MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA II Enero 2012 Texto Final Con Viro

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS CARRERA DE BIOQUIMICA MENCION MICROBIOLOGIA
MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA II
Autores:
Dr. Miguel Estenssoro Cernadas. Katty Terrazas Aranda MSc. PhD. Sergio Quisberth Barrera. MSc.
La Paz Bolivia 2012
Dr. Miguel Estenssoro C. Katty Terrazas A. MSc. PhD. Sergio Quisberth B. MSc.
Prologo Segunda Edicin
En la primera edicin se inicio con algunas bases acerca de los mtodos diagnsticos para la deteccin de diferentes microorganismos a partir de muestras biolgicas, sin embargo en esta segunda edicin se incluye nuevas tablas en las cuales se muestran los factores de virulencia de diferentes bacterias, adems los captulos de Streptococcus y Enterobacterias son divididos en partes, para una mejor comprensin y anlisis de estos captulos. Tambin se completa en el capitulo de Enterobacterias las enfermedades producidas por los miembros de esta familia as como la clasificacin de las especies diarreognicas de E. coli. Adems se completa en el capitulo de bacilos Gram negativos no fermentadores, donde se incluyen Pseudomonas y Acinetobacter. En los captulos de prcticas de Diagnstico e Investigacin en Virologa, se realizan 5 sesiones prcticas, desarrolladas mediante trabajo grupal de anlisis y discusin de procedimientos, elaboracin de rutas crticas y su aplicacin en el diagnstico de procesos virales de importancia en salud pblica. Los estudiantes requieren para cada prctica realizar revisin bibliogrfica previa del tema de la prctica, lo que ser evaluado a travs de un examen previo a la prctica, donde se consideraran conceptos bsicos, patogenia/patologa de procesos a estudiar. El reporte de la prctica incluye el trabajo del cuestionario y las preguntas de la sesin de prcticas no respondidas, asimismo la participacin en cada componente de la prctica es importante para la asimilacin de conocimientos.
Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II
Tabla de contenido
DIAGNOSTICO DE Bacillus spp. ......................................................................................... 4 DIAGNOSTICO DE Clostridium spp .................................................................................... 9 DIAGNOSTICO DE Staphylococcus spp ............................................................................ 13 DIAGNOSTICO DE Streptococcus y Enterococcus spp ..................................................... 19 DIAGNOSTICO DE Enterobacteriaceae ............................................................................. 30 DIAGNOSTICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES ........... 39 DIAGNOSTICO DE Haemophilus spp................................................................................ 43 DIAGNOSTICO DE Neisserias spp .................................................................................... 47 DIAGNOSTICO DE Sfilis .................................................................................................. 51 INTRODUCCIN A LA TECNOLOGA DE DIAGNSTICO DE PROCESOS VIRALES ............................................................................................................................. 56 ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS GASTROINTESTINALES .................................................................................................. 58 ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS RESPIRATORIOS ............................................................................................................... 60 ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS INDIRECTOS: HERPES VIRUS .................................................................................................................. 62
DIAGNOSTICO DE Bacillus spp.

1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad de poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Bacillus a partir de muestras biolgicas. Identificar la morfologa que presentan estos bacilos mediante una tincin Gram. Determinar la presencia de microorganismos que se encuentran en la placa de sembrado. Observar la formacin de esporas e indicar a que especie corresponde MARCO TERICO:
2.
Caractersticas
Bacilos Gram positivo, formadores de esporas, aerobios estrictos y anaerobios facultativos, desarrollan formando cadenas de clulas grandes (Figura 1).
Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Bacillus.
Presentan un tiempo de generacin corto (20-30 min), no son exigentes nutricionalmente; son quimiorganotrofos verstiles ya que pueden tener un metabolismo respiratorio y fermentativo, bsicamente fermentacin butanodiolica. Algunas especies pueden metabolizar una gran cantidad de fuentes de carbono, incluyendo metanol, celulosa y quitina. Esporula y germina fcilmente, lo que permite su gran distribucin. Adems a travs de un subcultivo en un medio nutritivo suplementado con MnSO 4 a una concentracin final de 5 g/ml e incubacin a 37C, se logra tambin favorecer la esporulacin. Presenta alta resistencia al calor y desecado, respondiendo a condiciones hostiles del medio por la formacin de esporas. En placas de agar sangre desarrollan formando hemlisis beta, siendo la excepcin el B. anthracis.
Patgenos para humanos y animales Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis.
Bacillus anthracis. El carbunco (enfermedad de los animales herbvoros, ovinos y bovinos, equinos, porcinos y caprinos) es causado por el B. anthacis. Es un bacilo recto que mide de 3 a 5 micras de largo y de 1 a 1.2 micras de ancho, es inmvil. Estos contaminan los pastizales donde se alimentan los animales, ingresan por la ingesta de alimentos espinosos, forman una pseudomembrana en el lugar de inoculacin y luego ingresan a torrente sanguneo produciendo bacteremia y posteriormente la muerte del animal. Patogenia. Los seres humanos se infectan de una de tres formas (Figura 2): 1. 2. La va cutnea. Los microorganismos acceden a travs de pequeas abrasiones o cortes y se multiplican. Inhalacin. Los microorganismos son inhalados, se multiplican en los pulmones y son llevados hacia los ganglios linfticos hiliares de drenaje, donde se produce una necrosis hemorrgica. Ingestin. Rara vez los microorganismos son ingeridos en carne infectada, una vez ingerida en la carne el microorganismo causa invasin y ulceracin de la mucosa gastrointestinal.
3.
Figura 2. Enfermedades producidas por Bacillus anthracis. Tomado de Manual CTO.
Bacillus cereus. Es una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia. Tiene una morfologa celular similar a la del B. anthracis pero a diferencia de ste en general es mvil y no es susceptible a la penicilina. La intoxicacin alimentara por B. cereus puede causar dos sndromes clnicos: 1. Tipo emtico: Tiene un periodo de incubacin breve de cuatro horas aproximadamente. Se caracteriza por nuseas y vmitos severos y con frecuencia se confunde con la intoxicacin alimentaria estafiloccica.
2.
Tipo diarreico: Tiene un periodo de incubacin ms prolongado (17 hrs.) y se caracteriza por clicos abdominales y diarrea. Habitualmente se confunde con la intoxicacin alimentaria por clostridios.
Bacillus subtilis. Este es un Bacillus saprofito pero en pacientes inmuno-comprometidos se observo que pueden producir infecciones oportunistas, desde conjuntivitis hasta bacteremia y meningitis. Identificacin en laboratorio. Morfologa de la colonia: Las especies de Bacillus presentan variaciones en cuanto a la morfologa de la colonia. Por ejemplo B. anthacis desarrolla de forma ptima en placas de agar sangre formando colonias caractersticas, las cuales no presentan hemlisis, estn fuertemente adheridas al medio, son de consistencia viscosa y de aspecto como de vidrio esmerilado y con bordes en forma de cabeza de medusa Por otra parte las colonias de B. cereus y B. thuringiensis suelen ser grandes observndose una hemolisis presentan bordes lisos y B. subtilis produce colonias grandes planas con -hemlisis. Test rpidos: El test ms rpido para la deteccin es la tincin Gram donde se visualizan bacilos con borde recto en cadena, pero tambin se puede emplear tincin de esporas y pruebas bioqumicas. Test convencionales: Estos se detallan en la Tabla 1. Requiere un nivel de bioseguridad 2 para el procesamiento de muestras clnicas infectadas con este patgeno.
Tabla 1. Pruebas de identificacin para bacterias del Genero Bacillus. B. cereus B. cereus var B. thuringiensis mycoides Gram. + + + Catalasa + + + Lecitinasa +/+/+/Movilidad +/+/Citrato + + + Crec. Rizoide + Gluc. Anaerbica + + + Red. de nitrato +/+/+ VP + + +
B. subtilis + + + + + + +
B. anthrancis + + + +/+ + +
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Medios de cultivo y pruebas Caldo soya tripticasa Placas de Agar Sangre Agar Gelatina Material biolgico Cepa de Bacillus subtilis
4.
PROCEDIMIENTO
El cultivo en CST se deja incubar durante 7 das, para observar la presencia de esporas por tincin de Gram.
5.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Indique 5 ejemplos de especies del genero Bacillus. Indique que pruebas se emplean para diferenciar Bacillus de Clostridium. Indique como contribuye a la patognesis la toxina del ntrax. Usted tiene un animal de su ganado que lo encuentra muerto en el campo. a) que caractersticas observara para pensar que trata de un posible carbunco. b) para confirma bacteriolgicamente como procedera desde la toma de muestra. c) que medidas preventivas asumira para evitar que su ganado contraiga la enfermedad. d) como usted evitara un posible contagio de ntrax. 5. Indique 3 pruebas para diferenciar Bacillus anthracis de otros Bacillus. 6. Realice un esquema para el diagnostico de Bacillus. 7. Indique el fundamento de la prueba de licuefaccin de la gelatina. 8. Como determinara la presencia de los genes que codifican para la sntesis de la toxina del ntrax. 9. Indique cual es el comportamiento de de las diferentes especies de Bacillus con respecto a la susceptibilidad a antibiticos. 10. Indique como procede en el laboratorio para evidenciar la presencias de capsula en el Bacillus anthracis.
6.
BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed.
Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
DIAGNOSTICO DE Clostridium spp

1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Clostridium a partir de muestras de origen biolgico. 2. MARCO TERICO: Caractersticas principales Los clostridios son bacilos grandes mviles, Gram positivos y anaerobios estrictos, son formadores de esporas que deforman su morfologa, muchos descomponen protenas, forman toxinas o ambas cosas (Figura 1).
Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Clostridium.
Son bacterias anaerobias estrictas ya que no producen catalasa y SOD, sin embargo algunos son aerotolerantes logrando soportar bajas concentraciones de oxigeno (microaerofilia), convirtindose este un elemento toxico para estos microorganismos (Figura 2).
Figura 2. Efecto del oxigeno en bacterias aerobias y anaerobias.
Pueden ser patgenas por Produccin de toxinas (C. tetanii, C. botulinum) Destruccin de tejidos (C. perfringens) Son los agentes causantes de la putrefaccin de la carne (descomposicin anaerobia de las protenas).
Rutas fermentativas de las bacterias del gnero Clostridium. Presentan una gran variedad de rutas de fermentacin: Fermentacin de azcares polimerizados Fermentacin del butanol Fermentacin acoplada de aminocidos (disimilacin anaerobia de aminocidos). Fermentacin no acoplada de aminocidos (produccin de piruvato) Fermentacin de compuestos cclicos que tienen N2 (por ejemplo: bases nitrogenadas). Fermentacin de productos del metabolismo secundario.
Morfologa e identificacin. Las bacterias del genero Clostridium se caracterizan por producir esporas que en algunos casos (C. tetani) tienen un dimetro mayor al de los bastoncillos deformando su morfologa. Casi todos los clostridios son mviles y poseen flagelos pertricos. Cultivo. Crecen solamente en condiciones de anaerobiosis, mediante el mtodo de Gaspack System (BBL) que genera un ambiente de anaerobiosis o en medios lquidos en tubos de ensayo con tejidos de animales que proporcionan protenas para el desarrollo (carne cocida), o con agentes reductores que generan un potencial redox negativo (Caldo tioglicolato). Se emplean diferentes metodologas para la identificacin de las especies de Clostridium que pueden encontrarse causando una enfermedad (Figura 3).
Figura 3. Marcha de procesamiento para bacterias del genero Clostridium.
10
Caractersticas del crecimiento. Algunos microorganismos producen colonias grandes, elevadas, con bordes enteros, otros producen colonias ms pequeas, cuyos bordes se extienden en forma de red de finos filamentos. Muchos clostridios producen una zona de hemlisis en agar de sangre. Los bacilos anaerobios son incapaces de utilizar el oxgeno como aceptor final de hidrgeno; carecen de de citocromo oxidasa y son incapaces de destruir el perxido de hidrgeno porque carecen de catalasa y peroxidasa. Pueden fermentar una variedad de azcares; muchos digieren protenas.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Latas de acero Velas, Alka seltzer, virutilla. Medios de cultivo y pruebas Caldo Carne cocida Caldo tioglicolato Placas de Agar Sangre Agar yema de huevo Caldo Leche tornasol Material biolgico Heces de burro
4.
PROCEDIMIENTO
5.
CUESTIONARIO 1. Cual es el significado relativo de potencial de oxido reduccin versus oxigeno atmosfrico en relacin con la supervivencia y el crecimiento de las bacterias anaerobias.
11
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
Indique cuales son los 5 gneros propuesto por Collins y colaboradores para el gnero Clostridium esto debido a su gran heterogeneidad. Indique como se realiza la tcnica de cultivo mediante el sistema GasPack y como es que las bacterias anaerobias logran desarrollar. Si Usted no cuenta con el sistema GasPack como lograra cultivar las bacterias anaerobias en el laboratorio. Indique 2 especies de Clostridium que pueden ser aerotolerantes y crecer en un medio de Agar sangre en un ambiente de 5 10 %de CO2. Cual es el significado metablico bioqumico de la aero-tolerancia. Indique cuales son las 3 pruebas claves para el diagnstico de C. perfringens. Explique porqu se observa hemolisis doble en el desarrollo de C. perfringens en placas de agar sangre. Indique que mtodo puede emplear para la determinacin de enterotoxina de C. perfringens. Qu tcnica empleara para determinar la produccin de la toxina alfa, beta, delta, psilon del C. perfringens. Como determina si la gangrena gaseosa es producida por especies de Clostridium diferentes a C. perfringens. Indique mediante que pruebas se realiza el diagnstico de colitis pseudomembranosa. Como se procede para el diagnstico de botulismo del lactante. Indique cuatro caractersticas utilizadas para diferenciar un posible aislamiento de C. tetani de una muestra de herida de otros clostridios. Cual es el fundamento de las pruebas lecitinasa y lipasa Que prueba utilizara para demostrar la presencia de toxina botulnica en una muestra de sangre de una paciente con botulismo, indique la tcnica a detalle. Indique por que no se puede realizar el Mtodo de Kirby-Baer a los anaerobios, y cmo se hacen las pruebas de susceptibilidad para estos. Se puede realizar la prueba de E-test para anaerobios?, justifique su respuesta. Como se realiza la identificacin de Clostridium por el mtodo de cromatografa gas-liquido, y presentar un resultado de cromatografa de una especie de Clostridium indicando como se tipifica dicha especie.
6.
BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
12
DIAGNOSTICO DE Staphylococcus spp

