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AISLAMIENTO DE PROTEINAS POR PUNTO ISOELCTRICO Y PRESIPITACION SALINA

Integrantes: CAROLINA ORDOEZ CLAUDIA GUADIR FELIPE YULY CHALPATAR

Estudiantes de VI semestre del programa de ingeniera en produccin acucola de la universidad de Nario RESUMEN: En el rea de bioqumica es muy comn aislar y purificar protenas para estudiar su composicin, su estructura y de ser posible su funcin. Con esta prctica se pretende hacer prcticos los conocimientos obtenidos anteriormente en clase en cuanto a la obtencin de protenas a partir de muestras naturales, la practica consiste en aislar las protenas del huevo y la leche conocidas como ovoalbmina y casena respectivamente, para lograr la extraccin de la casena se hace a partir de su punto isoelctrico, y para la extraccin de la ovoalbmina se hace por precipitacin de la clara de huevo por sulfato de amonio. Las protenas sometidas a diferentes condiciones de pH pueden alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto pueden ser precipitadas, este determinado comportamiento de las protenas se da gracias a su determinada composicin de aminocidos. Esta prctica tiene como finalidad determinar el mtodo utilizado para la obtencin de la casena y la ovoalbmina, tambin determinar cuntos gramos de protena se obtienen de tantos gramos de muestra. INTRODUCCION: Las protenas son sustancias orgnicas muy complejas presentes en toda la materia viva, por tal razn es tan importante el estudio de estas, para determinar su funcin, estructura y beneficio en el organismo.

La extraccin de protenas comienza siempre con una ruptura celular o lisis, los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los limites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos obtenindose lo que se denomina extracto crudo, los objetivos para lograr esta etapa son maximizar la liberacin de las protenas de inters, evitando la degradacin trmica o las alteraciones secundarias por oxidacin. Para la realizacin de este laboratorio se determino la utilizacin de leche y clara de huevo como muestras para la extraccin de las protenas casena y ovoalbmina. La leche es un producto de secrecin mamaria que se produce en las hembras de los mamferos, la muestra de leche utilizada para la prctica es proveniente de la vaca, esta es rica en protenas, tales como las casenas y las globulinas. La casena es una sustancia orgnica nitrogenada, es un slido blancoamarillento sin sabor ni olor, insoluble en agua. La forma de obtener la casena a partir de una muestra de leche es acidificar la leche hasta pH 4.6, a este pH en fosfato de calcio se disuelve de las micelas de casenas y se deteriora la estructura micelar, provocando que la casena se agregue y precipite, luego se vuelve a suspender el precipitado de casena mediante la adicin de hidrxido de sodio hasta aproximadamente pH de 7.0 seguido por secado, este proceso se usa en la fabricacin de caseinatos de sodio, los caseinatos se usan principalmente en la fabricacin de varios alimentos. Este mtodo para la extraccin de casena se denomina precipitacin por punto isoelctrico, se estudiara a fondo ms adelante. Otra de las muestras elegidas para la realizacin de esta prctica de laboratorio fue, la clara del huevo, es de extraccin fcil e importante en la dieta diaria de cualquier ser humano. El huevo es un ingrediente habitual en la alimentacin del ser humano, se caracteriza por su alta densidad nutritiva, la principal protena presente en huevo es la ovoalbmina. La ovoalbmina es la principal protena de la clara del huevo es una fosfoglicoproteinas, es decir que su cadena de aminocidos es lleva enlazados diversos glcidos, pertenece a la familia protenica de las serpinas, tambin inhibe muchas de las enzimas, por lo cual no es recomendable ingerirla cruda ya que esta puede inhibir a la enzima tripsina, es muy conocida dentro de la industria alimentaria como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones.

