IMUNOKEMIJSKE TEHNIKE Imunokemijske tehnike koje se primjenjuju za otkrivanje, razlikovanje i mjerenje koncentracije razliitih antigena ( Ag ) i protutijela (At ) osnivaju

se na reakciji izmeu antigena i protutijela. Zbog izuzetne specifinosti ove reakcije, imunokemijske tehnike se odlikuju: osjetljivou, reproducibilnou i jednostavnou. U veini imunokemijskih tehnika, koje se primjenjuju u klinikim laboratorijima, protutijela su radni reagens za kvalitativnu ili kvantitativnu analizu antigena u ispitivanom uzorku. S obzirom na nain otkrivanja reakcije izmeu antigena i protutijela, imunokemijske tehnike mogue je podijeliti u dvije skupine: Neobiljeene ili izravne tehnike, u kojima se mjerenja izvode u zoni ekvivalencije reaktanata kada dolazi do stvaranja netopivih imunoprecipitata. Njih moemo dalje podijeliti na: Kvalitativne: imunoelektroforeza protusmjerna imunoelektroforeza imunofiksacija imunoselekcija Kvantitativne: radijalna imunodifuzija imunoturbidimetrija imunonefelometrija Obiljeene tehnike, kod kojih se mjeri primarna reakcija izmeu Ag i At uz koritenje obiljeenih reaktanata. Pripadaju najvanijim analitikim tehnikama u klinikoj kemiji. Pronalazak ovih tehnika znaio je golem napredak u daljnjem prouavanju fiziologije i patologije ovjeka. Pridonio je znaajnom razvoju raznih grana medicine, a posebno endokrinologije. Ovim tehnikama omogueno je mjerenje tvari koje se u organizmu nalaze u vrlo malim koliinama (do 10-14 mol/L). One se takoer mogu podijeliti na: Kvalitativne: imunoblot tehnike gdje se proteini razdvoje elektroforezom u agaroznom gelu. Razdvojeni se proteini prenesu na vrsti nosa ( nitrocelulozni ili najlonski filtar ), te izravnim nanoenjem odgovarajueg antiseruma na nosa izvodi reakcija imunoprecipitacije. Kvantitativne: kod kojih se antigeni ili protutijela mogu obiljeiti radioizotopom, radioimunoloke tehnike (RIA) enzimom, inhibitorom, kofaktorom ili supstratom enzima, enzimoimunokemijske tehnike, (ELISA) luminiscentnim spojem, luminoimunokemijske tehnike (LIA) fluorescentnim spojem, fluoroimunokemijske tehnike (FIA) te mnogim drugim obiljeivaima. Vezanje antigena i protutijela dogaa se preko nespecifinih vodikovih, Coulombovih, hidrofobnih i Van der Waalsovih veza. Jakost tih veza vrlo je mala i postaje znatno vea tek nakon bliskog pristajanja antigena uz protutijelo. Jakost ili energija vezanja antigena i protutijela odreena je dvama pojmovima: afinitet i avidnost. Afinitet oznaava jakost vezanja jednoga spojnog mjesta protutijela i jednog epitopa odnosno determinante antigena, dok avidnost oznaava jakost vezanja protutijelai cijele molekule antigena, odnosno zbroj afiniteta svih spojnih mjesta na protutijelu. Afinitet je stoga svojstvo antigena, a avidnost je svojsvo protutijela.

