Biotechnologies vgtales et animales

Biotechnologies vgtales
Sommaire

I - Objectif des biotechnologies vgtales! II - Mthodologies gnrales!

II.1 - Choisir et prlever un explant vgtal aseptique!

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II.2 - Introduire cet explant vgtal dans un rcipient + milieu de culture! 4 II.3 - Dans un environnement contrl! 5

III - Les technologies de clonage!

III.1 - La micropropagation!
III.1.a - partir dexplants avec mristme II.1.b - partir dExplants sans mristme

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III.2 - Lembryogense somatique!

IV - Technologies gnratrices de variabilit!

IV.1 - Variations somaclonales! IV.2 - La mutagense! IV.3 - La fusion de protoplaste!
IV.3.a - Les protoplastes IV.3.b - La fusion de protoplaste

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IV.4 - Le sauvetage d'embryons immatures!

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V - L'haplodiplodisation!
V.1 - Mthodologie!
V.I.a - Culture de gamtophyte V.I.b - Croisements interspciques V.I.c - Doublement du stock de chromosomique

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V.II - Exemple d'un cas particulier de lasperge!

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VI. Production de mtabolites secondaires par les cultures cellulaires vgtales!

VI.1 - Mtabolites secondaires! VI.2 - Interet des cellules vgtales!
VI.2.a - Totipotence VI.2.b - Richesse gntique

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VI.3 - Mthodologie!

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VI.4 - Intrt de produire des mtabolites secondaires par ce procd! 25 VI.5 - Augmenter encore la production!
VI.5.a - licitation IV.5.b - Transgnse

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VI.6 - Applications!
VI.6.a - Production de shikonine

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VI.6.b - Bioconversion de -mthyl digitoxine en -mthyl digoxine par les cellules de Digitalis lanata 26 VI.6.c - Mise en vidence de nouveaux composs pharmacologiques actifs 26

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I - Objectif des biotechnologies vgtales

Crer des nouvelles varits vgtales (cultivs) Produire des molcules Produire des matriaux
elles rpondent aux besoins du consommateur et de lagriculteur

Avant les biotechnologies vgtales, on faisait de la slection classique (1883): Tout dabord, on choisit les plantes qui possdent des caractres intressants. Ensuite, on croise les parents (A x B). On obtient une descendance trs htrogne quon ne peut pas exploiter. partir de ce mlange, on autofconde la descendance pour obtenir des lignes homozygotes (5,6 et parfois 7 autofcondations). Cette partie peut prendre parfois plusieurs annes. On a maintenant lhybride F1 qui a les caractres dsirs. Avant de le commercialiser, il faut le caractriser et le multiplier Cela met en moyenne 12 17 ans avant de produire ce quon dsire, les crateurs doivent tre des devins. Avant la slection classique, on pratiquait la slection massale lpoque, il sagissait dune agriculture intensive. Maintenant, on cherche une agriculture durable (qualit, protection de lenvironnement...) Ce qui est la mode cest les alicaments, on se nourrit pour se soigner. Les consommateurs sont lHomme, mais aussi les animaux. Les besoins des agriculteurs sont divers comme des plantes qui passent bien dans la machine ou la rsistance O interviennent les biotechechnologies vgtales? Augmenter la variabilit gntique grce la transgnse (OGM), la mutagense, la fusion de protoplaste et la culture dembryons immatures Gagner du temps grce lhaplodiploidisation, la micropropagation par bourgeonnement et lembryogense somatique Meilleure caractrisation, on fait du marquage molculaire (avant ct de la caractrisation morphologique), pas vraiment un gain de temps, mais on dcrit plus prcisment les plantes et on peut les breveter Dnition des biotechnologies vgtales: lensemble des techniques qui font appel la culture in vitro et la biologie molculaire et qui ont pour but de saffranchir des limitations lies la reproduction sexue

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II - Mthodologies gnrales
! ! II.1 - Choisir et prlever un explant vgtal aseptique

On part de plante, non aseptique. On choisit une plante mre qui doit tre le plus jeune possible et qui doit pousser dans les conditions sanitaires les meilleures possible. Plus elle est vieille et plus elle est dure aseptiser. On la dbarrasse de tous les bactries et champignons. On utilise des solutions dsinfectantes comme leau de javel dilue 10% (hypochlorite de sodium) ou de lhypochlorite de calcium. On peut utiliser le chlorure mercurique lorsquon narrive pas dsinfecter la plante (1 pour mille). On peut faire des prtraitements lthanol, un agent mouillant (tween 20, mecryl) qui permet de mieux faire entrer les dsinfectants. Pour ne pas tuer la plante, il faut jouer sur la dure et la concentration. Sinon on sattaque directement la plante mre en sy prenant fort en avance en utilisant des fongicides et des antibiotiques On peut partir de nimporte quel explant (feuille, explant, racine...), car les cellules de plante sont totipotentes (1 cellule vgtale peut redonner une plante entire). Il faut choisir son explant selon son objectif et selon lespce vgtale sur laquelle on travaillera

II.2 - Introduire cet explant vgtal dans un rcipient + milieu de culture Le milieu de culture

Les lments essentiels,

Eau lments minraux Macrolments (g/L): N, P, K, Ca, Mg, S (sous forme de sel) Microlments (mg/l): Al, Cu, Ni, Co, Mo, Mu, I (sous forme de sel).
Seul le fer nest pas fourni sous forme de sel, on le fournit sous forme chlate, associ un agent chlateur (Fer-EDTA)

