura 4.3). Quando as duas fitas correm em sentidos opostos, ou seja, esto antiparalelas, as bases pricas e pirimdicas dos pares A-T e G-C encaixam-se perfeitamente bem.
Figura 4. 3. Polaridade das fitas do DNA. A polaridade relativa posio dos carbonos 3' e 5' da molcula de acar. A fita esque-rda, corre no sentido 5' para 3' e a fita direi-ta, no sentido 3' para 5'.
Apesar das pontes de hidrognio serem individualmente muito fracas, uma grande quantidade delas suficiente para manter as duas hlices unidas. temperaturas mais elevadas, todavia, estas ligaes se rompem e as hlices se separam, fenmeno denominado desnaturao. Quanto maior for a quantidade de pontes de hidrognio entre as duas hlices, maior ser a temperatura necessria para desnaturar a molcula de DNA. Portanto, quanto maior a quantidade de pares G-C (3 pontes), maior a temperatura de desnaturao. Cristina M. Bonato 31
Formas e Tamanhos do DNA

A estrutura do DNA descrita no tpico anterior denominada forma B do DNA. Nesta configurao as hlices enrolam-se para a direita (sentido horrio). As bases esto dispostas quase que absolutamente perpendiculares ao eixo principal e cada giro completo da hlice corresponde a cerca de 10 bases numa extenso de 34 (3,4 nm). Nem sempre a molcula de DNA encontra-se na forma padro B. Outras conformaes so possveis, uma vez que a molcula no uma estrutura esttica, mas dinmica, em constante movimento. Em certas regies e em determinados momentos, as fitas da dupla hlice podem se separar transitoriamente e depois, voltar conformao original ou adquirir, localmente, uma nova conformao. Mais de 20 variantes de hlices dextras j foram observadas. Alm, disso, em algumas regies da molcula podem ser encontradas estruturas onde a hlice gira para a esquerda (sentido anti-horrio). Esta forma, denominada forma Z do DNA, ocorre quando segmentos pequenos da molcula apresentam seqncias repetidas C-G. A estabilidade desta estrutura, em condies fisiolgicas, parece depender de grupos metila ligados s citosinas presentes nas repeties CpG e afetaria o padro de expresso gnica de clulas eucariticas. As molculas de DNA so enormes. Um par de desoxirribonucleotdios tem uma massa molecular mdia de 660 Da e uma espessura de 3,4 . A Tabela 4.2 mostra o nmero de pares de bases e o comprimento total do DNA de alguns organismos com diferentes nveis de complexidade. Numa faixa ampla, de virus mamferos, poderamos dizer que a quantidade haplide de DNA varia com a complexidade, todavia isto nem sempre verdade. Compare peixe pulmonado com Homo sapiens. Tabela 4. 2. Tamanho de algumas molculas de DNA
Organismo Vrus SV40 Lambda T4 Bacteria Mycoplasma hominis Escherichia coli Eucarya Levedura Drosophila Homo sapiens Peixe pulmonado 16 04 23 19 1,35 x 107 1,65 x 108 2,9 x 109 1,02 x 1011 4,6 x 103 5,6 x 104 0,99 x 106 (~1m) 34,7 x 106 (~35m) 7,6 x 105 4,7 x 106 2,6 x 102 1,6 x 103 5,10 x 103 4,8 x 104 1,66 x 10
5
# cromossomos haplides
pares de bases
comprimento, micrometro 1,7 17 55
Modos de Duplicao
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O grande mrito do trabalho de Watson & Crick (1953) foi sugerir um mecanismo de cpia da molcula de DNA baseado na complementaridade de bases: "It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material" Ao decifrarem a estrutura demonstraram como a molcula se auto duplicava garantindo a manuteno e a transmisso da informao gentica de gerao gerao. Em artigo posterior publicado ainda em 1953, Watson & Crick analisaram as implicaes genticas da estrutura do DNA, propondo que: a) cada uma das fitas serviria de molde para a sntese de uma fita complementar; b) a seqncia dos pares de nucleotdeos nos genes constituiria informao codificada a qual seria sequencialmente traduzida para a linguagem dos aminocidos nas protenas. Watson e Crick salientaram ainda que o passo inicial da duplicao deveria ser o desenrolamento das duas hlices do DNA as quais, separadas, serviriam de molde para a sntese da fita complementar. Ao final do processo existiriam dois pares de cadeias onde a seqncia de bases estaria exatamente duplicada, uma vez que a duplicao baseava-se no emparelhamento especfico das bases. Cada par seria constitudo de uma fita nova e uma velha. O problema era desenrolar as duas cadeias interconectadas da dupla hlice. Se apenas uma das cadeias se quebrasse, a outra poderia facilmente girar em torno dela aliviando a tenso da fita no quebrada. No ponto de quebra os terminais mantidos bastante prximos, unir-se-iam novamente. Trs modos possveis de duplicao da molcula foram considerados (Figura 4.4): As duas fitas se desenrolariam, sem rupturas do esqueleto acar-fosfato e cada uma delas, separadamente, seria utilizada como molde para construir a sua complementar, de sorte que cada nova dupla seria constituda de uma fita velha e de uma nova (modo semi-conservativo); Similar ao modo anterior, mas as fitas novas recm sintetizadas constituiriam a nova dupla e a dupla original se manteria como tal (modo conservativo); Haveria quebras continuadas na espinha-dorsal de acar-fosfato e subseqente reconstituio aps duplicao que poderia resultar numa mistura entre segmentos velhos e novos na mesma fita (modo dispersivo).
Figura 4. 4. Modos possveis de replicao da dupla hlice: semi-conservativo, conservativo e dispersivo. As fitas recm-duplicadas so vermelhas
As hipteses colocadas foram testadas por Mathew Meselson & Franklin Stahl, em 1958, num engenhoso experimento que permitiria distinguir um modo do outro pelo padro de sedimentao das molculas de DNA aps ultracentrifugao em gradiente de clorento de csio.
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A Replicao Semiconservativa
Em 1958, Mathew Meselson & Franklin Stahl idealizaram um experimento para testar as hipteses colocadas acerca dos modos possveis de duplicao do DNA. Utilizaram como mtodo, ultracentrifugao em gradiente de cloreto de csio, que permite separar molculas com densidades levemente diferentes. O objetivo era distinguir as molculas de DNA, antes e depois da duplicao, por diferenas de densidade entre elas. Como a densidade do cloreto de csio (1,7) correspondente a do DNA, um gradiente deste sal permitiria que amostras de DNA com diferentes densidades se concentrassem na regio do gradiente que correspondesse a sua prpria densidade, formando bandas em diferentes posies do tubo. As bandas podem ser detectadas com luz ultra-violeta no comprimento de onda de 260nm, onde os cidos nuclicos absorvem fortemente. Mas, se o processo de duplicao do DNA gera uma dupla hlice idntica original, qual o truque utilizado para que molculas de DNA de mesma origem tivessem densidades diferentes antes e depois da duplicao? 1. Cultivaram clulas de E. coli em um meio contendo o istopo pesado de nitrognio na forma de 15NH4Cl. Aps vrias geraes todas as molculas sintetizadas naquela populao da bactrias, tinham incorporado 15N. 2. Transferiram as clulas para um meio contendo apenas istopo leve, 14NH4Cl e permitiram a duplicao de mais duas geraes. 3. No intervalo de tempo correspondente 1a gerao, coletaram uma poro das clulas e extrariam o DNA. 4. O DNA isolado foi ultracentrifugado (40.000 rotaes por minuto)/20 horas, quando deveria alcanar uma posio no tubo de centrfuga onde sua densidade correspondesse da soluo de CsCl. No intervalo de tempo correspondente 2a gerao, repetiram-se os procedimentos 3 e 4. Esperava-se o seguinte: amostra de DNA da 1a gerao contendo tanto istopo leve como istopo pesado, deveria sedimentar numa posio diferente daquela das molculas contendo apenas istopo leve ou apenas istopo pesado. Aps duas geraes, a quantidade de molculas com istopo leve aumentaria.
A
Levando-se em considerao as trs hipteses apresentadas, qual seria a localizao das bandas de DNA aps o primeiro ciclo de duplicao, ou seja, aps uma gerao (Figura 4.5)? a duplicao fosse conservativa, haveriam duas bandas, uma pesada a outra leve; a duplicao fosse semiconservativa ou dispersiva, haveria uma nica banda em posio intermediria entre a leve e a pesada.
Se Se
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15 14
NH4Cl NH4Cl 1o ciclo
2o ciclo Semi-Conservativo Leve Pesado Tempo 0 1a gerao Conservativo Dispersivo
2a gerao Topo Fundo
Figura 4. 5. Distribuio de molculas pesadas e leves e posicionamento das bandas em gradiente de cloreto de csio, no tempo 0, na 1a e na 2a gerao, de acordo com os modelos semi-conservativo, conservativo e dispersivo. As curvas mostram quantitativamente o montante de absoro da luz ultra-violeta atravs do tubo.
Qual seria a localizao das bandas aps o segundo ciclo de duplicao? No modo conservativo de duplicao ainda seriam detectadas duas bandas, s que a banda leve estaria, agora, mais espessa; No modo semi-conservativo surgiriam duas bandas de propores equivalentes, uma intermediria e uma leve; No modo dispersivo continuaria presente uma nica banda intermediria, porm mais espessa.
Os resultados obtidos por Meselson e Stahl mostraram que, aps o 1o ciclo de duplicao, somente uma banda intermediria era visualizada no gradiente de cloreto de csio, em conseqncia, descartaram imediatamente a hiptese do modo conservativo de duplicao do DNA. No 2o ciclo, encontrava-se uma banda leve e uma pesada, o que eliminava o modo dispersivo de duplicao. Demonstraram, desta forma que o modo de duplicao da molcula de DNA era semiconservativo, o que confirmava a sugesto inicial feita por Watson & Crick.
Movimentao Bidirecional
Em 1963, J. Cairns, utilizando-se da tcnica de autorradiografia e microscopia eletrnica, verificou fotograficamente o modo semi-conservativo de replicao do DNA em E. coli. Clulas da bactria foram cultivadas em meio contendo timidina radioativa. A radioatividade estava no tritium (3H-timina). O DNA foi extrado num tempo pouco superior ao de uma duplicao e tratado com emulso fotogrfica para observao ao microscpio eletrnico. A interpretao da autorradiografia revelou alguns pontos interessantes (Figura 4.6):
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS confirmou que a molcula de DNA em E. coli era circular, como indicavam as anlises genticas; mostrou que as duas fitas da dupla hlice de DNA inicialmente se separam em uma posio denominada ponto de origem e as novas fitas comeam a ser sintetizadas, produzindo-se os garfos de replicao (junes Y), que se movem ao longo da fita, bidirecionalmente, at o ponto de trmino (TER) da replicao; enquanto o DNA se replica a integridade do crculo mantida e uma estrutura teta () intermediria formada; mostrou, finalmente, que as duas hlices recm sintetizadas e entrelaadas so separadas, liberando as novas dplex, processo que requeria cortes em uma das fitas para que se efetivasse o desenlace.
Figura 4. 6. Estgios de duplicao do cromossomo circular da bactria E. coli. Modo semiconservativo, com crscimento bidirecional. Figuras inter-medirias so as estruturas teta.
Guia de Estudos
Numa molcula de DNA fita simples, a quantidade de G o dobro de A; a quantidade de T trs vezes superior a de C e a razo pirimidinas/purinas 1,5:1. Qual a composio de bases do DNA em questo? Se o contedo GC de uma molcula de DNA 56%, qual a porcentagem de cada uma das bases nesta molcula? Qual a relao entre os fragmentos de Okazaki e o fato da DNA polimerase sintetizar DNA no sentido 5' 3'? Para cada uma das molculas de cido nucleico abaixo, deduza se DNA ou RNA, e se fita simples ou dupla.
Molcula % A % G % T A B C D E 33 33 26 21 15 17 33 24 40 40 33 17 0 21 0 %C %U 17 17 24 18 30 0 0 26 0 15 Tipo cido Nuclico - DNA dupla fita -
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F 30 20 15 20 15 -
Se a massa de um nucleotdio ~330 Da, de quantos pares de base constituda uma molcula de DNA dupla fita cuja massa 8,9 x 109 Da? Quantos cm tem esta molcula? Quantos cm teria uma molcula de 2,9 x 109 nucleotdios? Quantas voltas completas da dupla hlice devem ser desenroladas durante a replicao de um cromossomo de E. coli? O cromossomo de E. coli contem 4,7 x 106 pb. A seguir esto as temperaturas de fuso (desnaturao) de 4 molculas de DNA: 73 0 C, 690 C, 84 C 780 C e 820 C. Ordene estas molculas de acordo com a quantidade crescente de pares G-C.
0
Se a razo A/C = 1/3, quais so as quantidades relativas de cada uma das quatro bases?
Captulo 5 MQUINAS REPLICADORAS

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Repicao Semidescontnua
A sntese de uma nova fita de DNA depende da colaborao de diferentes polimerases que se enquadram em dois tipos bsicos: as primases, que iniciam a cadeia e as polimerases replicativas, que sintetizam a maior parte do DNA (Kornberg & Baker, 1992). As polimerases replicativas sintetizam uma nova fita de DNA utilizando uma fita complementar como molde, desde que haja um grupo 3 OH livre de uma cadeia iniciadora (primer), o qual perpetuar o ataque nucleoflico sobre o a-fosfato dos nucleosdios trifosfatados ingressantes. Assim, a cadeia sempre cresce no sentido 5 3 (Figura 5.1).
Figura 5. 1. H necessidade de um primer para a DNA polimerase sintetizar a fita complementar. O segmento de primer sintetizado pela primase. O alongamento da cadeia com adio de desoxirribonucleotdios feito pela DNA polimerase III e sempre ocorre no sentido 5 3.
Arthur Kornberg (1957) identificou e purificou, em E. coli, uma atividade de DNA polimerase, que recebeu o nome de DNA polimerase I ou pol I. Posteriormente foram identificadas mais dois tipos de DNA polimerases, pol II e pol III. A dependncia das DNA polimerases por um terminal 3 OH para catalisar a sntese da nova fita colocava alguns problemas na compreenso do processo: Quem era o segmento iniciador (primer) e como era sintetizado? Se a enzima trabalha apenas no sentido 5 3, como explicar a sntese simultnea da dupla antiparalela, visualizada nas autorradiografias dos cromossomos replicantes de E. coli? Como era resolvida a questo topolgica do desenlace da dupla hlice e da manuteno destas hlices, separadas, durante a sntese? Quais seriam os mecanismos utilizados pela clula para a execuo destas tarefas?

As evidncias experimentais eram da:

Formao de uma bolha de replicao no ponto de origem de replicao; Dependencia de um primer para iniciar a sntese pela DNA pol III; As duas novas fitas sintetizadas acompanham o movimento do garfo de replicao que avana abrindo a dupla hlice.
Ento, qual seria o mecanismo utilizado para replicar a fita complementar antiparalela? (Figura 5.2).
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Figura 5. 2. Garfo de replicao. Como explicar a replicao simultnea das fitas antiparalelas observada por Cairns, em E. coli, se a DNA polimerase s permite o crescimento da cadeia no sentido 5 3 ?
Fragmentos de Okasaki
Em 1968 Reiji Okasaki, trabalhando com E. coli, explicou a incompatibilidade aparente entre a replicao simultnea das duas fitas antiparalelas e o fato da DNA polimerase s adicionar nucleotdios no sentido 5 3, ao mostrar que, enquanto uma fita replica continuamente, acompanhando o sentido de abertura do garfo de replicao, a fita complementar, antiparalela, replica descontnuamente, produzindo pequenos fragmentos de DNA que crescem no sentido oposto ao garfo de replicao e que s sero unidos posteriormente. Experimento realizado por Okasaki: Numa cultura de E. coli, Okasaki adicionou 3H (tritium) por 30 segundos (pulso radioativo) e imediatamente aps extraiu e desnaturou o DNA. Grande parte do DNA fita simples radioativo sedimentou a 7S-11S (molculas de 1000 a 2000 nucleotdios). Quando, aps o pulso, transferiu as clulas para um meio no radioativo (pulso e cassa) por 30 segundos adicionais, a marcao radioativa foi detectada em molculas maiores cujo tamanho e radioatividade incorporada, aumentava com o tempo de cultivo no meio no radioativo. Isto implicava que os fragmentos iniciais haviam sido unidos posteriormente. Baseado nestas observaes, Okasaki props, ento, o modelo semi-descontnuo de replicao do DNA: A nova fita sintetizada que se estende no sentido 5 3 em direo ao movimento do garfo de replicao, denominada fita lder (leading) e cresce continuamente. A fita complementar, denominada fita lenta (lagging), tambm sintetizada no sentido 5 3 mas, necessariamente, em direo oposta do movimento do garfo de replicao, implicando numa replicao descontnua, em pequenos fragmentos. Os pequenos fragmentos s podem ser sintetizados aps movimento do garfo sobre uma extenso razovel da hlice, implicando sempre num atraso em relao fita lder. Este tipo de replicao gera fragmentos de 1000 a 2000 nucleotdios, hoje denominados fragmentos de Okasaki. Posteriormente, os fragmentos de Okasaki so covalentemente unidos por ao da enzima DNA ligase (Figura 5.3)
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Figura 5. 3. Replicao semidescontnua do DNA. A fita lider sintetizada continuamente a partir do primer. A fita lagging sintetizada descontinuamente produzindo fragmentos de Okasaki. A) Dois fragmentos de Okasaki na fita lagging. B) Fragmento de Okasaki maior devido a unio covalente entre eles catalisada pela DNA ligase. Novo fragmento sintetizado conforme o garfo se movimenta. Trs polimerases esto presentes no garfo de replicao; uma primase e duas DNA pol III.
Primers e Primases
Uma anlise acurada dos fragmentos de Okasaki permitiu responder questo do primer, ou seja, do incio da replicao. O terminal 5 dos fragmentos de Okasaki constitudo de segmentos de RNA (de 2 a 12 nucleotdios), que so complementares fita molde. Duas enzimas de E. coli poderiam sintetizar os primers de RNA: a RNA polimerase, envolvida no processo de transcrio e a primase, uma enzima monomrica muito menor, de apenas 60kDa, produto do gene dnaG. Estas enzimas so capazes de iniciar a sntese de RNA estabelecendo uma ligao fosfodister entre dois ribonucleotdios livres, complementares fita molde. Portanto, ao contrrio das DNA polimerases, no dependem da existncia de um primer. As primases so responsveis pela sntese dos primers nos fragmentos de Okasaki e no so inibidas por rifampicina, um conhecido inibidor da RNA polimerase em bactrias. Fragmentos de Okasaki: curtos segmentos de cido nuclico (1000-2000n em E. coli e 100200n em eucariotos), que contm uma pequena seqncia de ribonucleotdios seguida de uma seqncia mais extensa de desoxirribonucleotdios sintetizadas, respectivamente, pela primase e pela DNA pol III. Um grupo de protenas, diferentes daquelas que participam da replicao propriamente dita, requerido para transformar os fragmentos de Okasaki numa fita contnua de DNA sem a presena dos primers (ribonucleotdios). Basicamente trs passos so necessrios neste processo:
Remoo dos primers por ao do domnio de exonuclease da prpria DNA pol I, o qual age no sentido 5' para 3'; Sntese de DNA, pela DNA pol I, preenchendo a lacuna resultante da remoo dos primers; Ligao dos segmentos de DNA adjacentes, pela DNA ligase.
Convm salientar que todas as DNA polimerases seja em fagos, bactrias, arqueotos ou eucariotos, possuem atividade exonucleoltica associada. Isto pode parecer estranho num primeiro momento, mas tem lgica ao considerarmos que a atividade exonucleoltica permite a remoo da base que tenha sido erroneamente adicionada no momento da replicao, exercendo um papel 40 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS revisor do processo replicativo e contribuindo, decisivamente, para a fidelidade da replicao. Os domnios de exonuclease com funo revisora agem no sentido 3 para 5 diferindo, portanto, dos que removem o primer. Porque os RNA seriam utilizados como primers, na sntese do DNA? Esta uma questo de interesse evolutivo. possvel que a utilizao de primers de RNA diminua a taxa de erros na replicao do DNA. A adio dos primeiros nucleotdios, sem um primer inicial, um processo que est sujeito a mais erros do que o alongamento subseqente. Se o fragmento inicial for RNA, ser reconhecido posteriormente, como tal, e removido. A re-sntese pela pol I ser feita a partir de um primer de DNA (fragmento de Okasaki adjacente).
Super-Hlices
Um problema que se coloca com o avano do garfo de replicao que a abertura das fitas provoca uma toro na dupla hlice, induzindo alteraes topolgicas nas molculas de DNA que podem culminar com a formao de super hlices (Figura 5.6 de Voegt & Voegt, 1995).
Figura 5. 6. Micrografia eletrnica de uma dplex circular de DNA, cujas conformaes variam de ausncia de super hlices para uma estrutura altamente super helicoidal .
Se, ao girar em torno de seu prprio eixo, a molcula de DNA o fizer no mesmo sentido de giro das fitas na dplex, ento ser introduzido um super enrolamento positivo (positive supercoiling) e a molcula ficar mais firmemente fechada. Caso o sentido de giro da molcula seja oposto (para a esquerda) ao do giro das fitas, ento se introduzir um super enrolamento negativo (negative supecoiling) e a molcula ficar mais solta. Construa uma dplex circular e experimente fazer os giros. Uma propriedade de dplex circulares que o nmero de voltas existentes na molcula no pode ser alterado a no ser que se corte, pelo menos, uma das fitas. Enzimas denominadas topoisomerases controlam o estado conformacional de super hlice que fundamental ao DNA no exerccio de suas funes biolgicas. Em geral, as molculas de DNA in vivo, apresentam super enrolamento negativo, contribuindo para a separao das fitas e, consequentemente, para a realizao de processos biolgicos tais como replicao e transcrio. A DNA girase um exemplo de topoisomerase. Corta as duas fitas da super hlice, um pouco frente do Y de replicao, permitindo um desenlace contido da molcula e, ao religar os terminais livres, inverte o sentido do giro, o que alivia a tenso, introduzindo um super enrolamento negativo. Um crculo relaxado no apresenta super hlices. A formao de super hlices mais estudada em molculas circulares pequenas de DNA, tais como os cromossomos de alguns vrus e plasmdios. Todavia, as mesmas consideraes feitas para estas molculas so aplicveis a qualquer regio de uma molcula de DNA cujos terminais estejam impedidos de girar livremente.
Origens de Replicao
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A replicao em E. coli inicia-se num stio especfico do cromossomo, denominado origem de replicao, onde se forma a bolha de replicao que se expande bidirecionalmente via garfos de replicao (Y) at encontrar o ponto de trmino. Num cromossomo circular como o da bactria E. coli, uma nica origem de replicao suficiente e os dois garfos de replicao, em movimento, encontram-se no polo oposto do crculo ao completar o processo. Os longos cromossomos de eucariotos contem mltiplas origens de replicao. Os dois garfos em movimento, a partir de um dado ponto de origem, avanam em direes opostas at encontrar os garfos em movimento de origens vizinhas. Cada segmento de DNA que contem um ponto de origem capaz de replicao autnoma e denominado replicon. Os cromossomos bacterianos constituem um replicon, na medida em que possuem apenas uma origem de replicao. Em eucariotos cada cromossomo possui vrios replicons. Estima-se que o genoma humano contenha 10.000 a 100.000 replicons. As origens de replicao esto localizadas em seqncias especficas do DNA, sempre no mesmo ponto do cromossomo, sendo definidas como o segmento de DNA que necessrio e suficiente para a replicao da molcula (Figura 5.4).
Figura 5. 4. Esquema das origens de replicao em bactrias e eucatiotos e do sistema de replicao semidescontnua do DNA.
A origem de replicao em E. coli, denominada oriC, contem 245 pares de bases (pb) e apresenta seqncias repetidas, em srie, de 9 e 13 nucleotdios. Os grupos de 9 nucleotdios repetem-se 4 vezes e so denominados caixas de DnaA (DnaA boxes), porque estas seqncias so reconhecidas pelas protenas DnaA, iniciadoras de replicao. Os grupos de 13 nucleotdios esto repetidos 3 vezes e apresentam alta freqncia de pares AT, o que facilitar a abertura da bolha de replicao, uma vez que pares AT s estabelecem 2 pontes de hidrognio entre si (Figura 5.5). As protenas DnaA, codificadas pelo gene dnaA, formam um complexo multimrico de 10-20 subunidades de DnaAs que se liga oriC. Utilizando a energia de hidrlise do ATP esta mquina protica facilita o desenlace inicial da dupla hlice, formando o complexo aberto. A ligao do complexo DnaA oriC pr-requisito, mas no suficiente ao desencadeamento do processo replicativo (Baker & Bell, 1998). 42 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Um passo crtico neste sentido a separao das duas fitas de DNA, o que facilita o carregamento da maquinaria de replicao e expe as fitas complementares s polimerases a instaladas. Tal abertura iniciada com o complexo DnaA expande-se por ao de helicases, as quais,s custas da energia de hidrlise do ATP, rompem as pontes de hidrognio entre as bases, movendo-se em direes opostas ao longo da dupla hlice. Em E.coli, as helicases que agem neste processo so denominadas DnaB e codificadas pelo gene dnaB. As DnaB formam um complexo hexamrico que se liga origem de replicao com ajuda de protenas acompanhantes denominadas DnaC, as quais, aps a entrega do complexo DnaB, abandonam o local. Para impedir o reanelamento, protenas que reconhecem fita simples ligam-se a cada uma das hlices num processo concomitante ao da separao. Estas protenas so denominadas SSB (do ingls, single-strand binding protein). Esta maquinaria protica instalada passo a passo no ponto de origem de replicao constitui o complexo pr-replicativo (Figura 5.5). Em seguida, a primase, sintetizadora do primer, recrutada. O conjunto helicase/primase denominado primossomo. Est formado o complexo de iniciao da replicao. Uma vez sintetizado o primer, duas DNA polimerase III acoplam-se ao complexo e iniciam o alongamento da cadeia, uma na fita leading e outra na fita lagging. Ao complexo protico primossomo + 2 DNA pol III, d-se o nome de replissomo. O replissomo coordena a replicao nas junes Y, movendo-se ao longo do DNA. Assim, em E. coli, a DNA pol III adiciona nucleotdios nas cadeias nascentes tanto da fita leading como lagging. Processo similar ocorre em eucariotos e arqueotos. Origem de replicao em eucariotos: Um eucarioto bastante estudado e utilizado como modelo a levedura Saccharomyces cerevisiae. O genoma de S. cerevisiae, um eucarioto unicelular, apresenta mltiplas origens de replicao denominadas ARS (do ingls, autonomously replicating sequence). Estima-se que existam cerca de 400 origens de replicao distribudas nos 16 cromossomos da levedura S. cerevisiae. Uma anlise detalhada dos 180 pb da regio ARS, revelou a existncia de um elemento essencial, constitudo de 15 pb o qual foi denominado elemento A. Trs outros segmentos, B1, B2 e B3 so necessrios para um funcionamento mais eficiente do ARS. Um heterodmero de 6 subunidades denominado ORC (do ingls, origin-recognition complex), anlogo ao complexo DnaA de bactrias, liga-se ao elemento A do ARS, em presena de ATP, para iniciar a replicao.
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Figura 5. 5. Iniciao da replicao em E. coli. A ori-gem de replicao oriC reconhecida pelo complexo multimrico DnaA ao qual se acoplam as helicases com ajuda das DnaC. A abertura da bolha garantida pelas SSBs. A replicao se inicia com a sntese do primer dirigida pela primase.
DNA Polimerases
A enzima DNA polimerase III (pol III) muito grande e complexa (~600kDa), sendo composta de dez polipeptdios diferentes (a, b, c, d, d, g, q, t, e, y). As subunidades, unidas por ligaes fracas, constituem a holoenzima. A pol III uma enzima dimrica, portanto, cada uma das subunidades predominantes est presente em duplicata e na sua conformao final expe dois stios catalticos para a adio de nucleotdios. A central enzimtica, constituda das subunidades a (polimerase), e (exonuclease) e q (funo desconhecida), contem os stios ativos para adio de nucleotdios e para reviso do processo de sntese. A subunidade t ajuda dimerizar a central enzimtica, ao mesmo tempo que interage com a helicase e com a primase exercendo o papel de protena andaime (scaffold) no replissomo, ao permitir a ao cooperativa das sub mquinas proticas helicase, primase e polimerase. As outras subunidades esto envolvidas na manuteno da enzima junto ao DNA forando a enzima a adicionar nucleotdios em seqncia, sem se desprender da hlice. A subunidade fundamental nesta funo a b, a qual, na forma de um dmero, enrosca-se em torno da dupla hlice recm-sintetizada movendo-se livremente ao longo do DNA, como um anel, carregando junto, a central enzimtica e garantindo a eficincia do processo (Figura 5.7).
Figura 5. 7. Papel da subunidade aumentando a processividade da DNA polimerase
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A forma dimrica da pol III sugere um mecanismo de sntese das fitas leading e lagging, onde os desoxirribonucleotdios sejam adicionados ao mesmo tempo nas duas fitas (Figura 5.8). possvel que a fita molde lagging d uma volta em torno de um dos stios catalticos da pol III, invertendo fisicamente porm, no bioquimicamente, a direo de crescimento da fita. Com esta inverso os terminais 3 das cadeias nascentes leading e lagging ficam posicionados prximos aos stios catalticos das DNA polimerases permitindo a adio simultnea de desoxirribonucleotdios nas duas fitas, no sentido de abertura do garfo.
Figura 5. 8. Modelo pro-porsto para a sntese com-comitante das fitas leading e lagging durante a replicao do DNA, com a participao das vrias mquinas proteicas (polimerases, exonucleases, helicases e complexos aces-srios) que cons-tituem o re-plissomo.
As DNA pol III trabalham numa velocidade superior da pol I. Adicionam cerca de 30.000 nucleotdios por minuto enquanto a pol I adiciona cerca de 600. Isto se reflete na quantidade de molculas necessrias para os processos em questo. Cerca de 400 unidades de pol I so encontradas dentro da clula para cada 10-20 unidades de pol III. A enzima pol II, menos estudada, est envolvida no reconhecimento e reparo de danos ao DNA. Stios de terminao: Ao stio de terminao (TER), em E. coli, ligam-se protenas denominadas Tus. Supe-se que estas protenas inibam as helicases impedindo, desta forma, o avano do garfo de replicao e provocando a parada da sntese. Ao final da replicao do cromossomo circular de E. coli so produzidos dois cromossomos filhos interconectados que sero separados pela ao de topoisomerases.
Modos Alternativos de Replicao em Cromossomos Circulares

Nos DNA circulares, alm da forma bidirecional de replicao, que implica na estrutura q, alguns podem replicar pelo modo de crculo rolante, como encontrado em bacterifagos e plasmdios ou pelo modo de ala D, como encontrado no DNA das mitocondrias e dos cloroplastos, em eucariotos.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Na Figura 5.9 est representado um esquema do crculo rolante na replicao do plasmdio F, de E. coli, durante a conjugao. No processo de conjugao, as informaes genticas contidas no plasmdio de uma clula, so transferidas para outra clula que no continha este plasmdio, de sorte que, ao final do processo as duas clulas carreguem o mesmo tipo de plasmdio. Durante a transferncia o cromossomo replica-se pelo modo de crculo rolante. No modo de crculo rolante, a replicao se inicia com um corte em uma das fitas. Este corte produz dois terminais distintos. O terminal 3 que expe um grupo OH livre, ser utilizado como primer para o replissomo que se mover desenlaando as duas fitas originais enquanto sintetiza uma fita nova, contnua, no sentido 5 3. O terminal livre 5, que vai sendo deslocado com o avano do replissomo, ser utilizado como molde para a sntese descontnua da fita complementar. Ao final do processo uma endonuclease separa as dplex.
Figura 5. 9. Crculo rolante. As letras representam marcas genticas no cromosssomo.
O DNA presente em cloroplastos e mitocndrias, apresenta duas origens de replicao, uma para cada fita, em posies diferentes do crculo. Isto cria um modo de replicao diferente, com a formao de uma ala (D loop) como esquematizado na Figura 5.10. A replicao se inicia em um ponto de origem, sintetizando apenas uma fita. O deslocamento da outra fita da dplex cria a ala D. Quando a fita recm sintetizada passa pelo ponto de origem da outra fita, inicia-se a replicao da fita complementar em sentido oposto. O resultado so dois crculos duplicados.
Figura 5. 10. Replicao de DNA mitocondrial no modelo de ala D.
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Replicao dos Telmeros

Uma diferena marcante na replicao de um cromossomo circular como o de E. coli e de cromossomos lineares como os de eucariotos e de algumas bactrias, a necessidade de um mecanismo especial para replicar os terminais do cromossomo. Replicar o terminal complicado uma vez que a DNA polimerase requer um primer e somente pode alongar a fita a partir do terminal 3'. A degradao do RNA primer no terminal, gera uma lacuna no preenchida. Isto poderia resultar em cromtides filhas progressivamente menores a cada ciclo de replicao pelo modo convencional. Como superar este problema? Em 1978 Elizabeth Blackburn & J. Gall (veja Blackburn, 1990) descreveram a estrutura dos terminais cromossmicos do protozorio ciliado Tetrahymena, que possui centenas de pequenos cromossomos lineares. Tal estrutura, denominada telmero, essencial para a estabilidade dos cromossomos e tambm importante na segregao dos mesmos durante a meiose (veja Price, 1999). As seqncias telomricas encontradas em vrios organismos (Tabela 5.1) consistem de repeties em srie de seqncias simples tais como 5'-TTAGGG-3', tpica de vertebrados. Tabela 5. 1. Seqncias telomricas repetidas em srie Tetrahymena Trypanosoma Dictyostelium Neurospora 5' T2G4 3' 5' T2AG3 3' 5' AG1-8 3' 5' T2AG3 3' Caenoharbditis 5' T2AG2C 3' Bombyx Vertebrados 5' T2AG2 3' 5' T2AG3 3' 5' T3AG3 3'
Saccharomyces 5' T1-6GTG2-3 3' Arabidopsis
Fonte: Hartl & Jones, 1998
A fita rica em nucleotdios G (fita G) estende-se em direo ao terminal 3', projetando-se na forma de fita simples e, portanto, no possui, o molde correspondente. Logo, durante a replicao pela DNA polimerase III as molculas filhas perderiam esta projeo (Figura 5.11).
Figura 5. 11. Perda de nucleotdios nos terminais telomricos no modo comvencional de replica-o, por ao da DNA polimerase III (Adaptado de Lingner & Cech, 1998).
No final dos anos 80, Blakburn e colaboradores isolaram, de Tetrahymena, uma enzima capaz de resolver este problema, a qual passou a ser denominada telomerase. A telomerase uma enzima ribonucleoprotica e age como uma transcriptase reversa para alongar o terminal 3' telomrico, Cristina M. Bonato 47
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS adicionando mais desoxirribonucleotdios na projeo da fita G. Uma molcula de RNA com ~160pb parte integrante desta enzima e funciona como molde para a sntese das repeties telomricas, uma vez que apresenta uma regio complementar projeo (RNA guia). Aps adicionar novas repeties a telomerase desliza sobre a dupla para adicionar mais desoxirribonucleotdios complementares ao segmento de RNA. Provavelmente, a fita complementar sintetizada via mecanismos usuais sntese da fita lagging. Com esta ttica o cromossomo pode ser estendido at 10 kb (Figura 5.12).
Figura 5. 12. O RNA guia pareia com a seqncia complementar das repeties telomricas e utilizado como molde para o alongamento do telmero conforme a telomerase deslisa sobre o DNA.
Mltiplas protenas ligam-se regio telomrica do DNA compactando o terminal telomrico num complexo DNA/protena onde no se encontram nucleossomos. As protenas associadas ao terminal protegem a projeo de degradao e recrutam a telomerase. Aparentemente, as protenas telomricas tambm participam do alinhamento de cromossomos homlogos durante a meiose, agindo como uma cola entre eles e permitindo recombinao e segregao adequadas. A utilizao de telomerases e repeties em srie nos terminais telomricos, apesar de amplamente utilizada no universal. Em Drosfila, por exemplo, o telmero composto de elementos transponveis especializados, retroposons, cuja transposio mantem os terminais cromossmicos. Bactrias com cormossomos lineares tambm no utilizariam telomerases para a manutano dos terminais cromossmicos. Em eucariotos, as polimerases envolvidas na sntese do DNA so as DNA polimerases a, b e d, correspondentes s DNA polimerases I, II e III de bactrias. Ainda so encontradas as DNA polimerases g (mitocndrias) e e. Estudos mais detalhados da replicao em eucariotos foram feitos com o vrus SV40, especficos de clulas de mamferos. Os mecanismos so basicamente os mesmos dos encontrados em bactria. Deve-se salientar a diferena entre as polimerases que atuam nas fitas leading e lagging. Aparentemente, tanto a pol a como a pol d atuam conforme o garfo se move sobre o cromossomo. Mas, a pol d preponderante na sntese da fita leading e a pol a, fortemente associada primase, preponderante na sntese da fita lagging.
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Guia de Estudos
Progeria uma desordem humana na qual os indivduos afetados envelhecem prematuramente. Uma criana de 9 anos semelhante, fisica e fisiologicamente, a um indivduo de 60-70 anos. Voc isolou o DNA de um paciente e, ao invs de encontrar longas molculas de DNA como era esperado, encontrou grande quantidade de fragmentos pequenos de DNA. Que enzimas poderiam estar deficientes neste paciente? O que uma nuclease? Qual a diferena entre exonucleases e endonucleases? Qual a funo das helicases? Qual seria a conseqncia, para o organismo, de uma mutao com perda de funo no gene que codifica a protena DnaA? Explique. Qual a funo das protenas SSB? Dos dados constantes neste captulo, quanto tempo leva para replicar o cromossomo de E. coli, a 37oC se dois garfos de replicao partem, bidirecionalmente, da origem? Em boas condies, as clulas de E. coli dividem-se a cada 20 minutos. Como isto possvel? Durante a replicao do cromossomo de E. coli, quantos fragmentos de Okasaki, aproximadamente, so formados? Qual poderia ser a conseqncia de uma mutao que diminuisse a atividade da enzima telomerase?
Captulo 6 TRANSCRIO EM BACTRIAS