Stvaranje protutijela mogu uzrokovati razliite kemijske tvari kao to su bjelanevine, polipeptidi, nukleinske kiseline, lipidi, aminokiseline, steroidi i druge molekule. Dok bjelanevine, polipeptidi, nukleinske kiseline i lipidi oznauju prirodne imunogene, male kemijske molekule hapteni, kao to su primjerice steroidi, lijekovi i aminokiseline, postaju imunogene tek nakon povezivanja s nosaem, najee bjelanevinom ( goveim ili ljudskim albuminom ). Stoga svaka kemijska tvar koja je sposobna uzrokovati stvaranje protutijela, kad se unese u ivotinju domaina, nosi naziv imunogen. U veini imunokemijskih tehnika koriste se poliklonska protutijela kao radni reagens. Ona tvore heterogenu smjesu protutijela s razliitim specifinostima. Proizvode ih razliite stanine linije plazma stanica kao odgovor na razliite epitope imunogena. Nasuprot tomu, monoklonska su protutijela homologna i potpuno specifina. Njih proizvode stanice koje su podrijetlom iz jedne jedine hibridne stanice nastale spajanjem B limfocita imunizirane ivotinje i mijelomske plazma stanice. Budui da monoklonska protutijela ulaze u reakciju samo s jednim jedinim epitopom imunogena, nisu pogodna za precipitacijske i aglutinacijske tehnike, zbog nemogunosti krinog povezivanja antigena i protutijela. No, vrlo su pogodna u tzv. obiljeenim tehnikama kao to su radioimunokemijska tehnika, heterogena enzimimunokemijska tehnika i imunofluorometrija. Reakcija izmeu antigena i protutijela Vezanje antigena i protutijela ravnotena je reakcija koja se zbiva u tri faze, sl.1. U prvoj fazi ili primarnoj reakciji dolazi do vezanja vievalentnog antigena i dvovalentnog protutijela u kompleks antigen-protutijelo u razdoblju od nekoliko sekundi. Nakon nastanka primarnog kompleksa antigen-protutijelo slijedi rast kompleksa koji moe potrajati od nekoliko minuta do nekoliko dana. U treoj fazi, ovisno o relativnim koncentracijama antigena i protutijela, kompleksi se mogu krino povezivati pri emu nastanu veliki trodimenzionalni kompleksi koji precipitiraju iz otopine. Kad se uspostavi ravnoteno stanje izmeu svih nastalih kompleksa, prestaje njihov daljnji rast.

1. faza

2. faza

3. faza

Slika 1.: Reakcija vezanja antigena i protutijela

Brzina tih reakcija ovisna je o vrsti antigena i protutijela, afinitetu vezanja protutijela, kao i o koncentraciji elektrolita, pH i temperaturi. Razliiti linearni polimeri kao polietilenglikol, dekstran, preinaena celuloza, propilenglikol, polivinilni alkohol, imaju svojstvo da smanje topljivost bjelanevina, to se primjenjuje u nekim imunokemijskim tehnikama za poveanje precipitacije kompleksa antigen-protutijelo. Reakcija izmeu antigena i protutijela prikazana je Heidelberger-Kendallovom krivuljom na sl.2. Ona oznauje rezultate mjerenja koliine precipitata nastalih dodatkom razliitih koliina antigena stalnoj koliini protutijela.

Slika 2. Heidelberger-Kendallova krivulja Odnos izmeu antigena i protutijela je razliit u svakoj zoni precipitacijske krivulje. U zoni suvika protutijela (1. faza), odnos je izmeu antigena i protutijela manji od 1. Budui da je broj veznih mjesta protutijela velik, gotovo sva mjesta za vezanje na antigenu zasiena su prije nego to moe doi do krinog povezivanja izmeu antigena. Stoga nastaju mali topljivi kompleksi sastava AgAt2. Daljnjim dodatkom antigena, pri emu je protutijelo prisutno u umjerenom suviku, vjerojatnost je krinog povezivanja antigena s protutijelom vea pa nastaju veliki netopljivi kompleksi. Veliina kompleksa raste do zone ekvivalencije u kojoj je sav antigen vezan s protutijelom. Odnos izmeu antigena i protutijela iznosi 1 (2. faza). U zoni suvika antigena odnos izmeu antigena i protutijela raste pri emu se veliine kompleksa smanjuju. Kad je suviak antigena velik, nastaju mali topljivi kompleksi sastava Ag2At (3. faza). Precipitacija u zoni ekvivalencije tvori osnovu za otkrivanje i mjerenje koncentracije antigena u veini izravnih imunokemijskih tehnika. Neobiljeene kvalitativne imunokemijske tehnike Imunoelektroforeza je spoj zonske elektroforeze i reakcije izmeu antigena i protutijela i omoguuje razdvajanje razliitih antigena tj. proteina u jednoj biolokoj tekuini. Pomou

