Shewanella oneidensis

Naydu Paola Zambrano Urrutia-2100969 Presentado a: Stelia Carolina Mndez Snchez Biologa Celular Universidad Industrial de Santander

INTRODUCCIN Shewanella oneidensis es una bacteria Gram-negativa no patognica que puede crecer en medios aerbicos y anaerbicos utilizando una diversidad de aceptores de electrones (nitrito, nitrato, tiosulfato, hierro, manganeso, uranio). Esta proteobacteria fue aislada por primera vez en el lago Oneida, Nueva York en 1988, de donde deriva su nombre. Esta especie tambin se refiere a veces como Shewanella oneidensis MR-1, indicando que "la reduccin de metales", es una caracterstica especial de este organismo en particular. A continuacin, se presentan los resultados de dos investigaciones hechas con la Shewanella oneidensis as como una breve explicacin de los mtodos utilizados.

OBJETIVOS Realizar una re-copilacin de dos trabajos de investigacin diferentes donde se uso la Shewanella oneidensis como materia de estudio . Explicar el mecanismo por el cual la Shewanella oneidensis realiza la oxidacin de metales para ser utilizados como fuentes de energa. Exponer algunas de las aplicaciones tiles que se le pueden dar a la bacteria y a sus propiedades.

MARCO DE REFERENCIA 1. Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR1 and other microorganisms1 En medios anaerbicos, las bacterias reductoras de metal (DMRB) deben superar el problema fundamental del sistema celular de transporte de electrones (ETS) con metales pocamente solubles. En este artculo se provee evidencia de que la (DMRB) Shewanella oneidensis produce nanocables conductores en respuesta a una limitacin de aceptores de electrones. Para este fin se utilizaron tres tipos diferentes de clulas: las primeras, clulas de Shewanella oneidensis salvaje (MR-1), las segundas clulas mutantes de S. oneidesis a las cuales se les haba hecho una supresin in-frame de los genes mtrC y omcA (MTRC/OMCA) y una tercera clase de clulas mutantes

Ver bibliografa [1]

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con la insercin de un transposon gspD (GSPD). continuo2. Todas fueron cultivadas en un reactor de flujo

2. Rapid electron exchange between surface-exposed bacterial cytochromes and Fe(III) minerals 3 La funcin para la reduccin de metales extracelulares va transferencia de electrones es conocida como (Mtr). Mtr usa un complejo porina-citocromo en el cual una transmembrana tipo barril une uno o ms citocromos que transfieren electrones va un canal de hemos. En la S. oneidensis, est funcin es llevada a cabo por un complejo MtrCAB. MtrA es una citrocromo periplasmatico de membrana externa; MtrB se predice es una porina transmembrana de 28 hebras tipo y MtrC es un citocromo extracelular, expuesto a la superficie. A continuacin se definir la topologa del complejo, por medio de la fabricacin de un proteoliposoma adems de comprobar la capacidad cataltica del complejo y los citocromos por separado.

RESULTADOS 3. Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR1 and other microorganisms Produccin de nanocables extracelulares bajo condiciones de crecimiento con limitacin de O2: clulas de MR-1 en cultivo continuo (quimiostatos) con limitacin de aceptor de electrones (O2) y baja agitacin (50 rpm) produjeron nanocables tipo pilus con un dimetro entre 50 y 150 nm y una longitud de varias decenas de micrmetros o ms (Fig 1A). Estructuras similares fueron observadas por microscopia de fluorescencia cuando fue tenida por una protena fluorescente de unin no especfica (fig 1B). Pocas estructuras fueron obtenidas (Fig 2) en el cultivo que creci con exceso de O2 (>5% de la saturacin del aire). Muestras de clulas con los nanocables extracelulares fueron tomadas del cultivo con limitacin de O2, aplicadas a una superficie de grafito y examinadas por microscopia de efecto tnel (STM) para valorar su capacidad de conducir una corriente elctrica. Las imgenes obtenidas por STM demostraron que los nanocables tenan un ancho entre 50 y 150 nm. Esto indic las propiedades conductivas de los nanocables, ya que el ancho de un material conductor debe ser similar a la anchura de la muestra (fig 3A y B).

Para ms detalles sobre el medio de cultivo y tcnicas de separacin ver bibliografia [1], Materials and Methods, pg 6. 3 Ver bibliografa [2]

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Fig. 2. Wild-type strain MR-1 taken from an electron acceptor-limited chemostat operating at low agitation (50 rpm) with excess electron acceptor.

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Figura 3

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Produccin de nanoclables, reduccin de oxido de hierro hidratado y slice y generacin de corriente por MR-1 por clulas mutantes deficientes en MtrC, OmcA y GspD: Citocromo tipo C (MtrC) ha estado implicado en la reduccin eficiente de Fe (III) y Mn (IV) por la MR-1. Para probar la hiptesis se fabricaron clulas mutantes con supresin in-frame de ambos genes, denominadas (MTRC/OMCA). Una segunda clula mutante con un trasposn insertado en gspD, llamada GSPD fue aislada usando mutagnesis himar-RB1 de trasposn. Un anlisis por SEM (microscopia de barrido de electrones) revelo que GSPD y MTRC/OMCA producen estructuras extracelulares (Fig 4A y B) en respuesta directa a la limitacin de aceptores de electrones y que estas estructuras tienen dimensiones similares a las encontradas para los nanocables producidos por las MR-1. Sin embargo, las estructuras encontradas para GSPD tena casi dos rdenes de magnitud menos que las de MR-1 pero con la misma corriente (Fig 5).

Fig 4. SEM images of extracellular structures from GSPD (A) and MTRC/OMCA.

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Fig. 5.