1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Staphylococcus a partir de muestras biolgicas. 2. MARCO TERICO:
Caractersticas El gnero Staphylococcus est compuesto por cocos Gram positivos dispuestas en grupos debido a que la divisin celular, que se realiza en planos perpendiculares entre s, y no se logra la separacin completa de las clulas hijas, quedando adheridas unas a otras formando racimos (Figura 1).
Figura 1. Divisin de los microorganismos del genero Staphylococcus.
Estos microorganismos son anaerobios facultativos, inmviles y no esporulados. Producen la enzima catalasa, pueden desarrollar en medios simples y toleran altas concentraciones de sal. El gnero est compuesto por 32 especies, pero en clnica humana slo 3 son de importancia: S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. Patogenia de S. aureus El principal mecanismo de transmisin de esta bacteria es a travs de manos contaminadas. Por esta razn, la medida de prevencin ms importante para evitar infecciones por este agente es el lavado de manos prolijo y frecuente. S. aureus posee una amplia gama de factores de virulencia que se pueden dividir en estructurales y no estructurales. Los primeros incluyen aquellos que forman parte de la estructura bacteriana y consisten en: 1. 2. 3. 4. Pptidoglicano: Posee importantes actividades biolgicas tales como induccin de IL1, atraccin de PMN, activacin del complemento e induccin de anticuerpos opsnicos entre otras. Acido teicoico: Participara en la capacidad de adherencia del microorganismo. Protena A: Est incorporada a la porcin externa de la capa de pptidoglicano y es capaz de unir la fraccin Fc de las IgG, evitando la fagocitosis. Cpsula: Su formacin es variable. Algunas cepas la poseen y otras no. Tendra un rol antifagocitario.
En cuanto a los factores de virulencia no estructurales, stos se refieren a las enzimas y toxinas producidas por la bacteria.
SARM: S. aureus era originalmente sensible a penicilina. Sin embargo se reportaron posteriormente casos de resistencia a penicilina debido a la produccin de una beta lactamasa; introducindose la meticilina (pariente de la cloxacilina) como antibitico resistente a esta penicilinasa (generalmente codificada en plasmidios).
13
Sin embargo, en 1961 se identific S. aureus meticilino resistente (SAMR) en Inglaterra. En U.S.A. apareci espordicamente en 1965 hasta que en 1981 emergi en forma importante causando numerosos brotes. Actualmente, la mayora de los hospitales presentan una situacin de endemia en relacin a este microorganismo. La meticilino-resistencia es de origen cromosomal e involucra a todos los beta lactmicos incluyendo a las cefalosporinas. Se asocia a la aparicin de una protena fijadora de penicilina (PBP) alterada. Estas protenas son muy importantes en la sntesis de la pared celular y generalmente presentan alta afinidad con los antibiticos beta lactmicos. Sin embargo, en las cepas meticilino resistentes, aparece una PBP llamada PBP2a asociada a la presencia del gen mecA. Si bien todos los SAMR tienen la habilidad gentica de 4 8 expresar resistencia frente a los antibiticos beta lactmicos, frecuentemente slo 1 clula en 10 -10 la manifiesta. Este fenmeno, llamado hetero-resistencia, constituye un problema en el laboratorio, pues si no se considera podra informarse una cepa resistente como sensible. Para reducir este riesgo el mximo posible, se estimula la expresin del gen de resistencia in vitro, incubando el antibiograma por 24 horas y a temperaturas menores (30-35 C), entre otras tcnicas.
Tabla 1. Clasificacin de S. aureus. Tipo de S. aureus. Meticilina MSSA. susceptible Genes Resistencia mecA (-). de Producto del gen Protena de unin a penicilina (PBP) normal -lactamasa Mecanismo de resistencia Afinidad por el antibitico. Hidrlisis enzimtico del ncleo -lactmico Baja afinidad al antibitico. Sntesis de un dipptido que reduce la afinidad de la vancomicina. Comentario Susceptible a penicilinas, cefalosporinas y otros lactmicos. Hiperproduccin de -lactamasa (MICs 1 a 2 g/ml) Meticilina resistente y a los lactmicos resistentes a lactamasa (MIC > 16 g/ml). Vancomicina MIC 8 a 16 g/ml (La mayora es MIC < 2 g/ml).
Bordeline resistente BRSA o BORSA Meticilina Resistente SARM o ORSA Vancomicina intermedio resistente VISA o Glicopeptido intermedio GISA
blaZ, mecA (-).
mecA.
PBP2a
van
Peptidoglicano alterado D-Ala-D-Lac
Staphylococcus epidermidis Es parte de la flora microbiana normal de piel y mucosas, que no tiene la capacidad de producir la enzima coagulasa, razn por la que se encuentra incluido en el grupo de estafilococos coagulasa-negativos. Sin embargo tiene la capacidad de adherirse a superficies extraas (como catteres y sondas) debido a que produce una capa de polisacrido extracelular (Limo) la cual se une a los catteres y las derivaciones, al tiempo que protege al microrganismo de la accin de antibiticos y las clulas inflamatorias. Una proporcin mayor al 50% de las infecciones por catteres se encuentran asociadas a los estafilococos coagulasanegativos, convirtindose en un problema medico de gran importancia, ya que el uso de catteres de larga duracin son empleados generalmente el pacientes graves.
Figura 2. Morfologa de Staphylococcus epidermidis.
14
Staphylococcus saprophyticus Es agente de infeccin del tracto urinario en mujeres en edad frtil (principalmente adolescentes) y en pacientes hombres con catter urinario. Tambin es un Staphylococcus coagulasa negativo.
Identificacin en Laboratorio. El diagnstico microbiolgico de especies de estafilococos, al igual que el de la mayora de las bacterias, incluye las siguientes etapas: 1. Tincin Gram de la muestra: Se observan cocos Gram positivos agrupadas en racimo y tambin aislados. Siembra y cultivo: Son bacterias poco exigentes nutricinalmente, que crecen en la mayora de los medios de cultivo. Generalmente se siembra en agar sangre donde las colonias se ven grandes (2-3 mm de dimetro), de color dorado (S. aureus) debido a la presencia de carotenos y usualmente rodeadas de un halo de alfa hemlisis y sin pigmebtacis o grisceas para los coagulasa negativos. o Se incuba a 35-37 C en atmsfera ambiental por 18 a 24 horas. Identificacin: Se basa en las caractersticas macroscpicas del cultivo, la tincin de Gram de las colonias (suele verse mejor la agrupacin en racimo cuando la tincin se realiza a partir de un cultivo en medio slido) y pruebas bioqumicas como la catalasa (es positiva) y la coagulasa (es positiva).
2.
3.
4.
Antibiograma: Presentan sensibilidad antibitica variable ya que poseen diversos mecanismos de resistencia antimicrobiana. De todas ellas la ms importante por su implicancia en el tratamiento es la resistencia a la meticilina, por esta razn se debe hacer el tamizaje a la oxacilina.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Solucin fisiolgica Azul Tripan 0,4% PBS pH 7.4 Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Agar Manitol Salado Caldo BHI Agua Oxigenada Agar Mller-Hinton Discos de Novobiocina Caldo BHI-Sac (Anexo 1) Caldo TSB-Glu (Anexo 1) Placa de Rojo Congo Agar CRA (Anexo 1) Material biolgico Cepa de S. aureus Cepa de S. epidermidis Cepa de S. saprophyticus Plasma Sanguneo
15
4.
PROCEDIMIENTO
Prueba de desarrollo de Biofilms por Staphylococcus epidermidis Mtodo de Christensen et al. 1982 prueba en tubo
16
Mtodo de Freeman et al. 1989 prueba en placa
5.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Qu es correcto decir Staphylococcus aureus o Staphylococcus aureus subesp aureus y porqu? Cite cinco enfermedades asociadas a estafilococos coagulasa negativos. Explique brevemente como se produce la infeccin por Staphylococcus epidermidis. Indique que pruebas realizara para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus. Indique como se realiza la prueba de la catalasa. Fundamento de esta. Y finalidad del test. Cmo se realiza la prueba de la coagulasa: a) Ligada y b) Libre. Cual es el principio de la prueba de la coagulasa. Indicando las diferencias de accin de la coagulasa ligada y coagulasa libre. Indique dos mtodos alternativos para determinar la produccin de coagulasa por Staphylococcus aureus. Cmo diagnostica Staphylococcus saprophyticus. Fundamento de la prueba. Indique como se debe realizar el antibiograma para los estafilococos. Si usted determina que un estafilococo es presumiblemente SARM como procede para hacer su tamizaje. Indique para que se emplea la prueba del manitol salado en el diagnostico de estafilococos. Indique que es el medio Baird Parker. Para que se utiliza y como se debe interpretar el desarrollo bacteriano en este medio. En el laboratorio que desventaja muestra el hecho de emplear plasma humano para realizar el test de la coagulasa, y que desventaja se tendra si se tratase de plasma proveniente de un paciente con dao heptico. Realice un flujograma de identificacin der los estafilococos coagulasa negativos. Como determina si un estafilococo coagulasa negativo es meticilino resistente, fundamente su respuesta. Indique como se determina si fenotpicamente la presencia del gen mecA en estafilococos coagulasa negativos, y cual su importancia clnica. En un periodo de tres semanas, un total de 5 recin nacidos en el cunero del Hospital de la Mujer, tuvieron infecciones por S. aureus con bacteriemia por el mismo; los aislados presentaron una misma morfologa de colonia, propiedades hemolticas, y patrones de susceptibilidad antimicrobiana los que sugiere que se trata de la misma cepa. a) Como determina por mtodos moleculares, si las cepas de Staphylococcus son la misma (Explique la tcnica). b) Que se debe hacer para el control de este brote.
15. 16. 17. 18.
6.
BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II.
17
Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM, Beachey EH. (1985) Adherence of coagulasenegative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol Vol 22. Pag: 996 1006. Christensen GD, Simpson WA, Anglen JO, Gainor BJ. (2000) Methods for evaluating attached bacteria and biolms. In: An YH and Friedmann RJ, editors. Handbook of Bacterial Adhesion. Principles, Methods, and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT (1989). New method for detecting slime production by coagulase-negative staphylococci. J Clin Pathol Vol. 42. Pag: 872 874. Gamazo C, Lopez-Goi I y Diaz R. (2005) Manual Prctico de Microbiologa. Masson. 3 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriologa en infecciones Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Per. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
18
DIAGNOSTICO DE Streptococcus y Enterococcus spp