Source de carbone (saccharose, glucose) (la lumire est peu disponible en culture in vitro
puisquon travail sur de petits explants, la photosynthse nest pas optimale cest pourquoi on met une source de carbone)

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Vitamines (mg/l) (la plupart du groupe B) # Les lments facultatifs : (ils ne sont pas moins importants) Rgulateurs de croissance (= hormones vgtales) Les auxines (AIA)
Le rapport auxine/cytokines est important dans la croissance et lorientation de la morphognse: ! - A/C > 1 rhizognse ! - A/C < 1 caulognse ! - A/C= 1 callognse (prolifration indnie de cellules)

Les cytokinines (BAP ou BA) Acide gibbrllique (AG3) Provoque lallongement cellulaire, croissance des entre-noeuds Acide abscissique (ABA) Elle empche la germination prcoce des embryons thylne hormone lie celui des auxines, soit inhibitrices ou activatrices selon les cas. Il faut
contrler la taille et le mode de fermeture des rcipients

Agar (4 8g/l) donne un support la plante pour viter quelle coule dans le milieu de culture Strilisation du milieu de culture par autoclave 121 C pendant 20 minutes ou par ltration pour ne pas dgrader certaines molcules (0,2 micromtre)

II.3 - Dans un environnement contrl

On place la culture dans un environnement contrl: La lumire: importance sur la morphognse en fonction de la quantit et de la qualit de la lumire. Si lon ajoute plus de bleu, on accentue la collognse, si lon ajoute plus de rouge, on accentue la rhyzognse. De manire gnrale on met de la lumire blanche, mais certaines lumires blanches ont plus de bleu ou plus de rouge. On peut aussi jouer sur la photopriode. Plante de jour long 16: 8. Plante de jours courts 8: 16 La temprature: la thermopriode qui va tre de lordre de 24C le jour et 20C la nuit. Certaines manipulations exigent des chocs thermiques (haplodiploidisation) choc 35C ou 4C Les changes gazeux: se font travers la fermeture des capuchonnages

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III - Les technologies de clonage

! ! III.1 - La micropropagation

4 tapes principales: Phase1: prlvement et aseptisation de lexplant Phase2: multiplication Phase3: dveloppement = enracinement Phase4: acclimatation Explants avec mristmes: Culture de fragments nodaux ou apex # # ou Culture de mristmes isols Explants sans mristmes ! ! ! ! III.1.a - partir dexplants avec mristme

Culture de fragments nodaux ou apex: On met le fragment nodal dans un milieu de culture et en fonction de lespce vgtale et du milieu de culture, ce fragment se dveloppera de 2 faons diffrentes: Si le milieu est pauvre en cytokinine, le bourgeon axillaire va se dvelopper et donner une nouvelle tige et engendrer son tour dautres bourgeons axillaires (quon appelle tigelle). On peut reprlever et remultiplier ces fragments linni. Il y aura enracinement en mme temps que le dveloppement de la tige, on a la phase2 et 3 qui se droule en mme temps Si le milieu est riche en cytokinine. Le bourgeon axillaire se dveloppe, mais tous les bourgeons axillaires vont aussi pousser, on aura un dveloppement en touffe. Les cytokinines vont inhiber la dominance apicale. Il ny aura pas denracinement. Pour lenraciner, on va devoir transfrer des petites tiges dcoupes dans un milieu riche en auxine et pauvre en cytokinine Avec cette technique, si 10 fragments nodaux J0 J30 (10 tigelles donc 100 fragments nodaux) J60 J90... cela peut atteindre des millions de plantes en 1 an

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Culture de mristmes isols: Elle apporte quelque chose de supplmentaire, permet dradiquer certaines maladies lies aux virus (pas des traitements phytosanitaires). Dans le dme mristmatique, il y a des cellules indiffrencies lintrieur. Le mristme est trs peu contamin. Le virus na pas le temps de se dvelopper, car il utilise les mmes molcules que les cellules mristmatiques et que les cellules mristmatique se dveloppent plus rapidement que les virus. On peut ajouter de la thermothrapie, on fait un choc thermique qui simule la vre pour liminer le virus Certaines plantes sont rcalcitrantes la culture de fragments nodaux, cest le cas des plantes ligneuses (arbres), car les tiges et les ptioles sont lignis. Le problme est d la lignication qui empche la culture in vitro. Avec la culture de mristmes isols, il y aura une rejuvnilisation de la plante, elle va devenir herbace et va pouvoir se dvelopper Les orchides sont trs difciles dvelopper en culture. Mais le mristme mis en culture va former sa base une structure globulaire quon appelle un peudoprotocorme et qui ressemble un protocorme lorsquon fait germer des graines dorchides. Ce protocorme la capacit de se multiplier et peut donner une plante entire ! ! ! ! II.1.b - partir dExplants sans mristme

Dveloppement direct (= bourgeonnement adventif) : on prlve nimporte quel matriel vgtal (feuille, ptiole...). On part alors de cellules diffrencies contrairement aux mristmes. Il faut alors provoquer la ddiffrenciation. On a besoin dhormones vgtales pour se faire. Lorsquon met un explant de feuille dans un milieu de culture, on observe directement sur la feuille des petits bourgeons quon transfert sur un autre milieu de culture et ainsi de suite... Dveloppement indirect sur lexplant dun cal : pour obtenir une diffrenciation, on transfert le cal dans un autre milieu de culture sur lequel se dveloppera des petits bourgeons (bourgeons noforms). On peut passer aussi le cal en milieu liquide pour obtenir une suspension cellulaire, les cellules se sparent les unes des autres pour se multiplier plus rapidement. On les utiliser pour produire des molcules dintrts

