Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad de Ciencias Biolgicas Departamento de Biologa Celular y Molecular

INFORME 5 BIOLOGA MOLECULAR Y CLONAMIENTO

PRCTICOS 7A, 7B, 8 Y 9A

Nombre: Nicols Acua Daniela Aros Nicols Lavandero Curso: BIO297C Profesor: Alejandra lvarez Instructor: David Chamorro

INTRODUCCIN
Las molculas de DNA que componen los genomas de los organismos vivos son demasiado largas como para ser analizadas directamente. Sin embargo pueden ser cortadas en fragmentos relativamente pequeos de un modo reproducible. Con este propsito se han aislado unas 700 endonucleasas de restriccin diferente, proveniente de varias bacterias. Las endonucleasas de restriccin (enzimas de restriccin) son enzimas que cortan el DNA en sitios definidos y/o especficos. Estas enzimas protegen a las bacterias del DNA extrao, el cual es cortado en fragmentos pequeos. Una enzima determinada reconoce una secuencia especfica de 4-8 nucletidos, llamados sitios de restriccin, por donde sta corta el DNA. El tamao de los fragmentos de DNA producidos depende de la distribucin de los sitios de restriccin. (1) La capacidad de construir molculas de DNA recombinantes y mantenerlas en las clulas se denomina clonacin del DNA. El proceso tpico es el empleo de un vector que aporta la informacin necesaria para propagar el DNA clonado hacia la clula y un inserto de DNA que se introduce dentro del vector y presenta el DNA en cuestin. Un elemento clave para crear molculas de DNA recombinantes es el uso de enzimas de restriccin que cortan el DNA en secuencias especificas y de otras enzimas que unen entre s los fragmentos de DNA seleccionado. Por medio de la creacin de molculas de DNA recombinantes que pueden propagarse a un organismo hospedador se puede purificar un inserto determinado de DNA y aislarlo del resto, adems de amplificarlo para producir grandes cantidades. (2) El proceso de clonamieto consta en general de 3 etapas: 1. DNA a insertarse y el DNA del vector deben cortarse con enzimas de restriccin apropiadas y compatibles. 2. El DNA inserto y el DNA plasmidial son ligados, luego de una etapa de purificacin. Luego viene la etapa de transformacin de bacterias competentes. 3. Seleccin y obtencin del plasmidios recombinantes para su posterior anlisis y uso. (3) La identificacin de plasmidos recombinantes es una etapa esencial para la obtencin del clon deseado. Existen numerosos mtodos para identificar un plasmidio recombinante. Una estrategia muy usada para la identificacin de colonias de bacterias que portan plasmidio recombinante, es la utilizacin de un plamidios que codifique para la enzima b-galactosidasa. Aunque este mtodo es excelente, rpido y muy eficaz, no es posible que todos los plsmidos codifiquen para esta enzima. Una alternativa para el anlisis de muchas colonias al mismo tiempo es el mtodo que se denomina cracking y consiste en la ruptura de la bacteria usando detergentes para que libere todos los cidos nucleicos. Sin mediar purificacin, se mezcla el extracto con buffer de carga y se fracciona en un gel de agarosa. Al final de la corrida se visualizarn todos los cidos nucleicos de cada colonia de bacterias. El plamidio recombinante migrar ms lento que el plasmidio parental. (3)

OBJETIVO PRINCIPAL
Aprender y aplicar la tcnica de Clonamiento de DNA plasmidial.

OBJETIVOS ESPECFICOS
Aprender y aplicar las tcnicas para cuantificar DNA por medio de espectrofotometra y para digerir DNA con enzimas de restriccin. Luego de fraccionar el DNA en un gel de agarosa y purificarlo, ligar y transformar con bacterias competentes nuestro DNA a clonar. Aplicar el mtodo cracking para identificar nuestro plsmidos recombinantes dentro e nuestras colonias de bacterias competentes.

MATERIALES Y MTODOS
Los materiales utilizados en los prcticos 7A, 7B, 8 y 9A correspondientes a Clonamiento de DNA son los siguientes: Kit comercial AXYGEN 250 l Buffer S1 (Tris-HCL y EDTA) 250 l Buffer S2 (NaOH y SDS) 350 l Buffer S3 ( isopropanol, cido actico, sulfato de amonio e hidrcloruro de guanidino) 700 l de Buffer W2 (Acetato de amonio y acetato de sodio y etanol) Tubo de microcentrifuga + Columna Placa de LB-agar 3 ml de LB con kanamicina 3 ml de LB con ampicilina Microcentrifuga Micropipeta p20, p200 y p1000 Agua ultra pura Espectrofotmetro con luz UV Cubetas de cuarzo Enzima Kpnl 10 U/ l Enzima Pstl 20 U/ l Buffer 1 NEB 10X BSA 10X Gel de agarosa al 1% con buffer TAE1x con GelRed Buffer de carga