Antecedentes Histricos
Ao se desvendar a estrutura da molcula de DNA o princpio da replicao pde ser visualizado sem dificuldades. Todavia, a forma com que as protenas eram geradas a partir desta molcula informacional ainda constitua um mistrio. Em 1954, o astrofsico George Gamow, tomando conhecimento dos trabalhos de Watson & Crick, sobre estrutura e replicao do DNA, props que os quatro tipos de bases dos desoxirribonucleotdios seqencialmente dispostos na molcula de DNA constituiriam as letras de um cdigo e que este cdigo comandaria a seqncia dos aminocidos nas protenas. A questo inicial era descobrir como o sistema de 4 bases estava organizado para sinalizar aos 20 tipos de aminocidos que participam das protenas. De 1954 a 1966, intensas discusses e experimentaes foram realizadas por todos aqueles que se interessavam pelo assunto, particularmente Crick, que j postulava a existncia de uma molcula intermediria para estabelecer a complementaridade necessria entre as bases dos cidos nuclicos e os aminocidos das protenas.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Finalmente, os trabalhos realizados por Nirenberg & Leder (1964) e por Khorana e colaboradores (1966), desvendaram por completo o cdigo gentico, estabelecendo que aminocido correspondia a cada cdon (cada uma das possveis combinaes das quatro bases, trs a trs). Este assunto discutido em "Desvendando o Cdigo da Vida".
A Sntese de Protenas Ocorre no Citoplasma

Em 1954 Zamecnik & Keller mostraram que para haver sntese protica in vitro, ou seja, num sistema livre de clulas, era necessria a presena dos seguintes componentes num tubo de ensaio: aminocidos, os quais eram marcados radioativamente (14C) para serem detectados nas protenas, aps precipitao das mesmas ao trmino do processo de sntese; ATP, como gerador de energia; retculo endoplasmtico rugoso (RER), ou seja, retculo endoplasmtico acoplado a ribossomos, local de sntese protica. O RER sedimenta no fundo do tubo aps centrifugao do extrato bruto celular a 100.000xg; sobrenadante de 100.000 x g, onde fora detectada atividade enzimtica capaz de produzir aminocidos ativados (aminoacil-AMP). Com isto ficava claro que a sntese protica ocorria no citoplasma, na presena de ribossomos, estabelecendo-se uma relao entre rRNA e sntese protica. Apesar de, neste momento, j estar claramente demonstrado que o material gentico era o DNA, cuja estrutura tambm j era conhecida, os autores no fizeram qualquer conexo entre o processo de sntese protica que ocorre no citoplasma e a molcula de DNA presente no ncleo. Em 1958 Hoagland e colaboradores detectaram um outro tipo de RNA no sobrenadante de 100.000 x g. Este RNA passou a ser denominado RNA solvel, em contraposio ao rRNA que sedimentava com os ribossomos. O RNA solvel era uma molcula pequena que se ligava covalentemente aos aminocidos ativados. Atualmente o RNA solvel denominado RNA transportador (tRNA). Paulatinamente sedimentava-se a idia de que o molde para a sntese de protenas era RNA e no DNA, baseado em evidncias tais como: Existncia de um tipo de RNA que transportava aminocidos (tRNA); Ocorrncia de sntese protica nos ribossomos localizados no citoplasma da clula eucaritica, portanto, separado do DNA, que se encontra no ncleo. De incio imaginou-se que a informao contida no DNA era trazida do ncleo para o citoplasma via rRNA. Mas Davern & Meselson (1960), trabalhando com E. coli, demonstraram que as molculas de rRNA eram muito estveis mantendo-se ntegras aps vrias divises celulares. Molculas to estveis e pouco variveis, no poderiam ser responsveis pela rpida mudana nos nveis de sntese enzimtica observada nas bactrias em resposta a diferentes estmulos. Particularmente importantes, para o compreenso do que estava acontecendo, foram os experimentos realizados no Instituto Pasteur por Franois Jacob, Jacques Monod e diversos colaboradores.
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Caracterizao de um RNA Instvel

Jacob & Monod estudavam a atividade de b-galactosidase em E. coli, cultivada em presena ou ausncia de lactose. A b-galactosidase degrada lactose em glicose + galactose. Clulas de E. coli produzem cerca de 0,5 a 5 molculas ativas da enzima, quando cultivadas na ausncia de lactose. Ao adicionarem lactose ao meio observaram que: A atividade de b-galactosidade, nas clulas, aumentava paulatina e drasticamente; O aumento de atividade dependia de sntese protica; A sntese da enzima b-galactosidade era induzida ~1.000 vezes A transferncia das clulas para um meio sem lactose, mas com glicose como fonte de carbono, implicava em parada imediata da sntese de b-galactosidase (Figura 6.1). Deduo: uma variao to grande e to rpida no poderia depender de molculas to estveis como os rRNAs, constituintes dos ribossomos. Num conjunto paralelo de experimentos o anlogo 5-fluor-uracila foi adicionado culturas de E. coli, que estavam produzindo b-galactosidase. Quando presente no meio este anlogo incorporado em lugar de uracil durante a sntese de RNA. Observou-se, ento, que a atividade de bgalactosidase produzida a partir da incorporao do anlogo, caa abruptamente. Quando as clulas retornavam a um meio sem 5-fluor-uracila, a atividade era recuperada (Bussard et al., 1960). Isto sugeria fortemente a existncia de RNA no estvel, que podia ser sintetizado e degradado rapidamente, o qual serviria de molde para a sntese da protena. A dificuldade em se detectar tal RNA devia-se a sua alta labilidade.
Figura 6. 1. Induo da sntese -galactosidase na presena de lactose.
de
J existiam, ento, algumas evidncias da existncia de um RNA instvel associado aos ribossomos.
Hibridizao
Quando um DNA dupla fita desnaturado pelo calor (90oC), suas hlices se separam devido ao rompimento das pontes de hidrognio entre as bases. Se a soluo contendo DNA desnaturado Cristina M. Bonato 51
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS for resfriada lentamente, as duas hlices, complementares entre si, voltam a se anelar (hibridizar). Ou seja, os segmentos complementares conseguem "se encontrar", refazendo a dupla hlice. Utilizando esta tcnica Hall & Spiegelman (1961) demonstraram que o DNA agia como molde para a sntese de molculas instveis de RNA e que havia uma correlao entre o aumento de RNA instvel e sntese protica. Hall e Spiegelman estudavam os tipos de RNAs produzidos em E. coli aps infeco com o fago T2. Quando o fago T2 infecta a bactria, esta passa a sintetizar uma srie de protenas tpicas do fago, parando a sntese de suas prprias protenas. Aps algum tempo uma grande quantidade de partculas fgicas produzida e liberada com a lise da clula bacteriana. Ao isolarem o RNA instvel, recm sintetizado, observaram que formava hbridos apenas com o DNA desnaturado de T2 mas no com o DNA desnaturado de E. coli. Antes da infeco, o RNA extrado da clula bacteriana hibridizava com o DNA bacteriano. Os trabalhos acima e outros publicados entre 1957-1961, com bactrias e seus bacterifagos, mostravam que um intermedirio instvel e heterogneo em relao ao peso molecular, o qual associava-se fracamente aos ribossomos, apresentava as caractersticas desejveis a uma molcula capaz de transferir a informao gentica do DNA, seja de bactria ou fago, at os ribossomos. Isto implicava que as mesmas mquinas produtoras de protena serviriam tanto para sintetizar protena bacteriana como protena fgica.
Figura 6. 2. Hibridizao DNA/RNA-Aps desnaturao da molcula de DNA uma das fitas pode hibridizar com a molcula complementar de RNA. A existncia de complemetaridade RNA/DNA uma forte indicao de que o DNA molde para a sntese de molculas de RNA.
O mRNA o Intermedirio Entre Genes e Ribossomos

Em trabalho publicado em 1961 (Brenner et al) assumiu-se, definitivamente, que a espcie instvel de RNA, agora denominada RNA mensageiro (mRNA), era responsvel por carregar a mensagem contida na molcula de DNA at os ribossomos. Finalmente estabelecia-se uma conexo entre genes e protenas via uma molcula instvel de RNA, cuja sntese e degradao podia ser perfeitamente regulada pela clula em resposta a suas necessidades (Leia Jacob & Monod, 1961). Como foram feitos estes experimentos?
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Clulas de E. coli foram cultivadas em presena de 15N. Portanto, os ribossomos produzidos continham 15N incorporado em suas molculas (ribossomos pesados). A seguir, as clulas foram infectadas com bacterifago T4 e, ao mesmo tempo, transferidas para um meio contendo 14N. No momento da infeco as clulas bacterianas foram expostas a curtos pulsos radioativos de 32P ou 35S que marcam, respectivamente, cidos nuclicos e protenas. Logo: a partir da infeco fgica, todas as molculas produzidas incorporariam nitrognio leve (14N); as protenas recm-sintetizadas estariam marcadas radioativamente com 35S e os RNAs recmsintetizados estariam marcados radioativamente com 32P. Resultados obtidos aps isolamento dos ribossomos e ultracentrifugao em gradiente de densidade (Figura 6.3): No se detectou partcula ribossmica leve radioativa, aps a infeco. Portanto, no houve sntese nova de rRNA. Foi detectado, aps infeco fgica, um RNA instvel (mRNA), marcado radioativamente com 32P, associado s partculas ribossmicas "pesadas", produzidas antes da infeco. As protenas sintetizadas aps a infeco, ou seja, as protenas do fago, identificadas pelo 35 S, estavam associadas partcula ribossmica "pesadas", antes de serem liberadas na soluo citoplasmtica.
Figura 6. 3. Aps infeco fgica, os ribossomos "pesados" de E. coli associam-se, transitoriamente, um tipo instvel de RNA (32P) e molculas de peptdios (35S)
Estas observaes sugeriam fortemente que a protena do fago era sintetizada a partir de mRNAs do fago, nos ribossomos bacterianos, que haviam sido produzidos antes da infeco. Uma vez que as informaes para protenas fgicas no poderiam residir em ribossomos bacterianos, esta informao deve ter sido provida pela frao de mRNA, sintetizada a partir do DNA do fago, a qual se associava transitoriamente aos ribossomos A presena de um intermedirio instvel que utilizava o DNA como molde, poderia explicar as observaes feitas com a sntese de b-galactosidase em E.coli: A partir de uma seqncia do DNA seria produzida uma fita complementar de RNA do tipo instvel, contendo a mensagem. Esta molcula se dirigiria aos ribossomos, complexos macromoleculares estveis, onde ocorreria a sntese protica. Tais mquinas de traduo, constitudas de rRNA e protenas, seriam capazes de traduzir qualquer texto que lhes fosse apresentado pelos RNAs instveis. Do processo participariam, necessariamente, as molculas de tRNA, carregando seus respectivos aminocidos. Cristina M. Bonato 53
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Em reviso publicada em 1961, Jacob & Monod analisam todos os resultados que, at ento, haviam obtido sobre a ao dos genes e explicitam claramente o conceito de RNA mensageiro (mRNA). A seguir, um extrato da introduo do artigo, onde a molcula intermediria nomeada mRNA: "Since it seems to be established that proteins are synthesized in the cytoplasm, rather than directly at the genetic level, this transfer of structural information must involve a chemical intermediate synthesized by the genes. This hypothetical intermediate we shall call the structural messenger. The rate of information transfer, i.e. of protein synthesis, may than depend either upon the activity of the gene in synthesizing the messenger, or upon the activity of the messenger in sinthesizing the protein." O trabalho realizado pelos pesquisadores do Instituto Pasteur teve uma amplitude maior do que a colocada no contexto deste captulo, uma vez que foram eles que estabeleceram os conceitos bsicos de regulao coordenada de expresso gnica em E. coli. Este assunto ser discutido no captulo referente regulao da expresso gnica em bactrias.
Tipos de RNA
As clulas possuem muitos tipos diferentes de molculas de RNA que executam trabalhos diversos. Os tipos de RNA que participam do processo de sntese protica so: RNA mensageiro (mRNA), RNA transportador (tRNA) e RNA ribossmico (rRNA)(Figura 6.4).
Figura 6. 4. Os trs tipos de RNA, rRNA, tRNA e mRNA participam do processo de sntese protica. Os mRNA contem a mensagem que ser traduzida em protena, de sorte que a seqncia de bases no mRNA determina a seqncia dos aminocidos no polipeptdio. Os tRNA carregam os aminocidos especficos para cada cdon. O local de sntese protica o ribossomo, um complexo ribonucleoprotico onde rRNAs associam-se protenas especficas. O valor S indica a velocidade de sedimentao de uma molcula numa ultracentrfuga.
A sntese dos diferentes tipos de RNA, a partir de um molde de DNA, usando as regras da complementaridade, um processo enzimtico denominado Transcrio do DNA. No processo de transcrio, a informao gentica contida num segmento do DNA, reescrita em uma fita simples de RNA que apresenta uma seqncia de ribonucleotdios 54 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS complementar a uma das fitas da dupla hlice de DNA (fita molde) e idntica seqncia da outra fita (fita codificadora), com substituio de T por U (Figura 6.5).
Figura 6. 5. Fita codificadora, fita molde e RNA. O sentido da transcrio est indicado pela flecha.
Por conveno, quando se escreve um seqncia de nucleotdios correspondente a um gene, sempre representada a fita codificadora. Tambm, por conveno, a seqncia sempre escrita no sentido 5' 3'. Em alguns sistemas a fita molde tambm identificada como fita menos (-) e a fita codificadora como fita mais (+). As molculas de mRNA, transcritas a partir de diferentes regies do DNA, carregam a mensagem que ser descodificada em polipeptdios, nos ribossomos, com a ajuda dos tRNAs. Isto implica que as molculas de mRNA apresentam tamanhos bastante variveis. Os tRNAs "leem" a mensagem contida nos mRNA, via pareamento de bases complementares (cdon/anti-cdon), ao mesmo tempo que carregam o aminocido correspondente aquele cdon. Assim, a cada cdon, corresponde um nico amino cido carregado por um tRNA particular. Diferentes genes codificam os tRNAs especficos para cada aminocido. Os diferentes tipos de rRNAs, juntamente com os diferentes tipos de protenas ribossmicas, constituem o complexo macromolecular ribonucleoprotico (mquina de traduo) denominado ribossomo, onde ocorre a sntese protica. As molculas de rRNA esto envolvidas nos processos de atrao de molculas de mRNA para o ribossomo e de catlise na formao das ligaes peptdicas. Os genes que codificam rRNAs so encontrados em mltiplas cpias no cromossomo.
Estruturas do RNA
A molcula de RNA fita simples, arranjada em estruturas secundrias e tercerias. A evidncia de que as molculas de RNA, em geral, esto na forma de fita simples dada pelo fato de no apresentarem as razes de Chargaff entre purinas e pirimidinas. P. ex., em RNA isolado de E. coli, as percentagens das bases so: A=24; U=22; G=32; C=22. As caractersticas de cada um dos tipos predominantes de RNA, em E. coli, esto apresentadas no Quadro 6.1.
Quadro 6. 1. Molculas de RNA em E. coli Tipo rRNA tRNA mRNA % RNA Total Coefic. Sedim. S 80 15 5 23 16 5 4 PM 1,2.106 0,55.106 3,6.10
4
no nucleotdios 3700 1700 110 75 varivel
2,4.104 heterogneo
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O pareamento de bases entre segmentos complementares distantes da molcula de RNA permite contatos intramoleculares substanciais, gerando domnios estruturais tipo haste/ala, grampos e outras estruturas secundrias. As interaes entre tais estruturas resulta num dobramento tridimensional, criando estruturas tercerias como o pseudo-n (Figura 6.6).
Figura 6. 6. Estruturas secundrias e tercerias: alas, grampos e pseudo-n
Neste sentido, as molculas de RNA assemelham-se protenas, com diferentes domnios estruturados que se conectam por regies mais flexveis. Tais conformaes sofisticadas conferem molcula de RNA a possibilidade de interagir especificamente com protenas e outras molculas e de apresentar, eventualmente, atividade cataltica agindo, portanto, como uma enzima ou Ribozima.
A Unidade de Transcrio
A sntese de qualquer dos tipos de molcula de RNA catalisada pela enzima RNA polimerase. Apesar dos processos de transcrio e replicao do DNA apresentarem vrias caractersticas em comum, so fundamentalmente diferentes em um aspecto: durante a replicao, o cromossomo inteiro copiado, produzindo-se fitas filhas idnticas s originais enquanto, durante a transcrio, apenas segmentos selecionados de uma das fitas do DNA so utilizados como molde resultando na transcrio apenas dos genes necessrios em um determinado momento da vida do organismo. Transcrever regies no-gnicas ou genes cujos produtos no so necessrios num determinado momento, seria uma perda de tempo e de energia. Portanto, o processo de transcrio deve ser bastante seletivo e as enzimas e protenas reguladoras que dele participam devem ser capazes de distinguir sinais que demarquem as seqncias de interesse, ou seja, onde comear e onde terminar a transcrio de um segmento. A transcrio de um segmento se inicia quando a RNA polimerase reconhece e liga-se a seqncias especficas de nucleotdios em uma regio especial, no incio do gene, denominada promotor. Alm destas seqncias, o promotor engloba o ponto de incio, que o primeiro par de bases a ser transcrito em RNA. A partir da a RNA polimerase move-se ao longo do molde, sintetizando RNA, at alcanar uma outra seqncia especfica que sinaliza o trmino da transcrio. Assim, a unidade de transcrio estende-se do ponto de incio (+ 1) no promotor, at o terminador (Figura 6.7).
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Figura 6. 7. A unidade de transcrio uma seqncia de DNA transcrita pela RNA polimerase, com incio no ponto +1 e trmino no sinal de terminao jusante.
Diz-se que as seqncias que antecedem o ponto de incio localizam-se montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se jusante (downstream). A posio das bases numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de incio, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) jusante e diminuem (valor negativo) montante.
Fita Molde
Numa unidade de transcrio, apenas uma das fitas do DNA utilizada como molde para sntese de RNA. Em princpio, qualquer uma das fitas da dupla hlice de DNA poderia ser utilizada como molde para sintetizar uma molcula de RNA. Se, dentro de uma mesma unidade, as duas fitas fossem transcritas, dois tipos diferentes de RNA seriam gerados. Evidncias genticas e bioqumicas indicam, todavia, que para um dado segmento informacional do DNA (gene) s um dos dois tipos possveis de molculas de RNA produzido. Uma das evidncias mais convincentes de que apenas uma das fitas do DNA transcrita num determinado segmento, dada pelo bacterifago SP8 ao infectar a bactria Bacillus subtilis (Figura 6.8).
Figura 6. 8. A) No bacterifago SP8, apenas uma das fitas do genoma utilizada como molde. B) No fago T4, que infecta E. coli, qualquer das duas fitas pode ser utilizado como molde, mas para um dado segmento apenas uma delas funciona como molde.
No bacterifago SP8, uma das fitas do DNA tem um percentual de purinas superior ao da outra, o que a torna mais densa, sendo possvel separar as duas fitas em gradiente de CsCl. Aps Cristina M. Bonato 57
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS infeco da bactria pelo fago, s ser sintetizado RNA viral. Ao se hibridizar o RNA viral coletado da bactria, com cada uma das duas fitas de DNA do fago, previamente separadas pela densidade, observou-se que o RNA s hibridizava com a fita mais pesada, demonstrando que, neste caso, somente uma das fitas do DNA era utilizada como molde para transcrio dos genes do fago SP8. Outros fagos pequenos apresentavam o mesmo comportamento. Em vrus maiores como o T4, qualquer uma das duas fitas pode ser transcrita, mas, num dado segmento de DNA, apenas uma das fitas utilizada como molde. Como determinado qual das duas fitas ser utilizada como molde? o posicionamento da RNA polimerase holoenzima, no segmento de DNA a ser transcrito, que define qual das fitas ser utilizada como molde, determinando o sentido da transcrio. Na Figura 6.9, a RNA polimerase caminha em sentidos opostos sobre os genes adjacentes A e B, implicando que fitas complementares esto sendo utilizadas como molde. O posicionamento da RNA polimerase, por sua vez, depende da configurao da regio promotora. As seqncias de nucleotdios a presentes, determinam o acoplamento e posicionamento da holoenzima (veja Reconhecimento do promotor).
Figura 6. 9. Transcrio utilizando fitas diferentes como molde. No segmento A, a fita "superior" ser utilizada como molde e a molcula de RNA produzida ter a mesma seqncia do segmento correspondente da fita "inferior". No segmento B, a fita "inferior" ser utilizada como molde e a molcula de RNA produzida ter a mesma seqncia do segmento correspondente da "superior".
Hbridos DNA/RNA na Transcrio

O incio da transcrio exige o rompimento localizado de algumas pontes de hidrognio entre as duas cadeias de DNA formando-se a bolha de transcrio, com cerca de 17 pares de bases, envolvida pela RNA polimerase. Conforme a RNA polimerase avana ao longo da fita molde, a dupla fita de DNA frente da bolha vai se abrindo enquanto, atrs da bolha, a fita enrola-se novamente. Na regio da bolha ocorre a formao de hbridos DNA/RNA,em funo do emparelhamento transitrio entre o segmento de RNA nascente e a fita de DNA que serve como molde. Geralmente, este hbrido abarca 2 a 10 pares de bases, o suficiente para dar estabilidade reao de pareamento do nucleotdio especfico. O emparelhamento DNA/RNA desfaz-se rapidamente com o avano da bolha de transcrio. A RNA polimerase, enquanto mquina protica de transcrio, executa diferentes funes: desenrola e enrola as fitas de DNA; mantm as fitas molde e codificadoras separadas no local de sntese; sintetiza o RNA. No est ainda claramente definida qual a contribuio de cada uma das subunidades da RNA polimerase neste processo inicial (Figura 6.10).
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Figura 6. 10. O DNA se desenrole localmente. A fita no-codificadora utilizada como molde no processo de transcrio. O transcrito produzido tem uma seqncia idntica da fita codificadora do DNA, apenas com substituio de T por U. Uma curta molcula hbrida DNA/RNA formada no local da bolha de transcrio.
RNA Polimerases
No processo de transcrio as RNA polimerases catalisam a formao de ligaes fosfodister entre ribonucleotdios, os quais so complementares aos desoxirribonucleotdios do molde (DNA). Isto implica que: A atividade desta enzima dependente da presena de DNA; O molde determina a ordem em que os ribonucleotdios sero adicionados via emparelhamento de bases onde uma purina forma pontes de hidrognio com uma pirimidina na seguinte combinao: A=U e G=C.
Os precursores imediatos na sntese de RNA so os ribonucleosdeos trifosfatados (ATP, GTP, CTP, UTP) que utilizam a energia armazenada na ligao pirofosfato de cada nucleotdio ingressante para estabelecer a ligao fosfodister entre os monmeros do RNA nascente. Esta reao necessita da presena dos ions Mg2+ e Zn2+. As RNA polimerases sempre adicionam ribonucleotdios ao polmero, via ligao fosfodister entre o terminal 3'-OH do polmero pr-existente e o fosfato do ribonucleosdio 5'-trifosfato ingressante, utilizando a energia armazenada no nucleosdio trifosfatado. O molde est orientado no sentido 3' 5' e a molcula de RNA nascente, no sentido 5'-->3', similar ao que ocorre no alongamento de uma cadeia de DNA. O sentido 5'-->3' da sntese de RNA pode ser comprovado experimentalmente. Se utilizarmos o inibidor 3' desoxiadenosina (cordicepina), um anlogo de adenosina que perdeu o oxignio no C3, haver uma parada na sntese de RNA assim que o anlogo for incorporado. Isto ocorre porque, no anlogo, o grupo 3OH est ausente, impedindo que se estabelea uma ligao fosfodister com potenciais ribonucleosdios trifosfatados ingressantes. Se o crescimento fosse pelo terminal 5'-trifosfato, o anlogo nem sequer seria incorporado j que, nele, no existe um oxignio reativo no C3. Neste caso, a sntese de RNA no seria inibida. Isto demonstra que a cadeia cresce do terminal 5' para o terminal 3' (Figura 6.11). Cristina M. Bonato 59

Figura 6. 11. O ribonucleotdio, selecionado pela sua capacidade de parear com o desoxirribonucleotdio comple-mentar na fita molde de DNA, adicionado ao terminal 3'OH da cadeia nascente com liberao de pirofosfato. A adio do anlogo 3'desoxiadenosina bloqueia o alongamento da cadeia, uma vez que no possui grupo 3'OH.
Uma das caractersticas das RNA polimerases que as distinguem das DNA polimerases a capacidade de iniciarem a sntese de uma molcula de cido nuclico na ausncia de um iniciador ou primer. Para iniciar a cadeia, a RNA polimerase liga os dois primeiros ribonucleotdios entre si, de acordo com sua complementaridade s bases da molcula de DNA, na fita molde. A DNA polimerase incapaz de realizar tal faanha, uma vez que ela s consegue adicionar novos nucleotdios a um polmero preexistente. Uma das conseqncias disto que a sntese de DNA requer primers de RNA (veja "Primers e primases"). Por outro lado, as RNA polimerases no fazem reviso do processo de transcrio, como fazem as DNA polimerases, durante o processo de replicao, corrigindo erros eventuais. Estima-se que uma base errada incorporada a cada 104 bases transcritas. Esta taxa de erro, todavia, pode ser tolerada porque uma grande quantidade de molculas de RNA sintetizada a partir de um gene; as molculas de RNA tem vida curta; muitas das substituies de aminocidos nas protenas so funcionalmente incuas. Assim, um erro ocasional no teria conseqncias graves, nem seria permanente. Se uma cpia foi sintetizada com erro, utiliza-se outra cpia. Do ponto de vista evolutivo, parece que sintetizar muitas molculas de RNA rapidamente mais interessante do que revisar cada uma das molculas que est sendo sintetizada.
RNA Polimerase de E.coli

Em E. coli a RNA polimerase uma protena multimrica constituda de cadeias polipeptdicas diferentes: b (beta), b' (beta linha), 2a (alfa) e s (sigma). A unio entre estas molculas assegurada por ligaes fracas. Quando todas estas molculas esto associadas, o complexo bb'a 2 s denominado RNA polimerase holoenzima (Figura 6.12, Quadro 6.2).
Figua 6. 12. Subunidades da RNA polimerase de E. coli: duas a (40.000 kDa), uma b (150.000 kDa), uma b' (160.000 kDa) e uma s (70.000 kDa). A subunidade s de 70.000 daltons a forma predominante na clula e tambm conhecida como s70. Todavia, outras formas de subunidades sigma so sintetizadas
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na clula e substituem a s70 em condies particulares. A determinao do stio correto de iniciao da transcrio depende das subunidades sigma. O processo de alongamento da cadeia de ribonucleotdios depende do stio cataltico existente na subunidade b.
Quadro 6. 2. Subunidades da RNA polimerase de E. coli
Subunidade
Gene Massa (d) rpoA rpoB rpoC rpoD ~40.000 ~150.000 ~160.000
Quantidade Funes possveis 2 1 1 montagem ligao dos nucleotdios ligao ao molde ligao ao promotor
'
32-92.000 1
A holoenzima tem um peso molecular aproximado de 450 kDa e apresenta uma forma alongada recobrindo cerca de 40 a 70 pares de nucleotdios no DNA. A associao da subunidade s ao complexo constituindo a holoenzima transitria, dissociando-se do agregado bb'a2 logo aps o incio da transcrio. O agregado bb'a2, denominado central enzimtica (core enzyme, em ingls), responsvel por catalisar as ligaes fosfodister para formao do polmero, independente da subunidade sigma, mas incapaz de iniciar a transcrio a partir do local correto. Para isto, depende da subunidade sigma.
A funo da subunidade s reconhecer o stio correto para o incio da transcrio. O processo de alongamento do polmero realizado pela central enzimtica e no pode ocorrer enquanto a subunidade s estiver presente. Qual a extenso do DNA ocupada pela RNA polimerase holoenzima? Isto pode ser determinado por digesto do DNA com nucleases como esquematizado na Figura 6.13.
Figura 6. 13. A RNA plimerase protege o segmento do DNA ao qual est ligada, contra a digesto pela DNAse I. Isolamento do DNA protegido e seu seqenciamento determinam o nmero de nucleotdios abrangidos pela RNA polimerase e identificam as sequencias de reconhecimento
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na regio promotora.
As nucleases so enzimas que digerem cidos nucleicos. Alguns tipos de nucleases so especficas para DNA (DNAses), outras para RNA (RNAses). Todavia, quando um segmento de cido nucleico est associado protenas, ele fica protegido da ao das nucleases. Baseado nisto pde-se estimar a extenso do DNA ocupada pela RNA polimerase.
Reconhecimento do Promotor
O processo de transcrio pode ser subdividido em quatro momentos fundamentais: reconhecimento do promotor, iniciao, alongamento e terminao. Cada uma destas fases est sujeita modulao via diversos mecanismos reguladores. Para que este processo ocorra necessrio, antes de mais nada, que a RNA polimerase identifique sinais especficos no DNA, os quais direcionaro a transcrio de genes especficos no momento adequado. A regio do gene que contem estas seqncias de reconhecimento o promotor. Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada nas regies promotoras de diferentes genes. por este motivo que os promotores so locais extremamente importantes no controle da expresso gnica. Analisando-se as seqncias de nucleotdios, de mais de 100 promotores diferentes de bactrias, observou-se que dois tipos de seqncias esto sempre presentes, centradas nas regies -10 e -35 do promotor. Apesar destas seqncias no serem perfeitamente idnticas entre os diferentes genes analisados, alguns nucleotdios so encontrados com maior freqncia do que outros, numa determinada posio, constituindo o que se denomina seqncia consenso. Dois consensos, com 6 nucleotdios cada, foram determinados a partir da anlise referida acima. A seqncia consenso -10, tambm conhecida como Pribnow box T77 A76 T60 A61 A56 T82. A seqncia consenso -35 T69 T79 G61 A56 C54 A54. Os ndices representam o percentual com que cada base encontrada entre os promotores analisados. Os consensos esto separados entre si por cerca de 16-18 nucleotdios em 90% dos casos analisados. A posio destas seqncias d orientao ao promotor e esta orientao direcionar a RNA polimerase holoenzima. Sem a subunidade s, a central enzimtica no pode iniciar a transcrio de modo especfico, mas pode alongar um transcrito pr-iniciado. Mutaes nas regies promotoras podem afetar o processo de transcrio. Regies promotoras cujas seqncias divergem muito do consenso so promotores fracos, pois sua afinidade pela holoenzima menor resultando num nmero menor de transcritos por unidade de tempo. Nas clulas bacterianas existem diferentes fatores s os quais so codificados por diferentes genes. Cada tipo de fator s reconhece seqncias especficas nas regies promotoras dos genes a serem transcritos. Dependendo da concentrao celular de um determinado s, um conjunto especfico de genes ser expresso. Uma vez que os diferentes fatores s diferem entre si pelo peso molecular (PM), convencionou-se denomin-los de acordo com seu PM. Quadro 6. 3. Seqncias -35 e -10 de alguns promotores de E. coli gene trp tRNAtyr lac 62 seqncia -35 TTGACA TTTACA TTTACA distncia seqncia -10 N17 N16 N18 TATGTT TATGAT TATGTT distncia +1 N5 N7 N6 A G A
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS recA araB, A, D bioB rrnA1 Consenso s70 Consenso s54 Consenso s28 TTGATA CTGACG TTGTAA TTGACT TTGACA CTGGNA CTAAA N16 N18 N17 N16 TATAAT TACTGT TAGGTT TATTAT TATAAT TTGCA CCGATAT N8 N6 N8 N6 A A T C -
Consenso s32 TxtCcCcTTGAA N13-15 CCCCATtTA
Em vermelho, as bases que diferem do consenso para s70, o qual est envolvido no metabolismo geral da clula. Genes cuja transcrio induzida por choque trmico so reconhecidos por s32. A expresso dos genes relacionados ao metabolismo de nitrognio controlada por s54. A expresso dos genes relacionados motilidade e quimiotaxia controlada po s28.
Iniciao da Transcrio
As taxas com que os genes so transcritos variam diretamente com a taxa com que seus promotores formam complexos de iniciao estveis com a holoenzima RNA polimerase. O fator s liga-se ao DNA somente enquanto subunidade da holoenzima. Sem ele, a central enzimtica associa-se inespecificamente a qualquer segmento do DNA, promovendo uma varredura da molcula ao deslizar sobre a fita at que o fator s encontre o stio promotor e ligue-se a ele fortemente, com uma constante de associao 1000 vezes superior da central enzimtica. Estabelece-se um complexo binrio (RNA polimerase/DNA) estvel ou complexo fechado. O fator sigma interage, via terminal carboxila, com as seqncias -10 e -35 do promotor. A regio central do fator sigma interage com a central enzimtica da RNA polimerase. A regio amino terminal do fator sigma tem funo reguladora, impedindo que o C-terminal interaja com o promotor na ausncia da central enzimtica. Aps a formao do complexo fechado ocorre a abertura local da dupla hlice (bolha), promovida pela RNA polimerase holoenzima, com o rompimento das pontes de hidrognio e a exposio de cerca de 17 bases em cada uma das fitas. Note que no consenso -10, reconhecido pelo s70, predominam nucleotdios de adenina e timina o que facilita a formao do complexo aberto, com a RNA polimerase articulada corretamente fita que ser utilizada como molde. Estabelece-se, ento, a primeira ligao fosfodister entre dois ribonucleotdios trifosfatados complementares s bases expostas na fita molde. Est constitudo o complexo ternrio: DNA, RNA polimerase holoenzima e RNA nascente (Figura 6.14).
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Figura 6. 14. Iniciao da transcrio: o fator s reconhece a seqncia do promotor e a subuni-dade adiciona os pri-meiros ribonucleot-dios sem necessidade de um primer.
Em seguida, a enzima move-se, dissociando-se da regio promotora, abrindo a dupla hlice mais frente e expondo novos nucleotdios. Este movimento acompanhado pela liberao do fator sigma provocando uma mudana conformacional na central enzimtica a qual se tornar apta a promover o alongamento da cadeia. S, ento, o promotor ficar disponvel para receber uma nova RNA polimerase holoenzima. Protenas ativadoras ou repressoras podem alterar a eficincia do processo de iniciao ao se ligarem seqncias especficas montante ou jusante do incio da transcrio (veja Regulao da Expresso Gnica).
Alongamento do Transcrito
A dissociao do fator s fundamental para que o processo de alongamento da cadeia ocorra, caso contrrio enzima permaneceria fortemente ligada ao promotor e no poderia deslocar-se sobre o DNA. Assim que o s liberado, a central enzimtica interage com a protena NusA que se mantm ligada central enzimtica at terminar a polimerizao. NusA influencia tanto o alongamento da cadeia como o processo de terminao e, aparentemente, serve de "ncora" para outros fatores que podem exercer papis especficos na transcrio (Figura 6.15). O processo de alongamento s termina quando a RNA polimerase encontra um sinal de terminao, que tambm, uma seqncia especfica de nucleotdios, na molcula de DNA. Neste ponto NusA dissocia-se e a enzima desliga-se do molde de DNA e do RNA nascente ficando livre para reassociar-se ao fator s disponvel e iniciar outro ciclo de transcrio.
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Figura 6. 15. Alongamento do transcrito: liberao do fator sigma e interao com NusA, permite o deslizamento da central enzimtica sobre a fita de DNA, at encontrar o sinal de terminao da transcrio
No processo de alongamento, a velocidade mdia de polimerizao de ~ 40 nucleotdeos/segundo/37oC. Consequentemente, uma cadeia de RNA com 6.000 nucleotdios sintetizada em aproximadamente 3 min. A hlice hbrida DNA/RNA formada durante o processo de curta durao porque as duas fitas do DNA voltam a se enrolar deslocando o segmento de RNA recm sintetizado. A extremidade 5' do RNA liberado fica, portanto, disponvel. Uma vez que em bactrias o material gentico no est compartimentalizado pela membrana nuclear os processos de transcrio e traduo podem estar acoplados e a extremidade 5' livre de uma molcula de mRNA poder ser imediatamente engajada no processo de traduo, mesmo antes do trmino da transcrio. Em eucariotos, as molculas de mRNA recm-sintetizadas precisam atravessar a barreira imposta pela membrana nuclear antes de alcanarem os ribossomos que se localizam no citoplasma, sofrendo uma srie de modificaes antes de serem exportadas para o citoplasma (veja Processamento ps-transcricional).
Terminao da Transcrio
Sinais de terminao so variados e o processo de terminao depende da formao de estruturas secundrias, em forma de grampo, na molcula de RNA nascente e/ou da participao de protenas auxiliares. H dois tipos de terminadores em E. coli: Rho-dependente e Rho-independente. Terminao Rho-independente: Neste caso, a terminao da cadeia cabe totalmente RNA polimerase, no dependendo de protenas auxiliares. As caractersticas de um terminador Rhoindependente so: Seqncias repetidas invertidas ricas em GC, na molcula de DNA, centradas entre 15 e 20 nucleotdeos do trmino. Cristina M. Bonato 65
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Uma srie de 6 ou mais As na fita molde que sero transcritas em Us no terminal 3' da fita de RNA. A presena de seqncias repetidas invertidas (auto-complementares) permite a formao de estruturas em grampo ou haste-ala (hairpin, stem-loop, em ingls) via emparelhamento dos segmentos complementares (Figura 6.16).
Figura 6. 16. Sinal de parada. Na fita molde, uma seqncia auto-complementar de ribonucleotdios seguida de uma srie de As. Aps a adio da srie de Us, forma-se um grampo entre as seqncias auto-complementares e a sntese do RNA pra.
Como funcionaria o processo de terminao, neste caso? Provavelmente, a formao de um grampo na molcula de RNA provoca uma pausa no movimento da RNA polimerase logo aps a transcrio da seqncia de As. A regio hbrida polidA/poliU, relativamente mais instvel, facilitando a expulso da fita de RNA e terminando o processo. Assim, a formao do grampo e a pausa da RNA polimerase so cruciais na terminao da transcrio. Se forem incorporadas bases alteradas nesta regio, afetando a formao do grampo, a terminao no ocorre. Terminao Rho-dependente: Em terminadores Rho-dependentes tambm encontrada uma regio de simetria dupla no terminal, porm ela apresenta baixa complementaridade entre as bases de sorte que um grampo "fraco" formado, no RNA, aps transcrio desta regio. Alm disto, no existe uma seqncia rica em As aps a dupla simetria. Neste caso, a parada da transcrio lana mo de uma protena auxiliar, Rho. A protena Rho um hexmero constitudo de seis unidades idnticas (~46kDa), com atividade de ATPase. Na presena de RNA liga-se ao mesmo e usa a energia de hidrlise do ATP em ADP + Pi, para deslizar sobre a molcula de RNA recm-transcrita, numa velocidade comparvel a do prprio processo de transcrio. Assim que o grampo fraco se forma no transcrito, ocorre uma pausa no movimento da RNA polimerase o que suficiente para permitir que a protena Rho alcance a polimerase aprisionando-a e provocando o desenovelamento do hbrido DNA/RNA com liberao final da enzima RNA polimerase. A habilidade de desenovelar o hbrido seria dada pela atividade de helicase da protena Rho . Os detalhes deste processo ainda no so conhecidos (Figura 6.17).
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Figura 6. 17. Terminao Rho-dependente. A pausa da RNA polimerase aps a formao do grampo fraco permite que a protena Rho alcance a enzima aprisionando-a e desenovelando o hbrido DNA/RNA.
Guia de Estudos
Qual a funo da b-galactosidase? Que evidncias levaram os pesquisadores a identificao do mRNA como molcula intermediria entre a informao contida no DNA e as mquinas de sntese protica? Quais os tipos de RNA? Quais suas funes principais? Quais as subunidades constituintes da RNA polimerase holoenzima de E. coli? Qual o tempo mdio gasto por uma bactria para sintetizar uma molcula de RNA de 2.000 nucleotdios? Qual o sentido de polimerizao de uma cadeia de RNA? Como ficou demonstrado que a cadeia de RNA cresce do terminal 5' para o 3'? Qual a funo da regio promotora? Qual a funo das subunidades sigma da RNA polimerase, em E. coli? Quais so as seqncias consenso reconhecidas pelo fator sigma? Quais as diferenas entre s70 e s32? Como determinado qual das fitas ser transcrita?
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quais os sinais, na molcula de DNA, reconhecidos pela RNA polimerase, como pontos de incio e pontos de trmino da transcrio? Explique. Uma unidade de transcrio pode conter mais do que uma unidade de traduo? O que so fatores de transcrio? Como se inicia a transcrio? Porque a dissociao do fator sigma importante no alongamento da cadeia de RNA? Quais as diferenas entre terminao da transcrio dependente de Rho e terminao da transcrio independente de Rho? Voc isolou um mutante de bactria que fabrica uma protena Rho termo sensvel: a protena funciona normalmente a 30oC mas no funciona a 40oC. Se voc cultivar a linhagem mutante, por um curto perodo de tempo, em ambas as temperaturas, e depois isolar o RNA recm sintetizado, em cada caso, que tamanho relativo voc esperaria para estas molculas? Explique. Diferente das DNA polimerases, as RNA polimerases no fazem reviso da sntese do RNA. Porque no seria to importante reparar os erros cometidos pela RNA polimerase? A seqncia de bases, abaixo, de uma molcula de DNA, foi transcrita em RNA: CCAGGTATAATGCTCCAGTATGGCATGGTACTTCCGGATC... Se T, em vermelho, a primeira base transcrita, determine a seqncia e polaridade no RNA; identifique o Pribnow box. A seqncia abaixo representa o incio de um gene de E. coli.O que os nucleotdios em vermelho poderiam estar indicando? Baseado nesta anlise, transcreva este segmento. Indique a polaridade do transcrito, a fita codificadora e a fita molde. Explique porque voc fez esta opo.
3' CCTCTTGTCAGGCCGGAATAACTCCCTATAATGCGCCACCACTAGCTAATCGTACACCTTAA 5' 5' GGAGAACAGTCCGGCCTTATTGAGGGATATTACGCGGTGGTGATCGATTAGCAUGTGGAATT 3'
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Captulo 7 PECULIARIDADES A TRANSCRIO EM

