2011

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Harumitsu Olivares Nobeta Rodolfo Garate Hernandez 01/01/2011

1- Introduccin
Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia del sistema biolgicos, estas llegan aumentar la velocidad de una reaccin hasta por un factor de 1014 . Hay distintas clase de enzimas dentro de las cuales se encuentran: Las oxidoreductasas las cuales catalizan reacciones redox las que implican la ganancia o prdida de electrones. Dentro de esta clase se encuentran las Perxidasas que estn distribuidas entre las plantas superiores. Parte de su gran importancia se debe a que estas catalizan la oxidacin de varios fenoles dadores de electrones en presencia de perxido de hidrogeno en conjunto a un grupo Hem, generando radicales libres que reaccionan entre s. Cabe destacar a la perxidosa que se encuentra en el rabanito ya que esta posee grandes aplicaciones en las tcnicas inmunolgicas debido a su gran estabilidad y sencillez para detectar su actividad enzimtica por mtodos espectrofotomtricos. Esta actividad es la capacidad de transformacin de sustrato en producto, esto se expresa como cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo por un volumen de enzima determinado, todo esto se determina grficamente por una curva de progreso. Para iniciar cualquier trabajo con una enzima es necesario elegir apropiadamente los sustratos. Dos de los sustratos ms ocupados es el 2-metoxifenol (Guayacol) y el perxido de hidrogeno ya que al reaccionar con la enzima Peroxidasa forman un complejo coloreado llamado Tetra guayacol fcil de detectar a 470 Nm en un espectrofotmetro . Estos sustratos cumplen con los cuatro requisitos esnciales, los cuales son: El sustrato debe experimentar una transformacin bien definida por la accin cataltica de la enzima, tiene que ser especfica o de un grupo muy restringido de enzimas, no debe

descomponerse espontneamente o producir otras reacciones y por ltimo la transformacin de sustrato a producto tienen que ser de fcil medicin. Adems es fundamental fijar las condiciones experimentales considerando los conocimientos sobre la naturaleza de la enzima (Perxidasa del rabanito) ya que esta alterar la actividad enzimtica media. Es por esto que conviene considerar el efecto de la temperatura, del pH, de la Fuerza inica, la necesidad de un co-factor enzimtico entre otras. Caractersticas de la Peroxidasa del rabanito: peso molecular 40000 g/mol, pH esta en el rango de 4 a 10 siendo el optimo 7, punto isoelctrico 7,2, la enzima es muy estable, en forma de polvo liofilizado, se puede almacenar aos en refrigeracin. Es de gran especificidad con el perxido de hidrogeno. Y reacciona junto a un co-factor llamado Hem. Todos estos requisitos y condiciones que se mencionan anteriormente se tomaron en cuenta para elegir como enzima a la Perxidasa del rabanito y los sustratos guayacol y perxido de hidrogeno. El objetivo de este trabajo es la determinacin de la actividad enzimtica de la Peroxidasa de rabanito , Para as obtener los datos necesarios de absorbancia, velocidad media y concentracin que sern tiles en la elaboracin de las curvas de progreso, a diferentes diluciones enzimticas y as observar cmo afecta la concentracin de la enzima a la actividad de esta , para que finalmente se pueda determinar los parmetros cinticos bsicos. Todo esto es de suma importancia para la industria de los alimentos ya que se debe ser capaz de
determinar correctamente la actividad de la peroxidasa debido a que esta permite tener ciertos estndares de control como por ejemplo el grado de pasteurizacin de la leche o en ciertos vegetales para as evitar algn proceso enzimtico de deterioro o pardiamiento.

2- Materiales y mtodos
2.1- Materiales 212.2 g de rabanito (Raphanus sativus).
Solucin de Guayacol al 1%. Solucin de perxido de hidrogeno al 1% (Preparada a base de una solucin al 6%). Agua destilada. Todo el resto de los materiales son de carcter analticos.

(Previamente calibrado con solucin A) a una longitud de onda de 470nm. Las lecturas de medicin de absorbancia fueron tomadas cada 15 segundos por 3 minutos. El proceso anterior se repiti para cada factor de dilucin de solucin B. 2.4-Parte terica.