1.
OBJETIVO:
El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al gnero Streptococcus y Enterococcus a partir de muestras clnicas.
2.
MARCO TERICO:
Caractersticas de los Streptococcus Los gneros Streptococcus y Enterococcus estn formados por bacterias esfricas u ovoides (Figura 1.) que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayora son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporas, catalasa negativa, inmvil y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales.
Figura 1. Divisin de las bacterias de genero Streptoccocus y Staphylococcus.
La infeccin estreptoccica es una de las ms frecuentes, siendo algunos de los cuadros ms importantes relacionados con el gnero: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumona, meningitis, infeccin del tracto urinario, abdominal o cutneo. Las infecciones ms frecuentemente asociadas con el gnero Enterococcus son endocarditis, las infecciones urinarias y la colonizacin/sobre infeccin de enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente cefalosporinas. La clasificacin de especies dentro de este gnero es complicada, debido a esta situacin se emplean tres esquemas que son los siguientes (Tabla 1): Propiedades serolgicas: Grupos de Lancefield. Patrones hemolticos en placas de agar Sangre. Pruebas bioqumicas.
19
Tabla 1. Clasificacin de las especies de Streptoccocus. Grupo Hemlisis Bacitracina SXT CAMP PYR Lancefield en PAS Grupo A S R + Grupo B Grupo C, F yG Enterococos Grupo D no Enterococos Viridans Neumococo o o o R V R R V V R S R S S S + + + V -
Bilis Esculina + + v -
Caldo 6,5 NaCl V + -
Hidrlisis Hipurato + V V -
Optoquina R R R R R R S
S= Sencible, v= variable, R= Resistente
PARTE 1 DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLITICOS Streptococcus pyogenes (Grupo A) La infeccin respiratoria ms frecuente producida por este agente es la faringoamigdalitis aguda y en algunos casos se puede identificar en cuadros de otitis media y sinusitis. A diferencia de otros microorganismos asociados a infecciones respiratorias, posee la capacidad de provocar una enfermedad aguda y secuelas no supurativas tipo enfermedad reumtica y glomerulonefritis, factores importantes a considerar en la erradicacin del germen de la faringe.
Figura 2. Morfologa de los Streptoccocus Grupo A.
Caracteristicas del Streptococcus pyogenes: Son cocos Gram positivos de 0,5 - 2 um de dimetro, anaerobios facultativos, crecen en pares o en cadenas en medio lquido (Figura 2), son inmviles, no formadores de esporas, capsulados, requieren medio nutricionalmente rico y una baja tensin de oxigeno para su desarrollo. Su energa la obtienen a travs de un metabolismo de tipo fermentativo, produciendo principalmente lactato, pero no de gas. Son catalasa (-). Generalmente atacan glbulos rojos provocando lisis total (beta hemlisis). El rango de la temperatura de crecimiento vara entre 25 45C (ptima: 37C). En la tincin directa de muestras clnicas se observan cadenas cortas, en cambio en los medios de cultivo lquidos se forman cadenas mas largas. El crecimiento ptimo es en agar sangre, pero se inhibe cuando el medio contiene una alta concentracin de glucosa. A las 24 horas de incubacin a 37C se formar colonias blancas de 1 - 2 mm. con una marcada zona de beta hemlisis.
20
Este patogeno posee un gran arsenal de factores de virulencia que favorecen la infeccin al huesped, entre los cuales podemos encontrar proteinas de unin (Proteina M, Proteina tipo M y Proteina F), pero tambien tiene la capacidad de producir una amplia variedad de toxinas (Exotoxinas pirgenas, Estreptolisina S, Estreptolisina O, Estreptocinasa, DNasa y C5a peptidasa). Todo este conjusto de factores de virulencia hacen de este patgeno unos de los mas peligrosos. Diagnostico de Laboratorio para Streptococcus del grupo A Muestras clnicas: Exudado farngeo, secrecin de lesiones cutneas, tejidos y lquidos estriles. Cultivo: Las muestras se siembran en agar sangre, se incuban 18 a 24 horas. Las colonias son puntiformes beta hemolticas, catalasa negativa y su diagnstico presuntivo se realiza mediante la prueba de susceptibilidad a la bacitracina y PYR, y su confimacin mediante serologa con anticuerpos especficos. Deteccin de anticuerpos: Estas pruebas se utilizan en el estudio de secuelas post-estreptoccicas y consisten en detectar la presencia de antiestreptolisina O y antiDNAsa b en suero.
Streptococcus agalactiae (Grupo B) Streptococcus agalactiae o estreptococo beta hemoltico del grupo B (SGB) fue reportado como patgeno humano por primera vez en 1935 por Fry, quien describi tres casos de sepsis puerperal. Sin embargo, no fue hasta 1960 que varios autores sealaron la existencia de patologa asociada a este microorganismo, indicando que sta era ms frecuente de lo considerado hasta esa fecha. Caracteristicas del Streptococcus agalactiae: Es un coco Gram positivo, catalasa y oxidasa negativa, anaerobia facultativa, inmvil y no esporulada, que se presenta formando cadenas de longitud variable. Este microorganismo puede desarrollar en medios simples, aunque los medios enriquecidos favorecen su desarrollo. Tras 18-24 horas de incubacin en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de dimetro, blanco grisceas y presentan un pequeo halo de beta hemlisis a su alrededor. Para facilitar la recuperacin de este agente de muestras polimicrobianas como las genitales, gastrointestinales o en mujeres embarazadas, se utilizan medios selectivos suplementados con antibiticos. Una de las caractersticas mas importantes de este microorganismo es la capacidad de producir el factor CAMP, que se emplea para su diferenciacin frente a Streptococcus pyogenes (Figura 3).
Figura 3. Resultados de Test CAMP. (A: positiva Streptococcus agalactiae y B: negativo Streptococcus pyogenes)
21
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Discos de Bacitracina Discos de SXT Material biolgico Cepa de S. aureus Cepa de S. pyogenes Cepa de S. agalactiae.
4.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Streptococcus Hemoliticos (Grupo A y B)
22
PARTE 2 DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS ALFA-HEMOLITICOS
Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae es un diplococo Gram positivo, capsulado, es un patgeno extracelular y su virulencia est asociada fundamentalmente a la produccin de cpsula (Figura 4). Pese a que su descubrimiento fue hace ms de 100 aos, este agente contina siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Griffith en la dcada de 1920, demostr la capacidad de transformacin de esta bacteria, al observar que neumococos vivos no capsulados inyectados en el peritoneo de ratn, junto a neumococos capsulados destruidos por el calor, determinaban la aparicin de bacterias capsuladas viables. Caracteristicas del Streptococcus pneumoniae: El neumococo es un coco Gram positivo encapsulado (Figura 4). Las clulas miden 0,5 a 1,2 m, tienen forma oval o lanceolada y adoptan una agrupacin en pares o en cadenas cortas. Son anaerobios facultativos, catalasa negativos. Son solubles en sales biliares y producen una hemlisis en agar sangre. Son susceptibles a optoquina. Requieren medios enriquecidos para desarrollarse.
Figura 4. Streptococcus pneumoniae. (Izq: La capsula confiere proteccin frente a la fagocitosis y Der: Streptococcus pneumoniae en tincin donde se visualiza la capsula)
La cpsula permite su clasificacin en alrededor de 90 serotipos distintos, lo que se realiza mediante la reaccin de Quellung. Para esta prueba los anticuerpos anticapsulares se mezclan con la bacteria y la reaccin es positiva cuando aparece aumento de la refraccin alrededor de Streptococccus pneumoniae, lo que se visualiza a microscopa. Diagnostico de Laboratorio para Streptococcus del grupo A Muestras clnicas: LCR., sangre, lquido articular, peritoneal o de otros sitios estriles. Secreciones provenientes del tracto respiratorio. Tincin de Gram: Se observan diplococos Gram positivos, lo que permite hacer un diagnstico presuntivo. Cultivo: En agar sangre, requiere incubacin en atmsferas con 5% de CO2. En este medio se visualiza la hemlisis y la aplicacin de pruebas bioqumicas tales como disco de optoquina y solubilidad en bilis permiten diferenciarlo de otros Streptococcus hemolticos. El diagnstico definitivo se realiza aplicando la reaccin de Quellung. Deteccin de antgenos: El polisacrido capsular soluble se puede detectar con rapidez en lquidos estriles Ej.: En el LCR se puede detectar con tcnicas de aglutinacin del ltex o de contra inmunoelectroforesis.
23
Susceptibilidad antimicrobiana: Se realiza con diferentes tcnicas. Tcnica de difusin en disco. Para evaluar la susceptibilidad a penicilina se utiliza un disco de oxacilina de 1ugr. Se considera resistente, cuando el halo de inhibicin es menor o igual a 20 mm. Es una tcnica cualitativa sensible y especfica. E-TEST: Es una tcnica cuantitativa que permite medir Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM). Tiene buena correlacin con los mtodos gold standard para evaluar susceptibilidad del S. pneumoniae, que son los de dilucin en agar y macrodilucin en caldo.
El comit internacional de estandarizacin de procedimientos de laboratorio clnico (National Committee for Control of Laboratory Standards, NCCLS), ha establecido los siguientes niveles de CIM para el diagnstico de cepas de S. pneumoniae sensibles o resistentes a Penicilina y Cefotaxima (Tabla 2).
Tabla 2: Niveles de resistencia de Streptococcus pneumoniae a Penicilina y Cefotaxima segn CIM.
El mecanismo de resistencia de Streptococcus pneumoniae a Penicilina se debe a la alteracin de las protenas fijadoras de penicilina (PBP), fenmeno debido a la recombinacin gentica de ADN entre diferentes especies.
Streptococcus viridans El grupo de los estreptococos viridans es un grupo heterogneo de estreptococos hemolticos y no hemolticos, cuyo nombre de grupo deriva de viridis (del latn verde), un reflejo del hecho de que estas producen un pigmento verde en placas de agar sangre. Actualmente se han registrado 6 grupos que se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Clasificacin de Streptococcus del grupo viridans.
Grupo
S. anginosus S. bovis S. mitis S. mutans S. salivarius Sin agrupar
Especies
S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius S. bovis, S. alactolyticus, S. equinus S. mitis, S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii, S. crista, S. oralis S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus, S. downei, S. macacae S. salivarius, S. vestibularis, S. thermophilus S. acidominimus, S. suis
Esta clasificacin esta basada en metodos tradicionales, con reacciones de idetificacin similares a el neumococo, pero tambien se toma en cuenta algunas caracterisitcas metabolicas y el uso de herramientas moleculares (16S rRNA). Caracteristicas del Streptococcus viridans: Como la mayora de los estreptococos, las especies del grupo viridans son nutricionalmente exigentes, requiriendo medios suplementados con sangre y vitamina B 6, as como un ambiente con 5-10% de CO2. Inicialmente estos microorganismos pueden crecer en medios suplementados con sangre, pero al ser subcultivados no desarrollan en medios que carezcan de piridoxal.
24
Estos estreptococos colonizan la orofaringe, el tracto gastrointestinal y el tracto genitourinario, colonizando rara vez la piel a causa de que los cidos grasos de dicha superficie son txicos para ellos. Es por esta razn que se encuentran asociados a infecciones en la placa dental, endocarditis aguda e infecciones supurativas intraabdominales.
5.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Tinta China Solucin Sulfato de cobre a 20% Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Discos de Optoquina Caldo con sales biliares Solucin fisiolgica Material biolgico Cepa de S. viridans Cepa de S. pneumoniae
6.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Streptococcus Hemoliticos (Grupo S. pneumoniae y S. viridans)
Para la visualizacin de la capsula producida por neumococo se pueden realizar dos tipos de tinciones:
25
Mtodo de Burri o tincin negativa
Mtodo de Antony
26
PARTE 3 DIAGNOSTICO DE ENTEROCOCOS Enterococcus Desde el establecimiento del gnero Enterococcus con los estudios quimiotaxonmicos y filogenticos realizados, se han transferido y descrito nuevas especies en este gnero por lo que su complejidad aumenta y la diferenciacin de algunas de estas especies resulta problemtica debido a la coincidencia de caractersticas fenotpicas. Los enterococos son cocos grampositivos, catalasa negativa, inmviles, anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cpsulas (Figura 5). Entre las caractersticas fisiolgicas que distinguen al gnero Enterococcus se encuentra la habilidad para crecer en presencia de 6,5 % de ClNa y pH 9,6.
Figura 5. Infeccin por Enterococcus
Desafortunadamente, no existe una caracterstica de las mencionadas que sea nica para este gnero; las cepas de bacterias en forma de cocos, Gram positivos y catalasa negativa de los gneros Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc y Lactobacillus pueden mostrar una o ms de las caractersticas tpicas del Enterococcus. El gnero Enterococcus se ha revelado como causa de infecciones nosocomiales y de una variedad de infecciones adquiridas en la comunidad, adems de ser intrnsicamente resistentes a un nmero de agentes antimicrobianos, es por esta razn que para su tratamiento se emplea combinaciones de un aminoglucosido con un antibitico que inhiba la sistesis de la pared celular. Entre las especies de mayor importancia clnica se destacan, Enterococcus faecalis que constituye el 85-90 % de los aislamientos en la mayora de los laboratorios y Enterococcus faecium del 5-10 % de las cepas detectadas clnicamente. Crecen fcilmente en medios comunes no selectivos, pese a poseer caractersticas similares a los Streptococcus, estos son fcilmente diferenciables por pruebas bioqumicas: Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis y poseen la enzima pyrrolidonyl arylamidasa (PYR positivo).
7.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Agua Oxigenada Agar Bilis Esculina Caldo 6,5 de NaCl Discos de Optoquina Solucin fisiolgica Material biolgico Cepa de E. faecium Cepa de E. fecalis
27
8.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Enterococcus
9.
CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4.
Explique brevemente que es el factor de opacidad de los estreptococos del grupo A. Que es la PspA del Neumococo y cual es su funcin en la patogenia. Indique la diferencia entre enfermedad de comienzo precoz y la enfermedad de comienzo tardo en la infeccin producida por S. agalactiae. Defina: a) hemlisis b) hemlisis c) hemlisis d) prima hemlisis
5.
Indique porque para el diagnostico de los estreptococos no se usan medios de cultivo que contengan carbohidratos. 6. Indique porque la concentracin de sangre en el medio de cultivo es muy importante. 7. De ejemplo de dos tcnicas directas de deteccin de S. pyogenes. Indique cual es la ventaja y desventaja de cada una de esas tcnicas. 8. Indique cual es la utilidad de la utilizacin de Sulfametoxazol/Trimetoprim para el aislamiento de S. pyogenes. 9. Dentro de las bacterias que pueden producir infeccin en el ser humano se encuentran bacterias que se parecen mucho a los estreptococos, antes la observacin de la hemlisis y la prueba de la catalasa eran pruebas presuntivas de diagnostico previo de estreptococos pero estas bacterias son hemolticas y tambin catalasa negativas. Indique que pruebas adicionales se pueden realizar para diferenciar a los estreptococos de estas bacterias. 10. Indique como se realiza la prueba de susceptibilidad a la Bacitracina y como se garantiza que esta se est realizando solo para el diagnostico del S. pyogenes.
28
11. Indique cual es la morfologa de una colonia de S. pneumoniae y que influye en la presentacin y tamao de esta. 12. Indique como se realiza la prueba de CAMP y cual es su fundamento. 13. La prueba de CAMP en la actualidad no es la nica prueba utilizada para la identificacin del S. agalactiae sino que existen dos pruebas adicionales. Indique cuales son estas y como se realizan. 14. Durante la prctica de identificacin de estreptococos para la identificacin de S. agalactiae se realizo la prueba de CAMP, la cual no dio como positiva siendo que la cepa empleada era un S. agalactiae. Fundamente porque esta prueba no dio positivo. 15. Porque las bacterias Gram positivas causan enfermedades respiratorias con ms frecuencia que las Gram negativas. 16. Cuales son los sntomas tpicos de una infeccin respiratoria estreptoccica. Porque las enfermedades respiratorias deben tratarse con prontitud. 17. Indique que es la prueba de la Bilis Esculina, como se realiza y cual es su fundamento. 18. Indique cual es el fundamento y como se realiza la prueba de tolerancia al NaCl al 6,5%. 19. Indique como se realiza y cual es el fundamento de la prueba de la Optoquina y Solubilidad en Bilis para la identificacin de neumococos. Y como se realizan estas pruebas.
10. BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriologa en infecciones Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Per. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
29
DIAGNOSTICO DE Enterobacteriaceae
1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes a la Familia Enterobacteriacea, a partir de muestras biolgicas. 2. MARCO TERICO:
Caractersticas de las enterobacterias El grupo de las Enterobacterias, nombre utilizado para referirse a la Familia Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayora de ellos mviles mediante flagelos pertricos. Como caracterstica comn tienen la capacidad de fermentar la glucosa; son oxidasa negativos y reducen los nitratos a nitritos, con algunas excepciones (Tabla 1).
Tabla 1. Rasgos fenotpicos de la familia Enterobacteriaceae Carcter Marcador de Familia Formacin de espora (-) Oxidasa Catalasa Nitrato reductasa (-) (+) (+) Excepcin Serratia marcescens (algunos) Plesiomonas Shigella dysenteriae 1, Xenorhabdus Erwinia and Yersinia (algunos)
Tienen como hbitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Presentan una amplia distribucin en el ambiente, encontrndose en suelo, agua y plantas, como Proteus que cumple una funcin ecolgica importante ya que inicia en el ambiente la degradacin de la materia orgnica. Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en su relacin con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli un constituyente importante de la flora microbiana intestinal normal, resultando ser beneficioso para el hospedero, ya que como parte de su metabolismo sintetiza vitaminas, participa en la degradacin de cidos y sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, la deteccin de E. coli se utiliza como marcador de contaminacin fecal y para evaluar la calidad microbiolgica del agua potable o de alimentos. Otros integrantes de este grupo en cambio son patgenos intestinales como el gnero Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia especficos que afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreognicos. Estos grupos o Gneros bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clnicamente como diarrea acuosa, diarrea con sangre (tambin denominada diarrea enteroclica o sndrome disentrico) y en algunos casos a partir de la infeccin intestinal estas bacterias pasan al torrente sanguneo y se puede producir una infeccin sistmica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre tifoidea (Figura 1). En algunas situaciones una persona puede infectarse con alguna de estas bacterias enteropatgenas y no sufrir ninguna enfermedad, es decir tener una infeccin asintomtica, en la cual el patgeno se multiplica a nivel intestinal y es excretado junto con las deposiciones. Este fenmeno es importante desde el punto de vista epidemiolgico porque la excrecin asintomtica pasa inadvertida y este sujeto disemina el patgeno al ambiente y eventualmente lo puede transmitir, ya sea a travs de manos contaminadas o contaminacin de alimentos, a otros sujetos susceptibles en quienes si se manifiesta la enfermedad. Otra condicin biolgica interesante de sealar es la portacin por periodos ms o menos largos de un patgeno bacteriano entrico. En este caso, despus de una infeccin intestinal generalmente sintomtica, no se logra la erradicacin del patgeno a nivel intestinal y aunque se superan los sntomas, continua la excrecin por periodos que pueden durar semanas, meses o aos. Los portadores junto con los pacientes asintomticos explican la mantencin de estos patgenos dentro de una comunidad.
30
Un concepto importante de subrayar es que fuera del tracto gastrointestinal, enterobacterias comensales del intestino pueden producir infecciones. Un buen ejemplo de ello es la participacin de E. coli como principal causante de Infeccin Urinaria, una patologa infecciosa muy frecuente principalmente en mujeres en la etapa activa de la vida. En este caso cepas de E. coli del intestino, colonizan la uretra y son capaces a ascender hasta la vejiga donde se multiplican activamente y provocan una respuesta inflamatoria. En otro tipo de pacientes como son los nios recin nacidos y los ancianos, quienes no tienen sus mecanismos de defensa muy eficientes, E. coli y otras enterobacterias comensales del intestino como Klebsiella, pueden pasar a la sangre y provocar focos de infeccin a distancia como meningitis.
Figura 1. Infecciones ocasionadas por enterobacterias.
31
Por ltimo, un concepto tambin importante de enfatizar es el hecho que algunas especies dentro de esta Familia tienen como hospedero exclusivo al hombre, como es el caso de Salmonella typhi y Shigella. En cambio otras presentan un amplio reservorio animal y se transmiten en forma natural de los animales al hombre, es decir son zoonticas, entre ellas tenemos varios tipos de Salmonella, E. coli enterohemorrgico y Yersinia enterocoltica. Las pruebas o ensayos bioqumicos (Anexo II), son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar de forma clara una determinada caracterstica bioqumica como: presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador) cuyo resultado puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos.
PARTE 1 DIAGNOSTICO DE ENTEROBACTERIAS FERMENTADORAS DE LACTOSA El grupo de enterobacterias que tiene la capacidad de fermentar la lactosa esta constituido por los gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Escherichia coli. Este genero esta constituido importancia desde el punto de vista subdividen el 6 grupos, los cuales anteriormente tambin cepas que no Infecciones de tracto urinario. por 5 especies, de las cuales E. coli es la ms frecuente, y de mayor clnico, las cepas de E. coli capaces de producir gastroenteritis se se muestran en la Tabla 2. Sin embargo como ya se mencion son diarreogenicas pueden ocasionar patologas como: Septicemia e
Tabla 2. Variedades de E. coli que causan enfermedades en el hombre Microorganismo E. coli enterotoxignica (ETEC) E. coli O169:H41 Lugar de accin Intestino delgado Enfermedad Diarrea del viajero, diarrea infantil en pases subdesarrollados Diarrea del destete, vmitos, espasmos abdominales, nauseas. Diarrea infantil en pases subdesarrollados o en lactantes, vmitos, fiebre, nauseas, heces no sanguinolentas. Enfermedad en pases subdesarrollados, fiebre, espasmos, diarrea acuosa indistinguible de la ETEC, pudiendo progresar a disentera. Colitis hemorrgica (CH) con fuertes espasmos abdominales, inicialmente diarrea acuosa, seguida de diarrea sanguinolenta sin leucocitos sin fiebre a menudo, puede progresar a Sndrome Urmico Hemoltico. Diarrea acuosa persistente, poco o ningn vmito, fiebre leve, heces no sanguinolentas Diarrea acuosa sin sangre y sin leucocitos.
E. coli enteropatognica (EPEC)
Intestino delgado
E. coli enteroinvasiva (EIEC)
Intestino grueso
E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli O157:H7
Intestino grueso
E. coli enteroagregativa (EAEC)
Intestino delgado
E. coli difusamente adherente (DAEC)
Intestino delgado
Adems de las variedades citadas en la anterior tabla hay que citar a la cepa asociada al brote de SUH en Alemania el ao 2011, siendo esta productora de toxina Shiga (STEC) y corresponde al serotipo O104:H4, toxina Shiga 2 (stx2)-positiva, intimina (eae)-negativa, enterohemolisina (ehxA)-negativa y que tambin presenta factores de virulencia compatibles con E coli enteroagregativa. Esta cepa ocasiono un fuerte impacto en los pases del norte, ya que se disemino rpidamente, ocasionando 3222 casos reportados,
32
incluyendo 39 fallecimientos, de los cuales 810 (25%) presentaron Sndrome Urmico Hemoltico (SHU) todo esto solo en Alemania. Klebsiella sp. Los miembros del gnero Klebsiella tienen la capacidad de producir capsula prominente que es responsable de la apariencia mucoide de las colonias. La especie que se asla con mayor frecuencia es K. pneumoniae agente causal de neumona lobular primaria, siendo los alcohlicos los que presentan mayor predisposicin a adquirir este patgeno.
Enterobacter sp. Los miembros del gnero Enterobacter son bacterias que tienen la capacidad de producir grandes cantidades de gas, razn por la cual anteriormente se los llamaba Aerobacter aerogenes. Enterobacter aerogenes y Enterobacter cloacae son las especies halladas con mayor frecuencia en muestras clnicas. Se distribuyen ampliamente en el agua, el suelo y las verduras; forman parte de la flora microbiana comensal y se cree que no causan diarreas, sin embargo Paton AW y Paton JC en 1996 aislaron una cepa de Enterobacter cloacae que produca una toxina similar a la de Shiga en las heces de un lactante con Sndrome Urmico Hemoltico. Citrobacter sp. Los miembros del gnero Citrobacter son bacterias que tienen la capacidad de fermentar lentamente la lactosa y es por esta razn que pueden llegar a tener el color caracterstico de colonias pasadas las 24 horas, son bacterias que se encuentran ms prximas a Salmonella teniendo la capacidad de producir H2S en medio SS y pruebas bioqumicas. Citrobacter freundii y Citrobacter koseri son las especies halladas con mayor frecuencia en muestras clnicas. 3. MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Asas. Mechero Bunsen. Estufa a 37C Gradillas Pinza Punta bacteriolgica Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Placas de Agar EMB Placas de Agar Mc Conkey Batera de pruebas Bioqumicas (TSI; LIA; SIM; Citrato y Urea) Rvo. De Kovacs. Discos de Oxidasa Material biolgico Cepa de Enterobacter Cepa de Escherichia Cepa de Klebsiella
4.
PROCEDIMIENTO
Diagnostico de Enterobacterias Lactosa positivas
33
34
PARTE 2 DIAGNOSTICO DE ENTEROBACTERIAS NO FERMENTADORAS DE LACTOSA El grupo de enterobacterias que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa y que poseen importancia clnica son: Salmonella, Shigella, Yersinia y Proteus. Salmonella spp. Con base en estudios genticos, existe una sola especie de Salmonella, (Salmonella enterica), pero empleando anticuerpos se han logrado diferenciar ms de 2400 serotipos O, sin embargo existen solo unos pocos tipos que comnmente estn asociados con las enfermedades humanas caractersticas (S. enteritidis, S. cholerae-suis y S. typhi). No pertenecientes al grupo de los coliformes, ya que no presentan la capacidad de fermentar la lactosa y tienen un carcter patgeno segn la especie. Son bacterias que en general provocan infecciones febriles de carcter entrico como son la fiebre tifoidea o paratifoidea (con deshidratacin severa y con escasas defecaciones) pasando a un estado de latencia en vescula biliar, o de tipo gastroenteritis (con diarrea severa sanguinolenta) llegando en algunos casos a producirse una bacteriemia (Figura 2).
Figura 2. Infecciones ocasionadas por Salmonella sp. Tomado de Manual CTO.
La infeccin comn por Salmonella es la Salmonelosis, est causada por una variedad de serotipos (ms comnmente por S. enteritidis) y se transmite por alimentos contaminados (tales como huevo y pollo) (Figura 2). No se conoce un reservorio humano y usualmente se presenta como gastroenteritis (nausea,
35
vmito y heces no sanguinolentas). La enfermedad es por lo comn, auto-limitante y normalmente cede al trmino de (2 - 5 das). Como Shigella, estos organismos invaden el epitelio y no producen infeccin sistmica. En los casos de salmonelosis sin complicaciones, mismos que son una vasta mayora, la terapia con antibiticos no es til. S. cholerae-suis (se ha visto menos frecuentemente) causa septicemia despus de la invasin. En este caso, la terapia con antibiticos s se requiere. La forma mas severa de las infecciones por salmonella, "tifoidea" (o fiebre entrica), es causadas por Salmonella typhi. Este microorganismo se transmite a partir de un reservorio humano o por medio de las reservas de agua (si las condiciones sanitarias son deficientes) o en alimentos contaminados (Figura 2). Inicialmente invade el epitelio intestinal y durante la fase aguda, se notan los sntomas gastrointestinales. Los microorganismos penetran (normalmente dentro de la primera semana) y pasan al torrente sanguneo donde se diseminan a travs de los macrfagos. Las caractersticas tpicas de una infeccin bacteriana sistmica son ya aparentes. La septicemia por lo general es temporal y el microorganismo finalmente se aloja en la vescula biliar, ocasionando cuadros espordicos.
Shigella sp. El gnero Shigella esta contituido de 4 especies; S. flexneri, S. boydii, S. sonnei, S. dysenteriae; siendo todas causantes de disentera bacilar o shigellosis, (heces sanguinolentas asociadas con dolor intestinal). El microorganismo inicialmente invade la capa epitelial de recubrimiento pero no lleva a cabo penetracin. Normalmente dentro de los 2-3 das, aparece disentera como resultado del dao a las capas epiteliales que recubren el intestino, con frecuencia con liberacin de mucosa y sangre (los cuales son detectados en las heces) con presencia de leucocitos (presentes en heces en forma de "pus"). Sin embargo la diarrea acuosa se observa frecuentemente, sin evidencia de disentera. Juega tambin un importante papel la toxina de Shiga (codificada en el cromosoma), que es neurotxica, enterotxica y citotxica. Su enterotoxicidad puede hacer que la enfermedad aparezca clnicamente como una diarrea. Esta toxina inhibe la sntesis de protenas, actuando sobre la subunidad ribosomal 70S y eliminando el rRNA 28S. Generalmente esta enfermedad la cursan nios pequeos, siendo el mecanismo de transmisin el contacto oral-fecal; pero tambin los adultos pueden adquirir de los nios esta enfermedad. 5. MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Asas. Mechero Bunsen. Estufa a 37C Gradillas Pinza Aguja bacteriolgica Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Sangre Placas de Agar Mc Conkey Placas de Agar SS Batera de pruebas Bioqumicas (TSI; LIA; SIM; Citrato y Urea) Rvo. De Kovacs. Discos de Oxidasa Material biolgico Cepa de Salmonella Cepa de Shigella Cepa de Proteus
6.
PROCEDIMIENTO
Diagnostico de Enterobacterias Lactosa negativas
36
7.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. El LPS de las enterobacterias es considerado como endotoxina. Indique de que partes consta y cual de ellas es la parte txica. Indique cuales son las tres pruebas utilizadas para identificar al grupo de enterobacterias, especificando cuales son las excepciones a esta regla. Indique cuales son las tres vas de fermentacin de glucosa por parte de las enterobacterias. Indique cuales son las dos enzimas que las enterobacterias contienen que les hace posible la utilizacin de lactosa, como funcionan y que prueba se utiliza para determinar la presencia de estas. Indique cules son los ingredientes y propsito de estos medios diferenciales. Agar Mc. Conkey Agar EMB Agar SS Agar Hektoen Enterico Agar XLD
37
6. 7.
Indique cuales son los medio de enriquecimiento para Salmonella y Shigella y cual su funcin. Indique como seran los resultados de las pruebas bioqumicas y el fundamento de las mismas, para los siguientes tipos de bacterias. a) b) c) d) e) f) g) h) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Kliger/TSI LIA Citrato Movilidad Indol Urea Fenilalanina Ornitina Escherichia coli Shigella sonnei Yersinia pestis Serratia marcecens Proteus vulgaris Edwardsielleae tarda Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae
8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
Como se debe realizar el antibiograma para las enterobacterias. Realice Elabore un fichero para la identificacin de para las bacterias de la pregunta 7. Como se realiza el diagnostico diferencial de las diferentes variantes de E. coli diarreogenica. Como se realiza y como se interpreta la prueba de Vidal para el diagnostico de Salmonella sp. Mencione cuales son las variedades de Salmonella y como se realiza su diferenciacin. Como diagnostica: 1. Enterocolitis por Salmonella 2. Bacteriemia con lesiones focales por Salmonella 3. Fiebre entrica por Salmonella 15. Como se realiza e interpreta la prueba rpida de identificacin API20E.
8.
BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriologa en infecciones Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Per. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
38
DIAGNOSTICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al gnero Pseudomonas a partir de muestras biolgicas.
2.
MARCO TERICO:
Al grupo de bacilos Gram negativos no fermentadores pertenecen bacterias taxonmicamente muy diversas, sin embargo realizar esta agrupacin es til en el diagnostico clnico. Muchas de estas especies son incapaces de acidificar medios como el TSI y crecen considerablemente mejor en condiciones aerobias que en condiciones anaerbicas. Este grupo de bacterias se consideran como patgenos oportunistas, especialmente de infecciones intrahospitalarias, donde los principales factores de riesgo para los pacientes son tratamientos con antimicrobianos y/o ciruga, instrumentacin y permanencia del paciente en salas de cuidados intensivos por perodos prolongados. Adicionalmente, es importante considerar la resistencia natural a los antibiticos que muchas de estas bacterias presentan y la facilidad con la que adquieren resistencia a otros antibiticos. Se emplean diversas pruebas de escrutinio para su identificacin, tales como morfologa microscpica, oxidasa, movilidad, produccin de indol y fermentacin de carbohidratos. Algunas cepas solamente crecen a temperatura ambiente y son incapaces de crecer en agar MacConkey. En este grupo se encuentran gneros como Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Moraxella, Eikenella, Flavobacterium, Alcaligenes (Achromobacter), Actinobacillus, Capnocytophaga, Stenotrophomonas y Kingella, entre otras de importancia mdica. Pseudomonas aeruginosa es la especie ms frecuentemente aislada de este grupo, seguida de Acinetobacter spp. y Stenotrophomonas maltophilia, caracterizndose estos ltimos 2 por producir infecciones intrahospitalarias y en su gran mayora asociadas al uso de respiradores o al implante de catteres. Pseudomonas spp. Las bacterias del grupo Pseudomonas est constituido por bacilos Gram negativos, mviles por la presencia de un flagelo polar. Se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, aunque pueden ser patgenos oportunistas (P. aeruginosa) y patgenos de plantas (P. syringae). Su metabolismo es respiratorio, donde la mayora usa como aceptor de electrones O2 pero tambin puede ser anaerobio (algunos usan NO ). Presentan una versatilidad metablica muy grande que se traduce en su capacidad de utilizar como fuente de carbono una gran variedad de compuestos de carbono (hay especies, como P. cepacia, que pueden utilizar como nutrientes ms de 100 compuestos qumicos diferentes). Por otra parte, hay algunos individuos del grupo que son quimiolitotrofos usando H 2 o CO como donadores de electrones. El metabolismo central de azcares en este grupo se desarrolla por la va de Etner-Doudoroff, y disponen de un ciclo de Acidos Tricarboxlicos normal. La versatilidad metablica del grupo se debe a la presencia de un gran nmero de plsmidos que contienen operones inducibles para la sntesis de enzimas especficas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. Esto confiere una importancia grande a las bacterias del gnero Pseudomonas como digestores aerobios de materiales animales y vegetales, lo que contribuye al reciclaje biolgico de materia orgnica. Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fcilmente solubles en agua. Estos pigmentos actan como siderforos: molculas cuya funcin es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del microorganismo
39
Pseudomonas aeruginosa. Es un bacilo Gram negativo, aerobio estricto, no fermentador, cuyos requerimientos nutricionales no son exigentes, y cuyo desarrollo en medios slidos presenta un olor caracterstico a frutas. Pseudomonas aeruginosa tiene una gran cantidad de factores de virulencia, entre los cuales se encuentran componentes estructurales y toxinas que favorecen su diseminacin (Tabla 1), adems enzimas que favorecen la resistencia a los antibiticos (Tabla 2) y pigmentos (piocianina).
Tabla 1. Factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa. Factores de Virulencia Efectos Biolgicos Componentes estructurales Capsula Exopolisacrido mucoide, con funcin de adhesina, adems inhibe la accin bactericida de los antibiticos aminoglucsidos, suprime la actividad de los neutrfilos y los linfocitos. Adhesina a los receptores del ganglisido GM-1 sobre superficies de las clulas epiteliales del husped. Actividad de endotoxina, causa fiebre, shock, oliguria, leucopenia. Altera la funcin de los cilios respiratorios, estimula una respuesta inflamatoria, media en el dao tisular con la produccin de radicales txicos de oxigeno.
Pili
Lipopolisacrido (LPS) Piocianina
Toxinas y Enzimas Exotoxina A Produce destruccin tisular, inhibicin de la sntesis proteica, interrumpe la actividad celular y la respuesta de los macrfagos. Inhibe la sntesis proteica. Es citotxica para las membranas eucariotas, inhibe la funcin de neutrfilos y linfocitos. Destruye los tejidos que contienen elastina, colgeno; escinde las inmunoglobulinas y los componentes del complemento, interrumpe la actividad de los neutrfilos. Destruye los tejidos, inactiva al interferon y al factor de necrosis tumoral. Destruye la membrana citoplasmtica, destruye la sustancia tensioactiva pulmonar, e inactiva las opsoninas.
Exotoxina S Leucocidina Elastasa
Proteasa alcalina Fosfolipasa C
Antibitico -lactmicos
Tabla 2. Mecanismos de resistencia antibitica de Pseudomonas aeruginosa. Mecanismo de resistencia Hidrlisis de -lactmicos, disminucin de la permeabilidad y alteracin las protenas de unin. Hidrlisis enzimtica por acetilacin, adenilacin o fosforilacin; disminucin de la permeabilidad; alteracin de la diana ribosmica. Hidrlisis enzimtica por acetiltransferasa, disminucin de la permeabilidad. Diana alterada (ADN girasa), disminucin de la permeabilidad.
Aminoglucsidos
Cloramfenicol Fluoroquinolonas
Acinetobacter spp. Las especies de Acinetobacter se caracterizan por ser bacilos pequeos o bien cocobacilos, son no mviles, oxidasa negativa y pueden tener una morfologa en pares (diplococo). Sus colonias en agar sangre no son caractersticos (producen colonias planas, opacas y pequeas), crecen bien en agar MacConkey, pero con colonias de pequeo tamao, incoloras o bien escasamente pigmentadas de rosado.
40
En infecciones vaginales, es importante descartar la presencia de Acinetobacter spp. ya que puede presentar una morfologa semejante Neisseria gonorrhoeae. La diferenciacin se puede hacer mediante la prueba de crecimiento en agar MacConkey y la prueba de citocromo C oxidasa. A diferencia de Acinetobacter spp, Neisseria gonorrhoeae no crece en MacConkey y es oxidasa positivo. Las especies de Acinetobacter estn ampliamente distribuidas en la naturaleza tanto en ambientes hmedos como en superficies secas y pueden ser parte de la flora normal de la piel y mucosas de los seres humanos. Stenotrophomonas maltophilia. La especie Stenotrophomonas maltophilia ha sufrido una serie de cambios taxonmicos. Inicialmente, fue clasificada como Pseudomonas maltophilia, luego se reclasific en el gnero Xanthomonas y hasta aos recientes que se le asign a un nuevo gnero denominado Stenotrophomonas. Esta bacteria es un bacilo no fermentador, que produce colonias en agar sangre de tono amarillento, crema claro o verde lavanda, opacas y con un fuerte olor amoniacal. Si se crece en agar nutritivo, sus colonias presentan una coloracin amarillenta, con un pigmento soluble en agua pero que no difunde al agar. Esta especie es mvil, utiliza la maltosa, es oxidasa negativo y ONPG positiva. S. maltophilia se asocia como agente de neumonas primarias e infecciones nosocomiales como septicemias, infecciones urinarias, bronconeumonas por aspiracin, infecciones de heridas, mastoiditis y ectima gangrenoso. Es importante en infecciones de pacientes con cncer.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Punta bacteriolgica Medios de cultivo y pruebas Agar Muller Hinton TSI OF glucosa Discos de Oxidasa Material biolgico Cepa de Pseudomonas aeruginosa
4.
PROCEDIMIENTO
41
5.
CUESTIONARIO 1. Indique el tipo de metabolismo que tienen los bacilos Gram negativos no fermentadores. Explicando este de forma bioqumica. 2. Indique dentro de los bacilos Gram negativos no fermentadores cuales son los que se aslan con mayor frecuencia en el laboratorio de bacteriologa. 3. Indique cuales son las tres caractersticas observadas en el laboratorio que nos indiquen que se puede tratar de un aislamiento microorganismo no fermentador. 4. Indique cuales son las tcnicas usadas para la tincin de flagelos en bacteriologa y como se realiza cada una de ellas. 5. Esquematice el sistema de identificacin de los bacilos Gram negativos no fermentadores (segn Schreckenberger) 6. Siendo que las especies de Pseudomonas son unas bacterias metablicamente ms verstiles, cuando estas son sembradas en medio TSI no ocasionan ningn cambio de color en el medio, pero se observa desarrollo microbiano. Indique porque ocurre esto. 7. De ejemplo de cinco gneros de microorganismos que adems de Pseudomonas sean no fermentadores. 8. Indique que pruebas de laboratorio de Microbiologa pueden ser utilizadas como indicadoras de que existe el desarrollo de un no fermentador. 9. Indique cuales son los mtodos de tincin de flagelos mas frecuentemente utilizados y que cuidados se deben tener en el momento de ser realizados. 10. Que pruebas son concluyentes para determinar que un aislamiento se trata realmente de Pseudomonas. 11. Indique cual es el fundamento de la Prueba OF. 12. Para diferenciar a las especies de Pseudomonas y Burkholderia de la familia de Pseudomonadaceae que pruebas utilizara. Fundamente su respuesta.
6.
42
DIAGNOSTICO DE Haemophilus spp