ARCHAEA, BACTERIA E EUKARYA
Organizao dos Genes em Operons

O mapeamento gentico em E. coli permitiu determinar que muitos dos genes com funes relacionadas, p. ex., os componentes de uma via biossinttica, esto agrupados numa regio especfica do cromossomo. Este grupo de genes transcrito numa nica molcula de RNA mensageiro (RNA polignico ou RNA policistrnico), e sua transcrio controlada por uma nica regio promotora. Dentro da regio promotora localiza-se uma pequena seqncia regulatria denominada operador, na qual se ligam protenas repressoras especficas que dificultam a transcrio dos genes quando seus produtos gnicos no so necessrios celula (vide Regulao da Expresso Gnica). Tais grupamentos de genes sob regulao de um nico promotor/operador so denominados operons, permitindo que os parceiros de uma mesma via metablica sejam ativados ou reprimidos em conjunto.(Figura 7.1).
Figura 7. 1. Organizao de um operon hipottico em E. coli. Os genes E, D, C, B e A codificam protenas cuja expresso comtrolada por um mesmo promotor, montante. Quando a protena repressora liga-se ao operador, no ocorre transcrio deste conjunto de genes. O segmento que compreende os genes mais a regio promotor/operador denominado operon.
Este tipo de organizao do genoma comum nos procariotos, tanto Archaea como Bacteria. Cerca de 30% do genoma bacteriano est organizado em operons. Em eucariotos este tipo de organizao mais rara. Os transcritos so, via de regra, monocistrnicos. Todavia, a estrutura opernica j foi identificada no nematide C. elegans (Zorio, 1994) e em tripanossomatdeos como T. brucei.
Processamento Ps-Transcricional
O produto imediato da transcrio, o transcrito primrio no , necessariamente, uma entidade funcional. Para se tornar funcional, a maioria deles precisa sofrer uma srie de modificaes que podem envolver adio ou remoo de nucleotdios ou ainda, modificao de alguns nucleosdeos especficos. Tanto o mRNA como o tRNA ou rRNA podem ser alterados de diferentes formas para se transformarem num RNA funcional. O conjunto das modificaes sofrida pelo transcrito primrio conhecido por processamento ps-transcricional.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A ausncia de compartimentalizao do genoma em procariotos permite que os processos de transcrio e traduo sejam acoplados de formas que, antes mesmo de terminar a transcrio a traduo j se inicia. Uma das conseqncias disto que, em geral, os mRNAs de procariotos no sofreriam modificaes. Nos eucariotos, os processos de transcrio e traduo esto temporal e espacialmente isolados. A transcrio do DNA ocorre no ncleo e a traduo no citoplasma. Os transcritos primrios que originaro mRNAs, na sua migrao do ncleo para o citoplasma, sofrem extensiva modificao antes de atravessarem a barreira imposta pela carioteca (Figura 7. 2). As modificaes que podem ocorrer nos transcritos nucleares so, basicamente de trs tipos: Coroamento ("capping") do terminal 5'; Poliadenilao do terminal 3'; Montagem de segmentos codificadores ("splicing").
Este conjunto de modificaes no transcrito nuclear originar o mRNA, pronto para migrar para o citoplasma. Transcritos originados na mitocndria ou cloroplastos no sofreriam tais modificaes, comportando-se de forma similar aos de bactrias.
Figura 7. 2. Nos Procariotos, transcrio e traduo ocorrem simultneamente. Em eucariotos, o transcrito primrio modificado dentro do ncleo e, s ento, migra para o citoplasma.
Coroamento do Terminal 5' ("Capping")

Assim que o terminal 5' do transcrito primrio liberado (em geral com cerca de 30 nucleotdios de extenso), um nucleotdio de guanina adicionado bloqueando o terminal. A ligao do nucleotdio de guanina se d via ligao fosfodister 5'- 5', uma reao pouco usual, formando a estrutura 3'-G-5'ppp5'-N-3'p. Em seguida um grupo metil adicionado posio 7 do anel de purina (7-metilguanosina). Esta estrutura denominada cap. Aps a formao do cap, o grupo 2'-OH da ribose metilado. O segundo acar da cadeia, no nucleotdio adjacente pode ser ou no metilado (Figura 7.3).
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Figura 7. 3. CAP no terminal 5' de molculas de RNA sintetizadas pela Pol II, que transcreve, especificamente, seqncias que originaro mRNAs em eucariotos. A letra N representa qualquer um dos 4 ribonucleotdios, se bem que, usualmente, o nucleotdio que inicia uma cadeia de RNA uma purina (A ou G). Imagina-se que as enzimas necessrias ao processo de adio do cap estejam associadas RNA pol II. Os transcritos das RNA Pol I e Pol III no tem cap.
Aparentemente esta estrutura metilada utilizada para ajudar na interao entre ribossomos e mRNA de forma tal que a traduo inicie-se no cdon AUG correto. Nos procariotos isto seria desnecessrio uma vez que, neste caso, os mensageiros possuem uma seqncia 5' complementar ao terminal 3' do rRNA 16S posicionando corretamente o mRNA nos ribossomos (veja Traduo). Outra funo que tem sido atribuda ao cap a de proteger o transcrito de degradao.
Poliadenilao do Terminal 3'

A adio de uma longa cauda de resduos de adenina (poli A) no terminal 3' tambm uma modificao sofrida por grande parte dos transcritos RNAPII. A cauda poli A, cerca de 200 resduos adenlicos, adicionada ao terminal 3' da molcula aps o trmino da transcrio (Figura 7.4). Inicialmente, uma endonuclease especfica reconhece a seqncia consenso AAUAAA, clivando o transcrito 11-30 nucleotdios jusante do consenso. A seguir, a enzima poli-A polimerase adiciona os resduos de adenina a partir do ponto de quebra. Vrias funes tm sido associadas cauda poli A: 1) poderia facilitar a exportao do mRNA do ncleo para o citoplasma; 2) poderia afetar a estabilidade do mRNA no citoplasma e, aparentemente, 3) importante na eficincia da traduo. Neste caso, o cap e a cauda poli A agiriam combinados, impedindo que se inicie a traduo de molculas de mRNA que no estejam intactas.
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Figura 7. 4. Poliadenilao do transcrito RNAPII. O stio AAUAAA reconhecido por uma endonuclease que cliva a molcula 11 a 30 nucleotdios jusante. A so adicionados resduos de Adenina pela enzima poli A polimerase. No h utilizao de molde para a sntese da cadeia de poli A.
Montagem do mRNA (Splicing)

Uma das caractersticas do genoma de eucariotos que os genes podem ser fragmentados. O que significa isto? Num segmento do DNA, correspondente a um gene que codifica uma determinada protena, so encontradas regies codificadoras (exons) alternando-se com regies no-codificadoras (introns). O transcrito resultante no funcional e s poder ser traduzido se for devidamente montado, descartando-se os introns e unindo-se os exons em seqncia ordenada. Este tipo de modificao do transcrito primrio denominado "splicing" (cortar e colar; montagem) e ocorre dentro do ncleo. O transcrito processado e pronto para migrar para o citoplasma, recebe o nome de RNA mensageiro. A descoberta de que os genes de eucariotos poderiam ser interrompidos ou fragmentados, foi realizada por Philip Sharp & Richard Roberts, em 1977, tendo lhes valido o prmio Nobel de 1993. Posteriormente, foram detectados genes interrompidos tambm em bactrias, porm como um evento raro tanto nos genomas indivduais como no prprio domnio Bacteria. Segmentos no codificadores so muito frequentes no genoma eucaritico. Ao contrrio do que ocorre nas bactrias, onde os genes esto mais compactamente organizados. Em eucariotos as distncias intergnicas so grandes e, dentro dos prprios genes a freqncia de introns alta. Em geral, os introns so muito mais extensos que os exons. O processo de remoo dos introns e unio dos exons ocorrem via reaes altamente especficas, em pontos de juno definidos, de sorte a garantir que a mensagem contida na seqncia de nucleotdios dos exons no seja alterada durante a montagem. O resultado da retirada dos introns pode ser visualizado quando o mRNA hibridizado com o segmento de DNA que lhe deu origem. As regies complementares entre mRNA/DNA pareiam, mas aquelas regies do DNA que correspondem aos introns no tm equivalente no mRNA e, portanto, formam-se alas de DNA fita simples, o que nos permite identificar o nmero de introns no gene (Figura 7.6). Existem diferentes mecanismos de retirada dos introns, podendo ser auto-suficientes (autosplicing) ou, ento, dependentes de partculas ribonucleoproticas (spliceossomos).
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Figura 7. 6. Alas formadas aps hibridizao do mRNA com a fita complementar de DNA que lhe serviu de molde.
Auto-Montagem ("Auto-splicing")
A auto-montagem (auto-splicing) do transcrito RNA pol II depende da configurao do prprio intron, uma vez que a prpria molcula de RNA que catalisar as reaes qumicas que culminaro na retirada de si prpria e na unio dos exons. Existem duas classes de introns que sofrem auto-splicing: introns do grupo I e do grupo II. Em ambos os casos, a reao de automontagem do mRNA implica em dois passos consecutivos de transferncia de ligao fosfodister de um ponto para outro, sem gasto de energia. Grupos hidroxila 2' ou 3' de uma ribose perpetuam um ataque nucleoflico a um fsforo, estabelecendo uma nova ligao, s custas da velha, mantendo o equilbrio energtico. Em introns do grupo I, o primeiro passo depende da presena de uma molcula de guanosina (GMP, GDP ou GTP), que no usada como fonte de energia, mas como nuclefilo. Em introns do grupo II o ataque nucleoflico perpetuado pelo 2' OH de um resduo de adenilato do prprio intron, sem necessidade de um cofator externo (Figura 7.7). Intron de grupo II tem sido detectado em bactrias, se bem que como evento raro (The Xylella fastidiosa Consortium, 2000 ; Ferat & Michel, 1993). O mecanismo de auto-splicing foi descoberto em 1982 por Thomas Cech e Sidney Altman, que receberam o prmio Nobel de 1988, ao demonstrarem que molculas de RNA podem apresentar propriedades catalticas. RNAs com atividade cataltica recebem o nome de ribozimas. A descoberta de ribozimas tem trazido uma grande contribuio para a compreenso da evoluo dos seres vivos no planeta, sugerindo que, provavelmente, as molculas de RNA precederam as de DNA neste processo.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS GRUPO I GRUPO II
Figura 7. 7. Reao de trans esterificao. Introns do grupo I: no primeiro passo, o 3' OH da guanosina estabelece uma ligao fosfodister 3', 5' com o terminal 5' do intron. No segundo passo, o grupo 3' OH livre do exon age como um nuclefilo no terminal 3' do intron. O resultado a exciso exata do intron e ligao dos exons. Introns do grupo II: um lao intermedirio formado entre a guanosina 5' terminal do intron e o 2' OH do adenilato interno, estabelecendo-se uma ligao fosfodister 2', 5'. O segundo passo similar ao do grupo I.
Spliceossomo
Nem sempre a montagem dos exons do tipo auto-splicing. Algumas vezes depende da ao de protenas e de RNAs nucleares pequenos (snRNAs, do ingls, small nuclear RNAs). Ao complexo de protenas especficas e de seus snRNAs, denomina-se snRNPs (pronuncia-se "snarps"). Diferentes snRNPs participam do processo de montagem de um transcrito primrio, constituindo a mquina ribonucleoprotica denominada "spliceossomo", a qual dirige a montagem do mRNA, dentro do ncleo. O "spliceossomo" sedimenta 60S, indicando que quase to grande quanto um ribossomo. De acordo com o seu tipo, as partculas snRNP recebem a denominao U1, U2, U4, U5 ou U6. As molculas de snRNA que participam dos diferentes snRNPs variam de tamanho entre 100 e 215 pares de base (pb). Funes especficas so atribudas a cada um dos tipos de partculas ribonucleoproticas. As reaes que culminam com a montagem do mRNA so reaes de trans esterificao, onde uma ligao fosfodister entre dois nucleotdeos no terminal 5' do intron transferida para um outro ponto no teminal 3' do intron, similar ao que ocorre no auto-splicing. Neste processo no h consumo de energia, uma vez que o nmero de ligaes ster-fosfato, na molcula, no alterado (Figura 7.8).
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Figura 7. 8. Esquema simplificado de splicing dependente de ribonucleprotenas. A montagem de transcritos da polimerase II catalisada pelo spliceossomo, um complexo ribonucleoprotico constitudo de U1, U2, U5 e U4/U6 entre outros componentes. Um OH reativo de uma purina localizada prxima ao stio 3' de splicing do intron, ataca o stio 5', clivando-o e liberando o terminal 5' do intron que se liga covalentemente purina, formando um lao (lariat). Em seguida, o 3' OH terminal do primeiro exon une-se ao incio do segundo exon, clivando o stio de splicing 3'. O intron liberado como um lao e os dois exons unem-se, em seqncia.
A marca registrada de eucariotos a presena de genes interrompidos, mas nem todos os genes eucariticos so interrompidos. P. ex., os mltiplos genes que codificam as diferentes histonas, protenas envolvidas no empacotamento do DNA em nucleossomos, ou os genes que codificam interferons, protenas produzidas por vertebrados contra infeco viral, no so, via de regra, interrompidos. Tambm no so interrompidos a grande maioria dos genes que codificam as protenas de choque trmico (HSPs), sintetizadas pela clula em resposta a condies adversas.
Genes Interrompidos e a Taxa de Evoluo

Porque a fragmentao dos genes um evento comum em eucariotos? Seria um resqucio da evoluo, hoje descartado pelas bactrias em funo de uma presso seletiva no sentido de tornar seu genoma o mais compacto possvel permitindo taxas mximas de reproduo ou estas interrupes foram adquiridas pelos eucariotos porque deveriam cumprir objetivos muito especiais? As evidncias em favor de uma ou outra alternativa no so conclusivas. De qualquer forma, as vantagens de genes interrompidos para o eucarioto poderiam ser elencadas como: Aumentar a taxa de recombinao entre genes e diminuir a probabilidade da juno recombinante cair dentro do exon, uma vez que, quanto maior a distncia entre dois segmentos Cristina M. Bonato 75
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS dados, maior a probabilidade de recombinao entre eles. Tais eventos permitem combinaes de diferentes domnios proticos (exons), aumentando a variedade de tipos de uma dada protena. Facilitar a duplicao de exons. H uma srie de exemplos de genes que contem dois ou mais exons que so muito semelhantes entre si. Tais exons provavelmente surgiram devido a crossingover desigual entre seqncias de introns, seguida por divergncia dos exons duplicados para prover novas funes. Os genes de imunoglobulinas e colgeno so um exemplo disto, apresentando mltiplas cpias de exons relacionados. Permitir que uma nova protena seja testada enquanto o organismo retm a expresso do produto original. Sabe-se que uma mutao pontual pode criar um novo sinal de juno 5' ou 3' para splicing do transcrito primrio. Durante o splicing, um stio de juno 3' pode unir-se a um dos dois (ou mais) stios de juno 5' (ou vice-versa), possibilitando que uma nica mensagem seja, agora, montada de duas formas diferentes, originando dois mRNAs diferentes. Assim, tanto a protena "velha" como a nova podero ser produzidas simultaneamente, independente de uma duplicao gnica anterior. Aparentemente, a presena de introns tanto maior quanto mais alto estivermos na escala evolutiva. Entre os eucariotos inferiores a freqncia de introns cai muito. Genes nucleares de levedura praticamente no possuem introns, apesar dos mesmos serem encontrados nos genes mitocondriais das leveduras. J em mamferos os introns no so encontrados nos genes mitocondriais mas so a regra entre os genes nucleares. Uma variante do splicing o trans RNA splicing, quando a montagem ocorre entre terminais de molculas de mRNA provenientes de dois genes diferentes.
Edio
O fenmeno de Edio do RNA consiste em adicionar ou deletar nucleotdios no mRNA antes do mesmo ser traduzido. Na maioria das vezes, as delees ou inseres so exclusivamente de Us. Este fenmeno comum nos mRNA mitocondriais de tripanossomos e depende da presena de um RNA guia (gRNA). O gRNA apresenta uma seqncia no inteiramente complementar ao mRNA que ser editado porque neste segmento do RNA guia esto presentes nucleotdios (As) ausentes no mRNA. Por causa disto o gRNA servir de molde para a insero de Us na fita do mRNA. (Figura 7.9). O interessante neste processo que o prprio gRNA o doador de Us, presentes em seu terminal 3'. A transferncia dos nucleotdeos de uridina do gRNA para o mRNA depende de duas reaes de trans esterificao.Vrios ciclos podem ocorrer, alterando a mensagem original.
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Figura 7. 9. Pareamento do gRNA ao mRNA e duas reaes consecutivas de trans esterificao que permitem a adio de um nucleotdo de uridina pareado ao nucleotdeo de adenosina do gRNA. Na primeira transferncia, o terminal 3' OH do gRNA ataca uma ligao fosfodister interna do mRNA pr-editado, gerando uma molcula linear 5' e um hbrido 3'-gRNA. Na segunda trans esterificao, o terminal 3' OH da molcula linear ataca a regio rica em Us do gRNA, liberando o gRNA e editando o mRNA.
RNA Polimerases em Eukarya e Archaea

Enquanto as bactrias utilizam apenas um tipo de RNA polimerase (RNAP) para transcrever todos os diferentes tipos de RNA encontrados na clula, os eucariotos necessitam de pelo menos trs tipos de RNA polimerases, especializadas na sntese de dos diferentes tipos de RNA: RNA polimerase I (RNAP I), para sintetizar rRNA; RNA polimerase II (RNAP II), para mRNAs e RNAs nucleares pequenos (snRNAs) e RNA polimerase III (RNAP III), para tRNAs, 5S RNA e outros RNAs pequenos. Estima-se que em uma clula de mamfero sejam encontradas 40.000 molculas de RNAP II, 40.000 de RNAP I e cerca de 20.000 de RNAP III. Nos procariotos estima-se que o nmero de molculas de RNAP seja 7.000/clula. As RNAP eucariticas so constitudas de vrias subunidades, cerca 10-15, que exercem funes especficas no processo de transcrio. O peso molecular varia de 500-700 kDa. As diversas enzimas eucariticas devem ter evoludo de uma mesma enzima ancestral a qual se especializou no decorrer do tempo, uma vez que as subunidades dos diferentes tipos apresentam similaridade entre si. Alm destas trs RNA polimerases nucleares, as clula eucariticas contem RNA polimerases separadas nas mitocndrias e nos cloroplastos. Nos Archaea, apenas uma RNAP transcreve todos os tipos de RNA, todavia, mais complexa do que a RNAP encontrada no domnio Bacteria. A RNAP arqueana constituda de 8-13 componentes, enquanto a RNAP bacteriana holoenzima apresenta as 4 subunidades centrais, (a2, b, b'), e o fator s, que reconhece o promotor. A maioria das subunidades arqueanas apresenta maior similaridade de seqncia com as subunidades da RNAP dos Eukarya do que de Bacteria (Keeling & Doolittle,1995). Em Archaea, as duas subunidades maiores da RNAP so denominadas A e B. A Cristina M. Bonato 77
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS subunidade A corresponde RpoC (b') de E.coli e RpoA da RNAP II de Eukarya. A subunidade B corresponde RpoB (b) de E. coli e RpoB da RNAP II de Eukarya (Brown & Doolitlle,1997). Uma distino importante entre as enzimas dos trs domnios o reconhecimento do promotor e incio da transcrio. Em bactrias, o fator de transcrio sigma, parte integrante da holoenzima, responsvel pelo reconhecimento do promotor. Diferentes sigmas reconhecem diferentes promotores. Em eucariotos, por sua vez, os fatores de transcrio, eTF (do ingls, eukaryotic Transcription Factor) no fazem parte da holoenzima. Ligam-se previamente ao DNA propiciando, ento, a ligao das RNA polimerases. Uma vez que existem trs tipos de RNA polimerases nos eucariotos, os eTF requeridos em cada caso tambm so diferentes e designados de acordo com a polimerase correspondente, ou seja: TFI, TFII e TFIII. Alguns destes fatores j foram isolados. Os fatores de transcrio TFI e TFII ligam-se montante dos stios de iniciao de transcrio e os TFIII ligam-se jusante. A expresso de genes que codificam protenas, os quais so transcritos pela RNAPII, dependem, de um modo geral, de trs classes de TFII: Fatores de transcrio gerais (GTF) ou basais, necessrios sntese de qualquer mRNA, selecionando o stio de iniciao (equivalente ao sigma em Bacteria) e contribuindo ao acoplamento da RNAPII; suportam nveis basais de transcrio (promotor basal). Nos Archaea so encontradas subunidades de fatores de transcrio bastante similares a dos TFII basais de Eukarya. Fatores de transcrio montante, os quais ligam-se seqncias montante, prximas do ponto de incio, estimulam ou reprimem a iniciao da transcrio pelo complexo RNAP II/GTF, modulando a expresso do gene. Estimuladores de transcrio (enhancers), os quais ligam-se seqncias especficas distantes do promotor basal, montante ou jusante e so necessrios mxima atividade dos promotores cognatos. Nos procariotos as seqncias reconhecidas por moduladores ou estimuladores esto, geralmente, prximas ao ponto de incio de transcrio do gene e so denominados elementos montante ou elementos UP (do ingls, upstream). Em Archaea os moduladores e estimuladores de transcrio so mais similares aqueles do domnio Bacteria.
Transcrio Basal em Eukarya

O incio da transcrio implica no reconhecimento do promotor pela RNA polimerase. No caso da RNAP II, em Eukarya, alguns tipos caractersticos de promotores so reconhecidos: TATA box ou Hogness box - seqncia consenso centrada aproximadamente na posio 25, rica em pares AT (T82A97T93A85A63A50), como os Pribnow box de E. coli. importante no posicionamento da RNAPII para iniciao da transcrio. Em ~75% dos casos, a primeira base a ser transcrita, nos genes contendo TATA box, uma purina, com predominncia de adenina. Estes promotores so caractersticos de genes expressos seletivamente em alguns tipos de clulas. Iniciador (Inr) - a maioria dos iniciadores apresentam um C na posio 1 e um A na posio +1. A seqncia ao redor do ponto de incio determina a fora do promotor. Um consenso, altamente degenerado, proposto para esta regio : Py Py A N T/A Py Py, onde A o ponto de incio (+1), Py pirimidina (C ou T) e N qualquer nucleotdio. GC box - em alguns genes, o incio da transcrio no est bem definido, podendo iniciar-se em qualquer ponto numa extenso varivel de 20 a 200 pb, da unidade de transcrio, gerando mRNAs com terminais 5' diversos. Em geral, estes genes contem uma regio rica em GC (2050 nucleotdios), posicionada entre 100200 pb montante do incio de transcrio, denominada GC Cristina M. Bonato
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS box. Genes que so expressos em todos os tecidos, denominados genes de rotina (housekeeping), costumam apresentar GC box. CCAAT box - elemento localizado -50 e -110, o qual, juntamente com o TATA box poderia ser o stio inicial de ligao da RNAPII e de outras protenas envolvidas na iniciao da transcrio. Transcrio basal pela RNAPII: Reconhecimento do promotor: depende de ligao prvia do fator de transcrio TFIID, o qual um complexo protico composto de vrias subunidades. Entre as subunidades do TFIID encontra-se a protena TBP ("TATA-Binding Protein"), a qual recebeu este nome por ter sido identificada, inicialmente, como ligante do TATA box.Todavia esta protena est sempre presente na mquina basal de transcrio atuando, tambm, em promotores que no contem TATA box. Ligao de outros fatores de transcrio ao complexo inicial, juntamente com a RNA polimerase II. Caminhada da RNA polimerase ao longo do gene: para tanto, a RNAPII precisa livrar-se dos fatores de transcrio, da mesma forma que a RNA polimerase de E.coli livra-se do sigma. O fator de transcrio TFIIH, uma serina/treonina protena quinase que fosforila o domnio carboxi-terminal da RNAPII um elemento preponderante neste desengate.
Figura 7. 10. Iniciao da transcrio. Da mquina protica de transcrio participam vrias protenas que se aglomeram numa seqncia especfica permitindo a ao da RNA polimerase II. Em mamferos, o terminal carboxila da RNAPII apresenta 52 repeties da seqncia YSPTSPS, onde os resduos de serina (S) e treonina (T) podem ser fosforilados por TFIIH.
Em Archaea foram encontrados homlogos dos fatores de transcrio eucariticos TFIIB e TBP, denominados respectivamente, TFB e aTBP. Alm disto os promotores de Archaea apresentam uma regio rica em A-T na posio -25 montante do incio de transcrio, que forma um complexo ternrio com aTBP e TFB, bastante similar estrutura encontrada em eucariotos. Os dados disponveis at o momento mostram que a maquinaria de transcrio basal partilhada por Archaea e Eukarya. A grande maioria dos componentes reguladores so partilhados por Archaea e Bacteria. Algumas protenas associadas transcrio so comuns aos trs domnios e, por causa disto, consideradas universais. Cristina M. Bonato
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Guia de Estudos
O que um operon? O que um RNA policistrnico? O que so introns e exons? Desenhe o produto de hibridizao DNA/RNA, gerado por um gene que contem 5 introns. Se o gene no tivesse introns, qual seria o produto de hibridizao? Que tipos de modificaes podem ocorrer em transcritos produzidos pela RNA polimerase II de eucariotos, antes de migrarem para o citoplasma? O que so ribozimas? Explique os tipos de auto-splicing que voc conhece. Como o spliceossomo funciona? Quais so seus componentes? Onde voc esperaria que se acumulassem mais mutaes, nos introns ou exons? Haveria vantagens em genes interrompidos? O que significa edio do mRNA? Desenhe uma molcula tpica de mRNA em bactrias e eucariotos. Marque todas as regies. Faa um quadro comparativo dos elementos e eventos chaves da transcrio em Archaea, Eukarya e Bacteria.
Captulo 8 O CDIGO GENTICO

Mutaes Gnicas e Protenas Alteradas
Como o DNA codifica a informao gentica? Desde a publicao de Watson & Crick (1953) sobre a estrutura do DNA e da carta de George Gamow a eles endereada, desenvolvendo a idia da existncia de um cdigo gentico onde o DNA serviria de molde para a sntese de protenas, muitas perguntas surgiram e vrios experimentos fascinantes foram realizados na tentativa de respond-las. 80 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Em 1957, Vernon Ingram mostrou que havia uma relao entre mutaes gnicas e protenas alteradas ao comparar a hemoglobina de indivduos normais com a de indivduos com anemia falciforme, caracterizada como uma doena molecular, por Linus Pauling em 1945. Pauling havia mostrado que a hemoglobina normal (HbA) apresentava uma carga aninica cerca de duas unidades mais negativa do que a da hemoglobina proveniente de clulas falcmicas (HbS). A hemoglobina, o pigmento dos eritrcitos, uma protena tetramrica, constituda de duas cadeias polipeptdicas a idnticas (141 aminocidos) e duas cadeias polipeptdicas b idnticas (146 aminocidos), cuja funo transportar oxignio atravs de todo o corpo. Indivduos com anemia falciforme apresentam eritrcitos em forma de foice, conseqncia da alterao conformacional sofrida pela molcula de hemoglobina, devido a uma mutao afetando o 6o aminocido da cadeia b onde cido glutmico substitudo por valina. A hemoglobina HbS, desoxigenada, agrega-se em filamentos suficientemente grandes para deformar os eritrcitos. A anemia falciforme j era conhecida como uma doena hereditria, de acordo com as leis da gentica Mendeliana, apresentando carter de codominncia ao nvel da molcula: HbA/HbA - clulas vermelhas normais; hemoglobina tipo HbA HbS/ HbS - clulas vermelhas em forma de foice; praticamente 100% da hemoglobina tipo HbS; geralmente a anemia fatal HbA/HbS- clulas vermelhas em forma de foice s ocorrem sob baixa concentrao de oxignio; curiosamente, os heterozigotos apresentam resistncia aumentada malria, o que confere uma vantagem seletiva a estes indivduos em regies onde a malria endmica; 40% da hemoglobina tipo HbS. As molculas de hemoglobina provenientes de um falcmico, quando submetidas a um campo eltrico, migram diferente das normais devido a diferena de carga entre elas, resultante da troca de um aminocido com carga negativa por um aminocido apolar (Figura 8.1).
Figura 8. 1. A) Clula normal de eritrcito e clula falcmica. B) Relao entre uma mutao geneticamente transmissvel, que provoca anemia falciforme, e migrao da hemoglobina num campo eltrico. No mutante, o cido glutmico, que possui carga negativa, foi substitudo por valina, um aminocido apolar, modificando as interaes intramoleculares que se refletem na conformao da protena que perde a capacidade de transportar oxignio.
Assim, no segmento da cadeia b, onde esta mutao pode ocorrer, a sequncia de aminocidos da hemoglobina normal (A), Val His Leu Thr Pro Glu Glu substituda pela seqncia Val His Leu Thr Pro Val Glu da hemoglobina falcmica (S). Que tipo de alterao ocorrera na molcula de DNA provocando a substituio de um aminocido por outro na protena? Por esta poca, nada se sabia sobre a natureza do Cdigo Gentico e vrias propostas estavam sendo feitas e analisadas pelos pesquisadores. Cristina M. Bonato 81
Caractersticas do Cdigo Gentico

O Cdigo Gentico a frmula que converte a informao hereditria dos genes em protenas. Uma seqncia de bases poderia especificar uma seqncia de aminocidos de diferentes maneiras. J que existem s 4 bases diferentes para os 20 tipos de aminocidos encontrados nas clulas, a combinao de algumas bases seria necessria para especificar cada um dos aminocidos. A esta combinao de bases especificando um determinado aminocido, d-se o nome de cdon. De quantas bases seria constitudo cada cdon? Uma combinao dos quatro tipos de bases, dois a dois, seria insuficiente para especificar todos os aminocidos, j que 42 = 16. Assim, uma combinao de bases trs a trs seria minimamente necessria, j que 43 = 64. Todavia, num cdigo de trincas, ou 44 cdons no especificariam nenhum aminocido ou ento, cada aminocido poderia ser especificado por mais de um cdon. Neste caso, o cdigo seria degenerado. Assumindo-se que o cdon uma trinca, como as trincas estariam organizadas para codificar protenas? Haveria ou no sobreposio das trincas? Observe a Figura 8.2: se houvesse sobreposio, a trinca ABC codificaria o primeiro aminocido, BCB o segundo, CBD o terceiro, e assim sucessivamente; no havendo sobreposio o primeiro aminocido seria codificado pela trinca ABC, o segundo por BDA, o terceiro por DCB, etc.
Figura 8. 2. Sobreposio ou no sobreposio de codons. No caso de sobreposio de codons, uma mu-dana em C poderia alterar os aminocidos 1, 2 e 3 emquanto, no caso de no sobre-posio, uma mudana em C afetaria apenas o aminocido 1.
Existiria pontuao na leitura do cdigo? Ou seja, na seqncia: ABC, BDA, DCB, ACD........ as vrgulas entre os cdons seriam representadas por uma das bases, por uma combinao delas ou, simplesmente, no existiriam? Como identificar o incio e o fim das seqncias a serem "lidas"? A resposta a estas questes foi resultado do trabalho intensivo de Crick, Brenner e colaboradores no final dos anos 50 e incio dos 60, culminando com a demonstrao de que o Cdigo Gentico lido a partir de um ponto fixo, no tem vrgulas, no se sobrepe, est organizado em trincas e degenerado. Abaixo, o primeiro pargrafo do trabalho publicado em 1961 por Crick e colaboradores, acerca das propriedades do cdigo: "There is now a mass of indirect evidence which suggests that the amino-acid sequence along 82 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS the polypeptide chain of a protein is determined by the sequence of the bases along some particular part of the nucleic acid of the genetic material. Since there are twenty common amino-acids found throughout Nature, but only four common bases, it has often been surmised that the sequence of the four bases is in some way a code for the sequence of the amino-acids. In this article we report genetic experiments which, together with the work of others, suggests that the genetic code is of the following general type: A group of three bases (or, less likely, a multiple of three bases) codes one amino-acid. The code is not of the overlapping type. The sequence of the bases is read from a fixed starting point. This determines how the long sequences bases are to be correctly read off as triplets. There are no special 'commas' to show how to select the right triplets. If the starting point is displaced by one base, then the reading into triplets is displaced, and thus becomes incorrect. The code is probably 'degenerate'; that is, in general, one particular amino-acid can be coded by one of several triplets of bases."
Os Cdons So Lidos Sem Sobreposio