Kit GeneJET Gel extraction (FERMENTAS) Binding Buffer Wash Buffer GeneJET Purification Columns

Kit Rapid Ligation (Roche) Buffer de dilucin 5x Buffer de ligacin 2x T4 DNA ligasa Bacterias DH5 competentes

Solucin de cracking 2x : 0,5 ml NaOH 10 N 1,0 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 5,0 ml SDS 10% 5 ml glicerol 0,025 gr Bromocresol verde SIGMA (B6771) Agua para completar 50 ml

MTODOS
PURIFICACIN DE DNA PLASMIDIALES
Recibimos nuestra colonia de bacterias transformadas inoculadas con 3 ml de LB con kanamicina (pEGFP-C3) y con 3 ml de LB con ampicilina (pCGN-Nurr1). Luego transferimos 1,5 ml de cada cultivo saturado a un tubo Eppendorf de 1,6 ml y centrifugamos durante 1 minuto a 13000 rpm en la microcentrifuga, descartamos el sobrenadante y agregamos, al pellet de cada tubo, nuevamente 1,5 ml de cultivo saturado y centrifugamos 1 minuto a 13000 rpm, descartamos el sobrenadante y dejamos el pellet de nuestros dos tubos los ms seco posible con las bacterias en el sedimento. Posteriormente resuspendimos cada pellet de bacterias con 250 l de Buffer S1 (kit AXYGEN) hasta que no quedo ningn grumo, luego agregamos 250 l de Buffer S2 (kit AXYGEN) y mezclamos el contenido invirtiendo 5 veces suavemente, luego de esto agregamos 350 l de Buffer S3 (kit AXYGEN) y mezclamos suavemente por inversin. Posterior a la aplicacin de estos tres buffer del Kit centrifugamos a 14000 rpm durante 10 minutos. Terminada la centrifugacin de cada tubo colocamos una columna dentro de un tubo de microcentrifuga de 2 ml, agregamos el sobrenadante suavemente a cada columna y centrifugamos por un minuto a mxima rpm en la microcentrifuga del laboratorio. Descartamos el eluido y lavamos cada columna con 700 l de Buffer W2 para despus centrifugar por 1 minuto, nuevamente a mxima rpm. Descartamos nuevamente el eluido y centrifugamos para eliminar el exceso de buffer, luego trasladamos cada columna a un tubo eppendorf nuevo de 1,6 ml. Para finalizar nuestra purificacin de DNA eluimos cada columna con 30 l de agua ultra pura a temperatura ambiente, dejamos reposar durante 1:30 minutos y finalmente centrifugamos a mxima rpm durante 1 minuto. El eluido obtenido contena nuestro DNA plasmidial.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACION DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRA

Luego de purificar nuestro DNA determinamos su concentracin por medio del espectrofotmetro con luz UV, para esto hicimos una dilucin 1 a 100 en volumen total de 500 l de cada preparacin de DNA con agua destilada. Luego medimos la absorbancia a 260nm y 280nm de longitud de onda de nuestra muestra blanco (agua) y determinamos nuestra concentracin de DNA de cada muestra considerando que cada 1DO corresponde a 50 g/ml de DNA de doble hebra. Digestin del DNA plasmidial con enzimas de restriccin

Luego de determinar las concentraciones de nuestras muestras de DNA plasmidial incubamos 0,2 g en las condiciones recomendadas por los proveedores usando 0,5 unidades de enzima por cada 20-25 l de volumen final de reaccin, incubamos durante una hora a una temperatura de 37C. Para ambos DNAs, pEGFP-C3 y pCGN-Nurr1, se realizaron las siguientes digestiones: DNA sin enzimas de restriccin (control) Digestin solo con Kpnl (control de corte) Digestin solo con Pstl (control de corte) Digestin con Pstl/Kpnl (preparativa)