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III.2 - Lembryogense somatique

Lorsque qu'on met en culture un explant vgtal notamment sur un milieu qui renferme beaucoup d'auxines, il arrive qu'on observe sur les explants des petites structures qui ressemble des embryons: on les appels des embryons somatiques. Il ressemble des embryons zygotiques du point de vue morphologique, mais ils sont gntiquement trs diffrents Les embryons somatiques seront identiques la plante mre tandis que les embryons zygotiques seront toujours diffrents des 2 parents

Origine: Unicellulaire sans cals dveloppement direct Pluricellulaire cals dveloppement indirect

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La croissance des embryons somatique est trs rapide, il n'y a pas de phase de dveloppement, mais elle n'est limite qu' un certain nombre d'espces Les stimuli pour dclencher lembryogense somatique: - Auxines: 2-4-D - Choc thermique (35C pendant une semaine chez la chicore) - Une blessure Changement de pression osmotique Changement de source de sucre

C'est un stress qui dclenche gnralement l'embryogense somatique 2 phases de cultures: - Phase d'induction - Phase d'expression Certains chercheurs les ont utiliss pour faire des semences articielles:

En ralit, ils voulaient refaire une graine. Mais le problme c'est que chez l'embryon zygotique, il n'y a pas de dessiccation, ni de dormance. Ces plantes germent quand elles en ont envie et pas quand l'agriculteur en a besoin La phase d'acclimatation: Une fois que les plantules sont bien implantes et bien dveloppes, il faut les sortir de l'in vitro. Ce nest pas si simple. In vitro les plantes sont soumises un microenvironnement optimal pour la multiplication, mais pas pour le dveloppement In vitro : faible luminosit, asepsie, milieu avec beaucoup de sucre (dveloppement htrotrophe), humidit relative importante

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Lefcacit photosynthtique: les plantes sont pauvres en chlorophylle puisqu'on les a nourris avec du sucre, la rubisco est totalement inactive. Elles ne sont donc pas capables de faire de la photosynthse. Les feuilles se dtriorent. En gnral, ce sont les nouvelles feuilles produitent qui seront capables de faire la photosynthse Lvapotranspiration: stomates non fonctionnels, car lhumidit est leve. La cuticule une composition chimique diffrente de celle qui se dveloppe en milieu naturel. Elle possde plus de composs permables, donc l'air libre, elle se dessche rapidement Lasepsie : terrain idal pour tous les champignons, bactrie... car la plante na pas l'habitude de se dfendre Racines: capacit d'absorption trs faible, car elle est dans un milieu trs moue, Pour rgler les problmes: Lvapotranspiration : on brumise en permanence pendant 24 heures en espacent de plus en plus, on transfert la plante en miniserre et progressivement on ouvre le couvercle Lasepsie : il faut contrler l'humidit et la temprature pour viter la pousse des champignons Lefcacit photosynthtique: travailler avec le maximum de lumire Les racines : on utilise un substrat trs lger et ar (tourbe + perlite ou terreau + sable) pour que les racines se dveloppent plus facilement

IV - Technologies gnratrices de variabilit

1 - Variations somaclonales 2 - Mutagnse 3 - Fusion de protoplastes 4 - Les croisements interspciques 5 - La transgnse (cf cours transgense)

IV.1 - Variations somaclonales

Ce nest pas une technologie proprement dite. C'est une proprit qui arrive de temps autre et qu'on va utiliser. Quand on fait de la micropropagation et quon gnre des plantes par culture in vitro, il arrive que des plantes soient diffrentes de la plante mre, elles prsentent des modications plus ou moins importantes. Ces modications seront plus importantes si on passe par du bourgeonnement adventif (bourgeon sans mristme) ou par la noformation de bourgeon (quand on passe par un cal) contrairement aux bourgeons axillaires, car le phnomne de ddiffrenciation induit de la variabilit gntique. Les modications plus important aussi dans des milieux riches en hormonent

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Les modications les plus courantes qu'on observe sont souvent indsirables: - Dcience chlorophyllienne Modications de l'haplodie (4n, 6n, chromosomes surnumraires)

On limine bien sr ces plantes Exemple du palmier huile: Multiplication par embryogense somatique, mais il est trs lent se dvelopper, car c'est un ligneux. En faisant de la variation somaclonale, ils se sont rendu compte qu'il y avait beaucoup d'anomalies orales. Les anthres devenaient des carpelles donc, elle ne faisait pas de graine donc pas d'huile Sil y a un effet bnque stable, on peut l'exploiter comme un nouveau caractre: Exemple du Pelargonium clone qui a un aspect des feuilles diffrent (velours et panach) assez beau (velvet rose) maintenant commercialis Exemple chez le fraisier culture d'anthres 10% plantes tolrantes au mildiou Les variations somaclonales sont dcrites pour la premire fois par Larkin et Scowcroft en 1971. Elles ne suivent pas les lois classiques de l'hrdit. On a soit une transmission 100% ou 0%. Ce sont des variations lies l'pignie L'pignie : mcanisme qui contrle l'expression des gnes. Elles sont dues des mthylations de l'ADN ou des transposons Plus l'explant mis en culture est petit, plus l'explant sera diffrenci. Plus la phase de multiplication est longue et plus il y aura de variations. Une cellule isole ne reoit plus les mmes signaux que dans la plante entire, cest ce qui explique le nombre plus lev de mutations in vitro que dans la nature