A anlise das seqncias de protenas mutantes obtidas de clulas tratadas com diferentes agentes qumicos levou ao entendimento de como agiam os mutagnicos utilizados e de como o cdigo gentico funcionava. As evidncias de no sobreposio vieram dos trabalhos realizados por alguns pesquisadores que estudavam mutaes produzidas no vrus do mosaico do fumo (TMV), por ao de cido nitroso. O cido nitroso um agente mutagnico que causa desaminao das aminas aromticas e, portanto, pode converter citosina em uracil e adenina em hipoxantina. A conseqncia disto que, na prxima duplicao, uracil parear com adenina e, portanto, a guanina que originalmente deveria estar naquela posio teria sido substituda por adenina, redundando na troca do par G-C por A-T, como esquematizado a seguir.
Se o cdigo fosse sobreposto, alm de restringir o tipo possvel de vizinhos para cada aminocido, a alterao de uma base geraria mudanas em aminocidos adjacentes da cadeia polipeptdica (Figura 8.2). Todavia, ao seqenciarem as protenas mutantes da capa do vrus, os pesquisadores observaram que apenas um aminocido, por vez, era alterado como resultado do tratamento com cido nitroso. Alm disso, todas as hemoglobinas humanas anormais estudadas em detalhe at ento, mostraram alteraes em um nico aminocido levando a concluso de que os cdons so lidos sem sobreposio.
Os Cdons So Lidos a Partir de um Ponto Fixo, Sem Vrgulas

As evidncias sobre a leitura contnua das trincas esto descritas no trabalho de Crick, Brenner e colaboradores, onde analisaram uma mutao induzida por proflavina no bacterifago T4.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Proflavina um agente mutagnico que intercala na molcula de DNA provocando deleo ou insero de nucleotdios. O fago T4 um fago ltico, ou seja, quando infecta a bactria E. coli provoca lise celular produzindo milhares de partculas fgicas (vide Transferncia de informao gentica em bactrias). Tratamento com proflavina, provoca uma mutao no fago T4, designada FC0, localizada no gene rIIB. O gene rIIB controla a morfologia das placas de lise. Mutantes FC0 no multiplicam-se no hospedeiro E. coli K12, mas multiplicam-se em E. coli B, produzindo placas de lise muito maiores que as produzidas pela linhagem selvagem do fago, a qual multiplica-se nas duas hospedeiras, E. coli B e K12 (Figura 8.3).
Figura 8. 3. Os pontos claros marcam os locais onde partculas fgicas individuais se multiplicaram resultando na lise das bactrias destas regies. Estas regies so denominadas placas de lise. A inativao do produto gnico rIIB provoca uma lise rpida das bactrias, produzindo-se placas de lise maiores que as do selvagem. O gene foi nomeado r, por causa da lise rpida observada nos mutantes.
Os pesquisadores haviam observado que proflavina gerava mutantes completamente no funcionais para o gene em questo, diferindo da ao dos anlogos de base que, ao substituirem uma base por outra, no comprometem totalmente a funo dos genes. O fato da proflavina provocar ausncia completa de funo sugeria que, provavelmente, no estava ocorrendo substituio de bases mas sim insero ou deleo de nucleotdios, desorganizando a leitura dos cdons a partir do ponto do evento (Figura 8.4). Considerando que uma mutao tenha sido produzida pela insero de uma base na seqncia selvagem, ento, a leitura direita da insero, estaria deslocada de uma base e geraria um produto completamente alterado da para frente, o que explicaria a ausncia de funo em mutantes produzidos pela ao de proflavina. Portanto, a retomada da fase de leitura dependeria da deleo de um nucleotdio.
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Figura 8. 4. Cada uma das letras A, B e C representa uma base diferente do cido nuclico. Para simplificar est representada uma seqncia repetida de bases ABC, codificando um polipeptdio onde todos os aminocidos so idnticos. A fase de leitura, a partir de um ponto inicial, est representada pelos col-chetes, implicando que a leitura feita em conjuntos de trs partir da esquerda. Com a adio do nucleotdio C (+), a leitura saiu de fase, s retomando com a deleo de outro C (-) mais frente.
Partindo do mutante FC 0 (placas grandes de lise), resultante do tratamento com proflavina, buscaram por indivduos que tivessem revertido para o fentipo selvagem (placas pequenas de lise), readquirindo a capacidade de infectar as duas linhagens de E. coli. A idia era que, para reverter ao fentipo selvagem, deveria ocorrer adio ou deleo de um nucleotdio no momento da replicao, dependendo se a mutao original fora causada por uma deleo ou insero, respectivamente. Isolaram 18 revertentes da mutao FC 0. Observaram ento que, nos revertentes, ocorriam inseres ou delees em posies diferentes, porm no muito distantes das originais. A nova mutao era antagnica original, permitindo que o fentipo mutante fosse suprimido. Assim, se a mutao FC 0 fosse uma insero, a mutao supressora seria uma deleo. Uma mutao que suprime o efeito da outra dentro de um mesmo gene provoca uma supresso intragnica. A explicao dada pelos autores ao fenmeno observado foi a seguinte: uma seqncia de bases lida, trinca a trinca, a partir de um ponto fixo localizado esquerda, sem nenhuma pontuao entre elas, ou seja, livre de vrgulas.
O Cdigo Gentico Constitudo de Trincas e Degenerado

Nos fagos revertentes FC0 a morfologia das placas de lise varivel porque depende da regio compreendida entre as duas mutaes. Esta regio est fora de fase, o que implica na codificao de aminocidos diferentes do selvagem, neste segmento (vide Figura 8.4). Dependendo das alteraes sofridas por este segmento, o produto sintetizado no revertente ser mais semelhante ou menos semelhante ao do selvagem, resultando nas diferentes morfologias das placas de lise. Quando duas mutaes de mesmo tipo (+,+) ou (-,-) so combinadas, sempre ocorre alterao no quadro de leitura. Porm, quando trs mutaes de mesmo tipo so combinadas, o fentipo selvagem pode ser restaurado. Estas observaes confirmavam a hiptese de que o cdigo gentico representado por trincas. Indicavam tambm que cada uma das 64 trincas possveis poderiam codificar um aminocido e, portanto, o cdigo degenerado.
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Figura 8. 5. A adio ou a deleo de trs nucleotdios recupera o qua-dro de leitura.
O Gene Colinear ao Peptdio que Ele Codifica

A demonstrao pontual de que a seqncia de cdons corresponde exatamente a seqncia de aminocidos na protena foi feita no incio dos anos 60. Um dos grupos de pesquisa envolvidos na resoluo deste problema isolou e analisou uma srie de mutantes do gene trpA, de E. coli, o qual codifica a enzima triptofano sintetase (Charles Yanofsky et al, 1964). Esta enzima, constituda de 286 resduos de aminocidos, converte indol glicerol fosfato em triptofano. Mutantes neste gene no sintetizam triptofano. Uma vez que, nesta poca, ainda no estava desenvolvida a tcnica de seqenciamento gnico, para saber a posio de cada nucleotdio no gene, Yanofsky e colaboradores fizeram um mapeamento gentico usando a tcnica de transduo. Transduo o processo de transferncia de informao gentica de uma bactria para outra via fago. Quando uma bactria infectada por um fago e, em seguida, lisada, algumas (1/1000) das partculas fgicas produzidas podero carregar um fragmento do cromossomo bacteriano (veja Transferncia da informao gentica em bactrias). Tais partculas fgicas (fagos defectivos) podem injetar este segmento de DNA em outra clula bacteriana. Uma vez que o cromossomo da clula infectada pelo fago defectivo contem um fragmento homlogo de DNA, ser possvel a recombinao entre o segmento carregado pelo fago e aquele presente no cromossomo da bactria. A freqncia de recombinao entre os diferentes mutantes trpA permitiu construir um mapa determinando-se a posio das diferentes mutaes no gene trpA (mapa gentico). Por outro lado, para saber qual a alterao causada pelas mutaes, em cada uma das protenas mutantes, foi utilizada a tcnica de impresso digital (fingerprint) ou mapa peptdico. Esta tcnica consiste em purificar a protena, cliv-la com enzimas proteolticas para obter peptdios e 86 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS separ-los por eletroforese e cromatografia. A posio ocupada pelos fragmentos peptdicos durante a migrao no suporte de separao, depende dos aminocidos que os constituem. Os fragmentos que contiverem o aminocido alterado migraro de forma diferente do selvagem, posicionando-se num ponto especfico do suporte (spot). Os spots (manchas) so ento cortados e eludos do suporte onde se encontram. Em seguida a seqncia de aminocidos de cada um determinada. O sequenciamento das manchas com migrao alterada, nos diferentes mutantes, permitiu desenhar o mapa peptdico. Os resultados mostraram que a posio das mutaes no gene correspondia posio ocupada pelos aminocidos alterados, na cadeia polipeptdica (Figura 8.6).
Figura 8. 6. Colinearidade do gene trpA e cadeia polipeptdica a, da triptofano sintetase, por ele especificada. Em vermelho esto especificadas as substituies ocorridas nos diferentes mutantes analisados.
Conclui-se, ento, que a seqncia de aminocidos na protena pode ser lida diretamente a partir da seqncia de nucleotdeos no gene. Posteriormente, a descoberta de que os genes podem ser fragmentados, apresentando regies codificantes (exons) e no-codificantes (introns), alertava para o fato da colinearidade estava restrita aos mdulos codificadores, uma vez que os introns no so traduzidos. Aps determinar as propriedades do Cdigo Gentico restava elucid-lo, ou seja, descobrir qual era o significado de cada uma das possveis 64 trincas. A que aminocido cada uma delas correspondia? Atualmente, como o cdigo j foi desvendado e a tcnica para seqenciamento de genes j est automatizada, possvel seqenciar genomas inteiros e identificar todos os segmentos passveis de codificarem protenas atribuindo-se a cada um destes fragmentos de DNA a seqncia putativa de aminocidos nele codificada. Segmentos de DNA que contem informao potencial para codificar um peptdio so denominados quadros de leitura aberta ou ORFs (do ingls, Open Reading Frames).
Decifrando o Cdigo Gentico: Homopolmeros e Copolmeros Aleatrios

Em 1955, Grunberg-Manago & Ochoa, isolaram da bactria Azobacter vinelandii, uma enzima capaz de juntar ribonucleotdios na reao esquematizada abaixo, onde NDP representa um ribonucleosdio difosfato: (RNA)n + NDP (RNA)n+1 + Pi
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Esta enzima, denominada polinucleotdio fosforilase, no utiliza um molde para sintetizar a nova molcula, ligando aleatoriamente os ribonucleosdios difosfatados disponveis. Difere, portanto, da RNA polimerase. Se apenas um tipo de ribonucleosdio estiver disponvel, sintetizar um homopolmero. Conhecendo esta enzima, Nirenberg e Matthaei sintetizaram trs tipos de homopolmeros de RNA: poli U, poli A e poli C. Com estes homopolmeros fizeram ensaios de sntese protica "in vitro". Em 20 tubos de ensaio contendo os requisitos necessrios sntese proteica, adicionavam um dos homopolmeros e uma mistura de 19 aminocidos no marcados + 1 marcado radioativamente, que era diferente em cada tubo. O homopolmero poli U (mRNA poli U), recuperava uma quantidade significativa de radioatividade no precipitado protico do tubo que recebera fenilalanina (Phe) radioativa. Logo, UUU cdon para Phe. Nos casos de mRNA poli A e mRNA poli C, precipitado protico radioativo foi encontrado, respectivamente, em presena de lisina (Lys) e prolina(Pro) marcadas. Assim, AAA especifica lisina Lys e CCC especifica Pro. Para elucidar o significado das outras trincas foram sintetizados copolimeros aleatrios, misturando-se a enzima polinucleotdio fosforilase com quantidades diferentes de cada tipo de nucleotdio. Por ex., ao misturar 76% de U e 24% de G, a probabilidade de uma trinca desta mistura ser UUU 0,76 x 0,76 x 0,76 = 0,44. UUG, UGU ou GUU (2 UU e 1 G) 0,76 x 0,76 x 0,24 = 0,14 para cada uma das configuraes possveis. GGG 0,24 x 0,24 x 0,24 = 0,01 (Tabela 8.1). A utilizao de diferentes copolmeros permitiu que se inferisse os cdons para alguns aminocidos e comprovou o fato do cdigo ser degenerado. Tabela 8. 1. Incorporao de aminocidos estimulada por um copolmero aleatrio de U e G numa razo molar 0,76:0,24. GGG
Cdon UUU UUG, UGU, GUU UGG, GUG, GGU GGG
a
Probabilidade de Incidncia Ocorrncia Relativa 0,44 0,14 para cada 0,04 para cada 0,01 100 32 9 2
Aminocido Phe
Quantidade Relativa aminocido incorporado 100
de
Leu ou Cys Leu 36; Cys 35; Val 37 ou Val Trp ou Gly Trp 14; Gly 12 -
Incidncia relativa aqui definido como 100 x probab. ocorrncia/0,44. Adaptado de Voet & Voet, 1995, pg 964.
Ligando Trincas Especficas aos tRNAs

Em 1964 Nirenberg & Leder verificaram que trincas de nucleotdios so capazes de promover a ligao de aminoacil-tRNAs especficos aos ribossomos. Utilizaram um filtro de nitrocelulose cujos poros eram suficientemente pequenos para impedir a passagem dos ribossomos mas no dos aminoacil-tRNAs livres. Quando o aminoacil-tRNA liga-se ao ribossomos, fica retido no filtro. Os ensaios foram feitos em tubos contendo ribossomos, uma dada trinca e uma mistura de tRNAs 88 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS carregados com seus respectivos aminocidos, sendo que apenas um dos amincidos daquela mistura estava marcado radioativamente. O aminoacil-tRNA complementar trinca liga-se a ela. Este procedimento foi repetido para os vinte aminocidos (Figura 8.7). Cerca de 50 cdons foram determinados neste ensaio de ligao.
Figura 8. 7. Ensaio de ligao do tRNA trinca especfica. Uma trinca de ribonucleodios associa-se ao ribossomo e captura o aminoacil-tRNA cognato. Este complexo no atravessa o filtro de nitocelulose. Os aminoacil-tRNAs no ligados atravessam o filtro. No tubo contendo o aminoacil-tRNAcognato, marcado radioativamente, ser possvel detectar radioatividade aprisionada ao filtro.
A resoluo do Cdigo finalmente foi completada por Khorana, utilizando poliribonucleotdos de trincas conhecidas e repetidas em seqncia. P.ex., num poli UGC, trs homopolmeros diferentes poderiam ser especificados, uma vez que a leitura do polmero pelos ribossomos pode acontecer em trs fases possveis (UGC UGC UGC UGC ou GCU GCU GCU GCU ou CUG CUG CUG CUG), gerando homopeptdios de cistena, alanina ou leucina (Figura 8.8).
Figura 8. 8. Um mRNA pode ser lido em qualquer um dos trs quadros de leitura, gerando, em cada caso, um polipeptdio diferente.
Cdons de Terminao e Iniciao

A utilizao de tetranucleotdios repetidos permitiu a identificao dos cdons de terminao. Analise os trs copolmeros abaixo: No caso A) gerado um polipeptdio onde 4 aminocidos se repetem em seqncia: Tyr(Y).Leu(L).Ser(S).Ile(I). Nos casos B) e C) so gerados apenas tripeptdeos com as composies de aminocidos Ile(I). Asp(D). Arg(R) e Val(V). Ser(S). Cristina M. Bonato 89
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Lys(K), respectivamente. Isto porque UAG e UAA so sinais de parada da sntese protica. UGA outro sinal de parada. Os cdons de terminao UAA, UAG e UGA so denominados cdons sem sentido (nonsense) porque so os nicos cdons que no especificam nenhum aminocido. Freqentemente so denominados ochre (UAA), amber (UAG) e opala (UGA). O cdon AUG inicia a cadeia polipeptdica na maioria dos casos. GUG um iniciador mais raro. Estes mesmos cdons so encontrados em posies internas do gene, especificando metionina (AUG) e valina (GUG). Algumas variaes em torno da regra so encontradas (veja Universalidade do Cdigo Gentico). A sntese de protenas a partir dos polmeros sintticos acima descritos como, p. ex., UUU, que no possui o iniciador, acontece "in vitro", sob condies muito altas de Magnsio, bastante diferente das condies fisiolgicas.
Tabela do Cdigo Gentico

O arranjo da tabela do cdigo no aleatrio, porque basea-se em propriedades do cdigo. O cdigo altamente degenerado, sendo que trs aminocidos, Arg, Leu e Ser podem ser especificados por 6 cdons cada. Os outros so especificados por 4 ou 2 cdons. Somente metionina e triptofano so especificados por um nico cdon. So trs os cdons de terminao. Cdons que especificam o mesmo aminocido so denominados sinnimos. A maioria dos sinnimos difere apenas na 3a posio e, assim, esto agrupados na mesma caixa da Tabela, exceto os que possuem 6 cdons e, portanto, ocupam mais de uma caixa. Assim, mutaes na 3a posio, em geral, no provocam mudanas de aminocidos sendo fenotipicamente silenciosas. Cdons com pirimidinas na 2a posio codificam, em geral, aminocidos hidrofbicos (verde). Cdons com purinas na 2a posio codificam, em geral, aminocidos polares. Observando estes cdons verifica-se que se os cdons codificando os aminocidos hidrofbicos F, L, I e V, sofrerem mudanas na 1a ou 3a posio continuaro codificando aminocidos com caractersticas similares de sorte a preservar o funcionamento da protena resultante. Aparentemente o cdigo evoluiu de modo a minimizar os efeitos deletrios das mutaes. A maioria das mutaes que levam a substituio de um aminocido por outro na cadeia polipeptdica so provocadas pela mudana de uma nica base, ou seja, num nico ponto do polmero de cido nuclico e, por esta razo so denominadas mutaes de ponto. Acredita-se que grande parte das variaes genticas observadas entre indivduos de uma populao humana (polimorfismo) seja decorrente de alteraes em um nico nucleotdio no gene, recebendo a denominao SNP, do ingls single nucleotide polymorphism.
Tabela do Cdigo Gentico 1a posio U UUU U UUC UUA UUG C CUU CUC Phe(F) Leu(L) Leu(L) UCU UCC UCA UCG CCU CCC Pro(P) Ser(S) C UAU UAC UAA UAG CAU CAC 2a posio A Tyr(Y) TERM His(H) UGU UGC UGA UGG CGU CGC G Cys(C) TERM Trp(W) Arg(R) U C A G U C 3a posio
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CUA CUG AUU A AUC AUA GUU G GUC GUA GUG Val(V) Ile(I) CCA CCG ACU ACC ACA GCU GCC GCA GCG Ala(A) Thr(T) CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Gln(Q) Asn(N) Lys(K) Asp(D) Glu(E) CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG Gly(G) Ser(S) Arg(R) A G U C A G U C A G
AUG Met(M) ACG
A Universalidade do Cdigo
O fato de ser possvel traduzir genes de um organismo em outro, p. ex., genes humanos, em E. coli, sugeria que o cdigo padro apresentado na tabela 8.2 era universal. Todavia, o estudo de diferentes seqncias de DNA a partir dos anos 80 revelaram algumas divergncias em relao ao padro. Por exemplo, em mitocndrias de mamferos o cdon para a Met iniciadora pode ser AUG ou AUA (Ile no padro); UGA especifica Trp e no terminao; AGA e AGG especificam terminao e no Arg. Nas mitocndrias de plantas, fungos, Drosfila e protozorias, tambm ocorrem variaes em relao ao padro. Nos protozorios ciliados, os cdons UAA e UAG, ao invs de especificarem parada, codificam Gln. Alm disto, foi relatado em Candida spp (Santos et al, 1997), eucariotos unicelulares, a existncia de cdons polissmicos, isto , um cdon codificando mais de um aminocido. No caso citado, CUG codifica tanto Leu como Ser, denotando ambigidade e nos remetendo as seguintes questes: 1) em Candida, as alteres no Cdigo Gentico ainda no estariam completamente estabelecidas, ou 2) a ambiguidade CUG seria vantajosa, permitindo rpida adaptao a desafios ambientais, devendo ser mantida como tal. Estas so algumas das evidncias de que o cdigo gentico padro, se bem que amplamente utilizado, no universal. Ainda, em relao utilizao de cdons, o seqenciamento dos genomas nos permitiu verificar que existe uma preferncia por determinados cdons de acordo com os grupos taxonmicos. A preferncia de cdons (codon usage, em ingls) nos permite fazer conjecturas acerca da origem de determinados genes dentro de um grupo taxonmico. Mais recentemente podese verificar preferncia de cdons dentro de um mesmo genoma dependendo do posicionamento dos genes. Em Borrelia burgdorferi , genes localizados na fita lder (leading) de duplicao do DNA apresentam uma preferncia diversa daqueles localizados na fita lenta (lagging), revelando um novo paradigma para seleo de cdons em procariotos (McInerney, 1998). Genes sobrepostos: O fato dos cdons serem lidos sem pontuao e de cada cdon ser uma trinca, permite, em princpio, que qualquer seqncia de nucleotdios apresente trs fases potenciais de leitura. Logo, uma dada seqncia poderia codificar at trs polipeptdios diferentes. Este tipo de organizao do genoma foi encontrado no fago fX174, onde a seqncia de um gene est completamente contida na seqncia de um gene maior, lido em outro quadro de leitura e codificando protenas no relacionadas (Figura 8.8). Em bactrias pode-se observar sobreposio nos terminais de genes que pertencem ao mesmo operon: o terminal de um gene sobrepe-se ao incio do prximo. Mas, sobreposio completa de um gene s foi detectada em fagos pequenos de Cristina M. Bonato 91
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS DNA fita simples, como fX174. Este tipo de organizao permite o uso mximo daquela quantidade de DNA, que a quantidade disponvel para ser empacotada em seus capsdios.
Figura 8. 8. Regio do genoma de fX174. Note que o gene B est completamente contido em A. Tambm, o gene E est completamente contido em D. Alm disto, os terminais dos genes D e E sobrepem-se a seqncia controle de iniciao da trado do gene J. Logo, este pequeno segmento do DNA executa uma tarefa tripla.
Guia de Estudos
Qual o polipeptdio especificado na fita molde de DNA, abaixo? Assuma que a traduo se inicia no primeiro cdon de iniciao transcrito. 5TCTGACTATTGAGCTCTCTGGCACATAGCA3 A seqncia abaixo um mRNA: 5 - CGAUGCGAACCACGUGAUAAGCAU - 3 Transcreva a fita molde indicando seu sentido Transcreva a fita codificadora indicando seu sentido Deduza a seqncia de aminocidos, indicando o terminal amino e carboxila Deduza a seqncia de aminocidos caso haja a insero de um A, no incio da cadeia de mRNA.
Qual seria a seqncia possvel de um mRNA que codificasse o polipeptdeo abaixo? (Indique as variaes) His - Thr - Glu -Asp - Trp - Leu - His - Gln Asp Quais as propriedades do cdigo gentico? A impresso digital (fingerprinting) de uma protena de um mutante fenotipicamente revertente do fago T4 indica a presena de um peptdio alterado em relao ao selvagem: Selvagem: Cys-Glu-Asp-His-Val-Pro-Gln-Tyr-Arg Mutante: Cys-Glu-Thr-Met-Ser-His-Ser-Tyr-Arg Explique como surgiu o mutante e d as seqncias, sempre que possvel, dos mRNAs que especificam os dois peptdios. Quais so os aminocidos especificados por cdons que, com uma nica mutao de ponto mudam para um cdon mbar (UAG)? 92 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O mRNA especificando a cadeia a da hemoglobina humana contem a seqncia: ........UCCAAAUACCGUUAAGCUGGA......., que codifica o tetrapeptdio C-terminal da cadeia anormal: Ser-Lys-Tyr-Arg. Numa hemoglobina mutante, a seqncia correspondente a esta regio : Ser-Lys-Tyr-Arg-Gln-Ala-Gly... Que tipo de mutao provocou esta alterao? Um segmento de uma protena normal e de trs mutantes aparece abaixo: Normal: gly, ala, ser, his, cys, leu, phe.... Mutante 1: gly, ala, ser, his Murante 2: gly, ala, ser, leu, cys, leu, phe Mutante 3: gly, val, ala, ile, ala, ser Qual a provvel seqncia de bases no RNA normal? Uma protena normal tem histidina numa dada posio. Quatro mutantes foram isolados com os seguintes aminocidos na posio da histidina: tirosina, glutamina, prolina ou leucina. Quais os possveis cdons para estes aminocidos e qual era, provavelmente, o cdon utilizado para histidina?
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Captulo 9 TRADUO EM BACTRIAS

A Molcula Adaptadora
A molcula de tRNA preenche todas as caractersticas da molcula adaptadora proposta por Crick, necessria ocorrncia da traduo: carrega um aminocido, que a se ligou por ao enzimtica e reconhece o cdon correspondente por complementaridade de bases (Figura 9.1). Desta forma, a funo do tRNA assegurar que cada um dos aminocidos incorporados na protena corresponda ao seu cdon particular na molcula de mRNA.
Figura 9. 1. Hiptese do adaptador.
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Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A primeira molcula de tRNA a ser seqenciada foi tRNAAla, de leveduras, em 1965. A partir de ento, centenas de molculas de tRNA de diferentes organismos j foram seqenciadas. A molcula de tRNA pode ser representada na forma de uma folha de trevo, resultante de pareamento intramolecular, produzindo trs estruturas tipo haste/ala e uma haste, caracterizando os quatro braos da molcula (Figura 9.2). No brao aceptor de aminocido, algumas bases dos terminais 3 e 5 da molcula esto pareadas, deixando livre a seqncia 5CCA 3 que constante em todos os tipos de tRNAs. Ao grupo 3 OH ou 2OH livre do adenilato terminal conecta-se o aminocido especfico. Oposto ao brao aceptor encontra-se o brao do anticdon, ou seja, os 3 nucleotdios complementares ao cdon da molcula de mRNA. O brao DHU posiciona-se prximo ao terminal 5. O brao TyC posiciona-se prximo ao terminal 3. Entre o brao TyC e o brao do anticdon, encontra-se um brao de tamanho bastante varivel quando se comparam os diferentes tRNAs. Este brao no est presente em todos os tRNAs (brao extra). Um grande nmero de bases nos tRNAs so modificadas aps a sintese da molcula gerando diidrouridina (D), pseudouridina (y), inosina, metilguanosina, etc. No est claro qual a funo destas modificaes. Algumas foram associadas restrio ou expanso no reconhecimento do cdon. Outras seriam necessrias como elementos identificadores, para as aminoaci-tRNA sintetases. Os cromossomos de E. coli contem aproximadamente 60 genes para tRNAs, alguns dos quais participam dos operons de rRNA. Os outros encontram-se agrupados em diferentes posies do cromossomo e o transcrito inicial pode incluir vrios tRNAs. Nos eucariotos so encontradas vrias centenas de genes para tRNAs, espalhados no genoma.
Figura 9. 2. Estrutura planar e estrutura terceria do tRNA. Em geral apresentam 76 nucleotdios, variando na faixa de 60 a 95 (18 a 28kDa). Anlises de cristalografia sugerem que as molculas de tRNA assumem uma estrutura terceria na forma de um L, onde o brao aceptor e o brao TyC constituem uma perna do L e os braos D e do naticdon, constituem a outra perna. Variaes nesta estrutura so encontradas nos tRNAs mitocondriais de mamferos, flagelados e nematides, incidindo sobre os braos D e T.
Os transcritos iniciais dos tRNAs apresentam seqncias extras nos terminais 3 e 5 as quais so retiradas por diferentes RNases. A RNase P, que atua no terminal 5 dos tRNAs uma ribozima, encontrada em procariotos e eucariotos (ncleo, mitocndria e cloroplastos). Esta ribozima apresenta um componente ribonuclico e um componente protico, mas o RNA que, de fato, possui atividade cataltica. Cristina M. Bonato 95
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Muitos transcritos primrios para tRNAs de eucariotos contem introns adjacentes ao brao do anticdon, os quais so excisados antes da molcula migrar para o citoplasma. Outra caracterstica de eucariotos que os tRNAs so transcritos sem a seqncia CCA tpica do terminal 3 de todos os tRNAs, a qual ser adicionada posteriormente, pela enzima tRNA nucleotidil transferase, utilizando CTP e ATP como substrato. A quantidade, dentro da clula, de cada espcie de tRNA isoaceptor varia de acordo com o organismo. interessante observar que esta quantidade est associada preferncia dada por um organismo na utilizao de certos cdons. Ou seja, tpico de cada organismo a preferncia de cdons dentre os vrios possveis num sistema degenerado. Quanto maior a quantidade de tRNAs para estes cdons, maior ser a eficincia de traduo dos mesmos.
Hiptese Oscilatria
Nem sempre necessrio um pareamento perfeito entre as bases, na interao cdonanticdon. Se isto fosse imprescindvel, as clulas deveriam possuir 61 tipos de tRNAs, correspondentes aos 61 cdons. Todavia, as clulas contem apenas cerca de 30 a 40 tRNAs diferentes em bactrias e ~50 em eucariotos. Portanto, no existe um tipo de tRNA para cada cdon. Por exemplo: O tRNAPhe com o anticdon 5GmAA3, pode parear com 5UUC3 e 5UUU 3 (lembre-se que as fitas so antiparalelas); O tRNAAla, com o anti-cdon 5IGC3, pode parear com 5GCU3, 5GCC3 e 5GCA3. Para explicar como o anticdon de um dado tRNA pode reconhecer cdons degenerados Crick props a hiptese oscilatria (wobble)(Crick, 1966). Analisando o cdigo gentico, observa-se que a 3a base do cdon menos restritiva que a 1 a e a 2a. Ele assumiu que os dois primeiros pares cdon-anticdon, obedeciam o pareamento normal Watson-Crick. O 3o par, todavia, podia apresentar oscilao no pareamento. Quando U, G ou I ocupam a 1a posio do anticdon, podem ser reconhecidos dois ou trs cdons, com variao na 3a posio (Tabela 9.1). Tabela 9.1 Pareamentos permitidos na 3a posio Base 5' - anticdon C A U G I Base 3' - cdon G U A ou G U ou C U, C ou A
As Aminoacil tRNA Sintetases

As enzimas aminoacil tRNA sintetases so responsveis pela ligao correta de cada aminocido a seu tRNA correspondente. Em E. coli existe uma amino acil tRNA sintetase, pelo menos, para cada um dos 20 tipos de aminocidos (p. ex., arginil t-RNA sintetase - ArgRS, leucil t96 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS RNA sintetase - LeuRS, etc). Uma enzima particular reconhece um aminocido particular e todos os tipos de tRNAs que transportam aquele aminocido (Como o cdigo gentico degenerado, existem diferentes cdons para leucina, p. ex., que sero reconhecidos por diferentes anti-cdons e, portanto, diferentes tRNAs). Em eucariotos existe um conjunto de pelo menos 20 diferentes aminoacil t-RNA sintetases nucleares e um outro conjunto mitocondrial. Uma vez que todas estas enzimas exercem o mesmo papel, ou seja, "carregar" o t-RNA com o aminocido correto e, considerando-se que os diferentes tipos de tRNAs tem estrutura bastante similar, esperava-se que as enzimas tambm apresentassem uma estrutura similar. Todavia, este no o caso. Elas so um grupo bastante heterogneo, variando de protenas monomricas tetramricas. Os diferentes tipos de amino acil tRNA sintetases pertencem a duas classes, I e II, de acordo com sua habilidade de conectar o aminocido, respectivamente, ao grupo 2OH ou 3OH do adenilato livre no terminal 3 da molcula. Geralmente, a face interna (cncava) do L que interage com as aminoacil t-RNA sintetases. As evidncias atuais so de que os identificadores de cada um dos tipos de tRNA encontram-se no brao aceptor e na ala do anticdon (Figura 9.3).
Figura 9. 3. Interao do tRNA com a enzima aminoacil tRNA sintetase (AARS)
Acoplando o Aminocido ao tRNA Especfico

Para carregar um tRNA especfico com o aminocido correto duas reaes consecutivas, catalisadas pela mesma aminoacil t-RNA sintetase so necessrias, utilizando-se energia de hidrlise de uma molcula de ATP: Ativao do aminocido ao reagir com ATP, gerando aminoacil adenilato (aminoacil-AMP) + PPi; Ligao do aminoacil-AMP ao tRNA, gerando aminoacil-tRNA + AMP.
Cristina M. Bonato
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O processo de aminoacilao do tRNA altamente especfico. Se o aminocido errado (nocognato), ligar-se ao tRNA, a seqncia de aminocidos ficar alterada uma vez que o reconhecimento do aminoacil tRNA via pareamento cdon-anticdon. Este fenmeno foi demonstrado experimentalmente da seguinte forma: um resduo de cistena ligado ao tRNACys, cisteinil-tRNACys, foi modificado para alanina, tornando-se alanil-tRNACys (Figura 9.4).
Figura 9. 4. Demonstrao experimental de que o pareamento codonanticdon direcio-na a adio de aminocidos ativados durante a sntese protica.
No momento da sntese "in vitro", o alanil-tRNACys agrega alanina aos polipeptdios em resposta ao cdon de cistena no mRNA, de sorte que, no polipeptdio, alanina passa a ocupar posies que deveriam ser ocupadas por cistena. Isto significa que somente o anticdon do aminoacil-tRNA participa do processo de reconhecimento do cdon, sem qualquer envolvimento do aminocido. Assim, a traduo correta do cdigo gentico em protenas depende de dois eventos de reconhecimento por parte do tRNA: reconhecer o aminocido ativado e reconhecer o cdon equivalente no mRNA.
Ribossomos, as Mquinas Tradutoras

O processo de sntese protica est confinado complexas e abundantes estruturas ribonucleoproticas denominadas ribossomos, s quais se agregam, transitoriamente, tRNAS e mRNAs. O confinamento das molculas envolvidas no processo de sntese torna-o extremamente eficiente. 98 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Os ribossomos de E. coli so partculas esferides de ~250 , com coeficiente de sedimentao 70S e massa aproximada de 2,5 x 106 Da. Estas partculas so formadas por duas subunidades desiguais. A subunidade pequena (30S) constituda de uma molcula de rRNA 16S e 21 tipos de protenas. A subunidade grande (50S) constituda das molculas de rRNA 23S e RNA 5S mais 31 protenas diferentes (Figura 9.5). Por conveno, as protenas das subunidades grande e pequena so designadas, respectivamente, com os prefixos L (do ingls, Large) e S (do ingls, Small), seguidas de um nmero indicativo de sua posio no gel aps corrida eletrofortica em duas dimenses. A seqncia de aminocidos de todas as 52 protenas ribossmicas de E. coli j est determinada, uma vez que o genoma j foi completamente sequenciado. A maioria das protenas ribossmicas rica nos aminocidos bsicos Lys e Arg, contendo poucos resduos aromticos, o que era de se esperar de protenas interagindo intimamente com molculas polianinicas como o RNA. O rRNA 16S consiste de 1542 nucleotdios com pareamento intramolecular, determinando uma estrutura secundria complexa com 4 domnios bastante conservados. A estrutura da molcula de RNA determina sua interao com as protenas ribossmicas e a prpria conformao da subunidade ribossmica pequena. O rRNA 5S constitudo de 120 nucleotdios e o 23S de 2904 nucleotdios.
Subunid. grande, 50S Massa: 1590 kDa RNAs: 23S e 5S Protenas: 31
Subunid. pequena, 30S Massa: 930 kDa RNA: 16S Protenas: 21
Ribossomo, 70s Massa: 2520 kDa RNAs: 23S, 16S, 5S Protenas: 52
Figura 9. 5. A subunidade pequena combina-se com a subunidade grande formando o ribossomo completo (70S)
Os ribossomos de eucariotos (80S) so maiores e mais complexos que os de E. coli. A subunidade pequena (40S) constituda de ~ 33 protenas e de uma molcula de rRNA 18S (1900 nucleotdios). A subunidade grande (60S) constituda de 3 espcies de rRNA: 28S (4.800 nucleotdios); 5,8S (160 nucleotdios) e 5S (20 nucleotdios). Cerca de 50 protenas fazem parte desta subunidade. Os cloroplastos e mitocndrias tambm possuem ribossomos, os quais assemelham-se aos de bactria. Se bem que a seqncia primria de cada tipo de rRNA varie consideravelmente entre diferentes organismos, a estrutura secundria que acabam adotando muito similar em todos os casos analisados.
Os Estgios da Traduo
Trs estgios podem ser considerados no processo de sntese protica: iniciao, alongamento e terminao.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A iniciao implica na ativao do aminocido iniciador. O aminocido iniciador a metionina, cujo cdon AUG (cdon de iniciao). Uma vez que o aminocido iniciador sempre uma metionina, a iniciao requer a presena de metionil-tRNAMet. Existem dois tipos de tRNAMet. Um deles, o tRNAiMet, inicia a cadeia, o outro tRNAMet, incorpora metionina na cadeia crescente. A mesma aminoacil-tRNA sintetase acopla metionina aos dois tipos de tRNA, mas somente o metioniltRNAiMet pode se ligar subunidade pequena do ribossomo para iniciar a sntese protica. Em bactrias, o grupo amino da metionina do metionil-tRNAiMet modificado pela adio de um grupo formil sendo, algumas vezes, designado formilmetionil-tRNAfMet ou fMet-tRNAfMet. A enzima responsvel pela formilao utiliza N10-formil tetrahidrofolato como doador do grupo formil (Fig. 9.6).
Figura 9. 6. Estruturas da Metionina e N-formil metionina. Em vermelho, o grupo formil.
Em E. coli, o stio de iniciao da sntese protica, na molcula de mRNA, identificado pela interao do terminal 3 do rRNA 16S, da subunidade pequena, com o terminal 5 da molcula de mRNA a ser traduzida. Uma seqncia de nucleotdios no terminal 5 do mRNA, denominada seqncia Shine-Dalgarno (a dupla de pesquisadores que a identificou), parcialmente complementar a uma seqncia do terminal 3 do rRNA 16S, rica em pirimidinas (Shine & Dalgarno, 1974). A seqncia Shine-Dalgarno, no mRNA, est centrada a cerca de 10 nucleotdios do ponto de incio da traduo. O pareamento entre as duas molculas no absoluto e devem ser considerados pares G.U.
mRNA da replicase do fago Qb mRNA da prot. ribos. L10 mRNA do trp leader Terminal 3' do 16S rRNA 5' UAAGGAUGAA-(5 nucl.)- AUG...3' 5' CAGGAGCAAA -(4 nucl.) - AUG ...3' 5' AAAGGGUAUC - (4nucl.) - AUG ...3' 3' AUUCCUCCAC - (~1400 nucl.) - 5'
Em E. coli, a interao inicial entre a molcula de mRNA, a subunidade pequena do ribossomo e o fMet-tRNAfMet forma o complexo de iniciao de traduo. Tal interao facilitada por protenas que se associam transitoriamente aos ribossomos conhecidas pelo nome genrico de fatores de iniciao da traduo (IF1, IF2 e IF3). Apesar da sntese protica sempre iniciar com metionina, este aminocido no encontrado no terminal amino de todas as protenas funcionais uma vez que modificado ou removido aps a sntese.
O Complexo de Iniciao da Traduo