Luego de digerir nuestras muestras de DNA con las enzimas de restriccin corrimos nuestras 8 muestra en un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1x con GelRED agregndole buffer de carga. Corrimos el gel hasta de la corrida, la expusimos a luz UV y fotografiamos el gel. Luego nuestro ayudante cort el sector de agarosa que contena pEGFP cortado con Pstl/Kpnl y lo pusimos en un tubo que fue previamente pesado. En otro tubo procedimos de igual forma con el sector de gel que tena el fragmento de DNA de Nurr-1. Luego de extraer los trozos de gel con nuestro DNA procedimos a la extraccin y su posterior purificacin con el Kit comercial JetGET (FERMENTAS); agregamos 1 volumen del Binding Buffer a 1 un peso del gel. En nuestro caso, tanto la muestra de pEGFP como de Nurr-1 pesaron 44 g, por lo tanto agregamos 44 l de Buffer por cada muestra, luego incubamos las muestras a 50 C por 10 minutos para solubilizar la agarosa, mezclando cada 2 minutos con vortex y chequeando el color que se torn amarillo. Posteriormente instalamos una columna sobre un tubo eppendorf y agregamos nuestra muestra con el buffer y centrifugamos por 1 minuto para luego descartar el eluido. Luego lavamos la columna con 700 l de Washing Buffer, centrifugamos nuevamente y descartamos el eluido para elimar los restos de agarosa contaminante. Volvimos a centrifugar para sacar el excedente de Washing Buffer e instalamos, en un tubo eppendorf nuevo, una columna y agregamos 30 l de agua pura a temperatura ambiente para dejarla reposar un minuto y medio y luego centrifugar por ltima vez. Descartamos el eluido y nos quedamos con nuestro DNA purificado.

LIGACIN DEL DNA

Para hacer la ligacin utilizamos el Kit Comercial de la empresa Roche llamado Rapid ligation Kit. Mezclamos la cantidad de DNA plasmidial equivalente a 33 g con la cantidad DNA del inserto equivalente a 100 g ms 2 l de Buffer de dilucin 5x y luego completamos los 20 l con agua, posteriormente mezclamos bien y agregamos 10 l de Buffer de ligacin 2x y 1 l T4 DNA ligasa, finalmente mezclamos bien e incubamos a temperatura ambiente por 5 minutos. Transformacin Debido a la baja concentracin de DNA de nuestras muestras los ayudantes del curso nos otorgaron colonias ya transformadas con suficientes cantidad de DNA para proceder con el Cracking.

CRACKING
Para comenzar, nos pasaron 5 colonias de bacterias ya picadas y resuspendidas en 25 l de agua , ya que la transformacin fue realizada por los ayudantes debido a que la concentracin de DNA purificada por nosotros no fue suficiente, luego agregamos a cada muestra 25 l de solucin cracking, mezclamos con vortex e

incubamos a temperatura ambiente por 5 minutos. Posteriormente cargamos 30 l de cada una de las 5 mezclas de solucin cracking ms las colonias en el gel de agarosa al 1% con cierta dificultad ya que luego de agregar la solucin de cracking la muestra tom una consistencia extraa que dificultaba su carga en el gel. Finalmente corrimos el gel.

RESULTADOS
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN POR ESPECTROFOTOMETRA
Para medir la concentracin de cada DNA, se utiliz la tcnica de espectrofotometra, los resultados se pueden observar en la Tabla 1.

Tabla 1: Absorbancias de pCGN-Nurr1 y pEGFP-C3. Se midieron las absorbancias de los dos plasmidios a 260 nm y 280 nm. La razn DO260/DO280 da una estimacin de la pureza de los cidos nucleicos, para ver si existe contaminacin de ls muestras.

Muestra de DNA pCGN-Nurr1 pEGFP-C3

Absorbancia a 260 nm (DO) 0,170 0,174

Absorbancia a 280 nm (DO) 0,160 0,167

Relacin DO260/DO280 1,06 1,04

Para determinar la concentracin se consider que 1 DO = 50 g/ml de DNA de doble hebra. El clculo realizado a modo de ejemplo para la absorbancia a 260 nm se expone a continuacin: ( )

Como la muestra estaba diluda1/100, este valor se multiplica por el factor de dilucin:

Para la preparacin de DNA EGFP, realizando el calculo con el factor de dilucin y absorbancia a 260 nm: ( )

Estos valores de concentracin se pueden observar en la Tabla 2.

Tabla 2: Valores de las concentraciones de las muestras de DNA. Con la absorbancia que se puede observar en la Tabla 1 se calcularon las concentraciones para los plasmidios pCGN-Nurr1 y pEGFP-C3.

Muestra de DNA pCGN-Nurr1 pEGFP-C3

Concentracin (g/ml) 850 870

Concentracin (g/l) 0,85 0,87

DIGESTIN CON ENZIMAS DE RESTRICCIN

Para calcular el volumen equivalente a 0,4 g de DNA y 3 g de las preparaciones controles de corte y la reaccin preparativa, respectivamente, de la Tabla 3 y la Tabla 4 se realiz el siguiente clculo: ( )

Tabla 3: Volmenes necesarios para hacer cada una de las muestras de DNA de pCGN-Nurr1. Detalle de la composicin de cada muestra de DNA preparada para pCGN-Nurr1 para completar una dilucin total de 30 l.