1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Haemophilus a partir de muestras biolgicas. 2. MARCO TERICO:
Haemophilus influenzae H. influenzae es agente etiolgico de infecciones respiratorias altas y bajas como tambin de infecciones invasivas tipo meningitis, bacteremias, artritis y otras. La importancia de H. influenzae tipo b (Hib) como agente productor de enfermedad infecciosa disminuy drsticamente en la dcada del 90, despus de la incorporacin de una vacuna conjugada al programa de vacunas de pases desarrollados y en vas de desarrollo. Sin embargo, H. influenzae no capsulado contina jugando un rol en la patologa respiratoria alta tipo otitis media aguda, sinusitis, bronquitis y pueden causar neumonas y enfermedad invasiva en recin nacidos. Caracteristicas de Haemophilus influenzae. El gnero Haemophilus incluye varias especies, siendo H. influenzae la que tiene mayor relevancia para el hombre, tanto por su frecuencia, como por la severidad de los cuadros clnicos que produce. Otras especies de Haemophilus que se asocian menos frecuentemente con infeccin en el hombre son H. parainfluenzae agente de neumona y endocarditis, H. aphrophilus a veces aislado de endocarditis, H. aegyptis asociado a conjuntivitis y fiebre purprica de Brasil y H. ducreyi agente de chancro blando. H. influenzae es un cocobacilo Gram negativos de 0,3-0,5 mm de dimetro y de 0,5-3,0 mm de longitud, pleomrficos, inmviles, anaerbicos facultativos, citocromo oxidasa y catalasa positivos, capaces de reducir nitratos a nitritos. Su temperatura ptima de crecimiento flucta entre 35C a 37C. Quimiorganotrficos, fermentan carbohidratos generando cido actico, lctico y succnico, a partir de la glucosa. Son parsitos obligados de las membranas mucosas del hombre.
Figura 1. H. influenzae en muestras biolgicas, (Izq: Forma de cocobacilos en una muestra de esputo Der: Formas pleomrficas observadas en un nio de frica no vacunado)
Una de las caractersticas fisiolgicas ms relevantes del gnero Haemophilus, es su dependencia de factores de crecimiento para su desarrollo: factor X (hemina) y/o factor V (nicotn adenina dinucleotido: NAD) Figura 2. En el caso de H. influenzae, esta especie requiere ambos factores (X y V), por lo cual su aislamiento "in vitro" est condicionado el uso de medios enriquecidos como agar chocolate, en el cual los glbulos rojos de la sangre lisados por calor, aportan los factores requeridos.
43
Diagnostico de Haemophilus influenzae Muestras clnicas: Lquido cfalo-raqudeo (LCR), sangre, lquido articular, secreciones tica, ocular, senos paranasales, tracto respiratorio inferior, secrecin vaginal y lquido amnitico. En el transporte de la muestra, especialmente del LCR se debe considerar que Haemophilus es muy sensible a la sequedad y bajas temperaturas, por lo tanto no se debe refrigerar. Tincin de Gram: Se observan bacilos y cocobacilos Gram negativos altamente pleomorfos. Cultivo: En base a las exigencias de Haemophilus las muestras se siembran en agar chocolate e incuban 37C por 18-24 horas en 5% de CO2. H. influenzae forma colonias lisas de bordes regulares, convexas, con una leve coloracin verdosa y olor caracterstico. El requerimiento de factores XV es una de las caractersticas ms importante que permite orientar el diagnstico de especie. Otras pruebas bioqumicas se utilizan tambin para este objetivo. (Tabla 1).
Figura 2. Requerimientos de factor V y Factor X para la identificacin de H. influenzae.
Tabla 1. Caractersticas metablicas de especies de Haemophilus de importancia clnica. Req. de factores Especie X H. influenzae H. haemolyticus H. ducreyi H. parainfluenzae H. parahaemolyticus H. segnis H. paraphrophilus H. aphrophilus V = Variable d = Dbil + + + V + + + + + + + + Hemlisis Glucosa + + + + +d + + Sacarosa + + +d + + Lactosa + + + + V V V Fermentacin de Catalasa
La determinacin del biotipo se basa en tres pruebas bioqumicas: indol, urea y ornitina. En general, se observa que las cepas no capsuladas son heterogneas a diferencia de las cepas Hib que corresponden a biotipo I sobre el 90% de los casos.
44
Deteccin de antgenos: Se puede pesquisar con tcnicas de diagnstico rpido el antgeno capsular de Hib especialmente de LCR u otros lquidos de cavidades estriles mediante mtodos de coaglutinacin o aglutinacin con ltex, sin embargo estas tcnicas no reemplazan al cultivo. Susceptibilidad a antimicrobianos: H. influenzae presenta resistencia a ampicilina y/o cloranfenicol, debido a la presencia de enzimas betalactamasas y cloramfenicol acetiltransferasa respectivamente, ambas codificadas por plasmidios. En nuestro pas, la resistencia a ampicilina flucta entre 10 a 30% y alrededor de un 10% al cloramfenicol. En general son sensibles a cefalosporinas y macrlidos de ltima generacin. Dado que la sensibilidad de H. influenzae es variable se debe realizar antibiograma por el mtodo de difusin en agar Haemophilus test Medium (HTM Oxoid).
3.
MATERIAL Y MEDIOS: Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Pinza Medios de cultivo y pruebas Placas de Agar Chocolate o Thayer Martin Agua Oxigenada Agar Mller-Hinton Discos de factor V y X Disco de Oxidasa Material biolgico Cepa de H. influenzae
4.
PROCEDIMIENTO:
45
5.
BIBLIOGRAFIA. Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriologa en infecciones Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Per. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
46
DIAGNOSTICO DE Neisserias spp
1.
OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Neisserias a partir de muestras biolgicas.
2.
MARCO TERICO: Familia Neissereaceae. El gnero Neisseria pertenece conjuntamente con Kingella, Moraxella y Acinetobacter, a la familia Neissereaceae. Esta familia ha experimentado multiples cambios a travs de los estudios genticos, estudios recientes han demostrado que la antigua especie Branhamella catarrhalis es un subgnero de Moraxella, designndose a la especie ms comnmente hallada en el ser humano como Moraxella (Branhamella) catarrhalis. A travs del uso de tcnicas moleculares se estableci que las bacterias del gnero Neisseria pertenecen al grupo de las -proteobacteria mientras que las bacterias de gnero Moraxella pertenecen al grupo de -proteobacteria. Se caracterizan por ser diplococos Gram negativos arrionados, catalasa y oxidasa positivos, aerobios estrictos, inmviles, que utilizan pocos carbohidratos. Neisserias Actualmente el gnero Neisseria comprende dos especies patgenas para el hombre siendo estas la N. meningitidis y N. gonorrhoeae; donde el hombre es el nico reservorio conocido. Otras especies de Neisseria no patgenas, se encuentran habitualmente formando parte de la flora normal de la orofaringe; estas especies no son exigentes nutricionalmente, causando enfermedad solo en personas inmunodeprimidas. Son bacterias aerobias, que en muestras biolgicas (Infecciones gonoccicas con uretritis purulenta) se visualizan como diplocococs Gram negativos en leucocitos polimorfonucleares Figura 1, son exigentes nutricionalmente, razn por la cual se emplea para su cultivo medios enriquecidos como Thayer-Martin, desarrollan de forma ptima a una temperatura de 37C y en un ambiente con 5 a 7 % de CO2. Son oxidasa positiva. Estos requerimientos de cultivo, as como el perfil de fermentacin de azcares (principalmente glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa) son de gran utilidad para diferenciar las diferentes especies de Neisserias (Tabla 1)
Figura 1. N. gonorrhoeae en un exudado uretral donde se visualizan diplocococs Gram negativos en leucocitos polimorfonucleares
47
Tabla 1. Perfiles metabolicos de las especies de Neisserias.