Ribossomos intactos (70S) no se ligam a novos mensageiros para iniciar a sntese protica. necessrio que as subunidades se dissociem. A formao do complexo de iniciao da traduo (Figura 9.7) requer os seguintes passos: 100 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O fator de iniciao da traduo, IF3, liga-se partcula 70S propiciando a dissociao das duas subunidades. IF1 aumenta a taxa de dissociao. O mRNA e o fMet-tRNAfMet ligam-se subunidade 30S, assessorados por IF3. O acoplamento do fMet-tRNAfMet ao mRNA exige energia, cedida por GTP, e assistncia do fator IF2 (IF2-GTP + fMet-tRNAfMet). Forma-se o complexo 30S de iniciao: subunidade ribossmica 30S, mRNA, IF3, IF1, IF2GTP e fMet-tRNAfMet).
Figura 9. 7. Iniciao da sntese protica em E. coli.
A subunidade ribossmica grande, 50S, acopla-se ao complexo 30S, aps liberao do fator IF3. O acoplamento estimula IF2 a hidrolisar GTP a GDP + Pi, provocando rearranjo conformacional na subunidade 30S que resulta na liberao dos fatores IF1 e IF2. Na iniciao da sntese protica, o fMet-tRNAfMet ocupa o stio ribossmico P enquanto o stio ribossmico A est posicionado para receber o aminoacil-tRNA ingressante cujo anticdon seja complementar ao cdon imediatamente adjacente ao iniciador AUG.
Alongamento da Cadeia de Aminocidos

O alongamento da cadeia (Figura 9.8) implica na adio consecutiva de resduos de aminocidos aos terminais carboxila do polmero em crescimento, de sorte que o polipeptdio cresce no sentido amino ao carboxila, colinear ao 5 > 3 mRNA. Este processo que ocorre na Cristina M. Bonato 101
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS velocidade de 40 resduos/s exige a presena de trs fatores de alongamento (EF-Tu, EF-Ts e EF-G) e da energia cedida por molculas de GTP:
Figura 9. 8. Ciclo de alongamento nos ribossomos de E. coli
O aminoacyl-tRNA liga ao stio A, formando um complexo ternrio com EF-Tu e GTP. EFTu uma GTPase porque hidrolisa GTP a GDP + Pi. A energia liberada permite o pareamento do cdon ao anticdon, ligando este complexo ao ribossomo. A seguir EF-Tu.GDP + Pi so liberados. O complexo EF-Tu.GDP reciclado pelo fator de elongao EF-Ts, que substitui GDP por GTP restaurando EF-Tu-GTP o qual voltar a capturar novos aminoacil-tRNAs. A enzima peptidil transferase faz a ligao peptdica entre fMet-tRNAfMet, localizada no stio P, e o aminoacil-tRNA ingressante, localizado no stio A. Nesta reao a formil metionina deslocada para o stio A, ligando-se ao aa-tRNA a presente. Este processo denominado transpeptidao. A atividade de peptidil transferase reside no rRNA 23S, portanto, uma ribozima. O tRNAfMet descarregado transferido para o stio E do ribossomo e depois descartado. O peptidil-tRNA, no stio A e o mRNA a ele acoplado por interaes cdon/anticdon, movem-se para o stio P, num processo denominado translocao. Neste momento o ribossomo est pronto para os ciclos subsequentes de alongamento. O processo de translocao exige a participao do fator EF-G + GTP que liga-se ao ribossomo e s ser liberado aps hidrlise do GTP. Uma vez que o stio de iniciao foi liberado, um segundo ribossomo pode ligar-se ao ponto de incio.
Terminao da cadeia de aminocidos

MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A traduo de mRNAs termina nos cdons de terminao UAA, UGA ou UAG. Neste momento, os polipeptdeos produzidos so liberados no citoplasma da clula. Em E. coli, os cdons de terminao, os nicos que no possuem um tRNA correspondente, so reconhecidos por fatores de liberao ou RF (do ingls, release factors). RF-1 reconhece os cdons UAA e UAG. RF-2 reconhece UAA e UGA. O fator RF-3, uma GTPase, quando complexada GTP estimula a ligao de RF1 ou RF-2 ao stio A do ribossomo. A ligao do RF ao cdon de terminao apropriado induz peptidil transferase a transferir o peptidiltRNA para a gua, ao invs de um aatRNA. Com a liberao do peptdeo, o tRNA presente no stio P fica descarregado e expelido do ribossomo. Tambm so descartados os RF, aps hidrlise de GTP a GDP + Pi pela GTPase RF3 e o mRNA, o qual ser degradado (Figura 9.9). Em eucariotos um processo similar ocorre mas requer apenas um fator de liberao denominado eRF, o qual reconhece os tres cdons de terminao. Liga-se ao ribossomo junto com a molcula de GTP. A hidrlise do GTP dissocia o fator do ribossomo
Figura 9. 9. Terminao da traduo em E. coli. RF1 reconhece os cdons de termi-nao UAA e UAG. RF2 reconhece UAA e UGA.
Polissomos
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Tanto em bactrias como em eucariotos, os ribossomos lem a molcula de mRNA no sentido 5 > 3 e a cadeia polipeptdica cresce do terminal amino para o carboxila. Micrografias eletrnicas revelam que os ribossomos engajados no processo de sntese protica localizam-se na molculas de mRNA, um em seguida do outro, como as contas de um colar, numa freqncia de 1 ribossomo a cada 80 nucleotdios. O complexo mRNA, ribossomos ativamente engajados na sntese protica e polipeptdeos nascentes denominado polissomo ou polirribossomo(Figura 9.10).
Figura 9. 10. Sntese protica em um polissomo. O mRNA mensageiro ocupado por vrios ribossomos. Cada um sintetiza uma cadeia polipeptdica completa, conforme vai deslizando sobre a molcula de mRNA.
Os polissomos so uma evidncia de que o stio de iniciao da traduo imediatamente ocupado por outro ribossomo assim que o ribossomo inicial desliza sobre a molcula de mRNA liberando o ponto de incio.
Chaperones Moleculares
Conforme uma cadeia polipeptdica emerge do ribossomo, associa-se protenas especiais denominadas chaperones moleculares cuja funo permitir que os polipeptdios recm-sintetizados adquiram sua estrutura final ativa. Os chaperones moleculares ajudam no enovelamento das protenas ao interagir com o peptdio nascente, impedindo interaes esprias com outras molculas, o que poderia interfirir na conformao final da protena (Ellis & van der Vies, 1991). Uma dada seqncia de aminocidos pode se enovelar, potencialmente, em diferentes estruturas. Muitas destas estruturas poderiam ser no-funcionais e/ou altamente instveis. O papel dos chaperones moleculares seria ajudar os peptdeos encontrarem um estado funcional estvel. O termo chaperone molecular foi utilizado pela primeira vez, para descrever a funo da nucleoplasmina na montagem ordenada dos nucleossomos. Quando DNA e histonas de Xenopus eram misturados sob condies fisiolgicas de fora inica, ocorria precipitao das molculas. Todavia, se nucleoplasmina fosse adicionada mistura, formavam-se os nucleossomos. A nucleoplasmina requerida apenas para a montagem dos nucleossomos, no participando do produto final. Ela tambm no carrega nenhuma informao estrica para a montagem dos nucleossomos. Esta informao est contida nas histonas. Assim, os chaperones moleculares agem sem modificar covalentemente seu substrato e sem participar do produto final. Uma srie de eventos celulares relativos a enovelamento, oligomerizao, transporte e degradao de protenas, em diferentes tipos de clulas dependem da participao das mquinas chapernicas moleculares, compostas de um chaperone molecular principal (o qual se liga promiscuamente cadeias polipeptdicas nascentes, desenoveladas ou agregadas) e um conjunto de outros chaperones (crte), cuja funo seria aumentar a eficincia do processo e permitir a reciclagem (Georgopoulos, 1992). Cada ciclo de enovelamento requer energia provida por molculas de ATP. Vrios dos chaperones conhecidos so protenas de choque trmico, ou seja , protenas cuja expresso induzida em resposta elevao de temperatura. Um dos papis presumido para protenas de choque trmico seria o de proteger a clula reparando os danos provocados pelo calor. Protenas desnaturadas pelo calor poderiam ser re-enoveladas na forma apropriada por ao dos chaperones Cristina M. Bonato
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS moleculares (Hartl et al., 1994). Os chaperones moleculares so encontrados tanto em bactrias como em rqueas e eucariotos e so protenas altamente conservadas na evoluo.
tmRNAs
O tmRNA bacteriano assim denominado devido sua dupla natureza: tipo tRNA e tipo mRNA. Este RNA tambm conhecido pela denominao 10Sa RNA ou SSrA. O tmRNA est envolvido num processo notvel trans-traducional. Sua funo adicionar uma etiqueta polipeptdica no C-terminal de peptdeos incompletos, prisioneiros dos ribossomos. Porque estes peptdios estariam aprisionados? Alguns mRNAs podem ter sido danificados e perderam seus cdons de parada. Nestas circunstncias, os fatores RF, de liberao dos peptdios, no podem associar-se aos ribossomos. Cria-se uma situao de bloqueio. Os ribossomos esto aprisionados ao polissomo; os peptdios nascentes continuam acoplados ao peptidil-tRNA. Uma vez que estes peptdios no terminaram de ser traduzidos, mesmo que sejam liberados no sero funcionais e, portanto, conveniente para a clula que eles sejam degradados. A etiqueta adicionada pelos tmRNA um sinal para as proteases degradarem tais peptdeos (Keiler et al., 1996). O terminal 3' da molcula de tmRNA apresenta similaridade com o brao T de molculas de tRNA e sempre est associado a um resduo de Alanina. Na ampla ala que se forma, antes do caule (Figura 9.11), encontra-se uma seqncia de cdons especificando a etiqueta (Tag) que sinaliza para protelise. A etiqueta constituda dos resduos de aminocidos (A)ANDENYALAA, em E. coli. O tmRNA reconhece ribossomos com traduo bloqueada e ocupa o stio A. O peptdio nascente transferido para o resduo de alanina no terminal 3' do tmRNA. O mRNA danificado descartado e substitudo pela seqncia de cdons do tmRNA. A sntese protica recomea e continua at encontrar um cdon de parada convencional. Assim, o tmRNA promove a destruio de produtos muito pequenos do processo de traduo, uma vez que, em bactrias, mRNAs danificados no so discriminados e entram no processo de traduo, gerando peptdios no funcionais. Molculas de tmRNA tem sido identificadas em diferentes grupos do domnio Bacteria, mas no foram encontrados entre os Archaea nem Eukarya.
Figura 9. 11. Modelo de ao das molculas de tmRNA.
Em eucariotos, o sistema tmRNA talvez no seja necessrio porque a traduo de mRNAs danificados evitada utilizando-se outros controles de qualidade, tais como a seleo positiva de mRNAs com cap no terminal 5' e cauda poliA no terminal 3.
Guia de Estudos
Cristina M. Bonato 105
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quais os passos de iniciao de traduo em E. coli? Quem determina o reconhecimento do cdon? O aminocido carregado pelo tRNA ou a seqncia de anticdon da molcula de tRNA? Qual a funo da seqncia ShineDalgarno? Quais so os fatores de iniciao da traduo? Como atuam? Quais so os fatores de alongamento da cadeia polipeptdica? Como atuam? Como ocorre a terminao da traduo? Qual o sentido de crescimento da cadeia polipeptdica? Qual a ao dos anlogos de base sobre a sntese protica? Qual a conseqncia, na sntese protica, da ao dos corantes de acridina? Comente esta frase: somente o anticdon do aminoacil-tRNA participa do processo de reconhecimento do cdon. Quais so as caractersticas estruturais da molcula adaptadora? Qual a constituio dos ribossomos de E. coli? Qual o papel das aminoacil-tRNA sintetases (AARS)? Qual o papel da tRNA-nucleotidil transferase? Como funciona o sistema tmRNA?
Captulo 10 RECOMBINAO GENTICA EM BACTRIAS

Crescimento de Bactrias em Laboratrio
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS As bactrias podem crescer tanto em meio lquido como em uma superfcie semi-slida, tais como um gel de gar, desde que alguns ingredientes nutritivos tenham sido adicionados. As bactrias dividem-se por fisso binria, isto , simplesmente dividem-se ao meio depois que seu nico cromossomo, um DNA circular dupla fita, se duplicou. O tempo de gerao das bactrias muito curto. Uma vez que as bactrias so unicelulares, seu tempo de gerao coincide com o tempo de duplicao da clula. Assim, o tempo de gerao de E. coli, por exemplo, 20 minutos, enquanto o tempo de gerao da mosca de frutas 14 dias e dos seres humanos cerca de 20 anos. Uma nica clula bacteriana num meio lquido ir se multiplicar geometricamente at exaurir os nutrientes do meio ou at que dejetos txicos se acumulem num tal nvel que bloqueiem o crescimento populacional. Se uma pequena quantidade desta cultura lquida for espalhada, em condies estreis, sobre uma superfcie semi-slida contida em placas de Petri, clulas isoladas, invisveis a olho n, iro se posicionar em pontos diferentes. Este processo denominado plaqueamento. Cada uma das clulas individuais, imobilizadas no gel, ir se dividir vrias vezes formando aglomerados de clulas, visveis a olho n, denominados colnias. Os membros de uma colnia, todos originrios de um nico ancestral gentico, so denominados clones. Assim, se quisermos determinar o nmero de clulas presentes numa cultura lquida de bactrias, espalhamos um pequeno volume desta cultura sobre um meio slido e contamos o nmero de colnias formadas. A Figura 10.1, mostra que aps plaqueamento de 100 ml de uma cultura lquida inicial foram obtidas 10 colnias na superfcie do gar. Portanto, em 1ml de meio lquido teramos 100 clulas, ou seja 102 clulas por mililitro.
Figura 10. 1. Crescimento de bactrias em laboratrio. Um pequeno volume de clulas crescidas em meio nutriente lquido espalhada sobre a superfcie de um meio semi-slido. As clulas individuais isoladas, no visveis a olho nu, na superfcie do gar, iro proliferar formando colnias. Todas as clulas de uma colnia apresentaro o mesmo fentipo e gentipo, pois so clones das originais.
Uma cultura lquida tpica da bactria Escherichia coli, por exemplo, contm cerca de 109 clulas por mililitro (cel/ml). A aparncia das colnias ou a capacidade de formar ou no formar colnias em meios particulares pode ser utilizada para identificar o gentipo das clulas bacterianas. Quando uma quantidade muito grande (> 104) de clulas colocada numa mesma placa contendo meio semi-slido, no possvel identificar colnias isoladas porque estando muito prximas, ao se duplicarem formam uma cobertura contnua de clulas (tecido) aps um dia de cultivo.
Identificao de Mutantes Bacterianos

Em geral as bactrias selvagens so prototrficas, isto , podem crescer em meio mnimo (MM) que contem apenas gua, sais inorgnicos e uma fonte de carbono orgnico. Clones incapazes Cristina M. Bonato 107
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS de crescerem em meio mnimo, mutantes auxotrficos, podem ser facilmente identificados. Um exemplo de mutao auxotrfica a deficincia em uma das enzimas que participam da via biossinttica de arginina (mutante arg1). Tal mutante no crescer em MM a no ser que se adicione arginina neste meio (veja Os genes governam a expresso das protenas). Outra caracterstica das bactrias selvagens que, em geral, so sensveis a antibiticos, como estreptomicina (Str) ou tetraciclina (Tet), de sorte que os mutantes resistentes so facilmente selecionados porque formam colnias em meio contendo o antibitico. Outro tipo de mutante aquele incapaz de utilizar uma determinada fonte de carbono orgnico. Por exemplo, mutantes Lac- no crescem em meio mnimo cuja nica fonte de carbono seja lactose, isto porque so defectivos ou na enzima que coloca a lactose dentro da clula ou na enzima que degrada a lactose para a obteno de glicose, substrato bsico para o crescimento bacteriano. Um meio nutriente denominado no-seletivo quando todas as clulas bacterianas, mutantes ou selvagens, formam colnias. O meio denominado seletivo quando permite o crescimento de apenas um tipo de clula, seja selvagem ou mutante. Por exemplo, um mutante arg-, no cresce num meio seletivo que no contenha arginina enquanto o selvagem cresce. Em meio completo (MC), que um meio no-seletivo porque contem todos os nutrientes, cresceriam tanto o mutante como o selvagem. Na gentica bacteriana o fentipo designado por trs letras, a primeira maiscula e um super escrito + ou - denotando a presena ou ausncia do fentipo em questo e um s ou r denotando a sensibilidade ou resistncia a antibiticos: Arg- ou Arg+; Strr ou Strs. O gentipo, por sua vez, designado por letras minsculas itlicas: arg- ou arg+ ; strr ou strs . Um nmero adicionado para identificar o passo da via que est alterado: arg1, arg2, etc. A facilidade em se determinar o fentipo de diferentes clones permitiu a descoberta da troca de informao gentica entre bactrias. Uma tcnica conhecida como plaqueamento de rplicas (replica plating), desenvolvida por Lederberg & Lederberg, permite a rpida identificao de clones mutantes (Figura 10.2). Nesta tcnica, as bactrias so plaqueadas em meio completo, no-seletivo, de forma a se obter colnias isoladas, as quais ocupam posies definidas no meio semi-slido. Esta placa pressionada sobre um pedao de veludo esterilizado ao qual ficaro aderidas as clulas bacterianas de cada posio. Em seguida o veludo pressionado sobre um meio seletivo, por exemplo, um meio seletivo contendo todos os requerimentos nutricionais exceto arginina. Aps um dia de incubao comparase o posicionamento das colnias nas duas placas. Se uma colnia cresceu na placa de meio completo e no cresceu na placa de meio seletivo, podemos inferir que a colnia que ocupava aquela posio, na placa original, era um mutante biossinttico de arginina e ser identificado como Arg -.
Figura 10. 2. Replica plating Aps a rplica possivel identificar os mutantes porque no formam colnias na placa seletiva, mas formam no meio completo.
A transferncia do material gentico de uma bactria para outra pode ocorrer por trs vias: transformao, conjugao e transduo. Na transformao a clula bacteriana capta DNA livre diretamente do meio ambiente e o incorpora ao seu genoma via recombinao. Na conjugao, uma molcula de DNA autnoma e auto-transmissvel transferida para outra clula bacteriana via 108 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS contato clula-clula. Na transduo, a informao gentica carregada de uma bactria para outra por um vrus de bactria (bacterifago). Em qualquer dos mecanismos utilizados, o DNA doador passar a integrar o genoma da clula receptora conferindo-lhe novas caractersticas fenotpicas.
Transformao
O fenmeno de transformao foi descoberto por Frederick Griffith (1928), quando investigava o modo de infeco da bactria S. pneumoniae (vide O DNA o material gentico). Na natureza, a transformao ocorre naturalmente quando molculas de DNA esto disponveis no meio e a clula bacteriana encontra-se num estado propcio captao destas molculas. Bactrias aptas a serem transformadas so denominadas competentes. O estado de competncia tem sido detectado em diferentes espcies bacterianas, tanto gram-positivas quanto gram-negativas. Em geral, as bactrias so induzidas ao estado fisiolgico de competncia, num perodo definido ao final do ciclo de crescimento, pouco antes da populao atingir a fase estacionria, quando os nutrientes comeam a escassear e a densidade populacional alta (Figura 10.3). Este perodo coincide com um decrscimo ou bloqueio na duplicao do DNA. A transferncia do DNA s geneticamente visvel se modificar pelo menos um dos caracteres da clula receptora. Considere, por exemplo, dois mutantes da bactria gram-positiva Bacillus subtilis: um mutante auxotrfico para leucina, sensvel estreptomicina (Str s Leu-) e um mutante resistente estreptomicina, capaz de sintetizar leucina (Strr Leu+). Misturando-se clulas competentes Strs Leu- com o DNA extrado de clulas doadoras Strr Leu , durante 60 minutos a 37oC, obtm-se clulas transformadas. Um volume conhecido da mistura espalhado na superfcie de meios seletivos para seleo dos transformantes. No meio seletivo contendo estreptomicina ou no meio seletivo sem leucina, s podem crescer transformantes, uma vez que a populao competente originalmente sensvel estreptomicina e no sintetiza leucina. J em um meio no seletivo crescem todas as clulas, transformadas ou no transformadas (Tabela 10.1).
+
Figura 10. 3. Desenvolvimento e eficincia da competncia durante o ciclo de crescimento de B. subtilis. Concentrao celular total (em azul). Concentrao dos recombinantes para uma determinada marca (em vermelho).
Tabela 10.1 - Transformao de clulas Strs Leu- em clulas Strr ou Leu+ Adio ao meio # clones crescendo sob condio seletiva Cristina M. Bonato
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS LEU Fentipos selecionados Todos (total de clulas receptoras) Leu+ Strr + + + STR cel/ml 1.108 5.105 4.105 A F* 5.10-3 4.10-3 B (controle) cel/ml 1.108 2.101 <1 F* 2.10-7 <1.10-8
F* (Freqncia) corresponde ao no de recombinantes dividido pelo no total de clulas A possibilidade de mutao espontnea na populao de clulas competentes checada nos mesmos meios seletivos, sem que estas clulas tenham sido previamente misturadas com o DNA extrado da clula doadora (coluna B). Os resultados obtidos comprovam que DNA exgeno foi captado pela clula competente e passou a integrar o seu genoma, uma vez que a freqncia de mutao espontnea de 2 em 10 milhes para leucina ou menor do que 1 em 100 milhes para a resistncia estreptomicina enquanto entre as clulas tratadas com DNA doador, a freqncia de bactrias com o gentipo da doadora 4 ou 5 em 1.000 (4-5.10-3).
Mecanismo de Transformao
A passagem do DNA transformador de fora para dentro da clula se d basicamente em 3 passos: Captao do DNA doador, o qual ser adsorvido a um complexo protico (fator de competncia) na superfcie da clula receptora; Transporte do DNA atravs da membrana; Integrao do segmento de DNA exgeno, ao cromossomo bacteriano via recombinao (Figura 10.4). Em B. subtilis, uma bactria gram-positiva, o DNA fita dupla presente no meio extracelular liga-se a receptores especficos na superfcie da clula bacteriana. Uma vez ligado o DNA digerido em fragmentos menores por endonucleases localizadas no espao periplasmtico, prximas ao stio de ligao. O fragmento dupla fita (DSF, do ingls double-strand fragments) com ~15kb, atravessa a membrana celular onde esto localizadas exonucleases que digerem uma das fitas gerando uma fita simple (SSF, do ingls single-strand fragment) que transportada para o citoplasma. Uma vez no citoplasma, este segmento de DNA fita simples ir reconhecer uma regio homloga no cromossomo bacteriano e integrar-se a ele via recombinao. Como o cromossomo bacteriano est ligado membrana, o DNA que acaba de atravessar a membrana entregue diretamente ao seu alvo. No processo de integrao ao cromossomo, regies transitrias de heteroduplex so formadas. O DNA fita simples resultante degradado por exonucleases bacterianas. A eficincia da transformao pode ser aumentada se as clulas forem submetidas a tratamentos qumicos adequados. A presena de CaCl2, por exemplo, importante na transformao de alguns tipos de bactrias.
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Figura 10. 4. Entrada do DNA transformador em B. subtilis.
Atualmente so utilizadas tcnicas que aumentam muito a eficincia de transformao como eletroporao e biobalstica. Na eletroporao, uma corrente eltrica de alta voltagem atravessa uma suspenso bacteriana por mili segundos, criando poros nas parede e membrana celular. Atravs deles, substncias podem entrar ou sair de acordo com seu respectivo gradiente de concentrao. Com isto, mesmo aquelas clulas, que sob condies naturais, no sofreriam transformao gentica, podem agora ser transformadas uma vez que o DNA entra atravs destes poros artificiais. Na tcnica de Biolstica (de Biologia e Balstica), o DNA que se quer introduzir na clula adsorvido micropartculas de tungstnio ou ouro as quais perfuram as clulas como projteis ao serem impulsionadas por um equipamento tipo revlver. Esta tcnica foi inicialmente desenvolvida para transformao de clulas vegetais.
Mapeamento Gentico
Transformao pode ser, eventualmente, uma tcnica conveniente de mapeamento gentico. Por exemplo, se dois genes a+ e b+, utilizados como marcadores de transformao, posicionarem-se muito longe um do outro no cromossomo doador, dificilmente faro parte do mesmo fragmento cromossmico aps ao das endonucleases (vide Mecanismo de transformao). Estando em fragmentos diferentes, dificilmente sero transferidos simultaneamente (cotransformao) para uma clula receptora a- b-. Se a probabilidade de transformao de uma marca ~1.10 -3, ento a probabilidade de ocorrer transformao das duas marcas (a+ b+) seria, grosseiramente, 1. 10-6 (10-3 x 10-3) (vide Transformao). Por outro lado, se dois genes esto suficientemente prximos um do outro, participaro do mesmo fragmento doador e, neste caso, a freqncia de cotransformao praticamente a de um nico gene. O ndice de co-transformao (r), calculado como: r = no. de duplos transformantes / no. de duplos + no. de simples Quanto maior o ndice r, mais prximos dois genes devem estar. Se a e c so cotransformados; b e c so cotransformados; a e b no so cotransformados, ento podemos supor que a ordem destes genes a c b, sendo que a e b esto a uma distncia tal que dificilmente participariam do mesmo fragmento de DNA. Assim, a anlise sistemtica de vrios loci permite a obteno de sua ordem relativa no cromossomo.
Conjugao
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O processo de conjugao foi descoberto em 1946 na bactria Escherichia coli, por Joshua Lederberg e Edward Tatum. Quando as bactrias conjugam, o DNA de uma clula doadora transferido para uma clula receptora atravs de contato clula-clula, sob o controle de um conjunto de genes que confere ao doador a capacidade de transferir DNA. Este conjunto de genes conhecidos como tra, encontra-se em uma molcula circular de DNA denominada fator de fertilidade ou fator F. Tais molculas circulares de DNA comportam-se como mini cromossomos. Replicam-se independente do cromossomo bacteriano, tm aproximadamente 100 kb e, alm dos genes tra contm outros genes e elementos de seqncia particulares, importantes na sua manuteno e distribuio nas clulas. O fator F membro de uma ampla classe de molculas de DNA extracromossmicas, auto-replicativas, independentes do cromossomo bacteriano, denominadas plasmdios. Clulas com plamdio F so denominadas F+ e sem plasmdio F so denominadas F-. Toda clula F+ um doador potencial porque pode transferir DNA para uma clula receptora. Nas bactrias gram-negativas, clulas F+ produzem pilus sexual, que um filamento protico longo e flexvel, constitudo de monmeros de pilina. O pilus sexual atraca na clula F- e mantm as duas unidas, propiciando a transferncia do DNA, uma vez que ao se retrair o pilus aproxima completamente as duas clulas. Um poro se forma no local de juno das duas membranas. Tais acontecimentos sinalizam uma endonuclease que faz um corte numa das fitas do DNA plasmidial, no stio oriT (origem de transferncia). Isto permitir a transferncia e replicao concomitante do fator F, de sorte que a clula receptora se transformar em F+ enquanto a doador continuar F+. Figura 10. 5. O stio oriT clivado por uma endonuclease codificada por um dos genes tra(violeta) do plasmdio. oriv, a origem de replicao do vetor; IS so seqncias de insero.
Plasmdios
Os plasmdios so molculas de DNA dupla fita, com replicao independente do cromossomo bacteriano, sendo encontrados em quase todos os tipos de bactrias. Os diferentes tipos de plasmdios apresentam tamanhos variados, de alguns milhares a centenas de milhares de pares de bases. Podem ser circulares ou lineares. Da mesma forma que os cromossomos, os plasmdios codificam protenas e molculas de RNA, replicam durante o crescimento celular e as cpias replicadas so distribudas entre as clulas filhas no momento da diviso celular. interessante observar que os genes plasmidiais no codificam funes essenciais ao crescimento celular, todavia, seus produtos podem beneficiar a clula em circunstncias especiais. Por, exemplo, os plamdios podem codificar protenas que confiram clula hospedeira, resistncia a antibiticos e, neste caso so denominados fatores R. J os plasmdios ColE1 carregam um gene para produo de colicina, que uma bacteriocina que mata as bactrias que no albergam 112 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS o mesmo plasmdio. Em Agrobacterium tumefaciens so encontrados plasmdios Ti (do ingls, Tumor iniciation), que carregam genes para iniciao do tumor em plantas (Tabela 10.2). Atualmente a nomenclatura para plasmdios est padronizada, mesmo porque muitos destes plamdios originais foram extensivamente modificados para sua utilizao como vetores de clonagem. Na nova nomenclatura, cada tipo de plasmdio recebe letras e nmeros como as linhagens bacterianas. Assim, a letra minscula p refere-se a plasmdio e antecede letras maisculas que descrevem o plasmdio ou so as iniciais de quem os construiu. Estas letras so acompanhadas de nmeros que identificam uma construo particular. Por exemplo, um plasmdio muito utilizado como vetor de clonagem o pBR322, construdo por Bolivar e Rodriguez. Tabela 10. 2. Alguns plasmdios de ocorrncia natural e seus traos caractersticos Plamdio ColE1 Tol Ti pSym SCP1 RK2 pJP4 Caracterstica Bacteriocina que mata E. coli Degradao de tolueno e cido benzico Iniciao de tumor em plantas Nodulao nas razes de plantas leguminosas Biossntese do antibitico metilenomicina Fonte original E. coli Pseusomonas putida Agrobacterium tumefaciens Rhizobium meliloti Streptomyces coelicolor
Resistncia ampicilina, tetraciclina e kanamiKlebsiella aerogenes cina Degradao de 2,4-D (dicloroacetato) Alcaligenes eutrophus
Assim como todo replicon, os plasmdios tambm possuem sua origem de replicao (Origens de replicao). A origem de replicao dos plasmdios denominada oriV (origem do vetor) e deve ser reconhecida por protenas que participam da maquinaria de iniciao da replicao. Algumas destas protenas so codificadas pelo cromossomo da clula hospedeira. Logo, a existncia de um plasmdio dentro de um determinado hospedeiro dependeria deste reconhecimento. Em funo disto, alguns plasmdios tem uma faixa restrita de hospedeiros onde podem se duplicar, como o caso de ColE1 e pBR322. Outros plasmdios, como o RK2, replicam numa ampla faixa de hospedeiros porque eles prprios codificam as protenas que necessitam para iniciao da replicao, da sua independncia em relao ao hospedeiro que os alberga. Dois mecanismos podem ser utilizados na replicao dos diferentes tipos de plasmdios: a replicao em teta (q) e a replicao do crculo rolante. O mecanismo q o mais comum, sendo utilizado pelos cromossomos bacterianos e por plasmdios como ColE1, RK2, F e P1 (Movimentao bidirecional). J o mecanismo de crculo rolante foi identificado nos plasmdios pUB110 e pC194, de Staphylococcus aureus e pIJ101 de Streptomyces lividans (Modos alternativos de replicao). Alguns plasmdios, como ColE1, apresentam um alto nmero de cpias dentro da bactria enquanto outros, como o plasmdio F tm apenas 1-2 cpias/clula. Plasmdios com alto nmero de cpias so denominados plasmdios relaxados (relaxed plasmids) e os com baixo nmero so denominados plasmdios rgidos (stringent plasmids). Uma clula bacteriana pode conviver com plasmdios de tipos diferentes durante muitas geraes. Mas, s vzes, alguns tipos no podem coexistir. Este fenmeno denominado incompatibilidade plasmidial. Plasmdios que no podem coexistir so membros de um mesmo grupo de incompatibilidade ou grupo Inc. Portanto, s coexistem plasmdios de grupos Inc diferentes. Assim, RP4 e RK2, do grupo IncP no coexistem, mas podem coexistir com RSF1010, do grupo IncQ. Cristina M. Bonato 113
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Tanto em leveduras como em fungos filamentosos j foram detectados plasmdios. Na levedura S. cerevisiae encontrado um plamdio de DNA circular dupla fita com 6.318pb, ~2mm de comprimento, da ser designado 2-micron. Contem uma nica origem de replicao (ARS, do ingls autonomous replication sequence). Cada clula haplide pode albergar 60-100 cpias do plasmdio; o plasmdio codifica um sistema de partio que promove a disperso aleatria, entre me e filha, das mltiplas cpias da molcula, seja durante a mitose ou meiose. No plasmdio ainda so codificados genes que catalisam recombinaes stio-especficas e regulao da expresso gnica. As molculas do plasmdio 2-micron residem no ncleo e so empacotadas como cromatina. Entre os Archaea, os plasmdios esto amplamente distribudos nos diferentes grupos. Os plasmdios, transformaram-se numa arma poderosa na tecnologia do DNA recombinante uma vez que so veculos eficazes no transporte de genes oriundos de organismos prximos ou distantes na escala evolutiva. Alm disto, sua autonomia replicativa permite a amplificao, em larga escala, da informao que carregam.
Mecanismo de conjugao
O mecanismo de transferncia do plasmdio de uma clula F+ para uma F- est acoplado duplicao da molcula pelo mecanismo de crculo rolante (Modos alternativos de replicao). Um corte, feito em apenas uma das fitas no stio oriT, gera os terminais 3'OH e 5'P. O terminal 3' OH livre utilizado como primer para sntese contnua em torno do crculo. Conforme o terminal 3' cresce, o terminal 5' vai sendo deslocado do crculo e direcionado para o poro que se formou aps contato das clulas F+ e F-. O processo de corte da fita simples e preparao da transferncia do terminal 5' denominado mobilizao(Figura 10.6). O terminal 5'P utilizado como molde para a sntese descontnua que se processa na clula receptora. A replicao inicia-se assim que o terminal 5' ingressa na clula receptora porque juntamente com o DNA transferida a primase codificada pelo plasmdio.
Figura 10. 6. Mecanismo de transferncia do DNA durante a conjugao. O cromossomo bacteriano no est representado no esquema. O corte de uma das fitas em oriT libera terminais 3'OH e 5'P. A adio de nucleotdios no terminal 3'OH desloca o terminal 5'P que invade a clula F -. Na clula receptora o terminal 5' serve de molde para sntese descontnua do DNA. Os crculos se fecham e o par conjugante se separa. Agora, as duas clulas so F+.
Aps completa transferncia e replicao da molcula, os terminais dos DNAs replicados so religados na regio oriT, recompondo o crculo. A seqncia oriT do plasmdio F possui <300pb, rica em AT e contem seqncias repetidas invertidas. O processo de transferncia unidirecional. Uma linhagem serve de doadora do material gentico e a outra de receptora. 114 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Ao trmino do processo uma cpia permanece no doador F+ e outra se instala no novo hospedeiro que se torna F+, comportando-se como doador daqui para a frente. O contato celular para transferncia do fator F s permitido entre uma clula F+ e outra F-. Entre duas clulas F+ o contato muito menos eficiente. A transferncia completa de F requer de 2 a 3 minutos. A unidirecionalidade da transferncia foi demonstrada por William Hayes em 1952 e em 1953 quando relata a existncia de linhagens Hfr. Linhagens Hfr propiciam alta freqncia de recombinao, mediada por plamdio, entre genes bacterianos cromossmicos. Em artigo de reviso publicado em 1956, juntamente com Wollman e Franois Jacob, define os diferentes passos envolvidos nos processos de conjugao e recombinao em E. coli K-12.
Clulas Hfr
A transferncia de genes cromossmicos de uma bactria para outra, resultando em recombinao, pode ser mediada pelo pelo plasmdio F. Ocasionalmente, o plasmdio F abandona sua vida livre e integra-se ao cromossomo da bactria hospedeira (Figura 10.7). A integrao de F um evento raro, mas clulas com F integrado podem ser isoladas e mantidas, estavelmente, neste estado. A integrao do plasmdio no cromossomo hospedeiro d-se via elementos de insero. Uma vez que existe homologia entre estes pequenos segmentos, pode ocorrer recombinao entre o IS cromossmico e o IS plasmidial. Aps integrao, o plasmdio F ficar ladeado por cpias do elemento IS que participou da integrao. Plasmdios capazes de existirem tanto no estado livre como no integrado so denominados epissomos.
Figura 10. 7. Insero do plasmdio F via recombinao homologa entre elementos IS do plasmdio e do cromossomo bacteriano, originando uma clula Hfr. A integrao de F ocorreu entre os loci a e b.
Clulas com o F integrado, ao conjugarem, carregam consigo genes cromossmicos para a hospedeira F -. Uma vez dentro da clula F -, o segmento de DNA transferido pode recombinar com a regio correspondente do cromossomo da receptora. As clulas das linhagens que conseguem transferir, com eficincia, seu cromossomo via plasmdio F integrado so denominadas clulas Hfr (do ingls, high frequency of recombination).
Hfr X FCristina M. Bonato 115
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O processo de conjugao de Hfr x F- tem aspectos semelhantes ao de F+ x F-, mas apresenta particularidades (Figura 10.8): A transferncia do DNA de uma clula Hfr para uma F- inicia-se com um corte na regio oriT, situada numa posio mediana do plasmdio integrado; A primeira poro do DNA a ser transferida o terminal 5' do F, seguido dos genes cromossmicos e, por ltimo, da outra poro do F; A transferncia do cromossomo inteiro um evento rarssimo e o par acasalante separa-se antes disto, mas dezenas de marcas cromossmicas chegam clula F-; O segmento linear transferido se replica porm no se circulariza; Num curto lapso de tempo a clula F possui duas cpias de cada um dos loci transferidos; O segmento replicado (exogenoto) pode incorporar-se ao cromossomo da clula receptora (endogenoto) via recombinao com regies homlogas; O DNA no incorporado degradado; A clula receptora torna-se um recombinante, porm continua F-, pois no recebeu o plasmdio integral.
Figura 10. 8. Transferncia de DNA cromossmico via plasmdio integrado.
Observando Recombinantes
Foi observando o surgimento de recombinantes que Lederberg & Tatum (1946) descobriram o fenmeno de transferncia de informao gentica entre clulas bacterianas. Estudavam dois mutantes auxotrficos: a linhagem A, Met - e Bio - e a linhagem B, Thr -, Leu - e Thi -. Logo, nenhuma das duas crescia em meio mnimo (MM). 116 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quando misturavam A (met-, bio-, thr+, leu+ e thi+) e B (met+, bio+, thr-, leu- e thi-), durante algumas horas e depois plaqueavam em MM, algumas colnias se desenvolviam. Portanto, estas clulas deviam ser prototrficas (met+, bio+, thr+, leu+ e thi+). A freqncia era de 1.10-7, ou seja, uma prototrfica em cada 10.000.000 de auxotrficas. A possibilidade de mutao foi descartada por duas razes: a) linhagens A ou B isoladamente no produziam colnias prototrficas em MM; b) no mnimo duas mutaes seriam requeridas para surgirem colnias prototrficas; como a freqncia de mutao ~1.10-7, a de duas mutaes seria ~1.10-14, muito menor do que a freqncia com que apareciam os recombinantes. Os pesquisadores concluram que deveria estar passando informao gentica de uma clula para outra (Figura 10.9 A).
Figura 10. 9. Transferncia de informao gentica entre mutantes auxotrficos. A. As placas contendo MM foram inoculadas com 108 clulas. Apenas nas placas que receberam a cultura mista houve formao de colnias, necessariamente prototrficas. B. No tubo em U, presso e suco alternadas foram o liquido e macromolculas atravessarem o filtro que separa as duas culturas, mas recombinantes no so gerados.
O fato de que as clulas precisavam entrar em contato uma com a outra para transferir informao foi demonstrado por Bernard Davis ao construir um tubo em U, onde os 2 braos estavam isolados por um filtro (Figura 10.9 B). Com este experimento ele eliminou, tambm, a possibilidade de estar ocorrendo transformao. Culturas de linhagens diferentes eram colocadas em cada um dos braos do tubo. Os poros do filtro no permitiam a passagem de bactrias e nenhum recombinante cresceu nas placas de MM, logo a transferncia de informao fora bloqueada. Portanto, o contato fsico entre as clulas era fundamental para transferncia da informao gentica. Este processo foi denominado conjugao. A partir da, o estabelecimento de linhagens puras Hfr permitiu que o processo de transferncia se realizasse com uma eficincia muito maior. Analisando-se os recombinantes produzidos pelo acasalamento Hfr x F-, foi possvel construir o mapa gentico do cromossomo bacteriano.
Mapa Gentico Via Conjugao