IV.2 - La mutagense

Il sagit dun phnomne naturel. In vitro, on essaye de l'induire pour crer de nouveaux caractres Quand le phnomne est naturel, la frquence est de 10-6 pour le gnome nuclaire et 10-8 pour le gnome cytoplasmique. On sera donc oblig de regarder des millions de plantes et parmi les plantes observes, le caractre voulu ne sera peut-tre pas prsent

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Pour acclrer le processus, on procde de 2 manires: # Agents mutagnes pour induire de la variabilit # puis Pression de slection pour arriver au caractre souhaiter In vitro, on fait de la mutagense induite: Agents chimiques (EMS, acridine orange...) Agents physiques (UV, rayon X, Rayon )

Pour avoir un maximum de chance, on fait de la mutagense sur des cellules isoles et indiffrencies (suspension cellulaire, culture de protoplastes, culture de cals) La mthodologie: On cultive un explant vgtal sur un milieu riche en 2,4-D ou riche en rgulateur de croissance dveloppement d'un cal transfert dans un milieu liquide suspension cellulaire On repique plusieurs fois la suspension cellulaire pour la multiplier l'inni et an que toutes les cellules soient isoles et bien en contacte avec le milieu de culture idale pour la mutagense induite On fait agir un agent mutagne de quelques minutes quelques heures, on multiplie ces cellules talement dans un milieu de culture glos sur boite de ptri. Elles vont former des petits cals qu'on repique sur des milieux de multiplication + un agent slectif (en fonction de ce que l'on veut obtenir rsistance au sel par exemple). En gnral, tous les cals vont se ncroser sauf quelques-uns (dpends de la chance qu'on a). Rgnration partir des cals survivants (souches variantes) pour obtenir une plante qui sera soumise analyse parce qu'il n'est pas obligatoire que la rsistance soit transmise toute la plante. On fait alors une analyse gntique pour savoir si la rsistance sera transmise la descendance Les applications: FAO dit qu'il y a 2025 varits cultives issues de la mutagense, mais en ralit il y en a beaucoup plus, c'est une technologie non considre comme OGM Slection de plantes tolrantes des stress abiotiques: 1) Tolrance au gel: espces cultives dans des rgions tempres. lvation de la teneur en soluts dans la vacuole pour viter que l'eau ne gle et fasse clater la cellule. Pour la mutagense induite, on fais soit des cultures glives ou milieu +
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analogue de la proline (agent slectif), car dans la rsistance des stress, la proline augmente toujours dans les vacuoles (on prend donc le problme l'envers) Van Swaarj (1986) culture pomme de terre avec hydroxyproline 2) Tolrance aux basses tempratures (pas tout fait comme le gel) : cest le cas pour les plantes tropicales et concernent tous les pays tropicaux et nos plantes d'appartement. Permets d'augmenter les surfaces de cultures dans les pays tropicaux, altitude leve. Pour les plantes d'appartement, cela permet l'horticulteur de faire des conomies d'nergies lorsqu'il fait pousser ses plantes. Cette rsistance est due aussi du l'augmentation de soluts dans la vacuole, mais galement au maintien de la uidit membranaire

3) Tolrance la scheresse (ou stress hydrique) : elle sexprime aussi par une augmentation de soluts dans la vacuole. On utilise soit l'hydroxyproline ou un agent osmotique (PEG ou mannitol) 4) Tolrance la salinit: trs recherch dans les rgions ctires an daugmenter les surfaces de culture. On cultive dans un milieu de culture contenant du NaCl. C'est surtout le sodium qui est toxique en entrant dans la plante. Le sodium cre un choc hyperosmotique qui provoque un dcit en eau. La plante va synthtiser des osmoprotecteurs ou de la proline pour rguler l'homostasie du sodium cytosolique activation de transporteurs de sodium sur la membrane de la vacuole ou sur la membrane plasmique 5) Tolrance l'aluminium : laluminium se trouve dans tout les sols et est toxique pour les plantes absorbes au niveau des racines ncrose du mristme croissance racinaire arrte. Dans la plupart des sols, il n'est pas gnant, car il nest pas toujours absorb puisquil se trouve sous diffrentes formes. Par contre dans les sols acides, il va tre solubilis et ingr par la plante (les sols acides reprsentent 40% des sols cultivables). Ceci est d la pollution pluie acide. Chez arabidopis thaliana, il existe un facteur At ATR qui lorsquil est mut provoque une tolrance l'aluminium. Ce facteur permet darrter les fonctions lorsquil y a une anomalie dans l'ADN donc quand il est mut il permet de laisser se faire la croissance. Cette tolrance est dure obtenir, car ces mcanismes sont diffrents pour chaque plante

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Slection de plantes rsistantes aux maladies: Champignons: fusariose, septoriose chez le bl, rhizomanie chez la betterave Bactries Nmatodes Virus