imunoelektroforeze mogu se pojedini proteini definirati prema njihovoj pokretljivosti u elektrinom polju kao i njihovoj specifinoj reakciji s homolognim protutijelima. Razliitim tehnikama bojenja mogu se razlikovati proteini, lipoproteini i glikoproteini, a specifinim reakcijama mogu se dokazati i enzimi. Imunoelektroforeza ima posebnu vanost u definiranju razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina kod monoklonskih gamapatija. Kako je monoklonski imunoglobulin proizvod jednoga klona plazma stanica, njegova osnovna karakteristika je kemijsko-fizika i imunoloka homogenost koja se na elferogramu vidi kao uska homogena proteinska vrpca, a na imunoelferogramu kao precipitacijska linija promijenjenog oblika, poloaja i intenziteta (sl.3.)

serum-monospeciini antiserumi Slika 3.: Imunoelektroforeza

likvor-polispecifini antiserum

Nakon elektroforetskog razdvajanja proteina u agar gelu, izvodi se imunokemijska reakcija precipitacije pojedinih proteina pomou monospecifinih ili polispecifinih antiseruma. Kako se ova metoda koristi prvenstveno za odreivanje razreda i tipa monoklonskih proteina , imunokemijska precipitacija izvodi se pomou specifinih antiseruma na teke lance imunoglobulina (G), (A), (M), vrlo rijetko (D) i (E), kao i na vezane i slobodne lake lance imunoglobulina kapa i lambda tipa. Protusmjerna imunoelektroforeza je vrlo slina dvostrukoj imunodifuziji, ali znatno bra jer pasivna difuzija je zamijenjena djelovanjem elektrinog polja. Ako se odaberu elektroforetski uvjeti pri kojima antigen ima pokretljivost prema anodi, a protutijelo prema katodi, pod uinkom elektrinog polja dolazi do njihova krianja u gelu agara. Kad su koncentracije antigena i protutijela optimalne, na mjestu susreta nastaje netopljiva precipitacijska linija koja vie ne putuje. Rabi se za razluivanje uzoraka po naelu ima-nema. Imunofiksacija je svakako tehnika izbora za odreivanje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina. Izvodi se u gelu agaroze. Nakon elektroforetskog razdvajanja proteina u ispitivanom uzorku (serumu, mokrai, likvoru) u est jednakih, paralelnih kanala, izravno se nanese u prvi (referentni) kanal otopina za fiksiranje proteina te redom na ostale kanale monospecifini antiserumi na teke lance (G), (A), (M) i vezane lagane lance kapa i lambda tipa. Monoklonske slobodne lagane lance imunoglobulina ( Bence Jones protein ) dokazujemo monospecifinim antiserumom na slobodne lagane lance kapa i lambda tipa. Ako je prisutan monoklonski imunoglobulin, nakon bojenja pojaviti e se uska homogena proteinska vrpca u kanalu razreda i tipa odreenog imunoglobulina (sl. 4.). Kod poliklonski sintetiziranih imunoglobulina nastat e iroke difuzne vrpce. Poloaj obojene i imunofiksirane proteinske vrpce usporeuje se s poloajem vrpce u referentnom kanalu.

serum

Slika 4.: Imunofiksacija Imunofiksacijom nativnog uzorka likvora , bilo da se proteini u likvoru razdvoje elektroforetski na acetat celuloznom nosau ili izoelektrinim fokusiranjem na poliakrilamidnom gelu (PAG), dokazuju se oligoklonski imunoglobulini (sl.5.). Nalaz oligoklonskih imunoglobulina upuuje na sigurnu intratekalnu sintezu imunoglobulina odnosno ukazuje na lokaliziranu imunoloku reakciju unutar centralnog nervnog sistema.