O mapa gentico do cromossomo construdo de acordo com a ordem em que os genes so transferidos. Para isto interrompe-se a conjugao em tempos definidos. A interrupo pode ser feita simplesmente com uma agitao vigorosa do tubo de cultura. Cristina M. Bonato 117
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quanto mais longe uma marca estiver da origem de transferncia, mais tempo ela demorar para ser transferida. As que esto bem prximas ao oriT sero as primeiras a serem transferidas. Portanto existe um gradiente de transferncia. Considere, por exemplo, o acasalamento Hfr a+, b+, c+ x F- a-, b-, c-, strr (Figura 10.10). Aps misturar as duas linhagens, a conjugao foi interrompida aos 10, 15, 20 e 30 minutos e amostras dos diferentes tempos foram plaqueadas em meio mnimo (MM) contendo estreptomicina (Str) e todos os outros componentes menos um, de sorte que apenas recombinantes pudessem formar colnias. Assim, os meios seletivos devem conter:
a) b) c)
MM + Str + A + B MM + Str + A + C MM + Str + B + C
% recombinantes tempo de entrada
a+ 25 9'
b+ 20 18'
c+ 20 25'
As colnias que crescerem em a) sero F- strr c+; as que crescerem em b) sero F- strr b+ ; as que crescerem em c) sero F- strr a+. O nmero de recombinantes, nos diferentes tempos, em cada uma das placas com meio seletivo, permite a construo de um grfico (Figura 10.10).
Figura 10. 10. A mistura de uma linhagem Hfr com uma F-, com marcas genticas diferentes, gera recombinantes identificados em meios seletivos. O grfico mostra que o nmero de reco-mbinantes aumenta com o tempo de contato entre as clulas e que existe um gradiente de transfe-rncia destas marcas.
O grfico nos diz que o nmero de recombinantes aumenta com o tempo de acasalamento e que para cada marca existe um perodo (tempo de entrada), antes do qual nenhum recombinante detectado. Por exemplo, recombinantes c+ s so detectados aos 25' de conjugao enquanto recombinantes a+ j estavam presentes nos 10 primeiros minutos. Isto significa que: Nem todas as clulas iniciam a conjugao ao mesmo tempo; A transferncia inicia-se num ponto particular do cromossomo Hfr (oriT); Os genes so linearmente transferidos do doador ao receptor; As distncias genticas entre as marcas podem ser medidas pelos minutos que decorrem entre seus tempos de entrada. O mapa gentico, onde a unidade de distncia o minuto, correspondente ao grfico acima, seria: A comparao de mapas construdos com diferentes marcas e linhagens de E. coli, permitiu concluir que o plasmdio podia se integrar em pontos diferentes do cromossomo e que o cromossomo de E. coli era circular. Cerca de 1500 genes de E. coli foram assim mapeados. A tcnica de acasalamento interrompido para mapear genes bacterianos foi desenvolvida 118 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS por Jacob & Wollman, no Instituto Pasteur, na dcada de 60. A Tabela 10.3 mostra a ordem de transferncia dos genes de alguns recombinantes de E. coli analisados por estes pesquisadores.
Tabela 10. 3. Tranferncia de informao de diferentes tipos de Hfrs. Tipos de Hfr Ordem de transferncia das marcas genticas 1 Pro Lac Ade Gal Try His Sm Iso 2 Iso Sm His Try Gal Ade Lac Pro 3 Pro Iso Sm His Try Gal Ade Lac 4 Ade Lac Pro Iso Sm His Try Gal 5 Iso Pro Lac Ade Gal Try His Sm 6 His Try Gal Ade Lac Pro Iso Sm 7 Sm Iso Pro Lac Ade Gal Try His Se voc se detiver nesta tabela por alguns minutos vai perceber que a ordem relativa dos genes sempre a mesma. O que difere o ponto de origem e a direo da transformao.
Diplides Parciais
Eventualmente, o fator F integrado excisado do cromossomo via recombinao entre as mesmas seqncias envolvidas na insero. Todavia, pode acontecer que o processo de exciso no seja exatamente o reverso da insero. Neste caso, junto com os genes plasmidiais podem ser excisados genes cromossmicos. Plasmdios que se encontram na forma livre carregando um segmento do DNA cromossmico so denominados plasmdios F' (F primo). Quando um plasmdio F transferido para uma clula F - ele poder continuar livre no citoplasma e, consequentemente, a clula receptora se tornar diplide, uma vez que apresentar dois alelos para os loci gnicos transferidos: um contido no plasmdio F' e outro, no cromossomo da F-. preciso lembrar que apenas um pequeno segmento cromossmico foi excisado juntamente com o plasmdio do cromossomo Hfr. Portanto os diplides acima referidos so diplides parciais ou merozigotos, uma vez que a diploidia diz respeito apenas queles loci gnicos (Figura 10.11). A passagem do plasmdio F' para uma clula F - denominada sexduo ou F-duo. A utilizao de diplides parciais muito til na verificao de dominncia e dosagem gnica.
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Figura 10. 11. Diplide parcial do operon lac
Transduo
No processo de transduo o DNA bacteriano transferido de uma clula bacteriana para outra por um vrus. Vrus que infectam bactrias so denominados bacterifagos ou simplesmente fagos. O termo bacterifago significa, literalmente, "comedor de bactria", uma vez que se reproduzem s expensas da bactria hospedeira a qual, normalmente, no sobrevive ao processo. Os fagos so estruturas especiais e simples constitudas, de uma molcula de cido nuclico (DNA ou RNA), envolvida por uma capa protica protetora. A molcula de cido nuclico contem a informao gentica do fago, a qual ser transmitida s novas geraes de partculas fgicas. Os genomas dos fagos so replicons possuindo, portanto, uma origem de replicao. Todavia, para se reproduzirem precisam infectar uma clula, agindo como parasitas celulares. Em geral as clulas apresentam stios receptores especficos para determinados vrus de sorte que a interao clulavrus especfica. Uma clula que permite infeo por um determinado vrus denominada clula hospedeira. A capa protetora do fago, denominada capsdeo, constituda de uma pequena variedade de protenas, especficas para cada tipo de partcula viral. O volume interno do capsdeo, na maioria das vezes, apenas levemente superior ao volume ocupado pelo prprio cido nuclico. Em geral, o capsdeo construdo como uma concha vazia e o cido nuclico inserido posteriormente, condensando-se comforme vai entrando (empacotamento). Os genomas dos fagos so lineares, via de regra. No caso do T4, por exemplo, o comprimento do genoma do fago 1.000 vezes maior que o dimetro do capsdeo o que exige um empacotamento considervel da molcula. Ao infectar a bactria o fago injeta uma molcula de cido nuclico dentro dela, livrando-se da capa protetora. A molcula invasora ser utilizada como molde para a sntese de mRNAs virais e tambm para a sntese de novos genomas virais. Normalmente, quando replicam, os genomas fgicos adotam a forma circular. A traduo dos mRNAs virais, utilizando a maquinaria da bactria, leva produo de uma srie de enzimas e protenas estruturais envolvidas no ciclo de desenvolvimento do fago. A infeco da bactria por fagos pode levar a sua lise ou no, dependendo do tipo de fago que a infecta. Se, ao infectar a bactria, o genoma do fago replica-se vegetativamente originado novas partculas fgicas, dizemos que instalou-se o ciclo ltico que resultar na lise da clula hospedeira. Se, ao infectar a bactria o genoma do fago integrar-se ao genoma do hospedeiro e a permanecer 120 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS silencioso por longo tempo, duplicando-se juntamente com o cromossomo do hospedeiro, sem lisar a clula, instalou-se o ciclo lisognico.
Ciclo Ltico
Dizemos que houve infeco ltica quando novas partculas virais so produzidas. A seqncia de eventos no ciclo ltico pode ser resumida em: Aderncia do fago superfcie da bactria seguida de injeo do DNA no citoplasma bacteriano; Transcrio dos genes virais; Traduo destas mensagens utilizando-se a maquinaria do hospedeiro; Replicao do DNA do fago; Montagem dos capsdeos; Empacotamento do DNA dentro do capsdeo; Lise da clula hospedeira; Liberao de dezenas de partculas virais (Figura 10.12).
Figura 10. 12. Infeco de E.coli pelo fago T4. O fago reconhece o receptor especfico na superfcie da bactria. O cido nucleico do fago utilizado como molde para duplicao e para transcrio dos genes virais que codificam as protenas da cabea, cauda e fibras.
As novas partculas liberadas infectam as clulas bacterianas vizinhas. Este ciclo se repete inmeras vezes redundando na formao de zonas claras numa camada de bactrias que cobrem um meio de cultivo semi-slido. Estas zonas claras so denominadas placas de lise e refletem a destruio das bactrias, localizadas naquela regio, pela prognie de fagos liberados consecutivamente a partir de uma bactria inicialmente infectada. Cada tipo de fago apresenta uma morfologia de placa de lise, tpica. A contagem das placas permite que se calcule a concentrao de fagos na suspenso inicial. Diferenas de morfologia refletem mutaes em dois loci. Um dos loci interfere na lise da bactria e o outro, na compatibilidade com o hospedeiro. Mutantes no locus de lise podem lisar a bactria mais rpidamente que o selvagem (+), produzindo placas de lise maiores. Mutao neste locus denominada r (lise rpida). Linhagens selvagens do fago infectam E.coli, mas no infectam uma variante resistente da bactria. Todavia, mutantes do fago so capazes de infectar a variante resistente e a selvagem. Mutao neste locus denominada h. Mutantes h podem lisar os dois tipos de bactrias e produzem placas de lise bem claras enquanto o selvagem h+ produz placas de lise turvas porque s consegue lisar um dos tipos de bactrias que recobrem a superfcie da placa (Figura 10.13).
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Figura 10. 13. Quatro tipos de placas produzidas por uma mistura de formas mutantes e selvagem do fago T2, sobre uma cobertura de dois tipos de E. coli. Selvagens h+r+ produzem placas pequenas e turvas; recombinantes hr+ produzem placas claras e pequenas; recombinantes h+r, placas turvas e grandes; duplo mutante hr, placas claras e grandes.
Ciclo Lisognico
Dizemos que houve infeco lisognica quando o DNA do fago integra-se ao cromossomo do hospedeiro. Integrado no tem replicao autnoma. Duplica-se a cada diviso celular da bactria, como parte integrante do cromossomo hospedeiro. Esta forma de perpetuao do genoma do fago no implica nem na morte do hospedeiro nem na liberao de partculas virais, uma vez que a expresso da maioria dos genes virais estar reprimida. O genoma viral integrado e inativo denominado profago. Este tipo de interao fagohospedeiro denominado lisogenia e as clulas hospedeiras so denominadas lisognicas. Fagos capazes de estabelecerem este tipo de interao com a clula hospedeira so denominados fagos temperados. O fago lambda (l) um exemplo de fago temperado (Figura 10.14). O fago l insere-se no genoma bacteriano via crossing-over. O ponto de crossing-over entre o stio de ligao do l e um stio do cromossomo bacteriano localizado entre os genes gal e bio.
Figura 10. 14. Ciclo lisognico. Fagos temperados como o bacterifago pode optar pelo ciclo ltico ou lisognico. O desenvolvimento lisognico permite a integrao do genoma do fago ao cromossomo bacteriano por ao de recombinases codificadas pelo genoma do prprio fago. Na condio de profago no provocar qualquer dano clula hospedeira.
Ocasionalmente as linhagens lisognicas podem produzir fagos infectivos. Agentes agressivos como raios ultra violeta (UV) e certos produtos qumicos podem induzir o profago, ou seja, provocar sua exciso do cromossomo bacteriano. A conseqncia disto ser a lise celular. Por esta razo, bactrias que contem o DNA do fago integrado a seu cromossomo recebem o nome de lisognicas que significa, literalmente, "dar origem lise". O fenmeno de lisogenia foi descoberto por Andr Lwoff em meados da dcada de 40. Em fagos temperados, a opo entre a via ltica e a lisognica de desenvolvimento governada por protenas codificadas pelo genoma do fago e da bactria assim como pelas condies de infeco. Dependendo dos estados escolhidos, ltico ou lisognico, diferentes conjuntos gnicos sero transcritos a partir do genoma viral. Uma vez estabelecido o padro de transcrio, ele estavelmente mantido. Assim, por exemplo, o fago l integrado poder permanecer latente no 122 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS genoma hospedeiro de E. coli por milhares de geraes celulares. Bactrias lisognicas so imunes infeco por outras partculas virais do mesmo tipo, ou seja, se uma bactria lisognica for infectada por um fago de mesmo tipo ele no poder se multiplicar. Os bacterifagos tm um importante papel na transferncia de genes entre bactrias. s vezes, na exciso, genes bacterianos, adjacentes ao stio de integrao, so carregados juntos e sero encapsulados nas partculas fgicas. Outras vezes, o capsdeo engloba fragmentos do DNA cromossmico provenientes de qualquer regio do cromossomo bacteriano. Em ambos os casos, informao bacteriana poder ser carregada para outra clula bacteriana por infeco fgica. O processo de transferncia de DNA bacteriano de uma clula a outra via fago denominado transduo. Partculas fgicas que transferem DNA cromossmico de uma bactria a outra so denominadas transdutoras. Dois tipos de fagos transdutores so conhecidos: transdutores generalizados e transdutores especializados. O fago P1 um exemplo de transdutor generalizado e o fago lambda (l) um exemplo de transdutor especializado. Ambos infectam E. coli.
Transduo Especializada
Na transduo especializada, o bacterifago l integrado e excisado do cromossomo bacteriano pela ao de endonucleases especficas que reconhecem elementos de seqncia tpicos, tanto no cromossomo bacteriano como no cromossomo do fago e catalisam as reaes de recombinao entre estas molculas. As seqncias envolvidas no reconhecimento e permuta, constituem o stio att (do ingls, attachment) presente no fago, attP e na bactria, attB. Uma pequena seqncia de homologia com ~15pb (O) flanqueada por segmentos no similares, P e P no fago e B e B na bactria. Do evento de permuta participam apenas os pares de bases assinalados em azul na seqncia O: GCTTT TTTATAC TAA. No cromossomo bacteriano este stio encontrase entre os operons gal e bio. O evento de integrao do fago ao cromossomo bacteriano depende da recombinase Int (integrase) do fago. O evento de exciso tambm depende de outra recombinase codificada pelo fago, a recombinase Xis. Este sistema de recombinao que envolve um stio especfico em cada uma das molculas denominado recombinao stio-especfica. O processo de transduo especializada anlogo ao de sexduo uma vez que ambos dependem de um erro durante a exciso de uma molcula integrada ao cromossomo do hospedeiro. Na sexduo o erro ocorre durante a exciso do plasmdio F enquanto na transduo especializada o erro ocorre durante a exciso do profago. As descobertas dos processos de transferncia de informao gentica em bactrias associadas ao conhecimento da fisiologia bacteriana, bastante desenvolvida no Instituto Pasteur de Paris, permitiram um enorme avano no conhecimento da gentica bacteriana: centenas de mutantes em diferentes vias metablicas foram isolados; foi possvel determinar as relaes de dominncia e recessividade entre alelos, utilizando-se diplides parciais; foi possvel mapear os genes ao longo dos cromossomos e, finalmente, foi possvel se estabelecer um modelo acerca de como a expresso destes genes era regulada. O desenvolvimento deste modelo culminou com o trabalho publicado por Jacob & Monod (1961) onde os princpios bsicos da regulao gnica em bactrias so claramente enunciados e se constituiram num suporte vigoroso para as futuras investigaes no campo do controle gnico.
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Guia de Estudo
Um experimento de transformao em bactrias foi realizado com uma linhagem doadora que resistente s drogas, A,B,C e D e com uma linhagem receptora sensvel a todas as quatro drogas. Aps transformao, as clulas foram distribudas em 4 placas contendo vrias combinaes das drogas e incubadas para desenvolvimento de colnias. Resultados na tabela abaixo.
Drogas adicionadas nenhuma A B C D AB AC AD
Nmero de colnias 10.000 1156 1148 1161 1139 46 640 942
Drogas adicionadas BC BD CD ABC ABD ACD BCD ABCD
Nmero de colnias 51 49 786 30 42 630 36 30
a. Um dos genes est obviamente mais distante do que os outros trs, os quais parecem estar intimamente ligados. Qual o gene mais distante? b. Qual seria a ordem provvel dos trs genes intimamente ligados? (Griffiths et al., 1993 Genetic Analysis, cap. 10, no. 16). Quatro linhagens de E.coli com gentipo a+b- foram marcadas 1,2,3, e 4. Quatro linhagens com gentipo a-b+ foram marcadas 5,6,7,8. Os dois gentipos foram misturados em todas as combinaes possveis e, aps incubao, espalhados para determinar a frequncia de recombinantes a+b+. Obteve-se o resultado abaixo, onde M = muitos recombinantes; L = poucos recombinantes; 0 = nenhum recombinante. (Griffiths et al., 1993 - Genetic Analysis, cap. 10, no. 3) 1 5 6 7 8 0 0 L 0 2 M M 0 L 3 M M 0 L 4 0 0 M 0
Baseado nestes resultados determine o tipo sexual de cada linhagem (Hfr, F+ ou F-). O DNA de uma linhagem prototrfica de E. coli foi isolado e usado para transformar linhagens auxotrficas deficientes na sntese de purinas (pirB-), pirimidinas (pyrC-) e do aminocido triptofno (trp-). O triptofano foi usado como marcador para determinar se a transformao ocorrera (marca seletiva). Qual a ordem dos genes e a freqncia de co-transformao, considerando-se os dados abaixo? (Tamarin,1996) trp+ pyrC + purB + 124 86
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS trp+ pyrC + purB trp+ pyrC purB + trp+ pyrC purB 04 67 14
Uma linhagem bacteriana que lys+ his+ val+ usada como doadora e lys- his- val- , como receptora. Transformantes iniciais foram isolados em meio mnimo + histidina + valina. a. Que gentipos crescero neste meio? b. Estas colnias foram replicadas em MM + histidina e 75% das colnias originais cresceram. Quais os gentipos das colnias que cresceram neste meio? c. As colnias originais tambm foram replicadas em MM + valina e 6% cresceram. Qual o gentipo possvel destas? d. Finalmente, as colnias originais foram replicadas em MM. No cresceu nada. Baseado nestas informaes, que gentipos cresceriam em MM + histidina e em MM + valina? e. Qual dos dois genes est mais prximo de lys? f. A transformao original foi repetida s que o plaqueamento original foi feito em MM + lisina + histidina. Formaram-se 50 colnias. As colnias foram replicadas para determinar seus gentipos e se obeteve os seguintes dados: val+ his+ lys+ 0 + + val his lys 37 + + val his lys 03 g. Baseado nestes dados, qual a possvel ordem dos genes? (Tamarin, 1996) O que recombinao stio-especfica. Exemplifique. Como se d a insero do plasmdio F no cromossomo do hospedeiro? Como funciona a tcnica de "replica-plating"? Quais as diferenas e semelhanas entre os processos de conjugao, transformao e transduo? O que um plasmdio? Que exemplos voc conhece? Quais as funes dos genes tra? Porque o plasmdio F um mutante que expressa constitutivamente os genes tra? O que significa competncia? O que so elementos de insero (IS)? O que uma placa de lise?
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Captulo 11 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Viso Geral
Do final do sculo XIX at meados do sculo XX, o estudo da gentica foi baseado em inferncias indiretas acerca dos genes, pautadas nas razes fenotpicas resultantes de cruzamentos controlados, como inicialmente proposto por Mendel. O estabelecimento de uma correlao entre mutaes especficas e protenas singulares, assim como a descoberta do cdigo gentico e da estrutura do DNA, constituram um avano considervel no entendimento da Gentica. Todavia, at ento, nenhum gene havia sido isolado nem uma seqncia de nucleotdios examinada diretamente. At os anos 70, todas as manipulaes feitas com material biolgico, para se obter organismos com novos gentipos e fentipos fundamentavam-se nos conceitos de mutao e recombinao e consistiam basicamente em: a) Tratamento com agentes mutagnicos que induziam o surgimento de mutantes na populao. b) Cruzamento entre mutantes diferentes permitindo o isolamento de recombinantes. Estes processos so essencialmente aleatrios e a identificao de recombinantes com as caractersticas desejadas, entre todos os produzidos , exige procedimentos seletivos, s vezes, bastante complexos. A partir da dcada de 70 tm sido desenvolvidas vrias tcnicas onde o gentipo de um organismo pode ser modificado diretamente, de maneira pr-determinada. O conjunto destas tcnicas recebeu o nome de Tecnologia do DNA Recombinante, ou Engenharia Gentica ou Clonagem Gnica. Neste tipo de manipulao as mutaes e recombinaes so realizadas "in vitro". Molculas de DNA provenientes de dois organismos diferentes so isoladas e cortadas em fragmentos menores utilizando-se enzimas especiais. Os fragmentos dos dois tipos so ento unidos na combinao desejada e reintroduzidos no organismo vivo. Assim, os fundamentos continuam os mesmo dos cruzamentos tradicionalmente praticados pelo ser humano em plantas e animais, mas aumentam a eficincia na construo dos tipos genticos desejveis e permitem, ao geneticista, criar gentipos novos que seriam impossveis utilizando as tcnicas de gentica clssica. O enorme interesse na tecnologia do DNA recombinante motivado pela grande variedade de aplicaes, tais como: Isolamento de um gene, de parte de um gene ou de uma regio genmica particular;
Produo de um RNA ou protena especfica em quantidades muito maiores do que se obteria por mtodos convencionais; Eficincia cada vez maior na produo de compostos orgnicos de interesse, tais como enzimas e drogas; Criao de organismos com caractersticas desejveis, tais como plantas que no dependam de fertilizantes ou de animais que exibam alta taxa de crescimento; Correo potencial de defeitos genticos em organismos superiores. 126 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A possibilidade de se criar novas combinaes informacionais na molcula de DNA dependeu fundamentalmente do isolamento de endonucleases (Enzimas de Restrio) que reconheciam e clivavam stios especficos da molcula de forma tal que molculas de origem diferentes pudessem, aps a clivagem, ligarem-se uma a outra.
Enzimas de Restrio
Uma enzima de restrio ou endonuclease de restrio um tipo de nuclease que cliva uma fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqncia particular de nucleotdios que seja o stio de restrio da enzima (Smith & Wilcox, 1970). Por exemplo, a enzima BamH1 reconhece a seqncia dupla fita:
Uma vez reconhecida a seqncia acima, a ligao fosfodister 5'GpG3' clivada em cada uma das fitas, como indicado pelas setas, produzindo grupos 3'OH e 5'P em cada posio. O nome dado enzima refere-se ao organismo de onde foi isolada. No caso, Bacillus amyloliquefaciens. Outras enzimas reconhecem outras seqncias, como exemplificado na Tabela 11.1. As enzimas de restrio tipo II fazem parte de um sitema mais amplo da clula bacteriana denominado sistema de modificao-restrio. Este sistema consiste de uma endonuclease de restrio e de seu par, uma metilase de modificao. A metilase metila uma base especfica da mesma seqncia reconhecida pela endonuclease de restrio. As bases alvo de metilao so Adenina (grupo amino) ou Citosina (grupo amino ou posio 5). Quando o DNA est modificado a enzima de restrio no capaz de cliv-lo. Desta forma o sistema de restrio-modificao protege a bactria da invaso de DNA exgeno (em geral, vrus) que ser clivado pela Enzima de Restrio da bactria que no ataca seu prprio genoma pois este est modificado (Linn & Arber, 1968). Todavia, se o genoma do vrus for modificado aps a invaso ele ser capaz de se reproduzir no seu novo hospedeiro. Centenas de enzimas de restrio j foram isoladas de diferentes microrganismos. Grande parte destas enzimas ao clivarem as duas fitas de DNA geram terminais coesivos enquanto outras geram terminais abruptos (Tabela 11.1; Figura 11.1). P. ex., a enzima EcoRI, gera terminais coesivos ao clivar as duas fitas nas ligaes fosfodister 5'GpA3'. Os terminais fita simples, gerados com a clivagem de cada uma das fitas, so complementares entre si. Isto significa que os fragmentos produzidos podem formar espontaneamente um novo crculo. Se a enzima DNA ligase estiver presente no meio, os terminais 3' e 5' podem ser covalentemente unidos. Estas propriedades da molcula de DNA e das enzimas de restrio permitem que se construa molculas recombinantes a partir de fragmentos de DNA originrios de organismos at bastante distantes do ponto de vista evolutivo.
Tabela 11. 1. Stios de reconhecimento, modificao e clivagem Cristina M. Bonato 127
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS por algumas enzimas de restrio Enzima EcoRI HindIII Stio de Restrio Organismo de origem Escherichia coli
Haemophilus influenza
TaqI PstI HaeIII SmaI
Thermus aquaticus Providencia stuartii Haemophilus aegyptius Serratia marcescens
As seqncias reconhecidas pelas Enzimas de Restrio caracterizam-se pelo fato de que as duas fitas complementares apresentam seqncias idnticas, porm invertidas, constituindo um palndromo. Observe o eixo de simetria. A letra m refere-se a modificao das bases A ou C por metilao. Assim, se o DNA de um mamfero e o da uma bactria forem digeridos com EcoRI, ambos formaro o mesmo tipo de terminal coesivo e podero ser covalentemente ligados, aps pareamento por complementaridade, gerando uma quimera. Este um dos fundamentos bsicos da tecnologia do DNA recombinante.
Figura 11. 1. Tipos de cortes feitos por enzimas de restrio. A. Terminais coesivos gerados por ao da enzima de restrio EcoRI. B. Terminais abruptos gerados por ao da enzima de restrio SmaI.
A seqncia de nucleotdios reconhecida pela EcoRI contem 6 nucleotdios. Como existem apenas 4 tipos de bases, a probabilidade de se encontrar a seqncia especfica GAATTC 1/4 6, portanto, um stio deste poder ser encontrado a cada ~4096 pares de bases. Se o DNA de E.coli formado por ~ 4,7.106 pares de bases, ento cerca de mil fragmentos podem ser gerados quando o 128 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS cromossomo de E. coli digerido com EcoRI. J o genoma de um mamfero, que muito maior do que o de uma bactria, geraria milhes de fragmentos. possvel construir mapas de restrio de segmentos de DNA analisando-se os fragmentos gerados aps tratamento com diferentes enzimas de restrio.
Mapa de Restrio e RFLPs

O tratamento de uma molcula de DNA com uma enzima de restrio, p. ex. HindIII, produz fragmentos de tamanhos diversos que podem ser separados por eletroforese em gel de agarose. Uma molcula de DNA com vrios stios para HindIII produzir vrios fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, dependendo da posio dos stios na molcula de DNA. Devido especificidade de seqncia, uma dada enzima de restrio produz um conjunto nico de fragmentos para uma molcula particular de DNA. Portanto, se a mesma molcula de DNA for tratada paralelamente com BamHI, muito provavelmente gerar fragmentos de tamanhos diferentes. O tratamento concomitante com as duas enzimas permite que se estabelea, por comparao, a posio relativa dos stios de restrio presentes na molcula, isto , permite que se determine o mapa de restrio da molcula (Figura 11.2).
Figura 11. 2. Mapa de restrio de uma molcula linear de DNA com 4kb, tratada com BamH1 e HindIII, isoladamente e em conjunto. Cada fragmento aparece como uma banda horizontal no gel. Os fragmentos maiores movem-se mais vagarosamente que os menores durante a migrao num campo eltrico. O comprimento de cada fragmento gerado com os diferentes tratamentos est indicado. A informao obtida dos gis permite deduzir as posies relativas dos stios de restrio na molcula de DNA.
Os mapas de restrio so convenientes na localizao de seqncias particulares de bases no cromossomo e para se estimar o grau de diferenas entre cromossomos relacionados. A individualidade nos seres vivos resulta de polimorfismo gentico, ou seja variao, de um indivduo para outro, na seqncia equivalente do DNA. Bases nicas do DNA que diferem em pelo menos 1% da populao, caracterizam polimorfismo de um nico nucleotdio (SNPs, single nucleotide polimorfism) e salpicam o genoma humano irregularmente, cerca de 1 a cada 1250 bases (Lewis, R., 2002). Tais variaes podem criar ou eliminar stios de restrio na molcula de DNA. Portanto, cromossomos homlogos quando digeridos com uma dada enzima de restrio geram fragmentos de tamanhos diferentes, ou seja, o DNA exibe polimorfismo em relao ao comprimento dos fragmentos de restrio (RFLPs, do ingls, Restriction-Fragment Lenght Polymorphisms). As vezes o RFLP resulta de diferenas no nmero de cpias de pequenas seqncias de DNA repetidas em srie num determinado local do cromossomo. Se o stio de restrio de uma determinada enzima flanqueia esta regio, claro que os fragmentos tero tamanhos diferentes, dependendo do nmero de repeties em cada um dos cromossomos homlogos que esto sendo comparados. Um RFLP resultante de um nmero varivel de repeties em srie denominado VNTR (variable number of tandem repeats). Como as diferenas de tamanho dos fragmentos de restrio podem facilmente ser visualizadas em gis aps eletroforese, os RFLPs so valiosos no diagnstico de doenas Cristina M. Bonato 129
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS hereditrias de genes desconhecidos, na identificao de indivduos nas investigaes criminais e no desvendamento da nossa histria evolutiva. Os RFLPs so herdados de acordo com as regras da gentica mendeliana (Figura 11.3).
Figura 11. 3. Um gene com quatro alelos que se caracterizam pelas posies diferentes dos stios de restrio (marcadores diferen-tes) podem ocorrer em qualquer das combinaes possveis e segregar independentemente a cada gerao. Na gerao parental dois indivduos so homozigotos (AA e BB) e dois so heterozigotos (CD e BD) para o gene em questo, detectado no gel pela utilizao de uma sonda especfica. Os descendentes em F1 so AC e BB. Portanto s podem gerar filhos que herdem o trao B do pai e A ou C da me (F2). Crculo representa fmea e quadrado representa macho.
A utilizao desta tcnica tem fornecido informaes interessantes sobre as populaes humanas. Barbujani et al., (1997), analisando 109 marcadores de DNA (79 RFLPs e 30 micro satlites) de 16 populaes mundiais verificaram que 84,4% da variao mundial destas marcas encontra-se entre os membros de uma mesma populao e apenas 10% ocorria entre "raas" predominantes. Estudos dos padres de restrio do DNA mitocondrial de 145 indivduos representando diferentes populaes mundiais concluiu que todo DNA mitocondrial humano originase de um ancestral comum pertencente a uma populao Africana h 200.000 anos (Cann et al., 1987).
Southern, Northern, Western Blots