Pour crer ces rsistances, on peut procder de plusieurs manires: Soit on cultive les cellules en prsence du pathogne, mais en mettant un systme de culture dans lequel le pathogne n'envahira pas toutes les cultures on fait donc une culture en bicouche Culture + extrait brut de la culture de champignon Culture + toxines puries Culture + analogue de la toxine (feu bactrien, pseudomonas tabacci, mthionine sulfonide)

La rsistance aux molcules organiques:

Antibiotique laboratoire (fusion de protoplastes slection des produits de fusion sur milieu + antibiotique) Diffrents mcanismes mis en jeu (rsistance): - Mutation de la cible de l'herbicide (enzyme): les plantes sauvages vont devenir rsistantes cet herbicide Amplication de la cible de l'herbicide : l'enzyme sera exprim en plus grande quantit et l'enzyme ne sera plus capable d'agir Mcanisme d'amplication de la capacit de dtoxication de la molcule activ (herbicide) Mcanisme de squestration de l'herbicide : Le Paraquat est trs toxique pour l'Homme

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La surproduction d'acide amin: Intrt pour l'alimentation humaine : ll existe des acides amins essentiels que l'Homme ne peut pas fabriquer (Lys, Met, Trh, Ileu, Val, Leu, Trp, Phe). On doit donc aller les chercher dans l'alimentation - Crals pauvre en lysine, thr et Trp - Lgumineuse (Fabaces) elles synthtisent Lys Th Trp mais sont dcientes en Met et Cys Quinoa (chnopodiaces) possde tous les acides amins essentiels

Technique: culture de cellule + analogue d'acide amin (agent slectif) Un acide amin est capable d'inhiber sa propre synthse. L'analogue sera incorpor dans les protines (qui conduira des protines modies) qui seront ltales pour la plante sauf si elle est mute. Donc si la premire enzyme de la chaine de biosynthse n'est plus rprime grce la mutation, on pourra alors crer en masse des acides amins Application: Augmentation de la lysine dans les crales (analogue de la lysine aminothylcystine). On a essay chez l'orge et le mas, mais la lysine n'augmentait pas dans les graines c'est une expression tissu spcique Intrt pour la tolrance au stress (augmentation de la proline, cf pages 11 et 12) Rsistances aux UV (car inhibiteur de la photosynthse) ils ont travaill sur la betterave donne de trs bon rsultats Tolrance aux tempratures trs leves travail sur le bl capable de rsister des tempratures de 48C Plante qui soit capable de se dvelopper dans un milieu pauvre en phosphate pour une meilleure efcacit d'absorption tomate les acides organiques solubilisent les phosphates du sol qui les rends beaucoup plus absorbable

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IV.3 - La fusion de protoplaste

! ! IV.3.a - Les protoplastes

Protoplaste: c'est une cellule sans paroi (composition pecto-cellulosique) La paroi est une barrire l'introduction de matriels gntiques ou la fusion cellulaire. On utilise des cellulases et des pectinases (extraites partir de champignons) pour dgrader la paroi. On les place ensuite dans une solution hypertonique an dviter la lyse
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de la vacuole en turgescence. On utilise pour cela le mannitol ou le sorbitol, car ils ne sont pas mtaboliss par les plantes. On peut utiliser aussi des solutions salines (KCl). La cellule rentrera en plasmolyse, on peut dsormais obtenir des protoplastes partir de quel matriel vgtal, obtient-on des protoplastes? Matriel vgtal le plus jeune possible, car ils ont des capacits de rgnration importante (cellules embryognes ou l'tat mristmatique) Matriel vgtal le plus aseptique possible sur de jeunes germinations dj cultives in vitro ou des suspensions cellulaires Feuille, racine, des cals, embryon... Il faut juste que les protoplastes soient capables de se diviser et de rgnrer des plantes. Parfois il est ncessaire d'effectuer des prtraitements qui favorisent la division cellulaire conditions d'clairement variable. On place alors les tissus vgtaux dans une solution enzymatique + agent osmotique (= solution de macration) qu'on laisse agir pendant plusieurs heures. On ltre sur des petits tamis pour enlever les gros dbris. On limine les enzymes l'aide de lavage (3 centrifugations successives avec un milieu de lavage qui renferme un agent osmotique). Une fois lav, on peut mettre les protoplastes en culture forte densit10 000 500000 protoplastes/ml induits la division cellulaire. Le protoplaste est une cellule ronde avec un plasmalemme, un cytoplasme et un noyau. Les premiers signes que lon observe lorsqueon met la cellule en culture, c'est une structure ovalise parce qu'elle reforme sa paroi pecto-cellulosique. Lorsqu'elle reforme sa paroi, la cellule va se ddiffrencier. Le petit noyau va grossir et se centraliser, le cytoplasme va se densier et la vacuole va se rsorber en une multitude de petites vacuoles. La cellule va ensuite se diviser puisqu'elle possde sa paroi. On obtient alors un microcal qu'on fait grossir en cals on induit le bourgeonnement enracinement acclimatation des plantes Au dbut, on travail sur un milieu riche en minraux, ensuite on ajoute des hormones (A/C = 1) et au fur et mesure, on diminue la concentration en agent osmotique, car les cellules n'en ont plus besoin, car elles ont reform leurs paroi pecto-cellulosique Proprits des protoplastes: Pas de paroi pecto-cellulosique Capables de rgnrer Cultiver en grand nombre

Ces proprits servent: Micropropagation

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! !