2.2-Extraccin y purificacin. Para la obtencin dela enzima peroxidasa de rabanito, se procedi a tomar 212.2g de estos, a los cuales se les quit la corteza. Posteriormente la muestra se llev a proceso de molienda por 10 segundos a una velocidad frape. Luego se procedi a purificar la enzima mediante una clarificacin, obtenindose una cantidad de 5ml de solucin enzimtica a ocupar, la cual fue inmediatamente puesta en fro para mantener la actividad enzimtica de la peroxidasa. 2.3-Medicin de la actividad enzimtica. Para determinar la actividad enzimtica de la peroxidasa de rabanito, se prepar 5 ml de una solucin A consistente en 4.7ml de agua destilada, 0.1ml de solucin de guayacol al 1% y 0.2ml de H2O2 . A su vez se prepararon tres muestras de solucin B mediante 2ml de agua destilada y 0.5ml de solucin enzimtica diludida, ocupndose un factor de dilucin de 10, 16 y 21 respectivamente. Seguidamente sobre la cubeta del espectrofotmetro se verti solucin B sobre solucin A, a razn 1:1, cubriendo completamente el volumen de la cubeta (3ml). Al tiempo que se agit rpidamente la solucin y se ley en un espectrofotmetro Para el clculo de la actividad enzimtica se us la frmula:
( )

Formula 1. Donde: M: Pendiente de la curva de progreso. VR: Volumen total de la reaccin (3ml). : Coeficiente de extincin molar. ( ) 2.5- Tratamiento de datos. Para el clculo de las pendientes del grfico Abs vs tiempo en la zona de velocidad inicial, se ocup el programa Origins pro 8, mediante el cual se trabajaron los datos usando una regresin lineal simple con un criterio de coeficiente de correlacin lo ms cercano a 0.999, partiendo del dato inicial.

3- Resultados y discusiones.
3.1- Clculo de actividad enzimtica. Para el clculo de la actividad enzimtica se hiso uso de la ecuacin 1, obtenindose los valores de las pendientes del grfico absorbancia vs tiempo segn la figura 1. Como se puede apreciar, el clculo de estas

pendientes fue efectuado en la zona lineal de aparicin del producto segn la figura 2, donde se muestra la zona de velocidad inicial para cada una de las diluciones trabajadas. El criterio usado para el clculo de las pendientes para todos los factores de dilucin, fue un anlisis de regresin lineal comparativo del avance de la absorbancia en funcin del tiempo, encontrndose para el factor de dilucin de 10 un de 0.9987 a los 0.5 minutos, tiempo al que luego la linealidad comienza a bajar. Para el caso de la dilucin a 16, se encuentra que la linealidad llega hasta el tiempo 1.5 minutos obtenindose un de 0.99861. Sin embargo para el caso de la solucin enzimtica con un factor de dilucin de 21 se encuentra que la regresin lineal no presenta un buen coeficiente de correlacin debido a que el primer dato experimental escapa de la linealidad, lo cual puede ser atribuido a un error de ndole experimental, donde posiblemente ocurri un desfase entre el valor inicial y el tiempo cero. Es por lo anterior que para obtener la zona de velocidad inicial se procedi a eliminar dicho dato, obtenindose un a tiempo 1.25 minutos de 0.9996 en comparacin con un de 0.9845 si se considerara el valor inicial. Una vez obtenidos los datos anteriores se procedi a calcular la actividad enzimtica

para cada muestra diluida, as como tambin su actividad total, haciendo uso de un volumen de reaccin de 1.5 ml, como se indica en la tabla 1. Los resultados obtenidos muestran que para un menor factor de dilucin se encontr una mayor actividad enzimtica, siendo esto esperado ya que se conoce que velocidad de reaccin en la zona lineal ser proporcional (constante cataltica) a la concentracin de enzima presente, por lo cual si se considera que entre menos diluida se encuentre una enzima mayor ser su concentracin, de forma que esta ser capaz de transformar una mayor cantidad de sustrato en para el mismo tiempo que para una solucin ms diluida que posee una menor concentracin de dicha enzima.

3.2- Variacin de concentracin de producto formado en funcin del tiempo Los resultados de la medicin de absorbancia en funcin del tiempo para cada muestra diluida fueron expresados en forma de una curva de progreso para la formacin de producto mediante el uso de la ley de Beer como se puede observar en la figura 3.

1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 Absorbancia 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 Tiempo (minutos)

X. Dilucin 10 veces Y. Dilucin 16 veces Z. Dilucin 21 veces

Figura 1. Curva de absorbancia vs tiempo para formacin de tetraguayacol.