Formacin de acido a partir de Especie Glucosa N. meningitidis N. gonorrhoeae N. gonorrhoeae ssp. kochii N. lactamica N. cinerea N. flavescens N. subflava biovar subflava N. sicca N. mucosa (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) Maltosa (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (+) (+) Sacarosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) Fructosa (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) Lactosa (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) DNAsa
N. gonorrhoeae posee diversos factores de virulencia (Figura 2) los cuales se encuentran enumerados a continuacin: Pilis (adherencia); Protenas de membrana externa: Proteina Por (Proteina I): Facilita la supervivencia intracelular evita la fusin del fagolisosoma; Proteina Opa (Proteina II): adherencia a clulas y entre bacterias; Proteina Rmp (Proteina III): resistencia al suero y proteccin de la Proteina Por y LOS; Lipooligosacrido (LOS): Actividad como endotoxina. Proteina de unin a transferrina; Proteina de unin a lactoferrina; Proteina de unin a hemoglobina; IgA proteasas. -Lactamasa
Figura 2. Factores de virulencia de N. gonorrhoeae.
Diagnostico de Laboratorio para N. gonorrhoeae
El diagnstico se sospecha por la clnica: Varones: Uretritis (disuria y exudado blanquecino) entre los 2-5 das despus del contacto. Mujeres: Uretritis, cervicitis no complicada (lo mas frecuente), endometritis, peritonitis perihepatica o generalizada. El material para examen se obtiene de la uretra, canal endocervical (con ayuda del especul), mucosa rectal o faringe. No debe hacerse toma de la vagina ni del canal anal, en las mujeres.
48
En caso de uretritis la toma se hace en la maana antes de la primera miccin. La toma de exudado del endocervix es realizado previo al aseo local y sin la aplicacin de tratamiento en las 48 horas previas. El hallazgo en el examen directo con coloracin de Gram, de polimorfonucleares, piocitos y diplococos Gram negativos intra y extracelulares, es muy sugestivo y a menudo suficiente para el diagnstico de etiologa gonoccica. Si la tcnica se realiza correctamente la sensibilidad y especificidad del frotis del exudado uretral es superior a 90% en hombres sintomticos. En cambio en la mujer la sensibilidad es menor de 60%. Cuando el examen directo es negativo, debe realizarse cultivo en Agar Thayer-Martin. Para la identificacin de la especie se emplea reacciones de fermentacin de azcares los cuales se realizan en medio semislido CTA (agar cistena tripticasa) con 1% de cada carbohidrato; producindose slo pequeas cantidades de metabolitos cidos en las reacciones positivas.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Portaobjetos. Asas. Mechero Bunsen. Charola de tincin. Set de colorantes de Gram. Aceite de inmersin. Microscopio. Estufa a 37C Pinza Medios de cultivo y pruebas Agar Thayer-Martin. Agar cistena tripticasa suplementado con glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa. Discos de oxidasa Catalasa. Material biolgico Cepa de N. gonorrhoeae
4.
PROCEDIMIENTO
49
5.
BIBLIOGRAFIA. Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II. Estenssoro M, Terceros P y Quisberth S. (2007) Manual de Prcticas de Microbiologa II.1 ed. Goldman E y Green L. (2008) Practical Handbook of Microbiology. CRC Press. 2ed. Harley J y Prescott L. (2002) Laboratory Exercises in Microbiology. McGraw-Hill. 5ed. Mac Faddin J. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de Importancia Clnica. Panamericana. 3ed. Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G y Pfaller M. (2002) Microbiologa Mdica. Elsevier Science. 4ed. Sacsaquispe R y Ventura G. (2005) Manual de procedimientos Bacteriologa en infecciones Intrahospitalarias. Ministerio de Salud del Per. Winn W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P y Woods G. (2008) Koneman Diagnostico Microbiolgico Texto y Atlas en Color. Panamericana. 6ed.
50
DIAGNOSTICO DE Sfilis
1. OBJETIVO: El objetivo es desarrollar en el estudiante la habilidad para poder aislar e identificar a microorganismos pertenecientes al genero Neisserias a partir de muestras biolgicas.
2.
MARCO TERICO:
Treponema pallidum es el agente etiolgico de la sfilis, una enfermedad de transmisin sexual, que presenta caractersticas clnicas y secuelas que tiene una importante con notacin social. T. pallidum, es una espiroqueta muy sensible a condiciones ambientales, como la desecacin y temperatura y el contacto con antispticos suaves, por lo que su transmisin requiere un contacto muy directo o muy constante. La va fundamental de transmisin de la enfermedad la constituyen las relaciones sexuales, pero la transmisin transplacentaria debe tenerse en cuenta. Aunque es probable que este microorganismo sea capaz de atravesar la piel o las mucosas intactas, al parecer el mecanismo de contagio es a travs de erosiones en superficies hmedas. Caracteristicas del Treponema pallidum: En el gnero Treponema, se encuentran bacterias comensales y patgenos humanos exclusivos. Los treponemas patgenos se encuentran relacionados por su morfologa, antigenicidad, homologa del DNA y por su capacidad para adherirse a clulas de mamfero. stos agentes son de forma delgada y helicoidal Figura 1. El citoplasma est rodeado por una membrana citoplasmtica trilaminar, una capa de peptidoglicanos, una capa interna de mucopptidos (periplasto), una membrana lipoproteca externa (lipopolisacrido) y una membrana externa (rica en fosfolpidos). Se moviliza con un movimiento rotatorio flotante y suele tener un movimiento ondulante caracterstico cerca del centro del microorganismo. Los treponemas patgenos, incluido T. pallidum, no pueden ser cultivados in vitro. Slo pueden mantenerse viables en nitrgeno lquido (a menos de 70C) y en mamferos (ejemplo, testculos de conejos).
Figura 1. Treponema pallidum en estudio de microscopia, (Izq: Microscopia de Campo oscuro Der: Prueba con anticuerpos fluorescentes directos frente al patogeno)
Treponema pallidum es un microorganismo mvil que, dadas sus dimensiones, 5-15 de largo por 0,2 de dimetro, se encuentra en el lmite de resolucin ptica de los microscopios convencionales; por ello no es posible visualizarlo mediante tinciones normales y s por contraste de fases o tincin argntica que "engruesan la bacteria". Tampoco es cultivable segn el concepto tradicional. Su movilidad se debe a flagelos
51
periplsmicos, y presenta un tiempo de generacin de 8 horas en tejidos humanos, por lo que su multiplicacin es lenta. Se distinguen 2 etapas: 1. 2. sfilis precoz o temprana. Es la enfermedad dentro del primer o segundo ao y comprende los perodos: primario, secundario y latente precoz sfilis tarda. Ocurre despus de ese tiempo y abarca los perodos de: latencia tarda, sfilis benigna tarda, sfilis cardiovascular y neurosfilis.
La sfilis primaria es el primer estado de la enfermedad. Se define por el chancro (Figura 2.) y las adenopatas satelitales. El perodo de incubacin es de 10 a 90 das (trmino medio 21); dicho chancro se encuentra localizado en la zona de entrada del patgeno, siendo visible en los genitales externos, siendo otras localizaciones: cuello uterino, boca, perin, canal anal, dedos, etc. Se inicia bajo la forma de una ppula eritematosa que pronto erosiona, quedando constituida una lcera superficial, bien delimitada, redondeada, indolora, de 0,5 a 2 cm de dimetro, indurada a la palpacin, con consistencia de cartlago, de fondo limpio y que no supura (Figura 2). En general es nico, aunque puede haber ms de un chancro. Puede pasar inadvertido, si se asienta en el cuello uterino o canal anal.
Figura 2. Chancro primario de tallo del pene, habitualmente indoloro
La sfilis secundaria es la expresin de la diseminacin hematgena del patgeno (Figura 3). Ocurre entre las 4 a 12 semanas (trmino medio 6) despus del contacto infectante y sus sntomas son recurrentes en 25% de los casos. Las recurrencias se observan especialmente durante el primer ao.
Figura 3. Exantema diseminado en la Sfilis secundaria
52
Sfilis latente es la fase asintomtica de la sfilis, cuando se resolvieron las manifestaciones de la sfilis primaria y secundaria, aunque no implica ausencia de progresin de la enfermedad, al contrario, este periodo es cuando el patgeno se alberga en diversos tejidos sin ocasionar manifestaciones clnicas. La sfilis latente se extiende hasta 1 o 2 aos despus del contacto infectante. Puede ser asintomtica durante todo su curso o ste verse interrumpido por los sntomas de recurrencia de la sfilis secundaria. Despus de 1 o 2 aos se habla de sfilis latente tarda, la que es asintomtica. Todos los pacientes con sfilis latente tarda deben ser evaluados clnicamente buscando aortitis, neurosfilis, gomas e iritis. Diagnstico Directo La identificacin del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la lesin a travs de microscopia de campo oscuro y/o fluorescencia directa (DFA-TP) (Figura 1), siendo esta una prueba definitiva para asegurar el diagnstico. Un resultado negativo en el examen directo del producto de la lesin no descarta la posibilidad de la enfermedad, ya que pueden existir una baja carga bacteriana en la misma, dependiendo de los das de evolucin y de la administracin de tratamiento previos. Nunca deber emplearse para el examen directo material procedente de lesiones sospechosas en la boca, ya que las posibilidades de confundir los treponemas con otras espiroquetas saprofitas son muy altas. La sensibilidad de esta prueba es del 75-80%. Diagnostico Indirecto La experiencia nos dice que, en la mayora de las ocasiones, existen dificultades o no es posible realizar el diagnstico directo, por lo que el diagnstico indirecto -serolgico- de la enfermedad se ha convertido en el procedimiento ms frecuente. Estos marcadores necesitan, aproximadamente, de unos 14 a 20 das para hacerse reactivos. En la Tabla 1 y Tabla 2 se resumen las pruebas que existen actualmente para el diagnstico serolgico de la sfilis y sus grados de sensibilidad.
Tabla 1. Pruebas serologicas empleadas actualmente para el diagnstico de la sfilis. Pruebas Valor de referencia Observaciones No treponmicas RPR No reactivo VDRL No reactivo USR No reactivo TRUST No reactivo ELISA Cut-off Treponmicas TPHA No reactivo Suero, hemaglutinacin FTA-ABS IgG e IgM No reactivo Suero y LCR FTA-ABS-DS Doble tincin ELISA anti-IgG Cut-off Suero ELISA anti-IgM Cut-off Suero Western-Blot Prueba confirmatoria
Caractersticas Generales Y Peculiaridades De Las Pruebas Serologicas Pruebas no treponmicas: V.D.R.L. (Venereal Research Disease Laboratory). nicamente puede emplearse con suero; es un antgeno no particulado. Lectura microscpica. R.P.R. (Rapid Plasma Reagin). Puede emplearse con suero y plasma. Es un antgeno con partculas de carbn. La reaccin que se obtiene con la muestra positiva es de floculacin. TRUST. (Toluidine Red Unheated Serum Test). Puede realizarse con suero o plasma. Es el mismo antgeno del VDRL con partculas coloreadas con rojo de toluidina. U.S.R. (Unheated Serum Reagin). Puede emplearse con suero. El antgeno no es particulado y la reaccin es de floculacin. Lectura microscpica. E.L.I.S.A. Se emplea con suero. Utiliza en la fase slida antgenos del tipo VDRL.
53
Pruebas treponmicas FTA-ABS 200. (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin del suero) Antigeno de Treponema cepa Nichols y absorbente de la cepa Reiter. Puede realizarse sobre con suero y L.C.R. FTA-ABS 200 DS. (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin y doble tincin). Utiliza el mismo antgeno y absorbente que en la prueba anterior y puede llevarse a cabo sobre el mismo tipo de muestras. Emplea como antisuero una IgG marcada con isotiocianato de tetrametil rodamina y como contraste un suero antitreponema marcado con isotiocianato de fluorescena. TPHA. (Microhemaglutinacin). Solo homologada para suero. Utiliza eritrocitos sensibilizados con antgenos de Treponema cepa Nichols y absorbente de cepa Reiter. Captia Syphilis M. (ELISA de captura anti cadena pesada). Se realiza en suero. Su mayor utilidad se centra en el diagnstico de la sfilis congnita, sobretodo la sintomtica. Parece ser la prueba con mayor sensibilidad para la deteccin de esta clase de inmunoglobulina. ELISA IgG. Para utilizar con suero. Existen muchos estudios que demuestran su alta sensibilidad y especificidad. FTA-ABS 19S IgM. Para suero. Poca sensibilidad. FTA-ABS LCR. Utilizar LCR diluido a 1/5 Western blot. Debe utilizarse como prueba de confirmacin.
Sensibilidad y especificidad de las pruebas en diferentes estados