Mutagense Fusion de protoplaste Transgense (par lctroporation) ! ! IV.3.b - La fusion de protoplaste

Mthodologie:

Les protoplastes sont tous chargs ngativement et ne se touche pas, il faut donc 2 tapes pour la faire de la fusion de protoplaste: - Accolement - Fusion Accolement: - Mthode chimique: le plus utilis est le PEG (polythylneglycol), il faut une bonne dure d'action et une bonne concentration. On utilise aussi des dextran, du nitrate de Na et des sulfates de dextran Mthode lectrique : courant alternatif de haute frquence, les protoplastes se transformeront en diple et se placerons en petite chainette

Fusion avec accolement chimique: elle sera induite par le calcium qui augmente le nombre de pores Fusion avec accolement lectrique: courant continu avec des impulsions taille et nombre des pores On effectue aprs la fusion des lavages pour liminer le calcium et le PEG qui sont trs toxiques Aprs la fusion, culture des protoplastes: Milieu liquide Milieu semi-solide (gel d'agarose basse temprature): On coupe les morceaux de glose contenant les protoplastes qu'on remet dans un milieu liquide intrt: les protoplastes se divise que quand ils ont une paroi (l'Agar joue se rle de tissu) Milieu solide: on dpose la suspension de protoplastes liquide sur la glose. Le liquide va tre incorpor dans la glose et les protoplastes se deposeront sur la
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surface de la glose. Certaines cultures ont besoin dune culture nourricire = cellules en division active Slection des produits de fusion: Rsistance un antibiotique: seul l'htrocaryon rsistera si on met le milieu a 2 antibiotiques Sous microscope: on va chercher manuellement les htrocaryons, mais il faut partir de 2 types de cellules diffrents linconvnient cest quil sagit de cultures faible densit milieu difcile mettre en place Caractristiques des htrocaryons (rparti en 3 catgories diffrentes): Espces trs proches phylogntiquement: dans ce cas, on observe une fusion des noyaux (4n) qu'on appel hybride somatique. Les mitochondries fusionnent et provoquent des remaniements des gnomes mitochondriaux aucune consquence, car ce sont des espces trs proches. Pour les chloroplastes un lot est limin, cela se fait alatoirement, libre nous de choisir le lot qui nous intresse Intrt: - Cration varitale - Restaurer la fertilit Espces peu loignes phylogntiquement : il y a aussi fusion des noyaux, mais apres les premires divisions, on a une limination progressive d'un certain nombre de chromosomes d'une des deux espces (2n chromosomes + X chromosomes de l'autre espce) on appel cela des hybrides asymtriques. Il y a aussi une fusion des gnomes mitochondriaux, mais les remaniements peuvent crer de la strilit mle cytoplasmique Interet : On peut transfrer quelques chromosomes d'une espce (transfert de gne) pour des espces non compatibles sexuellement Espce trs loigne phylogntiquement : il ny a pas de fusion des noyaux,. Ce sont des plantes 2n chromosomes, on appelle cela des cybrides car il y a quand mme des recombinaisons. Les remaniements des gnomes mitochondriaux permettent de crer del strilit male cytoplasmique. Les chloroplastes d'un lot sont limins et permettent parfois de pallier la dcience chlorophyllienne ou la rsistance a un antibiotique

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IV.4 - Le sauvetage d'embryons immatures

Embryons immatures = embryons issus de croisements interspciques, car incompatibilit sexuelle (pas de graine), mais il y a quand mme un embryon qui se dveloppe et donc par culture in vitro on essayera de faire du sauvetage Rle de l'albumen lors de la fcondation, il y a une double fcondation: 1 spermatozode va fconder l'oosphre (2n zygote) 1 spermatozode fcondera les 2 noyaux polaires (n+n) l'albumen (3n) 2 espces diffrentes: L'embryon 1 gnome maternel + 1 gnome paternel L'albumen 2 gnomes maternels + 1 gnome paternel Dun point de vue gntique peut tre trs diffrent et empcher la reproduction sexue. In vitro, on excise donc l'embryon de la graine mise en culture dans un milieu adapt. Pour allonger la dure de vie de l'embryon traitement sur les eurs pulvrisation de 2,4 D bl, mas. Avant le stade torpille, il est trs dur de sauver les embryons Les besoins nutritifs de l'embryon (dpends de l'ge de l'embryon): La culture se fait sur un milieu solide stade cotyldonaire mme besoin qu'une plantule. Avant le stade cotyldonaire, les besoins sont totalement diffrents a une nitrate rductase non fonctionnelle, on lui fourni donc des ions ammoniums et de l'azote organique. On cultive donc avec une osmolarit importante. Le fer est toxique donc on le diminue, mais on augmente le calcium (permets la survie) et le potassium (permets la croissance). Du point de vue rgulateur de croissance, on peut observer une germination prcoce qui peut tre empche par des hormones (ABA et l'AG3). L'osmolarit lev au dpart va devenir toxique trs vite. On effectue alors beaucoup de repiquage. Ce milieu adapt aux embryons immatures est le milieu de Norstog Intrt: permets de gagner du temps au cours de croisements Les graines ont souvent besoin d'une priode de maturation et de dormance pour arriver la germination. Chez le tournesol, il faut 1 an pour faire une gnration de plantes, avec le sauvetage d'embryon, on ne met plus que 80 jours

V - L'haplodiplodisation
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Le but est d'obtenir des plantes haplodes partir de plantes diplodes (htrozygotes). Ensuite, on double le stock chromosomique pour obtenir des plantes homozygotes Il est plus facile de faire la mutagense sur des plantes haplodes, car toutes les mutations s'expriment mutations homozygotes