A visualizao de um fragmento de interesse num gel que separou milhares de fragmentos de um DNA submetido a ao de uma determinada enzima de restrio pode ser feita via Southern Blot. Como funciona esta tcnica desenvolvida por Edwin Southern (da o nome)? Ela baseia-se no conhecimento de que as fitas de DNA so complementares e, portanto, seqncias similares podem hibridizar. Logo, este mtodo identifica um segmento de DNA com uma seqncia de bases especfica. A primeira coisa a se fazer desnaturar o DNA, in loco, com tratamento alcalino do gel. A seguir, as bandas do gel, que agora contem DNA fita simples, so carimbadas (blot) numa membrana de nitocelulose ou de nylon, o que facilita o manuseio e permite que elas continuem ocupando as mesmas posies originais. A membrana contendo todos os fragmentos seca a vcuo (800C), fixando o DNA permanentemente e, ento, exposta a uma soluo que contenha molculas radioativas de DNA desnaturado ou RNA cujas seqncias so conhecidas (sonda). Estas molculas vo hibridizar com a banda ou bandas onde houver DNA complementar a elas, gerando uma molcula dupla fita. A radioatividade detectada num filme de Raio-X que ser exposto a membrana. Depois de revelado o filme apresentar bandas escuras que indicam a posio de hibridizao. Desta forma possivel detectar, entre os milhares de fragmentos produzidos, aquele que lhe interessa (Figura 11.4). Deteco no radioativa, utilizando-se sondas fluorescentes, desejal sempre que possvel.
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Figura 11. 4. Southern blot. Um fragmento de interesse pode ser detectado usando-se sonda radioativa. A sonda s hibridiza com o fragmento complementar entre os milhares de fragmentos gerados pela digesto de um cromosso com enzima de restrio. Desta forma, utilizando-se como sonda o fragmento de um gene ou mRNA bacteriano podemos procurar por similares entre os fragmentos de um cromossomo humano.
O mesmo princpio descrito acima permite que imobilizemos RNA no papel e utilizemos DNA ou RNA como sonda. Esta tcnica denominada Northern blot (apenas por referncia ao Southern blot). Uma protena especfica tambm pode ser analogamente detectada num procedimento denominado Imunoblotting ou Western Blotting. Neste caso utilizam-se anticorpos para reagir com suas protenas especficas dentre aquelas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. Por exemplo, as protenas de um extrato de clulas so separadas por eletroforese, transferidas para o papel de nitrocelulose e exposta ao anticorpo que dever detectar a protena de interesse. Como isto visualizado? Trata-se o papel com um anticorpo secundrio que reage com o anticorpo primrio. Ao anticorpo secundrio est associada uma enzima cuja atividade fcil de visualizar (geralmente por reao colorimtrica). Onde houve interao antgeno-anticorpo sugem bandas coloridas. Fragamentos de DNA obtidos por ao das enzimas de restrio, separados por eletroforese e identificados pela tcnica de Southern Blot podem ser lidos, ou seja, podemos saber exatamente qual a seqncia de bases do fragmento de interesse.
Sequenciando o DNA
O mtodo atualmente utilizado para sequenciamento automtico do DNA aquele proposto por Frederick Sanger em 1975 e baseia-se nos princpios de duplicao do DNA e na utilizao de um terminador da cadeia nascente. Ou seja, a DNA polimerase s trabalha no sentido 5 > 3, adicionando os desoxirribonucleosdeos trifosfatados (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ingressantes no terminal livre 3OH de uma seqncia pr-existente (primer), obedecendo a ordem determinada pela fita molde (Figura 11.5). Cristina M. Bonato 131
Figura 11. 5. Duplicao do DNA.
Portanto, a duplicao implica na presena de um molde, do primer, das enzimas apropriadas e de desoxirribonucleosdeos trifosfatados (dNTP). Na proposta do terminador, alm de todos estes componentes adiciona-se tambm aos tubos de reao uma pequena quantidade de um 2,3didesoxinucleotdio trifosfato (ddNTP) especfico. Os ddNTPs so os terminadores, uma vez que no possuem um grupo 3 OH livre para perpetuar o ataque nucleoflico sobre o a-fosfato dos nucleosdios trifosfatados ingressantes. Como isto feito? Quatro tubos de reao so utilizados e em cada um adiciona-se uma pequena quantidade de um dos ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). O terminador competir com o desoxirribonucleosdeo trifosfatado anlogo (dNTP) e interromper a cadeia sempre que for incorporado, gerando fragmentos de diferentes tamanhos. Como visualizar estes fragmentos? Em geral marcava-se radioativamente o primer ou um dos dNTPs e os fragmentos de cada tubo eram separados por eletroforese, onde os fragmentos maiores migram mais lentamente que os menores. Aps a migrao, um filme de Raios-X era exposto ao gel e ento revelado (autorradiograma), de sorte que os fragmentos de cada tubo pudessem ser visualizados. A ordem das bases na molcula lida, em seqncia, do fragmento maior para o menor, que corresponde ao sentido 3 > 5 (Figura 11.6).
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Figura 11. 6. Esquema do mtodo Terminador de Cadeia (di-desoxi).
Atualmente, no seqnciamento automtico, no se utiliza mais marcao radioativa e sim um corante fluorescente, ligado ao primer, especfico para cada ddNTP: verde, vermelho, preto e azul para ddATP, ddTTP, ddGTP e ddCTP respectivamente. Detectores de fluorescncia presentes nas mquinas de sequenciamento so controladas pelo computador de sorte que a aquisio dos dados automatizada (Figura 11.7). Em 2001 foi completado o rascunho da seqncia do genoma humano por dois grupos: a) International Human Genome Sequence Consortium e b) Celera Genomics, USA (Venter et al ).
Figura 11. 7. Produto de sequenciamento automtico. As letras especificam as bases e os nmeros indicam a posio das bases no segmento sequenciado. As curvas indicam a intensidade de fluorescncia de um corante particular.
Para sequenciar um fragmento de DNA conveniente partirmos de um grande nmero de cpias deste fragmento. Tal amplificao do segmento de DNA desejado pode ser obtida pela reao de polimerizao em cadeia (PCR) ou pela clonagem em vetores multi-cpia.
Reao de Polimerizao em Cadeia (PCR)

A tcnica de PCR, amplamente utilizada em laboratrios de pesquisa e clnicos, consiste em produzir, automaticamente, milhes de cpias de um nico segmento de DNA em questo de horas. Tal faanha depende da habilidade das enzimas copiadoras de DNA permanecerem estveis em alta temperatura, como veremos a seguir. A DNA polimerase isolada da bactria hipertermflica Termus aquaticus, encontrada em fontes termais do parque florestal de Yellowstone-USA, deu grande impulso a utilizao automatizada desta tcnica. A replicao no tubo de ensaio mimetiza o que ocorre na natureza. O primeiro passo "abrir o DNA", separando as duas fitas da dupla hlice. Em seguida a DNA polimerase de T. aquaticus, denominada Taq polimerase, faz cpias utilizando cada uma das fitas como molde. Para copiar o DNA, a polimerase necessita de nucleosdeos trifosfatados de adenina, timina, citosina e guanina e de primers. A partir dos primers, a polimerase sintetiza as novas fitas. Como isto feito? 1. Para separar as duas fitas, o tubo de ensaio contendo, Taq polimerase, nucleosdeos trifosfatos, primers e fragmento de DNA dupla fita, submetido temperatura de 90-95oC, por alguns segundos. Cristina M. Bonato 133
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS 2. Em seguida o tubo resfriado para a temperatura de ~55 oC. Nesta temperatura os primers vo se anelar s seqncias complementares no fragmento de DNA. Isto leva alguns segundos. 3. A seguir a temperatura novamente elevada porque a Taq polimerase trabalha melhor 75 oC. Ento, a polimerase comea a adicionar nucleotdios a partir dos primers fazendo, finalmente, uma cpia completa dos moldes. Ao final tem-se um ciclo completo de PCR. Este processo leva menos do que dois minutos. 4. Este ciclo repetido 30 ou mais vezes de sorte que aps ~3 horas, mais de um milho de cpias de um determinado pedao do DNA foi produzido (Figura 11.8).
Figura 11. 8. Reao de Polimerizao em Cadeia. Tcnica formulada por Kerry Mullis.
O PCR tem inmeras aplicaes. Na clnica utilizado no diagnstico de doenas infecciosas e na deteco de eventos patolgicos raros. Na criminalistica, um nico fio de cabelo pode identificar o doador. Na paleontologia molecular, a amplificao de amostras de DNA extradas de fsseis incrustados e preservados no ambar h mais de 120 milhes de anos permite a determinao da seqncia desta molcula para estudos evolutivos.
Vetores e Estratgias de Clonagem

Molculas de DNA capazes de auto-duplicao (replicons), podem ser utilizadas como veculos para carregar fragmentos de DNA obtidos por ao das enzimas de restrio. Os veculos so denominados vetores. Quando um fragmento de DNA inserido num vetor diz-se que est clonado, uma vez que vrias cpias deste fragmento podero ser produzidas com a auto-duplicao do vetor no hospedeiro apropriado. Em geral, a molcula recombinante colocada dentro do hospedeiro via transformao. Os vetores mais utilizados at o momento so plasmdios de E. coli e molculas derivadas dos bacterifagos l e M13. 134 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS As caractersticas bsicas de um vetor so: a. Pode ser introduzido numa clula hospedeira; b. Contem uma origem de replicao, o que permite sua duplicao no hospedeiro; c. Clulas contendo o vetor podem ser facilmente selecionadas pelo fentipo conferido ao hospedeiro, por um gene presente no vetor como, p. ex. resistncia a antibiticos. Estratgias de clonagem A clonagem de fragmentos em um vetor pode seguir os passos abaixo: a. Digesto do DNA de interesse, denominado DNA doador, com uma enzima de restrio apropriada, p. ex. EcoRI, que cria terminais coesivos, produzindo-se centenas de fragmentos com o mesmo tipo de terminal; b. Digesto do vetor com a mesma enzima de restrio, observando-se que o vetor deve possuir um nico stio de restrio para a enzima. Desta forma os terminais de qualquer dos fragmentos do DNA doador complementam-se ao do vetor, podendo ser inseridos neste nico ponto de abertura do vetor gerando uma molcula constituda de vetor + inserto; c. Tratamento com DNA ligase para selar os terminais, permitindo o fechamento do crculo e gerando um DNA recombinante, lembrando sempre que o vetor deve possuir genes que confiram clula receptora um fentipo facilmente identificvel; d. Introduo do vetor na clula hospedeira, seja por transformao clssica, eletroporao, biobalstica, etc.(Figura 11.9). Resumindo, a idia central na clonagem molecular inserir um segmento de DNA de interesse numa molcula de DNA de replicao autnoma (veculo ou vetor de clonagem), de sorte que o fragmento seja replicado com o vetor. O resultado uma quimera que, ao ser clonada num organismo hospedeiro apropriado como E. coli ou levedura, produz uma enorme quantidade do segmento de DNA ali inserido. Se o gene clonado estiver apropriadamente flanqueado por seqncias que controlem a sntese de RNA (transcrio) e de protenas (traduo), a clula hospedeira tambm ser capaz de produzir grandes quantidades de RNA e da protena codificada no gene inserido.
Figura 11. 9. Clonagem de fragmentos de DNA num vetor. Tanto o vetor como o DNA estrangeiro so cortados com a mesma enzima de restrio gerando terminais coesivos que podem se anelar produzindo uma quimera. Todavia, os terminais do prprio vetor podem se reanelar e neste caso no ser produzido um DNA recombinante. Com esta populao de vetores sero transformadas as clulas hospedeiras. Ao se transformar uma populao bacteriana com um vetor nem todas as clulas so transformadas. Portanto, necessrio selecionar as transfor-mantes. Para tanto, as clulas so espalhadas em meio slido seletivo, que permitir o crescimen-to apenas das clulas que receberam o vetor. Se o vetor conferir resistncia antibitico, o meio seletivo deve conter o antibitico em questo. Desta forma, as clulas que no foram trans-formadas com o vetor no sobrevivero neste meio. Como distinguir entre as clulas que receberam o vetor "vazio" e o vetor com inserto? Veja no item pBR322 e outros vetores.
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pBR322 e Outros Vetores

Existem vrios plasmdios interessantes para clonagem. Em geral so pequenos; replicam sob controle relaxado, isto , esto presentes em vrias cpias na clula; carregam genes de resistncia a um ou mais antibiticos e contm uma srie de stios de restrio estrategicamente localizados.Nos vetores construdos para clonagem, o stio de clonagem contem stios de clivagem, em srie, para diferentes enzimas de restrio. Isto permite que distintos fragmentos estrangeiros cortados com diferentes enzimas de restrio sejam inseridos no vetor. Tais segmentos de DNA com mltiplos sitios de clonagem so denominados polylinkers. Um dos primeiros vetores de clonagem construdos foi o plasmdio pBR322, representado na Figura 11.10.
Figura 11. 10. pBR322 - Vetor de Clonagem apropriado para duplicar em E. coli. Contem a origem de replicao de plasmdios bacterianos e dois genes conferindo resistncia aos antibiticos Tetraciclina (Tet) e Ampicilina (Amp). Os diferentes stios de restrio esto indicados. Ainda no tinha polylinker. Observe que o gene que confere resistncia Tet possui stios para as enzimas de restrio BamHI e SalII e o gene que confere resistncia Amp possui um stio para PstI. Se em qualquer destes stios for introduzido um inserto o gene correspondente ficar inativado.
Suponha que um fragmento de DNA humano, cortado com BamH1 foi colocado num tubo de ensaio contendo pBR322 tambm clivado com BamH1. Alguns vetores vo se ligar ao fragmento exgeno (inserto) e, com ajuda da ligase formar a quimera. Outros vetores vo simplesmente ligar suas extremidades novamente sem incorporar o inserto. esta populao de vetores que ser utilizada para transformar E. coli. Como selecionar apenas as colnias que contem o vetor com inserto? Se os transformantes forem semeados em um meio seletivo contendo Amp, crescero todos os transformantes, com e sem inserto. Se as colnias AmpR forem ento transferidas, via carimbo (replica plating), para um meio contendo Tet, no crescero as colnias que possuam o vetor + inserto, justamento porque o inserto entra no gene que codifica resistncia a Tet, inativando-o. Assim, a partir das placas de Amp podemos isolar as bactrias que receberam o inserto. Estas bactrias sero estocadas e nomeadas para posterior identificao do inserto a inserido. Os plasmdios so usualmente utilizados para clonar fragmentos pequenos de DNA (5-10 kb). Quando se quer clonar fragmentos um pouco maiores pode-se utilizar o bacterifago l cujo DNA tem ~50kb de comprimento. A poro central do genoma do fago no essencial ao crescimento ltico podendo ser retirada e substituda pelo DNA exgeno. O DNA recombinante ento empacotado "in vitro" e a partcula madura utilizada para infectar clulas bacterianas. O tamanho 136 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS do inserto, neste caso, pode variar de 12 a 20kb, devendo ser proporcional ao segmento excisado (nem maior, nem menor), caso contrrio no ser possvel empacot-lo. Alguns vetores combinam caractersticas de plasmdio e do fago l e aceitam insertos maiores (40-45kb). Tais vetores denominados cosmdios podem existir como plasmdios mas contm os terminais coesivos do fago lambda (stio cos) numa distncia de 36 a 51 kb. Nestas condies o plasmdio pode ser empacotado "in vitro" para infectar a clula hospedeira. Uma vez que o cosmdio no tem genes do fago, ao ser introduzido na clula reproduz-se como um plasmdio. Um vetor de clonagem mais moderno o plamdio pBluescript II (Figura 11.11), com 2961 pares de base contendo: 1. A origem de replicao do plasmdio ColE1 que permite um alto nmero de cpias (~300 cpias/cel). 2. O gene que confere resistncia ampicilina para selecionar as clulas transformadas. 3. O gene lac Z que permite a deteco dos plasmdios recombinante por colorao das colnias. A enzima b-galactosidade produzida pelo gene lac Z quebra o composto X-gal adicionado ao meio de cultura, liberando um corante azul forte. Portanto, em colnias azuis o gene lac Z est funcional. No plasmdio recombinante, todavia, a insero do fragmento exgeno inativa o gene lac Z. Portanto, so as colnias brancas que contem o plasmdio recombinante. 4. Um polylinker de 108 pb contendo stios de clonagem para 23 enzimas de restrio diferentes na poro N-terminal do gene lac Z, sem interfirir no quadro de leitura do gene. A insero do fragmento na regio do polylinker vai alterar o quadro de leitura do gene lac Z, inativando-o. 5. Origem de replicao do fago de DNA fita-simples f1.
s vezes a quimera construda partir de um mRNA. Isto porque em eucariotos so freqentes genes muito grandes devido a presena de introns. Os introns so retirados no processamento da molcula gerando um mRNA bem menor que o gene, facilitando a clonagem. Alm disto, genes com introns clonados em bactrias no poderiam gerar o produto, porque no seriam processados. Como um gene clonado a partir o mRNA? Utiliza-se a transcriptase reversa para sintetizar uma molcula de DNA dupla-fita a partir de um RNA fita simples. O DNA obtido denominado DNA complementar ou cDNA. Esta seqncia ento inserida no vetor apropriado Cristina M. Bonato 137
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS como descrito acima. necessrio salientar que esta molcula, contendo apenas a regio codificadora do gene, no possui as seqncias reguladoras de iniciao (promotor) e terminao de transcrio, as quais devero estar presentes no vetor onde o gene ser inserido se quisermos que o mesmo seja expresso. Um outro tipo de vetor aquele que mimetiza um cromossomo e, portanto, permite a clonagem de milhares de pares de bases. Um destes vetores o YAC (yeast artificial chromosome) que se duplica em levedura e o outro o BAC (bacteria artificial chromosome), que se duplica em bactria. YACs: podem receber fragmentos de DNA de at 1Mb. Os YACs contem um stio de clonagem; o centrmero de leveduras; um par de seqncias telomricas; origens de replicao de levedura e de E. coli e marcas genticas para seleo tanto em levedura como em E.coli. Assim, o vetor YAC bifuncional j que pode se replicar e ser selecionado tanto em E. coli como levedura. Alis, qualquer plasmdio capaz de se propagar em clulas de duas ou mais espcies diferentes um plasmdio bifuncional (shuttle vector). BACs: podem receber fragmentos de 100.000 a 300.000 pb que sero herdados mais estavelmente que nos YACs. Os BACs funcionam como um cromossomo bacteriano, portanto possuem origem de replicao, marcas seletivas e stio para clonagem. No sequenciamento do genoma humano, longos fragmentos do DNA cromossmico humano foram clonados em BACs para serem posteriormente sequenciados.
Bibliotecas Genmicas e de cDNA

Uma biblioteca genmica refere-se ao conjunto dos fragmentos de DNA, obtidos do genoma completo de um organismo, clonados no vetor escolhido. Tal biblioteca feita uma nica vez porque ela pode ser perpetuada para uso sempre que uma nova sonda estiver disponvel. As bibliotecas genmicas podem ser geradas por uma tcnica denominada "shotgun cloning". Resumidamente, o DNA de um organismo isolado e submetido a digesto parcial por uma dada enzima de restrio, de sorte que o conjunto de fragmentos gerados contenha representantes intactos de cada um dos genes do genoma. Os fragmentos com tamanho adequado sero inseridos no vetor escolhido. Como calcular o nmero de clones para assegurar que uma dada seqncia esteja presente pelo menos uma vez na biblioteca? P= 1 - (1 - f)N Onde P= probabilidade; N= conjunto de clones; f= frao do genoma representada pelo fragmento clonado, em pares de bases. Portanto, N= log(1 - P) / log (1 - f) Por exemplo, considerando o genoma de E. coli, que possui 4700 kb (4,7.10 6pb) e decidindose por clonar fragmentos de 10kb, qual o nmero de clones necessrios para representar todos os genes do genoma, com uma probabilidade de 99%? N= log (1-0,99) / log (1-10/4700) N= log 0,01 / log 0,99787234 N= 2162 clones
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Assim, quanto maior o inserto clonado, menor o nmero de clones necessrios para representar o genoma. Por esta razo so utilizados vetores BAC ou YAC quando se pretende clonar genomas muito maiores que os de Bacteria ou Archaea. Uma vez clonados os fragmentos necessrio que encontremos entre os milhares clonados, aqueles que nos interessam, ou seja, preciso passar pela peneira (screen). Isto pode ser feito por hibridizao "in situ". As colnias que cresceram em meio seletivo so transferidas via replica plating para uma membrana de nitocelulose. Tratamento da membrana com NaOH lisa as clulas e desnatura o DNA, o que permite sua ligao a membrana. A secagem da membrana fixa o DNA in loco. A membrana ento mergulhada numa soluo contendo a sonda radioativa para o gene de interesse sob condies ideais para anelamento. Autorradiografia da membrana permite identificar as colnias que carregam o fragmento de interesse (Figura 11.12).
Figura 11. 12. Hibridizao in situ. Colnias que cresceram no meio seletivo contem o DNA recombinante. Estas placas constituem as placas mestres. A partir delas feita a rplica para a membrana de nitrocelulose. Na membrana as clulas so lisadas e o DNA desnaturado e fixado in loco. Aps hibridizao da membrana com a sonda radioaativa, a exposio ao filme de raio X revela a colnia que continha o fragmento de DNA com quem a sonda se hibridizou. Como a posio da colnia est fixada durante todo o processo, volta-se placa mestre e recupera-se o clone de interesse.
Uma biblioteca de cDNA refere-se a clonagem de fragmentos de DNA obtidos a partir de uma populao de mRNAs. As clulas expressam diferentes mRNAs durante o desenvolvimento do organismo e quando expostas a diferentes condies. Portanto, a populao de mRNAS de uma clula num dado momento no representa o genoma. Aps isolar a populao de mRNAs de uma clula, ela ser exposta transcriptase reversa que ir sintetizar DNA dupla fita a partir do molde de RNA. Este DNA complementar (cDNA) ao RNA ser ento clonado no vetor escolhido. Estes fragmentos contem basicamente a seqncia codificadora do gene, j que o mRNA no contem introns nem as seqncias controladoras de transcrio.
Protenas Recombinantes
O domnio da tecnologia do DNA recombinante permite que se produza, em grande escala, protenas raras ou totalmente novas. Para isto necessrio que o gene recombinante seja clonado num vetor de expresso, o qual contem seqncias controle de transcrio e traduo apropriadamente localizadas. Um plasmdio de controle relaxado da replicao e um promotor eficiente permitiro a sntese de um grande nmero de cpias do gene de interesse. A sntese da protena codificada por tais genes, na clula bacteriana, depender de sinais contidos no mRNA e que sero reconhecidos pelo aparato tradutor da bactria. Se o gene clonado for de origem eucaritica uma srie de providncias devem ser tomadas: Cristina M. Bonato 139
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS 1. Os elementos de controle para sntese de RNA e protenas dos eucariotos devem ser substitudos pelos de procariotos, caso contrrio no seriam reconhecidos. 2. Se o gene possui introns deve-se clonar o cDNA do mRNA correspondente, uma vez que as bactrias no tem a maquinaria para retirada dos introns e unio dos exons (splicing). 3. Para as modificaes ps-traduo que ocorrem nos eucariotos no existe uma estratgia universalmente aplicvel. Todavia, o desenvolvimento de vetores que se propagam em eucariotos eliminou muitos destes problemas. Algumas protenas recombinantes j so rotineiramente utilizadas na clnica mdica, tais como: insulina humana (tratamento de diabetes); fator de crescimento humano (tratamento de nanismo); eritropoietina (fator de crescimento secretado pelo rim que estimula a produo de eritrcitos); fator VIII de coagulao do sangue (para hemoflicos); fatores estimuladores de colnia (estimula a produo de leuccitos, utilizado nos casos de imunodeficincia); interferons (interfere na reproduo viral e tambm usado no tratamento de alguns canceres); interleucinas (ativam diferentes classes de leuccitos e poderiam ser utilizadas na cicatrizao de feridas, infeco por HIV, cancer, imuno deficincias); vacinas (como a da hepatite B, onde protena derivada da capa viral to eficiente em desencadear uma resposta imunolgica quanto o prprio vrus morto, porm mais segura); etc. Os escritrios de patente da Europa e dos USA j emitiram milhares de patentes para uso clnico de produtos de genes humanos geneticamente engenheirados. Se, num "site" de busca mundial, voc colocar a palavra chave "Recombinant Protein" aparecero dezenas de "sites" tratando do assunto, principalmente, comercializando os produtos. Algumas vezes h interesse em clonar um gene com alguma alterao que modifique uma dada protena de forma especfica para servir a um determinado propsito. Isto possvel via mutagnese stio-dirigida.
Mutagnese Stio-Dirigida
Na mutagnese stio-dirigida, altera-se a seqncia de bases (1 ou 2 pb) do DNA do gene de interesse, clonado num vetor especfico. Duas abordagens tm sido utilizadas para alterar o gene e consequentemente, engenheirar a protena: 1. Um pequeno segmento do gene que se deseja alterar removido pela ao de uma enzima de restrio que possua stios prximos, ladeando o segmento, o qual ser substitudo pelo segmento sinttico equivalente (oligonucleotdio), alterado em um nico par de bases, por exemplo. 2. Caso stios de restrio no estejam disponveis prximos ao local que se deseja alterar, sintetiza-se um pequeno segmento de DNA (oligonucleotdio), complementar regio de interesse, porm, contendo a alterao desejada. O plasmdio contendo o gene desnaturado e a fita simples do plasmdio anela-se a fita simples do oligonucleotdio snttico. Este anelamento no perfeito, visto que existe uma alterao de bases (mismatch). O oligonucleotdio funcionar como um primer para sintetizar a fita complementar do plasmdio. O plasmdio dupla fita transformar bactrias onde ir se duplicar gerando plasmdios com genes alterados e plasmdios com genes no-alterados. Em meio seletivo sero isolados os plasmdios alterados, contendo o gene que sintetizar a protena recombinante carregando a modificao desejada (Figura 11.13).
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Figura 11. 13. Um oligonucleotdio complementar a uma poro do gene A do plasmdio, carrega uma alterao e apesar do emparelhamento defeituoso funciona como um primer. Tambm funciona como primer o oligonucleotdio complementar ao gene amp que corrige a mutao existente no plasmdio. Aps a sntese da fita complementar o plasmdio hbrido dupla fita transforma clulas bacterianas e se duplica, sendo gerados, de um lado, plasmidios com gene A alterado e resistncia ampicilina (ampR) e, de outro, plasmdios com gene A selvagem e sensibilidade ampicilina (ampS). As bactrias contendo o gene A mutado sero selecionadas em meio contendo tetraciclina e ampicilina.
Organismos Transgnicos
O termo transgnico refere-se a animais ou plantas nos quais um novo segmento de DNA tenha sido incorporado na clula germinativa. Vejamos alguns exemplos de transgnicos: Salmo gigante engenheirado com hormnio de crescimento - Sabemos que a expresso de um gene depende dos elementos reguladores encontrados, geralmente, montante da regio codificadora, aos quais se ligam protenas reguladoras (fatores de transcrio) que podem ativar ou inibir a transcrio. O gene que codifica a protena metalotionena contem elementos reguladores altamente eficientes podendo induzir um alto nvel de expresso da protena na presena dos estimuladores adequados. Quando esta regio regulatria associada ao gene do hormnio de crescimento do salmo, vai induzir uma alta expresso deste gene. O salmo da espcie coho um peixe pequeno (~10cm) do oceano Pacfico e foi engenheirado com o hormnio de crescimento sob controle da regio regulatria do gene da metalotionena, ambos provenientes de uma espcie maior de salmo (sockeye). Os salmes coho transgnicos mediam, em mdia, 42 cm e eram 11 vezes mais pesados que os originais (Devlin et al., 1994). Plantas transgnicas: A introduo de DNA recombinante em plantas poderia propiciar a produo de alimentos mais nutritivos e assegurar uma alta produo de gros, resistindo a estresses ambientais tais como o ataque de insetos, nematides, vrus, alta temperatura ou seca. As plantas de algumas espcies podem se desenvolver a partir de uma nica clula, de sorte que se introduzirmos um gene modificado nesta clula, ele ser transmitido a todas as clulas do indivduo adulto e s geraes futuras. Cristina M. Bonato 141
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A introduo na planta do gene modificado depende de um vetor. O vetor que tem sido utilizado o plasmdio Ti (Tumor-inducing), de ~ 200kb. Este plasmdio est presente na bactria de solo Agrobacterium tumefaciens, que invade plantas sensveis, num local onde exista um ferimento. Um segmento do plasmdio, denominado DNA T (23kb), flanqueado por repeties diretas de 25pb, transforma as clulas da planta integrando-se em qualquer stio dos cromossomos vegetais. O segmento T, depois de integrado, induz a formao de um tumor na planta (crown gall tumor). Este um exemplo natural de engenharia gentica, com transferncia de informao de um procarioto para um eucarioto (Figura 11.14 A). O DNA T codifica protenas que estimulam a diviso celular da clula infectada (tumor) e enzimas que convertem o aminocido arginina em nopaline ou octopina, necessrios ao crescimento da prpria bactria e metabolizados apenas por ela. O processo de transferncia do DNA T depende de seis genes presentes na regio vir do plasmdio. A expresso dos genes vir induzida por um composto fenlico (acetilsiringona) que produzido e excretado pelas clulas da planta na regio do ferimento. Utilizando tal sistema, foi possivel criar plantas de tomate resistentes ao ataque da larva de mariposa. A bactria Bacillus thurigiensis produz uma protena que txica para a larva de certas espcies de mariposa que atacam o tomateiro. Esta toxina, todavia, no txica aos seres humanos. O gene que codifica esta toxina, quando transferido para a planta torna-a resistente ao ataque da larva (Figura 11.14 B).
Figura 11. 14. A. Estratgia de dois plasmdios para criar uma planta recombinante de tomate. Um dos plasmdios est envolvido no processo de transferncia (genes vir) e o outro contem o segmento que ser transferido (toxina de B. thuringiensis). Este segmento mimetiza o T DNA, uma vez que est flanqueado pelas repeties de 25pb mas, ao invs dos genes indutores de tumor, contem um gene de Bacillus thuringiensis que codifica uma toxina e outro gene codificando resistncia kanamicina. O fentipo de resistncia kanamicina permite selecionar as plantas recombinantes. B. Tomateiros expostos a larva da mariposa: direita est a planta transgnica que resistiu ao ataque.
Plantas resistentes ao herbicida glyphosate: a primeira planta recombinante de valor comercial foi desenvolvida em 1985. A produo agrcola tem dependido de herbicidas utilizados contra as hervas daninhas da cultura. Um dos herbicidas mais comercializados no mundo o Roundup cujo ingrediente ativo o glyphosate que ataca plantas e microrganismos. O problema na sua aplicao, porque s pode atingir as ervas daninhas uma vez que tambm txico para a colheita. Um mutante de Salmonella typhimurium resistente ao glyphosato permitiu que a forma resistente do gene fosse isolada, clonada em E. coli e reclonada no DNA T de Agrobacterium. 142 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Plantas transformadas com o gene de resistncia ao glyphosato produziram variedades de milho, algodo, tabaco e outras, resistentes ao herbicida.
Guia de Estudo
Porque as enzimas de restrio produzidas por uma dada bactria no degradam seu prprio DNA? Quais as caractersticas de uma biblioteca genmica e de uma biblioteca de cDNA? O que as tcnicas de Southern, Northern e Western Blot permitem visualizar, respectivamente? Um fragmento linear de DNA foi clivado individualmente com as enzimas HindII e SmaI. Paralelamente, foi clivado com as duas enzimas ao mesmo tempo. Foram obtidos os seguintes fragmentos: tubo 1 (HindII): 2,5kb e 5,0 kb tubo 2 (SmaI): 2,0 kb e 5,5 kb tubo 3 (HindII e SmaI): 2,5 kb, 3,0 kb e 2,0 kb. a) desenhe o mapa de restrio b) os fragmentos do tubo 3 foram submetidos clivagem com a enzima EcoRI. Num gel de agarose colorido com brometo de etdio, a banda original de 3kb desapareceu, tendo surgido uma banda que representa um fragmento de 1,5kb. Marque o stio de clivagem de EcoRI no mapa de restrio. Qual a metodologia utilizada por Sanger para seqenciar o DNA? A protena W, isolada de uma linhagem selvagem de E. coli, pode ser detectada pelo anticorpo anti-W. O peso molecular da protena W 40kDa. Voc isolou a protena W e produziu o anticorpo anti-W. Submeteu a protena eletroforese em gel de acrilamida. Transferiu para nitrocelulose. Exps a nitrocelulose ao anticorpo marcado anti-W. O anticorpo anti-W liga-se protena alvo (W). O resultado mostrado abaixo, na linha 1:
Que resultados voc esperaria obter se ocorressem as seguintes mutaes: Inativao do promotor do gene W (linha 2) Mutao nonsense no gene W, localizada adiante do terminal 5'do mRNA (linha 3) Mutao missense, localizada adiante do terminal 5'do mRNA (linha 4) Deleo de um nucleotdio do cdon de parada de traduo, permitindo que a traduo continue ainda por mais 90 nucleotdios ao longo do mRNA (linha 5) Cristina M. Bonato 143
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Obs.: O peso mdio de um aminocido 110 daltons. Desenhe as bandas nas linhas correspondentes a cada tipo de mutao, na posio relativa a seu peso molecular. Deseja-se clonar um gene que confere resistncia ampicilina (ampr ) em um plasmdeo que possui o gene de resistncia a canamicina (canr ), como marca de seleo. Os mapas de restrio so dados abaixo.
Para obter clones positivos, digere-se o DNA genmico e de plasmdeo com certa enzima e, em seguida, utiliza-se um antibitico para seleo. A enzima e o antibitico apropriados so, respectivamente, (A) Eco RI e canamicina. (B) Eco RI e ampicilina. (C) Sal I e ampicilina. (D) Sal I e canamicina. (E) Hind III e ampicilina. O que o DNA T? Como funciona? O que mutagnese stio-dirigida? O que um vetor de expresso? O que so cosmdios? O que so YACs e BACs? O que so RFLPs? O que o sistema de modificao-restrio?
Captulo 12 Regulao da Expresso Gnica em Bactria

Viso Geral
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Nem todos os genes so continuamente expressos numa clula. Dependendo da situao em que a clula se encontre, conjuntos apropriados de genes sero acionados. Por exemplo, sob condies de estresse, tais como aumento de temperatura, aumento de concentrao salina ou diminuio da quantidade de O2 disponvel, a clula "ligar> certos genes especficos, capazes de responderem a tais situaes adversas e "desligar" outros. Tambm, durante o ciclo celular, a cada momento, expressam-se diferentes conjuntos de genes para executar as tarefas especficas de cada fase do ciclo. o conjunto de protenas encontrados numa clula, numa dada situao, que lhe confere seus atributos especficos. Uma clula de bactria, como E. coli contem toda informao gentica necessria ao seu metabolismo, crescimento e reproduo. Pode sintetizar qualquer molcula orgnica a partir de ons inorgnicos e glicose. Muitos de seus genes esto se expressando continuamente, ou seja, esto ligados. Genes com expresso constante so denominados genes de expresso constitutiva. Outros genes, como citado anteriormente, s so ligados em circunstncias muito especiais onde seus produtos so necessrios. A expresso destes genes, portanto, regulada. Neste captulo iniciaremos o estudo dos mecanismos que regulam a expresso gnica e usaremos como modelo, genes bacterianos que codificam polipeptdios. A presena ou no de uma atividade protica num determinado momento pode ser regulada em diferentes nveis: Transcrio: o gene poder ou no ser transcrito e isto depende da habilidade da RNA polimerase acionar os promotores desejveis no momento certo (vide Reconhecimento do promotor) Traduo: o mRNA poder ou no ser traduzido em determinadas circunstncias e a eficincia eficincia do processo tambm poder ser controlada. Ps-traduo: o peptdeo resultante poder ser modificado para exercer sua funo, pois nem sempre sintetizado na forma ativa. As modificaes podem implicar em protelise parcial, fosforilao, acetilao, metilao, dimerizao, etc.
Em bactrias a atividade gnica controlada, predominantemente, ao nvel da transcrio. Se uma determinada atividade for requerida pela clula a transcrio do gene correspondente ser induzida (Sistema induzvel). O fenmeno de induo implica em aumentar espetacularmente (1.000-10.000 vezes), o nmero de cpias de mRNA existentes em nvel basal. Por outro lado, se uma determinada atividade precisar ser "desligada", ento a transcrio do gene correspondente ser reprimida por reguladores que bloqueiam a ao da RNA polimerase (Sistema Reprimvel). Na bactria E. coli, um exemplo de Sistema Induzvel o operon lac, responsvel pela degradao da lactose (via degradativa) e que s induzido quando lactose a nica fonte de carbono disponvel. Um exemplo de Sistema Reprimvel o operon triptofano, que contem os genes responsveis pela sntese do triptofano (via biossinttica) e que somente ser reprimido quando a concentrao de triptofano na clula for alta.
Sistema Lac
A lactose, um dissacardio encontrado no leite, um b-galactosdio que pode ser utilizado pela bactria E. coli como fonte de carbono e energia, aps sua quebra em glicose e galactose. A enzima que quebra a lactose a b-galactosidase (b-gal), codificada pelo gene lacZ. Esta mesma enzima tambm capaz de modificar a lactose convertendo-a em alolactose a qual, na verdade, a molcula indutora do operon lac (Figura 12.1).
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Figura 12. 1. Degradao e modificao da lactose pela enzima b-galactosidase, cuja transcrio induzida em presena do indutor 1,6-alolactose.
O que um operon? Um operon um grupamento de genes adjacentes sob controle do mesmo promotor/operador. Em geral os genes de um mesmo operon executam funes relacionadas. Quando um operon induzido, todos os genes que dele fazem parte so transcritos numa molcula nica de mRNA. Tal molcula denominada RNA polignico ou policistrnico. Tais grupamentos de genes so comuns em Bacteria e Archaea e ainda podem ser encontrados em alguns eucariotos. O operon lac constitudo pelos genes lacZ, lacY e lacA, sob o controle dos stios P (promotor) e O (operador)(Figura 12.2).
Figura 12. 2. Operon Lac
Qual a funo de cada um destes genes? O gene lac Z, como mencionado acima, tanto modifica como degrada a lactose que entra na clula. A entrada da lactose na clula depende da ao de uma protena transportadora transmembrana denominada b-galactosdio permease codificada pelo gene lac Y. O gene lac A codifica a enzima tiogalactosdeo transacetilase que, in vitro, transfere grupos acetil da acetil-CoA para o grupo OH do C6 b-galactosdeos. Como a fermentao da lactose ocorre normalmente na ausncia desta enzima sua funo fisiolgica desconhecida. Numa linhagem selvagem de E. coli, a quantidade de b-galactosidase presente em clulas cultivadas na ausncia de lactose muito baixa (nvel basal). Todavia, assim que as clulas so transferidas para um meio contendo lactose como nica fonte de carbono, a atividade de b-galactosidade aumenta cerca de 1.000 vezes (Figura 12.3). Ao mesmo tempo 146 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS induzida a sntese de permease e acetilase. Alm disto, se glicose e lactose esto presentes no meio, o operon lac no induzido enquanto a glicose no se esgotar.Tais observaes permitem propor a existncia de um controlador, regulando a expresso concomitante destes genes. Mostra ainda que este controlador, de alguma forma detecta a presena de lactose ou do bgalactosdio alolactose, em cuja presena a expresso dos genes do operon liberada, desde que no haja glicose no meio. Como decifrar este sistema?
Mutantes Lac
A utilizao de mutantes com perda de funo, para os genes lac Z, lac Y e lac A, e tambm de mutantes controladores permitiu a elucidao do sistema. Inicialmente foram isolados mutantes de diversos tipos: Mutantes com perda de funo para os genes lacZ e lacY, incapazes de utilizar lactose (Lac -). Estes mutantes so designados z- e y- enquanto a forma selvagem designada z+ e y+. Mutantes constitutivos, ou seja, mutantes que sintetizavam as enzimas mesmo na ausncia do indutor. Dois tipos de mutantes constitutivos foram isolados: i- e oc. Mutantes suprimidos, ou seja, mutantes que nunca sintetizavam as enzimas, mesmo que o indutor estivesse presente e que mapeavam na mesma posio da mutao i-. Em seguida, foi feita uma anlise de diplides parciais gerados por sexduo, o que permitiu entender melhor o sistema. Mutantes estruturais Quando o operon lac z - y+ incorporado ao fator F' transferido para uma linhagem F - z+ y -, os diplides parciais (merozigotos) gerados, F z - y+ / z+ y -, so do tipo selvagem, ou seja, fermentam a lactose e produzem quantidades normais das enzimas b-galactosidase, permease e acetilase (Tabela 12.1), indicando que: a) houve complementao, portanto, as mutaes z b) z+ e y+so dominantes sobre z - e y -.
-
e y
pertencem a genes diferentes;
Os genes codificadores das enzimas (lacZ, lacY e lacA) foram nomeados genes estruturais. Experimentos com merozigotos haviam demonstrado que mutaes nos genes estruturais afetavam apenas a estrutura da enzima correspondente. Assim, mutantes z -, por exemplo, no produziriam b-galactosidase ativa, mas poderiam produzir permease e acetilase ativas. Tabela 12. 1. Diplides parciais dos genes estruturais Gentipo Fentipo Concluso Complementao total: z e y pertencem a cistrons diferentes No h complementao: mesmo cistron (y) F z - y +/ z+ y- Fermenta lactose F z+ y - / z- y+ Fermenta Lactose F z+ y- / z+ y No Lactose fermenta
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Mutantes i -, oC e iS Nos mutantes constitutivos a transcrio do operon lac nunca est "desligada", mesmo na ausncia de indutor. Experimentos de conjugao entre linhagens Hfr e F -, permitiriam mapear esta nova mutao, que se mostrou independente do operon lac, posicionando-se montante de lac Z. O lcus foi nomeado lac I e a mutao i -. Os mutantes i - produzem as mesmas quantidades de enzimas (Z, Y e A) que o selvagem induzido. Tais fatos poderiam significar que o gene lac I codificava um Repressor do sistema, controlando negativamente a expresso dos trs genes (Figura 12.4).
Figura 12. 4. Mutaes no gene lac I podem redundar em expresso constitutiva (i -) ou suprimida (iS). Mutaes em O podem redundar em mutao constitutiva (oC).
O outro tipo de mutao constitutiva mapeava entre o gene lac I e o lac Z e s tinha efeito sobre a expresso dos genes adjacentes, portanto, no mesmo cromossomo. Foi assim encontrado um stio de ao em cis, ou seja, uma regio de controle que s ativa na mesma molcula, regulando genes adjacentes. Tais mutantes foram denominados oC (operator constitutive). Como se testou a possibilidade de haver um repressor do sistema? Como foi possvel distinguir entre os dois tipos de mutantes constitutivos?
Elucidando o Sistema: Diplides Parciais e Indutores Gratuitos