Tabla 3. Pruebas serologicas empleadas actualmente para el diagnstico de la sfilis. Tipo de prueba Primaria Secundaria Latente Tarda VDRL No treponmico 78% 100% 95% 71% RPR No treponmico 86% 100% 98% 73% USR No treponmico 84% 100% 97% TRUST No treponmico 85% 100% 95% FTA-ABS-DS Treponmico 80% 100% 100% 96% TPHA Treponmico 76% 100% 97% 94% Captia IgM* Treponmico 90% ? ? ? Especifidad 98% 98% 99% 93% 98% 99% 90%
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Agitador magntico Placas de RPR Mezcladores Medios de cultivo y pruebas Control reactivo Control no reactivo Reactivo para RPR Material biolgico Suero reactivo
4.
PROCEDIMIENTO RAPID PLASMA REAGIN (RPR) TEST Dejar atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Depositar 50 L de la muestra a ensayar y una gota de cada Control en crculos separados de la tarjeta visualizadora. Homogeneizar el Reactivo (A) con suavidad antes del ensayo. Adaptar la aguja al extremo del vial dispensador de plstico. Invertir el conjunto y presionar ligeramente para eliminar el aire retenido en la aguja. Situar la aguja en posicin vertical a la tarjeta y aadir a cada crculo una gota del Reactivo (A) prxima a la muestra a analizar. Mezclar con ayuda de un palillo desechable, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del crculo. Emplear palillos distintos para cada muestra. Agitar la tarjeta a 100 r.p.m. durante 8 minutos.
54
LECTURA Examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin antes de transcurrido 1 minuto tras la parada del agitador. Los resultados se evalan de acuerdo con el siguiente criterio:
Los sueros positivos pueden titularse. Para la titulacin, realizar diluciones dobles en NaCl 9 g/L. Se define el ttulo como la dilucin mayor que da resultado positivo.
5.
55
INTRODUCCIN A LA TECNOLOGA DE DIAGNSTICO DE PROCESOS VIRALES