4. Rapid electron exchange between surface-exposed bacterial cytochromes and Fe(III) minerals Topologa del MtrCAB en el Proteoliposoma: utilizando inmunomarcaje se demostr que el MtrC se encuentra expuesto en la superficie del proteoliposoma MtrCAB( Fig 6A). En contraste con el anticuerpo para el MtrC, el anticuerpo de MtrA dio resultados negativos. De acuerdo con resultados obtenidos por localizacin con inmunomarcaje, protelisis seguida por un anlisis de SDS/PAGE muestra que MtrC es susceptible a la digestin con Proteinasa K mientras que MtrA no (Fig 6B). Esto establece que el complejo MtrCAB insertado dentro de la bicapa lipdica, tiene una estructura donde MtrC est expuesto a la superficie del liposoma y MtrA orientado hacia el interior.

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Fig. 6.

Comparacin de la competencia cataltica para la transferencia de electrones a Fe(III) soluble e insoluble de Proteoliposomas que contienen MrtCAB o MrtAB: se comparo la diferencia en velocidad de transferencia de protones desde MV .+ encapsulada en proteoliposomas preparados con diferentes componentes del complejo MrtCAB. Los proteoliposomas MrtCAB poseen MV+2 interno que puede convertirse en MV.+ si se cultiva en condiciones anaerbicas con ditionito de sodio. Se monitore una suspensin de proteoliposomas a 606 nm luego de agregar el ditionito hasta que la absorbancia alcanz un equilibrio (10 mn despus). En contraste no se observo reduccin significativa cuando se adicion ditionito de sodio a los liposomas solos o a los liposomas con solo MtrC incorporado. Al usar proteoliposomas que solo contenan un complejo MtrAB se encontr un incremento inicial en la absorbancia que luego alcanz el equilibrio, donde solo el 16% del MV interno fue reducido. As cuando solo el complejo de MrtAB est presente, la transferencia de electrones transmembrana es menos eficiente que con el proteoliposoma MrtCAB (Fig 7A). La adicin de 1 mM de citrato de Fe (III) a una suspensin de MrtCAB reducido, desencadeno un decaimiento en la absorbancia a 606 nm debido a la re-oxidacin del MV.+ a MV+2 (Fig 7B y C). Adicin de citrato de Fe (III) a la suspensin de MrtAB tambin mostro decaimiento (Fig 7D), indicando que el citrato de Fe(III) puede ser directamente reducido por membranas con MrtCAB o MrtAB. Cuando se adiciono goethita (-FeOOH-GT) en vez de citrato, se encontr un decaimiento en la absorbancia para los proteoliposomas MrtCAB pero no en los de MrtAB (Fig 7C y D). Este experimento demostr que la MrtC es necesaria para la transferencia de protones hacia partculas insolubles de goethita.

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Fig. 7.

CONCLUSIONES 5. La S. oneidensis produce nanocables conductores de electricidad como respuesta a la limitacin de O2. En contraste con estudios previos, este estudio demuestra que los nanocables producidos por la MR1 son conductores elctricos eficientes. Se excluye la posibilidad de que la corriente haya sido creada por conduccin inica ante la posible presencia de agua o solventes inicos, ya que se midi la dependencia de la distancia del tnel de corriente a varios metros. Con mayores investigaciones colaborativas dentro de la composicin total de los nano-cables, mecanismo del flujo de electrones y la interaccin entre ellos mismo y con otros organismos nos dara una completa garanta de que ests estructuras podran utilizarse en areas como produccin de energa alternativa, captura de carbn, bioremediacin, marcaje celular y tal vez en la salud humana. 6. Se comprob la topologa del complejo MrtCAB proteoliposomico (Fig 8). En vivo, experimentos bioelectroquimicos han demostrado que se necesita un camino completo tipo Mtr para que las biocapas de la S. oneidensis puedan donar o recibir electrones. Clulas mutantes sin MtrC no eran capaces de realizar reduccin. In Vitro, las suspensiones de clulas mutantes de MR-1 (sin MtrC) pueden reducir a un 50% de la velocidad normal. Usando un sistema de proteoliposoma, se demostr que los electrones pueden ser transferidos directamente desde el complejo MtrCAB a oxido de Fe (III) en fase slida. En presencia de aceptores/donores redox solubles, hay un lmite de transferencia de electrones va MrtAB, sin embargo es necesario el complejo completo MrtCAB para la transferencia de electrones entre la membrana externa y fases minerales insolubles.

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Fig. 8.

BIBLIOGRAFIA

[1] Yuri A. Gorby, Svetlana Yanina, Jeffrey S. McLean, Kevin M. Rosso, Dianne Moyles, Alice
Dohnalkova, Terry J. Beveridge, In Seop Chang, Byung Hong Kim, Kyung Shik Kim, David E. Culley, Samantha B. Reed, Margaret F. Romine, Daad A. Saffarini, Eric A. Hill, Liang Shi, Dwayne A. Elias, David W. Kennedy, Grigoriy Pinchuk, Kazuya Watanabe, Shunichi Ishii, Bruce Logan, Kenneth H. Nealson, and Jim K. Fredrickson. (2006). Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR-1 and other microorganisms. PNAS 103(30): 1135811363. [2] Gaye F. White, Zhi Shi, Liang Shi, Zheming Wang, Alice C. Dohnalkova, Matthew J. Marshall, James K. Fredrickson, John M. Zachara, Julea N. Butta, David J. Richardson and Thomas A. Clarke. (2013). Rapid electron exchange between surface-exposed bacterial cytochromes and Fe(III) minerals. PNAS Early edition.

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[3] Bacteria power 'bio-battery' breakthrough. BBC News (online), UK, 23 de Marzo del 2013. En: technology. Disponible en: http://www.bbc.co.uk/news/technology-21925123.