A anlise dos diplides parciais envolvendo os genes estruturais e o regulador, assim como a utilizao de indutores gratuitos, permitiu o estabelecimento de um modelo de regulao do operon lac. O que so indutores gratuitos? So b-galactosdios capazes de induzirem o sistema sem, todavia, serem substrato para a enzima b-galactosidase. Assim, se as bactrias crescerem em presena de glicerol como nica fonte de carbono, pode-se analisar o efeito do indutor sob a sntese das enzimas independente da metabolizao do b-galactosdio. O indutor mais eficiente do sistema foi o isopropil tiogalactosdio (IPTG) que passou, ento, a ser utilizado nas anlises subsequentes. Quando os merozigotos com duplas mutaes (F i - z+ y+/i+ z - y+ ou F i+ z+ y - / i - z+ y+) foram analisados, verificou-se que a produo das enzimas s ocorria na presena de IPTG (Tabela 12.2). Portanto: 148 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS a) o alelo induzvel i+ era dominante sobre o alelo constitutivo i -; b) o alelo induzvel i+ tinha ao em trans, em relao aos genes lac Z e lac Y. Dos resultados obtidos podia-se inferir que: a) lac I era um gene independente cujo produto, com ao em trans (atuava tanto no plasmdio como no cromossomo bacteriano), regulava negativamente a expresso de lac Z e lac Y; b) a funo repressora do produto de lac I era antagonizada pelo indutor IPTG. Tal idia foi confirmada quando se isolou um outro tipo de mutante, o mutante iS. Em mutantes iS o operon lac est sempre reprimido, mesmo em presena do indutor. No merozigoto iS/i+ a transcrio do operon lac encontra-se travada, indicando que iS dominante sobre i+. Tal comportamento sugeria que o repressor tinha perdido a capacidade de se ligar ao indutor mantendo, portanto, o operon lac desligado. Quando o merozigoto F i + oC z- y+ / i + o+ z+ y+ foi testado, apesar da mutao constituiva oC em F, a expresso de b-gal no diplide parcial no constitutiva mas, a da permease constitutiva. Isto demonstrava que o Operador s agia em cis, ou seja, o oC plasmidial no tem qualquer efeito sobre a expresso do gene z+ presente no cromossomo. Uma vez que no cromossomo o Operador no est mutado, s ocorrer expresso de b-gal quando houver indutor no meio. A permease, todavia, ter expresso constitutiva porque est sob ao de oC. O isolamento dos mutantes oC (Figura 12.5.) permitiu definir claramente a existncia do operador com ao em cis, numa poca em que ainda no se seqnciava o DNA nem estava desenvolvida a tcnica de footprinting que permitiu estabelecer exatamente qual era o fragmento do DNA ao qual se ligava o repressor. Alis, nem o prprio repressor havia sido isolado (Isolando o Repressor). A descoberta deste sistema de regulao da expresso gnica foi feita por Jacob & Monod, valendo-lhes o Prmio Nobel em 1965.
Tabela 12.2. Expresso do operon lac em haplides e diplides parciais na presena e ausncia do indutor (IPTG) Gentipo B-gal - IPTG +IPTG i+ o+ z+ y+ i - o+ z+ y+ i + oC z+ y+ i S o+ z+ y+ F i - o+ z+ y+ / i + o+ z - y+ F i - o+ z- y+ / i - o+ z+ yF i + oC z- y+ / i + o+ z+ y+ F i + oC z+ y+ / i + o+ z+ y+ + + + + + + + + + + + Permease - IPTG + IPTG + + + + + + + + + + + + Repressor funcional Repressor no No reconhece o Operador Repressor funcional e Operador constitutivo Super Repressor: no se liga ao indutor. Ao em trans Repressor funcional agindo no DNA plasmidial. Ao em trans. Repressor no-funcional. No reconhece o Operador Repressor funcional e operador constitutivo no plasmdio. Ao em cis. Repressor funcional e operador constitutivo funcional. Observaes
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no plasmdio. Ao em cis. F i + o+ z+ y+ / iS o+z+ y+ F i - o+ z+ y+ / iS o+ z+ y+ Super Repressor: no se liga ao indutor. Ao em trans Super Repressor: no se liga ao indutor. Ao em trans
Figura 12. 5. Seqncia de DNA do Operador, a qual reconhecida pelo Repressor. Esto indicadas mutaes identificadas neste stio e que tornam o operador constitutivo.
Controle Negativo: O Repressor em Ao

O gene regulador lac I codifica uma protena repressora que impede a transcrio do operon lac ao nvel do DNA. A ao do repressor antagonizada pelo indutor (IPTG, alolactose). O repressor lac uma protena tetramrica, alostrica, que reconhece uma seqncia especfica do DNA denominada operador. Enquanto protena alostrica, possui stios para ligao tanto com o DNA como com o indutor, de sorte que cada vez que se liga a uma das molculas, sua conformao alterada e sua habilidade de reagir com a outra molcula afetada. Na ausncia do indutor, liga-se ao DNA. Na presena de indutor, liga-se a ele, o que diminui significativamente sua afinidade pelo stio operador no DNA Alguns nucleotdeos do operador sobrepem-se aos do promotor, onde se liga a RNA polimerase. Assim, quando o repressor est ocupando sua posio no operador, a RNA polimerase no pode atuar - operon desligado (Figura 12. 6). Os genes do operon lac s sero liberados para transcrio quando o indutor ligar-se ao repressor - operon ligado (Figura 12. 7). Quando a concentrao do indutor diminui dentro da clula, o repressor volta a conformao anterior e liga-se ao DNA, "desligando" o operon
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Figura 12. 6. Operon Lac Desligado. Quando o tetrmero repressor liga-se ao stio Operador, impossibilita a ao da RNA polimerase.
Figura 12. 7. Operon Lac Ligado. Na presena do Indutor, o tetrmero repressor inativado. O stio operador livre no bloqueia mais a ao da RNA polimerase.O operon lac transcrito e o mRNA polignico traduzido, gerando as enzimas bgalactosidase, permease e acetilase.
Controle Positivo: CAP-cAMP em Ao

Quando a bactria E. coli cultivada em presena de glicose + lactose, a expresso do operon lac permanece inibida at que a lactose seja exaurida. A represso do operon lac pela glicose denominada represso pelo catablito e o resultado dos baixos nveis de cAMP intracelular, caracterstico de clulas crescendo com suprimento adequado de glicose. Quando o nvel de glicose cai, os nveis de cAMP aumentam e, simultaneamente os galactosdios induzem o sistema ligando-se ao repressor. Em conseqncia, o promotor liberado para ligao da RNA polimerase. Como agem as molculas de cAMP? cAMP interage com a protena CRP (cAMP receptor protein), tambm denominada CAP (catabolite activator proteina). O complexo cAMP/CAP, na forma de um dmero tem afinidade por uma regio do promotor, montante da regio onde a RNA polimerase se liga. A ligao do complexo facilita a ligao da RNA polimerase, aumentando em 50 vezes sua atividade (Figura 12. 8).
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Figura 12. 8. A glicose inibe a atividade da Adenilato Ciclase, a qual sintetiza cAMP a partir de ATP. Em conseqncia, a concentrao de cAMP diminui dentro da clula, no ativando eficientemente o fator de transcrio CAP. O complexo CAPcAMP um ativador do Operon Lac. Sem ele a transcrio bastante ineficiente porque o promotor Lac um promotor fraco, ou seja, um promotor pelo qual a RNA polimerase tem baixa afinidade. Isto porque a seqncia do promotor difere um pouco do consenso, dificultanto o reconhecimento pelo fator sigma 70 (s70). Da a necessidade de ajuda.
O Operon Lac um modelo tanto de controle positivo como negativo. O repressor codificado pelo gene lac I mantem o sistema trancado (controle negativo), at que ele seja induzido por um bgalactosdio. J o complexo cAMP/CAP imprescindvel para a ocorrncia da transcrio, pois propicia a ligao da RNA polimerase (controle positivo). Mesmo em presena do indutor, se o stio de ligao do complexo cAMP/CAP estiver alterado, a transcrio ocorrer em nveis baixssimos.Logo, a lactose s age como indutor na ausncia de glicose. Sempre que glicose e lactose estiverem presentes no meio o operon lac no ser induzido, at que a concentrao de glicose decaia.
O Fago Lambda: Lise ou Lisogenia?

Os vrus so estruturas muito especiais e simples constitudas, basicamente, de uma molcula de cido nuclico envolvida por uma capa protetora. A molcula de cido nuclico contem a informao gentica do vrus, a qual ser transmitida s novas geraes de partculas virais. Para se reproduzirem precisam infectar uma clula. So, portanto, parasitas celulares. Tanto clulas de eucariotos como de procariotos podem ser infectadas por vrus. Em geral as clulas apresentam stios receptores especficos para determinados vrus de sorte que a interao clula-vrus especfica. Uma clula que permite infeo por um determinado vrus denominada clula hospedeira. Vrus que infectam bactrias so denominados bacterifagos ou, simplesmente, fagos. Aos vrus que infectam as clulas vegetais ou animais referimo-nos, de um modo geral, como vrus vegetais e vrus animais. A informao gentica dos vrus pode estar contida em molculas de DNA ou de RNA Nunca DNA e RNA coexistem em uma mesma partcula viral. Na maioria das vezes o DNA fita dupla e o RNA fita simples. Todavia, podem ser encontrados vrus de DNA fita simples e vrus de RNA fita dupla. Em alguns vrus a quantidade de informao disponvel suficiente para codificar de 3 a 10 tipos de protenas enquanto em outros so codificadas de 100 a 200 tipos. A partcula viral infecciosa denominada vrion e consiste de cido nuclico protegido por uma capa protica.
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MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS A capa protetora viral constituda principalmente de protenas A capa protetora, denominada capsdeo, constituda de uma pequena variedade de protenas, especfica para cada tipo de partcula viral. Em alguns exemplos conhecidos, molculas de carboidratos e lipdeos tambm fazem parte do capsdeo. Na maioria das vezes, o volume interno do capsdeo, apenas levemente superior ao volume ocupado pelo prprio cido nuclico. Em alguns vrus muito simples, o capsdeo tem um nico tipo de protena, com centenas de cpias idnticas arranjadas em estrutura regular, helicoidal, em torno do cido nuclico. Este o caso do vrus vegetal TMV, vrus do mosaico de tabaco, que um vrus de RNA. Durante a montagem do capsdeo, as protenas so arranjadas em volta do RNA, condensando-o, via interaes RNA-protena (Figura 12. 9).
Figura 12. 9. No TMV, o capsdeo um filamento de ~2.000 molculas idnticas de protenas arranjadas helicoidalmente em torno da molcula central de RNA fita simples, que contem, ~6000 nucleotdeos (2nm).
O bacterifago Lambda (l), que infecta E. coli, contem mais de um tipo de cadeia polipeptdica e apresentam um capsdeo com simetria icosadrica (poliedro de 20 faces). O capsdeo construdo como uma concha vazia e s ento o cido nuclico (DNA dupla fita) inserido, condensando-se conforme vai entrando. Assim, o empacotamento posterior construo do capsdeo ao qual se conecta uma cauda com fibras terminais que so utilizadas no processo de reconhecimento e infeo do hospedeiro (Figura 12.10).
Figura 12. 10. No capsdeo do bacterifago l est empacotada uma molcula de DNA dupla fita de ~ 50Kb codificando cerca de 50 protenas. O DNA inserido na cabea vazia, que se expande durante o processo. A estrutura estabilizada pela adio da cauda e fibras, originando a partcula madura.
Em alguns casos, como no do HIV, um vrus animal de RNA, o capsdeo envolvido por uma membrana (vrus de envelope). A aquisio do envelope ocorre via um processo de brotamento ao nvel da membrana plasmtica (Figura 12. 11).
Figura 12. 11. Vrus animal com envelope. O envelope constitudo da bicamada lipdica e protenas especficas da membrana plasmtica da clula infectada.
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Controle Temporal na Expresso dos Genes Virais

Ao infectar a clula hospedeira o vrus injeta uma molcula de cido nuclico dentro da clula livrando-se da capa protetora. No caso do bacterifago l, as fibras terminais da cauda interagem com uma protena de membrana da E. coli, responsvel pelo transporte de maltose, codificada pelo gene lamB. Esta interao inicia um processo pouco compreendido, no qual o DNA linear do fago injetado na clula hospedeira. Assim que penetra no hospedeiro, o DNA do l se circulariza, uma vez que apresenta terminais 3' e 5' complementares (terminais coesivos) que so covalentemente ligados pela ligase do hospedeiro. A molcula invasora ser utilizada como molde para a sntese de mRNAs virais e tambm para a sntese de novos genomas virais. A traduo dos mRNAs virais leva produo de enzimas e protenas estruturais envolvidas no ciclo de desenvolvimento do fago. Todavia, a expresso dos genes virais rigidamente controlada ao nvel de transcrio. Algumas molculas de mRNAs virais, produzidas imediatamente aps a infeco, codificam protenas reguladoras que controlam a expresso posterior de outros genes, criando-se uma cascata na qual grupos de genes so ligados ou desligados no momento exato. Freqentemente observa-se uma correlao entre a ordem temporal de expresso dos genes e a ordem espacial de organizao dos genes nos cromossomos. O bacterifago l um exemplo marcante desta correlao (Figura 12. 12). Os genes que codificam protenas com funes relacionadas esto todos agrupados permitindo que sejam controlados por um nmero reduzido de promotores e protenas reguladoras. Ao infectar a bactria E. coli, o fago l pode seguir dois caminhos: Seu genoma replica-se vegetativamente originado novas partculas fgicas e lisando a clula hospedeira (via ltica); Seu genoma integra-se ao genoma do hospedeiro e a permanece silencioso por longo tempo, duplicando-se juntamente com o cromossomo do hospedeiro, sem lisar a clula (via lisognica).
Figura 12. 12. Mapa gentico do fago l na forma circular intracelular. Antes de ser empacotado dentro do capsdeo o DNA do fago cortado no stio cos, tornando-se linear. O genoma do l possui cerca de 50.000 pb. Os promotores/operadores PLOL e PROR controlam a transcrio esquerda e direita, respectivamente. Inicialmente so transcritos os genes reguladores. Dependendo do equilbrio momentneo entre as protenas reguladoras, desencadeia-se a transcrio, esquerda, de genes emvolvidos na integrao do genoma do vrus ao genoma do hospedeiro (lisogenia) ou a transcrio, direita, de genes envolvidos na montagem de partculas virais (lise).
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Via Ltica de Desenvolvimento

Na via ltica de desenvolvimento h multiplicao das partculas virais com morte da clula hospedeira. A seqncia de eventos no ciclo ltico pode ser resumida em: O fago adsorvido ao receptor presente na superfcie da bactria; O DNA injetado na clula; Inicia-se a transcrio dos genes virais; Os mRNAs so traduzidos pela maquinaria do hospedeiro; O cido nuclico do fago replica e recombina; Os capsdeos so montados e o DNA empacotado com posterior adeso da haste e fibras; O cromossomo bacteriano degradado; A clula hospedeira lisada; Dezenas de partculas virais so liberadas (Figura 12. 13).
Figura 12. 13 Infeco fgica da bactria E. coli. Os primeiros genes a serem transcritos so os genes reguladores. A seguir so transcritos os genes que codificam enzimas envolvidas na sntese, recombinao e modificao do DNA, levando a uma produo massiva do genoma do fago. Posteriormente so ativados genes que codificam os componentes proticos que participam da estrutura e montagem da partcula viral.
Via Lisognica de Desenvolvimento

Na via lisognica de desenvolvimento o fago integra-se ao cromossomo da clula hospedeira, sem lise celular. O bacterifago l um exemplo de fago que apresenta tanto a via ltica como a lisognica. Quando o DNA do l est integrado ao cromossomo bacteriano a replicao autnoma do cromossomo do fago fica reprimida e o fago s se duplica a cada diviso celular da bactria, como parte integrante do cromossomo hospedeiro. Esta forma de perpetuao do genoma do fago no implica nem na morte da clula nem na liberao de partculas virais, uma vez que a maioria dos genes virais estaro reprimidos. O genoma viral integrado e inativo denominado profago. Este tipo de interao fagohospedeiro denominada lisogenia e as clulas hospedeiras so denominadas lisognicas. Fagos capazes de estabelecerem este tipo de interao com a clula hospedeira so denominados fagos temperados (Figura 12. 14).
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Figura 12. 14. Ciclo lisognico. Fagos temperados como o bacterifago l podem optar pelo ciclo ltico ou lisognico. As recombinases codificadas pelo fago so responsveis pela integrao do genoma do fago ao cromossomo bacteriano. Aps integrao, a expresso gnica do fago ficar quase que completamente reprimida. Na condio de profago no provocar qualquer dano clula hospedeira.
A opo entre as vias ltica e lisognica de desenvolvimento governada por protenas codificadas tanto pelo genoma do fago como da bactria e, tambm, pelas condies de infeco. Dependendo do estado escolhido, ltico ou lisognico, diferentes conjuntos de genes sero transcritos a partir do genoma viral. Uma vez que um ou outro padro de transcrio tenha se estabelecido, ele mantido estavelmente. O fago lintegrado poder permanecer latente no genoma hospedeiro de E. coli por milhares de geraes celulares. Bactrias lisognicas so imunes infeco por outras partculas virais do mesmo tipo, ou seja, se uma bactria lisognica for infectada por um fago de mesmo tipo ele no poder se multiplicar.
Transcrio Precoce
De acordo com sua ordem de expresso, podemos distinguir trs grupos de genes no fago l: precoce imediato, precoce posterior e tardio. Quando o fago l infecta a clula bacteriana, seu DNA se circulariza e comea a ser transcrito via RNA polimerase do hospedeiro, a partir dos promotores PL (Left, esquerda) e PR ( Right, direita). Os primeiros genes transcritos codificam protenas reguladoras que controlaro os passos posteriores de desenvolvimento. Os genes reguladores esto todos agrupados numa regio especfica do cromossomo sob o comando dos promotores PL, PR e PRM. Na fase precoce imediata de transcrio os promotores PL e PR controlam, respectivamente, a expresso de genes N ( esquerda) e cro ( direita), transcritos em sentidos opostos. Isto implica que fitas complementares so utilizadas como molde pela RNA polimerase. Entre os dois promotores encontra-se o gene cl e seu promotor PRM (Figura 12. 15).
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Figura 12. 15. O fago l apresenta duas unidades de transcrio precoce imediatas. A fita superior transcrita para a esquerda e a inferior para a direita, a partir dos promotores P L e PR. Os sinais de terminao da transcrio, tL1 e tR1 esto indicados, assim como os stios nut, locais de reconhecimento da protena antiterminadora N. Os genes N e cro codificam funes precoces imediatas e esto separados dos genes precoces posteriores por seus terminadores. Nesta fase inicial o gene cl no transcrito.
O gene N, regulado pelo promotor PL, codifica uma protena antiterminadora que se liga s seqncias nut (do ingls, N utilization) e interage com a RNA polimerase impedindo que ela reconhea os stios usuais de terminao, tL1 e tR1. O fato da RNA polimerase ignorar os stios de terminao permite que a transcrio avance, tanto direita como esquerda. Inicia-se, assim, a fase precoce posterior, com a transcrio dos genes reguladores cll e clll, os quais controlam a expresso do gene cl. Tambm nesta fase so transcritos genes necessrios replicao do fago (O e P) e integrao do fago no cromossomo hospedeiro (att, int, xis, a, b e g) assim como de outro antiterminador codificando a protena Q (Figura 12. 16).
Figura 12. 16. Transcrio dos genes reguladores cll e clll na fase precoce posterior assim como do antitermindor Q. Os stios terminadores tL1 e tR1 so ignorados pela RNA polimerase quando a enzima interage com o antiterminador N, ligado aos stios nut.
As protenas Cll e a Clll so reguladores positivos, capazes de ativar a transcrio do gene cl, propiciando a lisogenia. A protena Q tambm um regulador positivo que age como um antiterminador dos genes de transcrio tardios envolvidos na sntese de protenas da cabea, cauda e lise. Assim, enquanto o antiterminador N permite que se avance para a fase precoce posterior de transcrio, o antiterminador Q permite que se avance para fase tardia da cascata ltica desde que as condies sejam propcias. O fato do fago l utilizar antiterminadores para assegurar a transcrio em estgios subsequentes permite que os mesmos promotores iniciais, PL e PR, sejam utilizados para transcrever quer os genes da via ltica quer os genes da via lisognica. Como tomada a deciso?
Competio Cro X Cl
No bacterifago l os reguladores Cro e Cl e a enzima RNA polimerase competem pela mesma regio do DNA. O gene cl, codifica a protena reguladora Cl, capaz de ligar-se s regies P R/OR e PL/OL. Quando ligada, bloqueia a transcrio de todos os genes do fago ao mesmo tempo que ativa a transcrio de seu prprio gene partir do promotor P RM. Por esta razo Cl denominado repressor do l e responsvel pela manuteno do estado lisognico. Cristina M. Bonato 157
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS O gene cro, regulado pelo promotor PR, codifica a protena reguladora Cro. A protena Cro tambm se liga s mesmas regies PR/OR e PL/OL, competindo com Cl. Quando Cro se instala na regio reguladora a transcrio do gene cl fica reprimida. Por esta razo a protena Cro considerada um anti-repressor de l. A prpria organizao dos genes no cromossomo do fago, permite esta competio. Os promotores PR e PRM direita e PL esquerda, esto sobrepostos aos stios operadores OR e OL, respectivamente. O operador OR constitudo de trs stios discretos de reconhecimento: OR1, OR2 e OR3. Estes stios so semelhantes, mas no idnticos. As protenas Cro e Cl apresentam afinidades diferentes por eles. Cl, p. ex., possui maior afinidade por OR1 enquanto Cro possui maior afinidade por OR3. O arranjo espacial de operadores e promotores que se sobrepem, regulando a expresso de operons esquerda e direita, crucial na opo lise/lisogenia (figuras 12. 17 e 12. 18). Logo, a transcrio dos genes cl e cro mutuamente exclusiva. Como este sistema regulado? O que determina que Cl ligue-se a seus stios operadores antes de Cro ou vice-versa? Muitos dos mecanismos que controlam este sistema j foram esclarecidos e, aparentemente, a opo por um tipo de desenvolvimento ou outro do fago depender, em ltima instncia, das condies apresentadas pela clula hospedeira. Os sinais transduzidos pela bactria modularo a atividade do regulador positivo de transcrio, a protena Cll, elemento chave neste processo.
Figura 12. 17. Circuito autgeno na manuteno da lisogenia. Cl liga-se a OR1/OR2 e OL1/OL2, pelos quais tem alta afinidade, impedindo a transcrio dos genes cro e N, respectivamente e facilitanto a do gene cl a partir de PRM (do ingls, Repressor Maintenance)
Figura 12. 18. Estabelecimento do ciclo ltico. Na ausncia de Cl, as protenas tardias so sintetizadas e Cro acaba ocupando os operadores OR3/OR2 e OL3/OL2, pelos quais tem alta afinidade,
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impedindo a transcrio de cl.
O Regulador Positivo Cll

A opo entre lise e lisogenia depende dos nveis relativos de atividade das protenas reguladoras CII e Cro. O fator de transcrio Cll ativa a transcrio a partir de dois promotores no DNA do fago: PI e PRE (de Repressor Establishment). Ao ligar-se a estes promotores permite uma atuao mais eficiente da RNA polimerase. Os promotores PI e PRE controlam, respectivamente, a transcrio do gene int e a transcrio inicial do gene cl (Figura 12. 19). O produto do gene int uma recombinase (integrase) envolvida na insero do fago no cromossomo bacteriano, enquanto o gene cl produz o repressor do l. Logo, Cll cria as condies ideais para que se instale a via lisognica de desenvolvimento. A transcrio de cl a partir do promotor PRE utiliza como molde a fita oposta utilizada na transcrio do gene cro produzindo, conseqentemente, um transcrito antisense de cro, que pode hibridizar com o mRNA de cro inibindo sua traduo.
Figura 12. 19. O circuito lisognico mantido pela protena Cl. A expresso inicial do gene cl depende da ao da protena reguladora Cll que ao ligar-se ao promotor P RE permite o reconhecimento deste promotor pela RNA polimerase que transcrever o gene cl esquerda. Cll tambm agir sobre o promotor P I, ativando a transcrio do gene que codifica a integrase. O 5' terminal do mRNA transcrito a partir de PRE o antisense de cro.
A traduo dos primeiros mensageiros cl produz os monmeros de Cl que se unem formando dmeros (repressor) com alta afinidade pelo stio OR1. Assim que o dmero liga-se ao stio OR1, o stio OR2 torna-se muito mais atrativo a outro dmero repressor, sendo imediatamente preenchido. Este fenmero chamado cooperatividade. Uma vez instalado no stio OR2, o dmero permitir que a RNA polimerase ligue-se ao stio promotor esquerda, PRM. A partir deste momento a transcrio do gene cl ocorrer via promotor PRM e no necessitar mais de Cll, uma vez que o repressor Cl exercer controle positivo sbre a transcrio de seu prprio gene (Figura 2.11). Cristina M. Bonato 159
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Instala-se, assim, o circuito autgeno onde o gene cl continuamente transcrito. Ao mesmo tempo, como os stios OR1 e OR2 esto preenchidos com a molcula repressora, a RNA polimerase fica impedida de ligar-se ao promotor da direita, PR e, consequentemente, a transcrio do gene cro e dos genes subsequentes estar reprimida (controle negativo). Fenmeno semelhante ocorre esquerda, em relao ao promotor PL. Desta forma a lisogenia mantida estavelmente atravs de geraes. a sntese continuada do repressor que explica o fenmero da imunidade infeco por outro fago de mesmo tipo. Se um outro fago l infectar uma bactria lisognica, as molculas repressoras Cl, sintetizadas pelo genoma do profago ligar-se-o imediatamente aos operadores OL e OR do novo invasor impedindo sua duplicao e a entrada no ciclo ltico.
Cll Degradada por uma Protease Bacteriana

Uma vez que Cll controla a transcrio de cl, a partir do promotor PRE, resta saber quem controla a atividade da Cll. A protena Cll extremamente instvel "in vivo" porque degradada pela protease HflB/FtsH, sintetizada pelo gene hflB (do ingls high frequency of lysogeny) tambm denominado ftsH, do cromossomo de E. coli. Mutantes hflB/ftsH apresentam alta freqncia de lisogenia, uma vez que a protease HflB est ausente. HflB uma protena transmembrana com atividade de protease dependente de ATP. Perda de sua funo estabiliza Cll e a super produo da protease acelera a degradao de Cll (Kihara et al., 1997). A ao da protease HflB modulada pelo complexo HflKC (HflA), que reside na margem periplasmtica da membrana plasmtica de E. coli. HflB tem afinidade por HflKC(HflA) formando um complexo hetero oligomrico in vivo. A modulao transmembrana permitiria acoplar os rumos do desenvolvimento do fago s condies do meio ambiente. Por outro lado, a ao da protease HflB sobre Cll pode ser controlada pela protena Clll, codificada no genoma do fago. Recentemente foi demonstrado que a ao de Cll tambm pode ser controlada pelo RNA oop, um RNA antisense de Cll. Concentraes elevadas do RNA oop tornam o processo de lisogeinizao do hospedeiro ineficiente. Portanto, o desencadeamento da via lisognica depende da relao entre as atividades dos genes cll e clll do fago e dos genes hflB/ftsH e hflA do hospedeiro, uma vez que estas atividades, em ltima instncia, vo afetar as concentraes relativas de Cro e Cl. Mutaes que tornam inativos os produtos dos genes cl, cll ou clll determinam o desenvolvimento ltico do fago enquanto mutao no gene hflB/ftsH aumenta a lisogenia. Quando a clula hospedeira est crecendo em um meio rico, o desenvolvimento ltico privilegiado formando-se inmeras partculas fgicas. Por outro lado, em clulas que se encontram em um meio carente h uma tendncia lisogenia. Assim, provvel que um sensor de membrana capte os sinais nutricionais repassando-os para a protease via complexo HflKC que modula a atividade de HflB/FtsH. Desta forma, a protelise intracelular de Cll poderia ser controlada por eventos que ocorrem na superfcie da clula. Resumindo, para que o fago faa a opo pelo ciclo ltico, a atividade da Clll deve estar baixa e a protena HflB/FtsH ativa. Isto diminuir os nveis de atividade de Cll e, consequentemente, no haver sntese do repressor Cl dirigida pelo promotor PRE. A protena Cro, na ausncia de seu competidor, liga-se ao stio OR3 impedindo a transcrio a partir do promotor PRM. Em compensao, o promotor PR direita, estar livre e a transcrio dos 160 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS genes tardios, envolvidos no ciclo ltico, ser ativada pela protena antiterminadora Q. Conforme aumenta a concentrao da protena Cro ela ocupar os stios OR2 e OR1 do operador, pelos quais tem baixa afinidade, impedindo a transcrio a partir de P R e PL. Todavia, neste momento, j existe quantidade suficiente do antiterminador Q para dirigir a transcrio dos genes tardios.
Induo do Profago
A induo do profago depende da degradao do repressor Cl. Como romper o circuito autgeno, que mantem a produo de Cl? Quando uma populao de bactrias lisognicas exposta brevemente a um agente que provoque danos ao DNA, como por exemplo a radiao ultra-violeta (UV), o repressor do l inativado por ao da protena RecA da bactria, que estimula a clivagem autocataltica do repressor Cl (Voet & Voet,1995) O repressor CI um dmero constitudo de dois monmeros idnticos (Figura 12. 20). Cada monmero possui dois domnios distintos. O domnio N-terminal est envolvido na ligao ao stio operador no DNA. O domnio C-terminal est envolvido na associao dos monmeros para formar o dmero ativo. o dmero que tem alta afinidade pelo DNA. A ao da protease sbre o repressor digerir a conexo entre os dois domnios do monmero. Como a afinidade dos domnios N-terminais pelo DNA controlada pela dimerizao dos domnios C-terminais, a clivagem resulta na dissociao do repressor do DNA. Consequentemente, a transcrio de cI diminui e a de cro aumenta; o genoma do fago excisado do cromossomo bacteriano; instala-se o ciclo ltico de desenvolvimento. Este processo denominado induo do profago e corresponde a uma resposta dramtica da clula alteraes transitrias no meio ambiente (Figura 12. 21).
Figura 19. 20. O monmero do repressor um polipeptdeo de 27.000 daltons com domnios distintos. Os domnios C-terminais associam-se formando dmeros e os domnios N-terminais ligam-se ao stio operador do DNA. O domnio N-terminal contem 5 segmentos de a-hlice. As a-hlices 2 e 3 ligam DNA.
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Figura 12. 21. No processo de induo do profago, a RecA estimula a autoprotelise dos monmeros de Cl separando os dois domnios.
Concluses
A deciso lise-lisogenia, depende, de quem ocupar primeiro as regies PL/OL e PR/OR: Cl ou Cro. A RNA polimerase, o repressor Cl e a protena Cro, competem pelas mesmas regies de controle de forma mutuamente exclusiva e cooperativa. A instalao de Cl ou Cro depende de suas concentraes relativas, as quais so afetadas pelas atividades de Cll, Clll, HflB e HflA. A presena de mltiplos operadores e a ligao cooperativa do repressor Cl so fundamentais na mudana de estado do l, frente as condies do hospedeiro.
Guia de estudos
Defina: fago l; virion; capsdeo; profago; fago temperado; lisogenia; infeco ltica; antiterminador; operador; mRNA antisense; cooperatividade; nut . Quantas vezes o genoma do l maior que o do TMV? Como vrus animais podem adquirir seu envelope? Quais so as protenas reguladoras codificadas pelo fago l? Como os genes esto organizados no cromossomo do l? Porque bactrias lisognicas so imunes infeco por outras partculas virais de mesmo tipo? Que genes do l so imediatamente transcritos aps a infeco? A partir de que promotores? 162 Cristina M. Bonato
MOLDES MDULOS E FORMAS: DO DNA AS PROTENAS Quais as conseqncias de uma mutao, com perda de funo, no gene cro? Quais as conseqncias de uma mutao, com perda de funo, no gene cl ? Porque as transcries de cro e cl so mutuamente exclusivas? Qual a vantagem de utilizar antiterminadores? Se um fago l mutado no gene clll, com perda de funo, infectar uma clula mutada no gene hflB, tambm com perda de funo, que tipo de desenvolvimento mais provavelmente acontecer, ltico ou lisognico? Porque? Porque a transcrio do gene cl a partir do promotor PRE inibe a traduo dos mRNA cro? Qual a conseqncia de uma mutao no gene recA da bactria hospedeira lisognica? Explique o circuito autgeno de manuteno da lisogenia. Qual a funo do RNA oop? Como explicar a transcrio dos genes tardios depois de Cro ligar-se a PR/OR e PL/OL?
REFERNCIAS
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168
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Captulo 1 - O FLUXO DE INFORMAO VIA MOLDES

2003 Cristina M. Bonato

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O Dogma Central e os Moldes

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Estas estruturas de haste e haste/alas so os braos da molcula:

Captulo 2 LEIS DA GENTICA

Figura 2. 1. Segregao dos alelos. Razes fenotpica e genotpica em F2.

Testando a Lei de segregao

Figura 2. 2. Auto-fertilizao de F2.

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Figura 2. 3. Cruzamento teste

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Segregando Dois ou Mais Genes

Testando a Lei de Segregao Independente

Os Genes Encontram-se nos Cromossomos

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X+ X+Xw X+Y Xw X+Xw XwY Xw X+Xw XwY Xw

Figura 2. 8. Padro de herana do olho branco em Drosophila.

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Captulo 3 NATUREZA DO GENE

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O RNA Como Material Gentico

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Prion: Uma Partcula Protica Infecciosa e Hereditria

Os Genes Governam a Expresso das Protenas

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Captulo 4 ESTRUTURA DO DNA

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Formas e Tamanhos do DNA

comprimento, micrometro 1,7 17 55

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NH4Cl NH4Cl 1o ciclo

2o ciclo Semi-Conservativo Leve Pesado Tempo 0 1a gerao Conservativo Dispersivo

2a gerao Topo Fundo

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Captulo 5 MQUINAS REPLICADORAS

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As evidncias experimentais eram da:

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Figura 5. 7. Papel da subunidade aumentando a processividade da DNA polimerase

Modos Alternativos de Replicao em Cromossomos Circulares

Figura 5. 9. Crculo rolante. As letras representam marcas genticas no cromosssomo.

Figura 5. 10. Replicao de DNA mitocondrial no modelo de ala D.

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Replicao dos Telmeros

Saccharomyces 5' T1-6GTG2-3 3' Arabidopsis

Fonte: Hartl & Jones, 1998

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Captulo 6 TRANSCRIO EM BACTRIAS

A Sntese de Protenas Ocorre no Citoplasma

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Caracterizao de um RNA Instvel

Figura 6. 1. Induo da sntese -galactosidase na presena de lactose.

O mRNA o Intermedirio Entre Genes e Ribossomos

no nucleotdios 3700 1700 110 75 varivel

Figura 6. 6. Estruturas secundrias e tercerias: alas, grampos e pseudo-n