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V.1 - Mthodologie
! ! V.I.a - Culture de gamtophyte

Si on fait de la culture de gamtophyte male androgense Si on fait de la culture de gamtophyte femelle gynogense Androgense Le gamtophyte male = grain de pollen trs peu de cellules et trs diffrenci. On essaye donc de trouver des cellules plus jeune encore anthres Les grains de pollen sont issus des cellules mres de l'anthre qui en subissant la miose donnent naissance aux ttrades qui se sparent les unes des autres pour donner les microspores. Les microspores se divisent par mitose et donnent les grains de pollen. Le stade microspore est idal pour faire de la culture Culture d'anthre immature Les grains de pollen se dveloppent dans les anthres, il va falloir faire de la culture danthre immature plus facile prlever Dtermination des critres morphologiques de la plante qui permette de mettre en culture des anthres qui soit au stade microspore: - Taille du bouton Rapport entre la taille des ptales sur la taille des spales Taille des anthres

Mise en culture en osmolarit leve: - Dveloppement direct : les microspores se divisent pour donner des embryons haplodes (Tabac) - Dveloppent indirect: les microspores se divisent pour donner cal embryon haplode (bl, riz) Inconvnient : la paroi de l'anthre est diplode, elle peut rgnrer des embryons somatiques diplodes
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Culture de microspores isoles Anthres immatures broyage lger dans un milieu en osmolarit lev. Les microspores se retrouvent la surface du milieu. On aura des microspores en milieu liquide qui se dvelopperont en embryon haplode Culture de protoplastes de grain de pollen Le grain de pollen est recouvert par une paroi qui est difcile digrer (intine et exine). Lorsque lon digre cette paroi, on peut faire de la culture de grains de pollen, mais cela reste une technique peu utilise Inconvnient de landrogense : elle aboutit parfois la formation d'embryons et de plantes albinos. Chez certaines espces: 100% albinos Nombre variable d'albinos 0% d'albinos On ne peut pas le savoir avant d'avoir fait la manipulation. Ce phnomne serait d aux chloroplastes qui se trouve au niveau des gamtes mles et qui ne serait plus fonctionnel. Des tudes ont montr que le gnome chloroplastique tait tronqu Gynogense Il y a moins de cellules haplodes, c'est pourquoi on utilise l'androgense en premier. Il sagit dune culture de gamtophyte femelle Le gamtophyte femelle = sac embryonnaire qui contient 8 noyaux haplodes Culture d'ovaires (Cucurbitaces): On peut avoir un dveloppement direct ou indirect comme pour landrogense. Dans tous les cas, on obtient toujours des plantes chlorophylliennes ! ! ! ! V.I.b - Croisements interspciques

Certains croisements vont conduire l'limination d'un lot de chromosome (paternels). Il reste donc un embryon haplode qui se dveloppe: Dans certains cas on rcupre des graines haplodes directement sur la plante Dans dautres cas, il a tendance avorter, on fait alors du sauvetage d'embryon pour rgnrer une plante haplode
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Dans les 2 cas croisements interspciques et la culture de gamtophytes, on doit faire un prtraitement de la plante mre: Culture de gamtophytes: - Froid: 4C pendant 1 heure par jour - Solution hypertonique (+ mannitol) - Ou les 2 : froid + solution hypertonique stress Croisements interspciques : pulvrisation ou injection de 2-4D, cela facilite la fcondation et la survie de l'embryon ! ! ! ! V.I.c - Doublement du stock de chromosomique

Spontan: cela arrive trs frquemment sans que lon ne sache pourquoi pratique Provoqu: Agents antimitotiques (colchicine, orysaline) La colchicine bloque la formation du fuseau achromatique donc les chromosomes ne peuvent pas se sparer l'anaphase. Il n'agit que sur les cellules qui sont en mitose. Donc si on vaporise sur la plante, on obtient une mosaque de cellules haplode et diplode que lon appelle chimre. Il faut donc passer par une tape de multiplication soit par la reproduction sexue ou par la multiplication vgtative pour obtenir un organisme compltement diplode Fusion de protoplastes: cellules haplodes : n+n 2n

V.II - Exemple d'un cas particulier de lasperge

Lasperge est une plante dioque, il y a des plantes mles (Mm) et des plantes femelles (mm). Lorsqu'on fait de la culture d'asperge, les plantes les plus productives sont les Mm donc si on fait des croisements de Mm x mm, on aura seulement 1/4 de plantes performantes. Les slectionneurs ont donc fait de l'haplodiplodisation avec de la culture d'anthres

Les MM (supermale) n'existent pas dans la nature, mais

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quand on les croise avec une plante mm, on obtient 100% de Mm performant donc c'est une belle utilisation de l'haplodiplodisation

VI. Production de mtabolites secondaires par les cultures cellulaires vgtales

! ! VI.1 - Mtabolites secondaires

Dans les vgtaux, diffrents types de mtabolisme: Mtabolisme primaire: survie de la plante (cycle du carbone, de l'azote...) Mtabolisme secondaire: Mcanisme de dfense face l'environnement Mcanisme d'interaction avec l'environnement Mtabolites en assez faible quantit (1% du poids sec de la plante)