La ovoalbmina de la clara del huevo se obtiene a partir de una tcnica denominada precipitacin salina de protenas, esta es una tcnica en donde se logra la precipitacin de una fraccin de protena mediante el aumento de la fuerza inica del medio, grandes cantidades de sal agregada a una solucin de protena disminuye la interaccin protena-agua, generando la precipitacin de la protena, la concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es la igual para todas las protenas lo que permite usar esta propiedad para la separacin de protenas particulares a partir de mezclas complejas, comnmente se usa sulfato de amonio, el que tambin fue empleado en esta prctica para la obtencin de ovoalbmina de la clara de huevo. Ms adelante se har una profundizacin sobre este mtodo. METODOLOGIA Existen varios mtodos para la obtencin de protenas, el mtodo que se utilizo para obtener la casena fue el de precipitacin por punto isoelctrico, el punto isoelctrico es el pH para el cual una protena presenta carga neta compensada (igual nmero de cargas positivas que negativas) y en el mismo, la solubilidad de la protena es mnima, el punto isoelctrico (pI) de la casena es de 4.6 el cual se precipita a partir de la leche que tiene un pH de 7, por adicin de acido actico. Para la obtencin de la protena de la leche, casena, se tomo una muestra de leche de vaca, la cual se someti a diferentes procesos, primero que todo se midi en un beacker 15 ml de leche, a esta muestra se le agrego acido actico solucin al 25%, el cual coagula la muestra, ya que el acido actico desnaturaliza la casena de la leche, luego se somete esta mezcla a centrifugacin, lo que permite eliminar los restos celulares y separar el sobrenadante que contienen las protenas solubles del precipitado, luego de este procedimiento se agrega etanol a la muestra obtenida anteriormente, ya que la casena es insoluble en el etanol, y por otro lado, el etanol permite que la polaridad del disolvente disminuya provocando la disminucin del grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica provocando la precipitacin de la misma, luego de centrifugar, se realiza el mismo procedimiento pero con etanol-ter 1:1, y se vuelve a centrifugar. Luego se deja secar el resultado de los procedimientos anteriores, obteniendose como resultado final la proteina caseina. Para la obtencion de ovoalbumina de la clara de huevo, se tomo una muestra de clara de huevo de un huevo de gallina, el metodo que se utizo en esta practica fue el de la presipitacion salina de proteinas, para este metodo se usa comunmente sulfato de amonio el cual tambien fue utilizado en esta practica para este

procedimento, el sulfato de amonio presipita la solucion alcanzando altas fuerzas ionicas, lo que hace que las proteinas presentes sean menos solubles, luego se centrifuga. Se repite este proceso pero antes de centrifugar se aade a la solucion acido acetico que hace que el ph suba hasta aproximadamente 4.5, ya que este es el punto isoelctrico de la ovoalbumina y se produce la presipitacion de la proteina, luego se agrega acetona, ya que la acetona es un agente desnaturalizante de las proteinas ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatacion y por lo tanto las presipita. Al terminar con los anteriores procedimientos, se obtiene la ovoalbumina, luego se deja secar, y se pesa. RESULTADOS El las siguientes tablas se demuestran los respectivos resultados de cada experimento realizado en esta paractica. MUESTRA METODO DE ML DE EXTRACCION DE MUESTRA LA PROTEINA Precipitacin por 15 ml punto isoelctrico PROTEINA AISLADA GRAMOS DE PROTEINA OBTENIDOS 0.55 g

leche de vaca clara de huevo de gallina

Casena 0,129 G

10 ml

Precipitacin salina ovoalbmina de protenas

Es decir que de 15 ml de de leche de vaca se obtienen, por el metodo de presipitacion del punto isoelctrico, 0.55 gramos de la proteina caseina. Y de 10 ml de ovoalbumina se obtienen, por el metodo de presipitacion salina de proteinas, 0.129 g de la proteina ovoalbumina.

BIBLIOGRAFIA Gentica de la casena de la leche, 2007, Revista electrnica de Veterinaria, volumen VIII. Carvajal Isabel, 2007, Mtodos de extraccin de casena a partir de leche y caseinatos y produccin de productos novedosos, Boletn europeo de patentes, 3 Cristina Royo Toms, qumica y cocina del huevo, aula y docentes, 41-48 Prof. Harry Alises, 2009, bioqumica. Protenas y aminocidos. Aislar casena a partir de la leche, Departamento de ciencias y matemticas, 1-6. Jos Mara Fernndez, 2005, estructura y funcin de protenas, ampliacin de tecnologa de los alimentos, 1-24. Extraccin y cuantificacin de protenas, introduccin a la biologa celular y molecular, 1-5. OBTENCION DE ALBUMINA DE CLARA DE HUEVO (Alemany M, Font S. Prcticas de Bioqumica.1983. Pg 235.Primera edicin. Edit Alhambra, Espaa). MANCILLA, C. G. E.; BLANCO, E. Z.; PREZ, S. L. J.; ROSAS, T. M. y CASTREJN, C. R, 2012, PROPIEDADES QUMICAS Y FISICOQUMICAS DE LAS PROTENAS, 1-26.