1. OBJETIVO: Revisar, analizar y discutir conocimientos bsicos previos sobre la tecnologa aplicada al diagnstico de procesos virales. 2. MARCO TERICO: Los virus son, probablemente, los agentes infecciosos ms antiguos y ampliamente distribuidos en la naturaleza. La tecnologa ha permitido evidenciar su existencia en prcticamente todas las especies y organismos, entre estas bacterias, protozoarios, hongos, algas, insectos, plantas, animales y humanos. Por su biologa, los virus han evolucionado con las especies, modulan varios procesos metablicos y moleculares que son vitales para la clula husped y su ecologa. Los virus se encuentran involucrados en procesos infecto-contagiosos de importancia biomdica que afectan al ser humano y se constituyen en importantes problemas de salud pblica ej., Cncer, SIDA, herpes, diarreas infantiles agudas, infecciones respiratorias agudas, infecciones tropicales, etc. Por lo que el estudio e identificacin de virus, mediante estrategias de laboratorio son trascendentales para desarrollar/establecer medidas de control, prevencin y/o tratamiento. La interaccin entre un virus y su husped celular da lugar a procesos genticos, moleculares y bioqumicos que pueden resultar en cambios genticos, morfolgicos, fisiolgicos que difieren dependiendo del virus en particular y el tipo de clula infectada. Por esto, los procedimientos y tecnologa aplicados a su estudio y diagnstico son particulares para cada proceso, y en el caso de los seres humanos tambin depende de la carga viral de infeccin, el sistema inmunitario del husped, de factores genticos, de la alimentacin, de su relacin con el medio ambiente, la edad, etc. 2.1. Estrategias para el diagnstico de laboratorio de procesos infecciosos virales. La tecnologa disponible para el estudio y diagnstico de procesos virales, en este tiempo, es diversa, por lo que los criterios de su aplicacin dependen no solo del proceso viral en particular, sino tambin del tipo de estudio, i.e., clnico, epidemiolgico de investigacin bsica, de investigacin aplicada, etc., etc. En general los procedimientos pueden ser agrupados en dos categoras: a) Procedimientos de identificacin directa b) Procedimientos de identificacin indirecta 2.1.1. En procedimientos de identificacin directa (Figura 1), el espcimen biolgico es examinado directamente por la presencia de partculas virales, antgenos (protenas) virales, o cido nucleico (DNA, RNA) viral o propiedades virales. Entre estos procedimientos se incluyen: Estudios morfolgicos por Microscopa electrnica e inmunoelectromicroscopa. Estudio histolgico (cuerpos de inclusin) por microscopa de luz. Deteccin de antgenos por Inmunofluorescencia, Ensayos inmunoenzimticos. Deteccin de material gentico viral por procedimientos moleculares, microarrays. Estudio de infeccin viral por tecnologa de cultivo celular, infeccin en huevos, y animales de experimentacin.
2.2.2. En procedimientos de identificacin indirecta (Figura 1), el espcimen biolgico es analizado por marcadores biolgicos de respuesta antiviral que el husped desarrolla de modo especfico, incluyendo anticuerpos, clulas, citokinas, propiedades/caractersticas celulares
56
En estos estudios la diferencia (ttulo) de marcadores humorales (anticuerpos, citokinas) entre estados de infeccin aguda y convaleciente o la deteccin de IgM identifica el agente causante de la infeccin. Estos estudios se pueden realizar por procedimientos clsicos: Fijacin de complemento, inhibicin de hemaglutinacin, Inmunofluorescencia, neutralizacin, hemlisis radial, ensayos inmunoenzimticos, aglutinacin, western blot. Como en todo proceso de diagnstico, el espcimen utilizado para el estudio de laboratorio es muy importante. Un resultado positivo de una muestra colectada del sitio de infeccin tiene mayor significancia diagnstica, que aquellos estudios realizados con muestras de otros sitios, por ejemplo, en el caso de una encefalitis por Herpes simplex, un resultado positivo del anlisis de fluido cerebro espinal ser de mayor significancia que el resultado de una lcera oral, o de una muestra srica; debido a que una reactivacin de herpes oral es comn bajo estrs y el sujeto puede ser portador, respectivamente.
Figura 1. Mtodos de diagnostico Viral.
3.
PROCEDIMIENTO Trabajo Grupal: Revisin bibliogrfica, anlisis y discusin de procedimientos directos e indirectos
4.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cual la estructura de una partcula viral? Cuales son los mecanismos bsicos de respuesta inmune antiviral? Represente esquemticamente la deteccin de un vp (protena viral) Represente esquemticamente la deteccin de RNA viral.
5. BIBLIOGRAFIA Martnez J. (1987) Tcnicas virolgicas de Jos. Ed. Enpes. Microbiologa Medica de Jawetz Specter S. (1986) Manual de Virologa Clnica de. ed. 10.
57
ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS GASTROINTESTINALES
1.
OBJETIVO: Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnstico de infecciones por virus gastrointestinales.
2.
MARCO TERICO:
Las infecciones gastrointestinales pueden ser causadas, entre otros virus, por enterovirus, rhinovirus, rotavirus. Estos virus comparten gran nmero de caractersticas clnicas, epidemiolgicas y ecolgicas, as como ciertas propiedades fsicas y qumicas. Difieren entre s por el distinto comportamiento en cultivo, antigenicidad y ciclo replicativo aunque, en todos los casos, el hbitat comn y el lugar de replicacin es el tracto intestinal humano. En la prctica, se realizar el diagnstico de la infeccin gastrointestinal causada por rotavirus. El rotavirus es agente causal de una infeccin diarreica aguda, de importancia en salud pblica porque afecta principalmente a nios pequeos y en edad pre-escolar. Es un virus con alta capacidad replicativa, por lo que el tiempo de incubacin es corto, por lo que la identificacin de marcadores de la respuesta inmunitaria no es de utilidad diagnstica, sino epidemiolgica. La profusa produccin de antgenos virales permite la aplicacin de procedimientos de deteccin directa bsicos de captura de antgenos virales a travs de anticuerpos capturados en soporte de papel de nitro celulosa.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Puntas descartables Pipetas Pasteur de plstico Medios de cultivo y pruebas Buffer fosfatos Anticuerpos anti vp de rotavirus Papel de nitrocelulosa Material biolgico Heces fecales
4.
PROCEDIMIENTO
58
5.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cual el ciclo replicativo del rotavirus? Describe la fisiopatologa del proceso infeccioso gastrointestinal que tiene lugar? Represente esquemticamente procedimientos de diagnstico epidemiolgico de rotavirus Represente esquemticamente un procedimiento para el diagnstico de enterovirus.
6. BIBLIOGRAFIA Martnez J. (1987) Tcnicas virolgicas de Jos. Ed. Enpes. Microbiologa Medica de Jawetz Specter S. (1986) Manual de Virologa Clnica de. ed. 10. .
59
ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS DIRECTOS: VIRUS RESPIRATORIOS
1.
OBJETIVO: Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnstico de infecciones por virus respiratorios.
2.
MARCO TERICO: Las infecciones por virus respiratorios, se constituyen en problema de salud pblica debido a que es la patologa ms frecuente .a lo largo de toda la vida del ser humano. En nuestro pas, atendiendo a los datos publicados en pacientes en edad infantil, las enfermedades infecciosas son el motivo de ms del 60% de las consultas en pediatra extrahospitalaria. De ellas, aproximadamente el 70% corresponde a una infeccin respiratoria y ms de la mitad de estas son de origen vrico. La mayora de las infecciones respiratorias slo afectan al tracto respiratorio superior y pueden ser consideradas leves, de curso benigno y autolimitado (catarro comn, rinitis y faringoamigdalitis). Sin embargo, se estima que alrededor del 5% pueden implicar al tracto respiratorio inferior (bronquitis, bronquiolitis y neumona). Son infecciones potencialmente ms graves que, en muchos casos, requieren el ingreso hospitalario. En edad adulta las infecciones respiratorias de origen vrico son una causa importante de morbilidad, sin embargo los cuadros clnicos que precisan atencin mdica prcticamente se limitan a ancianos y a pacientes severamente inmunodeprimidos o con una patologa pulmonar subyacente En la prctica, se realizar el diagnstico de la infeccin respiratoria causada por virus sincitial respiratorio. Los procedimientos para este virus incluyen: 1. Aislamiento de virus en clulas Hep-2 es el procedimiento ms sensible, en los que se produce el caracterstico efecto citoptico. En procesos agudos, la Inmunofluorescencia indirecta es el procedimiento alternativo al aislamiento en cultivo celular. El diagnstico serolgico como la fijacin de complemento y EIA pueden ser utilizados. Es posible encontrar anticuerpos en fase aguda de la infeccin. En nios pequeos, un resultado positivo representa anticuerpos transplacentarios, mientras que en nios mayores representa infeccin previa con el virus.
2. 3.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Puntas descartables Pipetas Pasteur de plstico Porta objetos Micropipetas graduadas 5 a 50 l Medios de cultivo y pruebas Medio bsico de transporte Anticuerpo monoclonal anti vp de virus sincitial respiratorio Anticuerpos anti Fcgamma, marcado con fluorescencia Solucin de azul de evans Material biolgico Hisopado nasal o lavado broncopulmonar en medio de transporte viral
4.
PROCEDIMIENTO
60
5.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cual el ciclo replicativo del virus sincitial respiratorio? Describe la fisiopatologa del proceso infeccioso respiratorio? Que otros virus respiratorios conoce y cual el procedimiento de diagnstico que recomienda realizar? Represente esquemticamente un flujograma para el diagnstico clnico y epidemiolgico del virus de la influenza, discuta similitudes o diferencias.
61
ESTUDIO DE PROCESOS VIRALES POR PROCEDIMIENTOS INDIRECTOS: HERPES VIRUS
1.
OBJETIVO: Analizar, discutir y aplicar conocimientos y procedimientos para el diagnstico de encefalitis por infecciones por virus herpes.
2.
MARCO TERICO: La familia Herpesviridae comprende una serie de virus DNA cuya caracterstica biolgica ms notable es su capacidad de producir latencia. Tras la infeccin primara, sintomtica o no, el virus permanecer latente en diversos tipos celulares o tejidos. Las reactivaciones, con replicacin y produccin de nuevas partculas vricas se producen con dinmica diferente. Adems de las infecciones primarias y las reactivaciones, en algunos herpesvirus se ha demostrado la posibilidad de reinfeccin. El diagnstico de la infeccin por herpes virus incluye: - Diagnstico diferencial en las infecciones congnitas y neonatales (herpes neonatal). - Prevencin del herpes neonatal (las estrategias no bien definidas en la actualidad). - Diagnstico etiolgico de las infecciones del sistema nervioso central (encefaltis). - Diagnstico de las infecciones generalizadas en inmunodeprimidos. - Establecer el diagnstico diferencial en formas de presentacin clnica inhabituales - Diagnstico etiolgico del herpes genital y diagnstico diferencial de lceras genitales - Pruebas de sensibilidad a los antivirales En la prctica, se realizar el diagnstico de encefalitis herptica. Los procedimientos para este virus incluyen: 1. Aislamiento del virus en clulas Vero es el procedimiento ms sensible. El efecto citoptico aparece en 2-3 das. El ensayo es complementado por tipificacin por inmunofluorescencia o neutralizacin. En procesos agudos, la Inmunofluorescencia directa es el procedimiento alternativo al aislamiento en cultivo celular en improntas celulares de la vescula. El diagnstico serolgico de la infeccin puede ser realizada por determinacin del ttulo de anticuerpos especficos, o la deteccin de IgM. Sin embargo se debe considerar que procesos de reactivacin no pueden ser asociados con ttulos de anticuerpos o presencia de IgM
2. 3.
3.
MATERIAL Y MEDIOS Material y equipos Puntas descartables Pipetas Pasteur de plstico Porta objetos Micropipetas graduadas 5 a 50 l Medios de cultivo y pruebas Anticuerpo monoclonal anti vp de virus herpes simplex Anticuerpos anti Fcgamma, marcado con fluorescencia Solucin de azul de evans Material biolgico Lquido cefalorraqudeo
62
4.
PROCEDIMIENTO
5.
CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cual el ciclo replicativo del virus herpes simplex? Describe el mecanismo de infeccin que da lugar a una encefalitis? Que otros herpesvirus conoce y cual el procedimiento de diagnstico que recomienda realizar? Represente esquemticamente un flujograma para el diagnstico clnico y epidemiolgico del virus de Epstein Barr, discuta similitudes o diferencias.
63
ANEXO I PREPARACION DE MEDIOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE PRODUCCION DE BIOFILM DE ESTAFILOCOCOS
PBS Buffer de fosfatos pH 7.4 Reactivo Concentracin molar NaCl 137 mM KCl 2.7 mM Na2 HPO3 10 mM K H2PO3 2 mM Agua destilada Ajustar pH a 7.4 con HCl Aforar Peso 8g 0.2 g 1.44 g 0.24 g 800 mL 1L
Nota: Conservado entre 4-8 C, es estable por tres o ms meses. Desechar si aparecen cambios de coloracin o precipitados
Caldo Soya Tripticasa Glucosa (TSB-Glu) Christensen et al 1982 Preparar el medio en dos partes, pesar el medio TSB segun la especificacin de la casa comercial (~30g/L) y disolver en 70% del volumen final del medio; en el restante 30% disolver glucosa para una concentracin final de 1% (10g/L). Autoclavar ambas soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 30-40 oC unir las dos soluciones y dispensar en tubos esteriles. OJO No autoclavar nunca el caldo con el carbohidrato, ya que este puede sufrir modificaciones y caramelizar el medio.
Caldo Cerebro-Corazn Sucrosa (BHI-Suc) Christensen et al 1982 Preparar el medio en dos partes, pesar el medio BHI segun la especificacin de la casa comercial (~37g/L) y disolver en 70% del volumen final del medio; en el restante 30% disolver sacarosa (Sucrosa) para una concentracin final de 2% (20g/L). Autoclavar ambas soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 30-40 oC unir las dos soluciones y dispensar en tubos esteriles. OJO No autoclavar nunca el caldo con el carbohidrato, ya que este puede sufrir modificaciones y puede llegar a hidrolizarse por efecto de la alta temperatura que se encuentra el caldo y caramelizar el medio.
Medio Rojo Congo Agar (CRA) Freeman et al 1989 Preparar el medio en tres partes: Solucin 1. Pesar el medio BHI segn la especificacin de la casa comercial (~37g/L) y agar bacteriolgico (10g/L) disolver en 70% del volumen final del medio
64
Solucin 2. Disolver sacarosa (Sucrosa) a una concentracin final de 5% (50g/L) en 20% del volumen final de agua destilada. Solucin 3. Disolver en agua destilada el Rojo Congo, en el restante 10% del volumen final a una concentracin final de 0,8g/L. Autoclavar las soluciones por separado y dejar enfriar a temperatura ambiente, cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 50-55 oC unir las tres soluciones y dispensar en cajas petri esteriles.
65
ANEXO II PRUEBAS BIOQUIMICAS EMPLEADAS

