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CROMATOGRAFIA CIRCULAR EN PAPEL DE

EXTRACTO DE COLORANTES VEGETALES

Antonio Quirante Candel


aquiran@yahoo.es

A)Introducción

El objetivo de esta actividad es describir un procedimiento sencillo de separación cromatográfica en papel


de filtro y posterior detección de extractos o muestras vegetales combinando una separación cromatográfica
simple y efectiva con el tratamiento de la imagen digital del cromatograma y posterior detección cuantitativa
de la misma con ayuda de una fotorresistencia

B) Preparación de la muestra

Se trituran 2-3 gramos de material vegetal a estudiar (jugos o cortezas de frutos, pétalos de flores, etc.) en
el fondo de un vaso de 100 cc. al que se añaden 5 cc. de alcohol y 3 gotas de ácido clorhídrico diluído. Se
deja reposar media hora y se separa la parte sólida filtrando el líquido si fuera preciso.

C) Realización de cromatografía circular.

Con el extracto líquido anteriormente preparado se marca en el centro de un trozo cuadrado de papel de
filtro de 8 x 8 cm. aproximadamente una una mancha circular de muestra de pequeñas dimensiones.
Repitiendo la operación después de evaporado el disolvente puede conseguirse una mancha suficientemente
concentrada de pequeñas dimensiones.

Se coloca el papel de filtro sobre un vidrio de reloj, haciendo coincidir la mancha con la vertical del
centro del mismo. El centro de la mancha se atraviesa con un hilo de coser que proporciona un contacto
entre la mancha y el fondo del vidrio de reloj. Una vez montado este dispositivo se vierte una pequeña
cantidad de líquido eluyente en el fondo del vidrio de reloj y se deja fluir por capilaridad el líquido eluyente
desde el fondo del vidrio al centro de la mancha y dispersarse después circularmente por el papel de filtro
obteniéndose el correspondiente cromatograma circular tal como se muestra en la siguiente figura

Figura 1.- Esquema del dispositivo para la obtención de un cromatograma circular. A) líquido eluyente; B)
papel de filtro; C) mancha; D) cromatograma obtenido

La siguiente figura corresponde al desarrollo de un cromatograma circular obtenido con una muestra de
extracto alcohólico de pétalos de flores desarrollada con una mezcla alcohol-agua-HCl

Figura 2.- Ejemplo de cromatograma circular : A) frente de eluyente. 1,2 y 3: especies separadas

D) Revelado y tratamiento de la imagen cromatográfica

En algunos casos la coloración de algunos componentes es observable directamente por la coloración que
presentan en el espectro visible. En otros hay que recurrir a algún procedimiento de revelado más o menos
selectivo que permite la visualización de los componentes separados. Muchas sustacias vegetales absorben en
el espectro UV y, en algunos casos, muestran fluorescencia en el visible por lo que la mera exposición a una
fuente de luz UV ( de la zona próxima al visible) hace visible la existencia de bandas no observadas
directamente.

En otros casos cambios ácido-base pueden alterar o hacer aparecer coloraciones en el cromatograma o en
la fluorescewncia observada, lo que aumenrta la efectividad de la cromatografía. En el caso de los
flavonoides la respuesta a la luz UV y sus cambios con el pH se utilizan de forma rutinaria en la
clasificación estructural de los mismos.

La siguiente figura muestra las imágenes de un cromatograma circular de una muestra de extracto
alcohólico de pétalos de corrihuela en distintas condiciones de observación
E) Medidas cuantitativas sobre el cromatograma
Para la estimación cuantitativa del color o del grado de absorción de la luz en el caso de reacciones en papel
de filtro realizamos las siguientes operaciones sobre la imagen digital

1) Sobre la imagen trasladada a entorno Paint


seleccionamos y copiamos un rectángulo que
comprenda una banda rectangular desde el centro al
extremo del cromatograma
2)Se copia el rectángulo seleccionado en un nuevo
documento Paint

3) Se coloca una
fotorresistencia sobre la
imagen del cromatograma y se
toman los valores de la
fotorresistencia al ir variando
la posición del cromatograma
con el cursor de
desplazamiento horizontal de
imagen.
Se introducen en una hoja
de cálculo una tabla de valores
con los datos de posición
horizontal en una columna y
de la lectura de la
fotorresistencia en otra