Slika 5.: Odreivanje oligoklonskih IgG metodom izoelektrinog fokusiranja na PAG-u i direktnom imunofiksacijom na gelu uz bojenje srebrom Nakon to se proteini, putujui u elektrinom polju uguste u uskom podruju svoje izoelektrine toke (pI), nanose se specifini antiserumi izravno na gel uz bojenje proteina ili srebrom ili Coomassie-Blue bojom. Imunoselekcija je imunokemijska tehnika kojom se mogu dokazati monoklonski sintetitzirani teki lanci. U gelu agara, u koji su prethodno dodani antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u serumu. Pri tom dolazi do vezanja kompletnih molekula imunoglobulina, dok eventualno prisutni slobodni teki lanci ostaju nevezani. U slijedeem koraku izvodi se imunokemijska reakcija precipitacije slobodnih tekih lanaca sa specifinim antiserumom na (G), (A) ili (M) teke lance. Sve bolesti tekih lanaca povezane su s istodobnim postojanjem jedne od malignih limfoproliferativnih bolesti. To su najee maligni limfomi i kronina limfocitna neoplazma.

Neobiljeene kvantitativne imunokemijske tehnike

Radijalna imunodifuzija osniva se na pasivnoj difuziji antigena u agarozni gel koji sadri jednolino rasporeena protutijela. Pri prvom dodiru s protutijelima, antigen je u velikom suviku pa nastaju kompleksi Ag-At. Daljnje difundiranje antigena uzrokuje pad koncentracije antigena, dok koncentracija raspoloivih protutijela raste. Kad se postigne optimalan koncentracijski odnos izmeu antigena i protutijela, nastaje netopljiv i nepokretan precipitacijski prsten koji se moe mjeriti (sl.6.). Povrina precipitacijskog prstena razmjerna je koncentraciji antigena. Usporeivanjem s povrinama precipitacijskih prstena poznatih koncentracija antigena moe se mjeriti nepoznata koncentracija antigena u ispitivanom uzorku. Ovom tehnikom odreuju se koncentracije imunoglobulina, lipoproteina, hemoglobina kao i mnogih drugih specifinih proteina.

Slika 6.: Radijalna imunodifuzija Imunoturbidimetrija i imunonefelometrija su imunokemijske tehnike koje se izvode u tekuem mediju. Prva reakcija izmeu antigena i protutijela bila je provedena u otopini. Dodatkom otopine protutijela u otopinu koja sadri antigen nastaje zamuenje zbog nastalih kompleksa Ag-At. Mjerenje reakcije izmeu antigena i protutijela, u zoni ekvivalencije kad je postignuta maksimalna koncentracija kompleksa Ag-At, naziva se metoda krajnje toke ( End-point method). Svaki uzorak antigena pomijea se sa stalnom koncentracijom protutijela u prisutnosti polietilenglikola 6000 koji pojaava reakciju vezanja, pomie toku ekvivalencije prema viim koncentracijama antigena i odrava homogenost kompleksa Ag-At koji lebde u otopini. Nakon inkubacije mjeri se kod imunoturbidimetrije apsorpcija svjetla ili kod imunonefelometrije rasap svjetla. Standardna krivulja apsorpcije ili rasapa svjetlosti dobije se mjerenjem poznatih koncentracija antigena. Kod ovih tehnika mjeriti se moe i brzina stvaranja kompleksa Ag-At, i to unutar prvih nekoliko minuta reakcije izmeu antigena i protutijela, jer se tada dobiju najvee promene intenzteta apsorpcije ili rasapa svjetlosti s obzirom na vrijeme ( Fixedtime method). Osjetljivost imunonefelometrije je neto vea od imunoturbidimetrije i iznosi 1-10 g/mL. Osim za odreivanje koncentracije raznih specifinih proteina obje metode se primjenjuju i za mjerenje koncentracije haptena, malih kemijski odreenih molekula kao to su na pr. lijekovi.