PRUEBAS BIOQUMICAS DE IDENTIFICACIN PRUEBA DE LA OXIDASA. Introduccin El sistema citocromo oxidasa est constituido por hemoprotenas capaces de catalizar la oxidacin de un citocromo reducido por el oxgeno molecular. Las bacterias que obtienen su energa por respiracin y utilizacin del oxgeno molecular como aceptor final de electrones, contienen diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias obligadas no contienen tales sistemas Principio El ensayo de citocromo oxidasa permite detectar la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo oxidasa, capaces de catalizar el transporte de electrones entre un dador presente en la bacteria y el colorante redox tetrametil-p- fenilendiamina (reactivo de Wurster). Este ensayo es til para sospechar la presencia de los gneros de bacterias que dan el ensayo positivo como Neisseria, Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y Pseudomonas y para excluir las Enterobacterias que dan reacciones negativas. Procedimiento Tcnica directa en placa: aadir directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que desarrollan en placas. Interpretacin Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-pfenilendiamina, se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg. Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. y se considera negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg.
TEST DE LA CATALASA. Introduccin La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en oxgeno y agua. Qumicamente, la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula +++ estn en estado oxidado (Fe ) en lugar de ++ reducido (Fe ). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Principio El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para
las clulas bacterianas. La catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin: 2 H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). Procedimiento Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar). Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin aadir agua.
66
Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. Observar si se forman burbujas de oxgeno.
Resultado: La aparicin de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.
TEST DE TSI (Triple sugar iron) En este test son medidos varios datos fisiolgicos importantes para determinar si un microorganismo es: fermentador de glucosa, fermentador de lactosa, productor de gas, productor de cido sulfhdrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculacin especial. Procedimiento Inocular los microorganismos aislados en un tubo con medio TSI con la punta bacteriolgica. La siembra se har de la siguiente manera: sembrar la superficie por estra y sembrar la parte interna del medio por picadura (es necesario pinchar suficientemente, sobre todo para la deteccin de produccin de sulfhdrico. Incubar 18-24 h a 37C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. Fermentacin de glucosa y lactosa. El medio contiene una pequea cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismos capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darn lugar a la formacin de cidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesin de eventos metablicos es la siguiente: 1. El microorganismo utiliza la fuente de carbono ms fcilmente utilizable en el medio, la glucosa. Produccin de gas. La produccin de gas se detecta por la formacin en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que estas logran partir el medio. El gas se origina mediante la reaccin catalizada por la enzima formiato liasa a partir de cido frmico. Pero como se encuentra en el medio en muy baja concentracin esta se agota rpidamente y los productos de su degradacin acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2. Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero solamente en aerobiosis (se corresponde a la zona del pico de flauta). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una alcalinizacin del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3. Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacrido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiar el medio de rojo a amarillo. La razn de que la lactosa se utilice despus es debido al tipo de regulacin de la galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacrido para dar los correspondientes monosacridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la produccin de las primeras molculas de galactosidasa, de tal forma que despus de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa. Produccin de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reaccin a partir del tiosulfato aadido al medio:
El cido sulfhdrico es detectado por la reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio dando lugar a la formacin de sulfuro de hierro.
67
LIA (Lisina Iron Agar) Este es un medio que nos permite realizar un estudio de la capacidad que tienen los microorganismos de descarboxilar la lisina liberando la amina aromtica cadaverina y dixido d carbono. En el proceso interviene la lisina descarboxilasa; adems este medio posee entre sus componentes glucosa la cual es consumida por los microorganismos durante las primeras horas acidificando el medio, una vez consumida la glucosa si el microorganismo tiene la capacidad de descarboxilar a la lisina el medio se alcalinizara nuevamente retornando a su color inicial tomndose como positivo para descarboxilacion,
si no tiene la capacidad de descarboxilar la lisina el fondo ser amarillo y el pico solamente retornara a su color inicial considerndose como negativa la prueba. Pero si el microorganismo tiene la capacidad de desaminar a la lisina a acido alfa cetocarbonico como lo hace Proteus spp, este forma un compuesto pardo-rojizo en el pico de flauta del medio se cree que es por la condensacin del acido formado con el indicador, pero hasta ahora no se conoce. Adems este medio pone de manifiesto la capacidad de reducir el azufre a sulfuro por la formacin de un precipitado negro en el fondo del tubo.
68
SIM (Sulfuro Indol Movilidad) Principio: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrogeno en un mismo tubo. Fundamento: El triptofano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, particularmente de la tripteina, que puedes ser oxidado por algunas bacterias. El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos.
La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. La movilidad viene proporcionado por los flagelos principalmente peritricos de los microorganismos poseen en su superficie, la movilidad es apreciada gracias a turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, ya que al tratarse de un medio semislido la fuerza de oposicin es mnima. Y la cepas productoras de sulfuro se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7,2.
69
CITRATO DE SIMMONS Principio La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. Fundamento: El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del acido tricarboxilico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente oxalacetato y piruvato sin participacin de
coenzima A. Este ltimo en presencia de un medio alcalino da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono producen carbonatos y bicarbonato alcalinos; adems este medio al poseer en su composicin sales de amonio, estas sales sirven como nica fuente de nitrgeno siendo degradadas a amoniaco, el cual en presencia de agua da hidrxido de amonio esto aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
70
PRUEBA DE LA UREA Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 26 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.
71
PRUEBA DE OXIDO-FERMENTACIN (OF) Introduccin La prueba de xido-fermentacin es importante en las primeras etapas de identificacin de un cultivo. Permite diferenciar las bacterias segn el rol del oxgeno atmosfrico en la utilizacin de carbohidratos. Principio El medio ms comnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que -a diferencia de otros medios de cultivo- contiene una baja concentracin de peptonas (0.2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios (1
al 2%), no es posible detectar la baja concentracin de cidos que se produce por metabolismo oxidativo de azcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentracin de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos de electrones (Ej. NO3-), la oxidacin de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la fermentacin es un proceso que no requiere oxgeno. El medio de cultivo es semislido.
72
73

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA II Enero 2012 Texto Final Con Viro

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originalbeschreibung:

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA II Enero 2012 Texto Final Con Viro

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS CARRERA DE BIOQUIMICA MENCION MICROBIOLOGIA

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA II

La Paz Bolivia 2012

Prologo Segunda Edicin

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

DIAGNOSTICO DE Bacillus spp.

Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Bacillus.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Figura 2. Enfermedades producidas por Bacillus anthracis. Tomado de Manual CTO.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

DIAGNOSTICO DE Clostridium spp

Figura 1. Desarrollo de bacterias del genero Clostridium.

Figura 2. Efecto del oxigeno en bacterias aerobias y anaerobias.

Figura 3. Marcha de procesamiento para bacterias del genero Clostridium.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

DIAGNOSTICO DE Staphylococcus spp

Figura 1. Divisin de los microorganismos del genero Staphylococcus.

blaZ, mecA (-).

Peptidoglicano alterado D-Ala-D-Lac

Figura 2. Morfologa de Staphylococcus epidermidis.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Mtodo de Freeman et al. 1989 prueba en placa

15. 16. 17. 18.

BIBLIOGRAFIA Apuntes de Prcticas laboratorio de Microbiologa II.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

DIAGNOSTICO DE Streptococcus y Enterococcus spp

Figura 1. Divisin de las bacterias de genero Streptoccocus y Staphylococcus.

Caldo 6,5 NaCl V + -

S= Sencible, v= variable, R= Resistente

Figura 2. Morfologa de los Streptoccocus Grupo A.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Determinacin de Streptococcus Hemoliticos (Grupo A y B)

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

PARTE 2 DIAGNOSTICO DE ESTREPTOCOCOS ALFA-HEMOLITICOS

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Determinacin de Streptococcus Hemoliticos (Grupo S. pneumoniae y S. viridans)

Mtodo de Burri o tincin negativa

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Figura 5. Infeccin por Enterococcus

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Figura 1. Infecciones ocasionadas por enterobacterias.

E. coli enteropatognica (EPEC)

E. coli enteroinvasiva (EIEC)

E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli O157:H7

E. coli enteroagregativa (EAEC)

E. coli difusamente adherente (DAEC)

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Diagnostico de Enterobacterias Lactosa positivas

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

Figura 2. Infecciones ocasionadas por Salmonella sp. Tomado de Manual CTO.

Diagnostico de Enterobacterias Lactosa negativas

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Mencin Microbiologa Manual de Prcticas de Microbiologa II

DIAGNOSTICO DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

Lipopolisacrido (LPS) Piocianina

Exotoxina S Leucocidina Elastasa

Proteasa alcalina Fosfolipasa C