F) Corrección de la intensidad de una banda circular


Cuando es posible obtener una respuesta instrumental cuantitativa de una señal cromatográfica
correspondiente a una mancha extendida sobre una superficie la intensidad correspondiente a la mancha se
determina por la integral
I=S R ds (1)
donde R es la respuesta cuantitativa instrumental en cada punto y ds es un elemento de área en un entorno
de ese punto. En el caso de la cromatografía circular podemos tomar como elementos de superficie coronas
circulares elementales de área

ds = 2πxdx (2)
donde x es el radio medio de la corona circular. La contribución a la intensidad de este elemento de
superficie valdrá
dI = 2πRxdx (3)
Si en un sistema de ejes coordenados representamos los valores de x,y,R este elemento de intensidad puede
considerarse como el volumen limitado por el elemento de área 2πrdr y la ordenada vertical R extendida a
los extrremos de este elemento de superficie, tal como muestra la siguiente figura
Figura 3.- Representación gráfica de la intensidad de un elemento de área en cromatografía circular

La intensidad total correspondiente al área circular total de una banda vendrá dada por

I = 2π S Rxdx (4)

Expresión que permite relacionar la respuesta a lo largo de una coordenada con la intensidad total de la
mancha circular.
Si la banda a estudiar es simétrica respecto a su máximo es posible expresar la intensidad total de esta
forma equivalente

I = 2πxm S Rdx =2πx m A (5)

Donde xm es la coordenada x correspondiente al centro de la banda (valor máximo) y A es el área de la


banda lineal que por revolución a lo largo del eje OR determina el valor de la intensidad total.

Si por último tenemos en cuenta que el área de una banda cuadrática simétrica está relacionada con la
semianchura de banda s y con el valor máximo de respuesta en el pico de banda (RM ) por la expresión

A = RM s (6)
Obtenemos la siguiente expresión para la intensidad de la banda circular

Ι = 2πxm RM s (7)

G) Tratamiento de datos.
Los datos registrados directamente del cromatograma sobre posición de la fotorresistencia sobre el
cromatograma y valor de la respuesta de resistencia obtenida deben modificarse adecuadamente para tener
en cuenta los siguientes efectos
1) Transformación de valores del desplazamiento horizontal en valores de Rf
2) Respuesta del polímetro para una señal en blanco
3) Corrección circular

La primera de estas correcciones se lleva a cabo dividiendo el desplazamiento horizontal de la posición


del cromatograma por el desplazamiento del frente eluyente. Cuando alguno de los componentes avanza con
el frente y dan respuesta apreciable la posición de dicho frente es inmediatamente localizable. Si no es este el
caso es preciso hacer visible con algún trazo la posición del frente antes de su secado. Si llamammos D al
desplazamiento y Df al desplazamiento del frente la transformación de desplazamiento horizontal por
valores de Rf vendrá dada por
rf = D/Df

La segunda de estas correcciones se realiza sustituyendo la respuesta directa de la fotorresistencia por la


diferencia entre dicho valor y el valor que proporciona el polímetro para r f = 1. Si llamamos R al valor de la
resistencia en cada punto del cromatograma y Rb a al respuesta del polímetro para un blanco (rf > 1) el valor
de la respuesta corregida, Rc, vendrá dada por
Rc = R - Rb

La tercera corrección se hace efectiva multiplicando el de la respuesta obtenida en el apartado anterior


por el valor del r f correspondiente a cada desplazamiento horizontal. El valor obtenido tras esta corrección,
Rcc, vendrá dada por la expresión
Rcc = Rc * rf

La representación gráfica de Rcc frente a r f responderá de esta forma a una señal que depende de la
concentración de la sustancia y de la sensibilidad de la respuesta, y de la que se han excluido efectos
distorsionantes de la respuesta a un blanco y debilitamiento circular.

La siguiente tabla muestra el desarrollo de este tratamiento de datos para la experiencia correspondiente a
la imagen con luz UV de una cromatografía circular en papel de filtro de un extracto en medio alcohol – HCl
de piel de ciruela

D R rf Rc rf Rcc
0 238 0,00 34 0,00 0,00
57 238 0,16 34 0,16 5,30
92 249 0,25 23 0,25 5,78
115 253 0,31 19 0,31 5,97
154 256 0,42 16 0,42 6,73
174 273 0,48 -1 0,48 -0,48
195 298 0,53 -26 0,53 -13,85
204 308 0,56 -36 0,56 -20,07
215 312 0,59 -40 0,59 -23,50
240 307 0,66 -35 0,66 -22,95
262 303 0,72 -31 0,72 -22,19
283 288 0,77 -16 0,77 -12,37
310 280 0,85 -8 0,85 -6,78
322 280 0,88 -8 0,88 -7,04
340 277 0,93 -5 0,93 -4,64
355 274 0,97 -2 0,97 -1,94
366 272 1,00 0 1,00 0,00

La siguiente figura muestra la representación gráfica de Rcc frente a rf como resultado de los datos
experimentales y el tratamiento de datos indicado
10,00

5,00

0,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
-5,00

-10,00

-15,00

-20,00

-25,00

-30,00