Le mtabolisme secondaire dpend du stade physiologique et du stade de dveloppement de la plante. Ces mtabolites sont stocks dans des tissus (souvent dans la vacuole) 100 000 mtabolites secondaires ont t dcouverts, mais seulement la moiti ont t dcrites On peut les classer en 3 classes: - Les terpnodes: menthole (menthe) cannabinodes (cannabis) - Les alcalodes: morphine (extraite du pavot) - Les phnylpropanodes: estragol On peut les utiliser: - Pharmacologie: taxol, vinblastine - Agroalimentaire: btacyanine pour colorer les aliments, le menthol pour le gout - Chimie: cosmtologie 1/4 des mdicaments pharmacologiques sont d'origines vgtales: - Utilisation directe: vinblastine, vincristine - Utilisation indirectement (on fait de l'hmisynthse) : une molcule lgrement modie comme la bodophyllotoxine (antiviral) - Synthse presque complte: on utilise le squelette de la molcule puis on vient greffer des groupements dessus comme les strodes (contraceptifs)

VI.2 - Interet des cellules vgtales

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VI.2.a - Totipotence

Lorsqu'on met des cellules en cultures, il n'y a plus de signaux qui proviennent de la plante, ce qui modie l'expression des gnes qui conduit: - une production plus importante de molcules - une production de nouveaux mtaboliques ! ! ! ! VI.2.b - Richesse gntique

Le gnome des vgtaux est aussi grand que celui des animaux, mais dans les cellules vgtales, il y a plus de squences non codantes qui permettent l'expression dautres gnes

VI.3 - Mthodologie

1) Choix de la plante 2) Obtenir des cals sur glose 3) Tri des cals pour obtenir des souches Souches culture de cals dont les cellules sont: - De mme origine phnotypique De morphologies identiques De caractristiques physiologiques semblables Dpourvu de capacit de rgnration Cultiv en condition identique

4) Passage en milieu liquide agit (stabilisation des suspensions) 5) Slection d'une suspension en haut rendement 6) Production en bioracteur dpendante de: - La physiologie de la cellule vgtale - Mtabolites non excrts Cellules vgtales qui ont une croissance lente (3 semaines, 1 mois) Cellules vgtales plus volumineuses que les bactries

Les types de bioracteurs : ailette (pas adapte) Au lift: circulation d'air pour l'oxygnation du milieu

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Quand une cellule se divise, elle ne produit pas tout de suite des mtabolismes. Il faut d'abord crer de la biomasse et ensuite elles synthtiseront des mtabolites. Pour cette synthse, il suft d'immobiliser les cellules dans des gels dextran pour simuler un tissu L'excrtion des mtabolites a t ralise grce: - Changement de pH: il suft de diminuer le pH du milieu extrieur pour que les mtabolites se dirigent vers l'extrieur de la cellule au lieu de se diriger vers la vacuole (vacuole pH 5) Agents permabilisant

VI.4 - Intrt de produire des mtabolites secondaires par ce procd

La culture en bioracteur permet: Une indpendance par rapport au : - Climat - Saison Une limination des alas gopolitique Maitrise totale de la production Dliminer les actions nfastes sur l'environnement (cologie) Dliminer les alas dus aux rcoltes Labsence de rsidus de substances phytosanitaire

L'inconvnient: cela coute trs cher donc autant faire de la culture classique, mais on peut amliorer la culture en bioracteur en augmentant encore la production

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VI.5 - Augmenter encore la production

! ! VI.5.a - licitation

liciteurs: substances introduites dans le milieu de culture an d'augmenter la production des mtabolites secondaires liciteurs : Molcules extraites de champignons Ultra Violet Ions (Cu, Cd)

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Lliciteur a pour but de crer des stress et gnralement la plante synthtise du mthylejasmonate (qui peut tre aussi un liciteurs, mais endogne cette fois-ci) ! ! ! ! IV.5.b - Transgnse

On fait des cultures de plantes transformes, on modie les mtabolismes au niveau des facteurs de transcription pour augmenter la production des mtabolites

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VI.6 - Applications
! ! VI.6.a - Production de shikonine

La shikonine provient des cellules de Lithospermum erythorhizon et est utilise en mdecine chinoise depuis trs longtemps. C'est un cicatrisant trs efcace (pharmacologique) et lon sen sert comme rouge lvres (cosmtologie) On l'extrait de racines ges de 5 7 ans dans lesquelles on trouve une concentration de 1 2% de shikonine donc a d faire de la culture en bioracteur: Culture de 11 jours + 14 jours - 11 jours pour la production de biomasse - 14 jours pour la production de mtabolite Le rendement est suprieur la culture traditionnelle VI.6.b - Bioconversion de -mthyl digitoxine en -mthyl digoxine par les cellules de Digitalis lanata Ce sont des mdicaments cardiotoniques l'tat naturel, la plante est capable de produire les 2, mais la digoxine est plus intressante pour la production de mdicaments Il suft de faire une 12--hydroxylation, les cellules arrivent trs bien faire cette conversion en racteur de 20 litres VI.6.c - Mise en vidence de nouveaux composs pharmacologiques actifs tude faite sur Picralima nitida apocynace africaine On ralise des suspensions cellulaires extraits tests biologiques (test de liaison comptitive avec la naloxone tritie sur des rcepteurs d'opiacs partir de cerveau de rats)
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Dcouverte de 2 molcules: Pricin : jamais dcrite, mais elle a une activit 3 fois plus importante que la codine Pricalcine

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