0.6 0.5 0.4

Zona de velocidad inicial

A=0,32243T+0,03 A=0,43T+0,1395
X. dilucin 10 veces Y. dilucin 16 veces

Absorbancia 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 Tiempo 1.5 2 Z. dilucin21 veces

A=0,2516T-

Linear (X. dilucin 10 veces) Linear (Y. dilucin 16 veces)

Figura 2. Zona de clculo de pendientes.

0.00018 0.00016 0.00014 0.00012 Concentracin 0.0001 producto formado 0.00008 (M) 0.00006 0.00004 0.00002 0 0 0.250.50.75 1 1.251.51.75 2 2.252.52.75 3 3.25 Tiempo (minutos) X dilucin 10 veces Y dilucin 16 veces Z dilucin 21 veces

Figura 3. Curva de progreso para la formacin de tetraguayacol.

Tabla 1.

Factor de dilucin 10 16 21

Pendiente

0,43 0,32243 0,2516

Tiempo de clculo pendiente(min) 0,5 1,5 1,25

U(umoles/min)

U/ml

0,18378686 0,13781023 0,10753669

0,12252458 0,09187349 0,07169112

En el cual se aprecio un aumento en la formacin de producto a medida que transcurra el tiempo para cada una de las

diluciones ocupadas, sin embargo se puede observar que dependiendo del factor de dilucin enzimtico ocupado vari la concentracin de producto formado
para un mismo tiempo, de modo que las mayores concentraciones de producto formado se encontraron para la preparacin

enzimtica con una factor de dilucin de 10, seguido por uno de 16 y finalmente uno de 21. Lo claramente pone en manifiesto que la formacin de producto aumentar a medida que se tenga una mayor concentracin de enzima presente para llevar a cabo la reaccin, por lo que a menor dilucin de la enzima tendremos una mayor cantidad de producto formado en el tiempo. Sin embargo el uso de una solucin enzimtica muy poco diluida como la solucin X de la figura 3, no

sera apropiada ya que debido a su alta actividad enzimtica, experimentalmente se comprob que rpidamente se sali del rango lineal de absorbancia (180 segundos), por lo que para llevar un buen estudio de la actividad enzimtica es preferible trabajar a menores concentraciones enzimticas, siendo preferible el trabajo con una actividad total de 0.09(factor de dilucin 16) o 0.07

(factor de dilucin 21) sin embargo si el objetivo del trabajo supusiera el cuantificar la cantidad de producto formado en la zona de equilibrio, lo preferente sera trabajar con una menor actividad enzimtica, ya que para todas las dilucin antes planteadas no se encontr que se llegara a un equilibrio, siendo la ms cercana la dilucin a 21, la de cualquier modo no alcanz este punto. el grfico de velocidad inicial vs concentracin de sustrato, se debi tener , una variacin de sustrato a una concentracin de enzima constante. 4-Conclusiones Como conclusiones se puede establecer que existe una relacin inversa entre la concentracin enzimtica a utilizar y su nivel de actividad, encontrndose que a medida entre ms enzima se encuentre presente, la velocidad de formacin de producto aumentar, sin embargo para una buena medicin del avance de la reaccin es importante fijar una cantidad de enzima adecuada para no perder la linealidad del sistema.

3.3- Factores que pudiesen alterar los resultados de actividad medidos. Si bien los resultados obtenidos tanto en formacin de producto en el tiempo como de actividad enzimtica para los distintos factores de dilucin siguieron un comportamiento esperado, se considera que los valores de actividad enzimtica obtenidos fueron fuertemente influenciados por la temperatura, ya que se trabaj a baja temperatura (enfriada por hielo), por lo que es de esperarse que su actividad se vea reducida en comparacin si se trabajara a mayores temperaturas o incluso a su temperatura ptima de accin ( 40C), lo cual para este trabajo se considera beneficioso ya que si se hubiese trabajado a mayor temperatura, se tendran que haber hecho mayores diluciones para poder obtener datos de absorbancia en el rango lineal. Otro factor que pudiese haber subestimado los valores de la actividad enzimtica medida es la presencia de compuestos azufrados y cianurados, los cuales se encuentran presentes de manera natural en la estructura del rabanito y que actan como inhibidores para esta enzima. 3.4- Clculo de los parmetros cinticos El clculo de los parmetros cinticos no pudo ser llevado a cabo ya que para poder realizar

Bibliografa
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