DNA Nurr1 Enzima KplI (10 U/l) Enzima PstI (20 U/l) Buffer 1 NEB 10X BSA 10X H2O para completar 30 l finales

Control sin enzima 4,7 l ----3 l 3 l 19,3 l

Control corte KpnI 4,7 l 0,5 l --3 l 3 l 18,8 l

Control corte PstI 4,7 l --0,5 l 3 l 3 l 18,8 l

Reaccin preparativa 3,53 l 0,5 l 0,5 l 3 l 3 l 19,47 l

Tabla 4: Volmenes necesarios para hacer cada una de las muestras de DNA de pEGFP-C3. Detalle de la composicin de cada muestra de DNA preparada para pEGFP-C3 para completar una dilucin total de 30 l.

DNA GFP Enzima KplI (10 U/l) Enzima PstI (20 U/l) Buffer 1 NEB 10X BSA 10X H2O para completar 30 l finales

Control sin enzima 4,6 l ----3 l 3 l 19,4 l

Control corte KpnI 4,6 l 0,5 l --3 l 3 l 18,9 l

Control corte PstI 4,6 l --0,5 l 3 l 3 l 18,9 l

Reaccin preparativa 3,45 l 0,5 l 0,5 l 3 l 3 l 19,55 l

Por lo tanto, estos son los volmenes que extrajimos para las muestras de controles de corte diluidas 1/100. Se calcul de igual manera para la reaccin preparativa.

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL DNA DESDE LA AGAROSA

Se cargaron las 8 muestras de DNA, ms el estndar al extremo derecho, en un gel de agarosa al 1%, lo que se evidencia en la Figura 1.

Figura 1: Resultado de la migracin de las 8 muestras de DNA ms el estndar. El orden de carga de los carriles superiores que representa pCGN-Nurr1 fue: E el cual representa el estndar que se encuentra explicado en la imagen de la derecha, 1 es Nurr1 sin ninguna enzima (se utiliza como control), 2 es Nurr1 con la enzima de corte KpnI, 2 es Nurr1 con la enzima PstI y 4 representa a Nurr1 con ambas enzimas de corte (KpnI y PstI) tambin llamada reaccin preparativa. El orden de carga de los carriles inferiores en los cuales se utiliz pEGFP-C3 fue: E que representa al estndar explicado en la imagen de la derecha, 1 que equivale a GFP sin enzimas (se utiliza de control), 2 que es GFP con la enzima de corte KpnI, 3 que es GFP con la enzima de corte PstI, y 4 que es GFP con ambas enzimas (KpnI y PstI) tambin llamada reaccin preparativa.

En el lado derecho de la Figura 1 se observa el estndar cargado en el carril E. Del gel de la Figura 1, fueron cortados los fragmentos que se necesitaban de cada digestin. Se cort el plsmido pEGFP-C3 de aproximadamente 4,7 kb con los extremos cohesivos que dejaron las enzimas utilizadas. En el caso de pCGNNurr1, se cort el fragmento que contiene el factor de transcripcin Nurr1, el cual es de aproximadamente 1 kb con los extremos cohesivos dejados por las enzimas. Utilizando los fragmentos obtenidos del gel de agarosa de la Figura 1, se procedi a purificar los fragmentos. Se pes la agarosa dentro de 2 tubos eppendorf (con Nurr1 y con GFP), donde ambos pesaban 0,984 gr, al restarle el peso del tubo slo, queda en 44 mg.

Para realizar la purificacin del DNA del gel, se debe agregar un volumen del binding buffer por cada volumen de gel, por lo que si la agarosa pesa 44 mg se deben agregar 44 l de binding buffer. El siguiente paso fue hacer la ligacin, pero de modo de favorecerla, se debe saber previamente la concentracin de DNA en cada muestra para poner al fragmento y el plasmidio en una razn de 3/1 respectivamente. Las concentraciones se encuentran en la Tabla inferior.

Tabla 5: Concentraciones de DNAs obtenidos. Se observan las concentraciones de DNA plasmidial y del fragmento obtenidos de la purificacin del gel de agarosa.

Tipo de DNA Plasmidial Fragmento

Concentracin (ng/l) 17,1 13,7

Para obtener la relacin 3/1 se tom un volumen de plasmidio correspondiente a 50 ng y de fragmento de 150 ng.

Por lo que se tomaron 2,95 l de DNA plasmidial, 10,95 l de DNA del fragmento y 2 l de buffer de dilucin, que luego se le agregan 10 l de buffer de ligacin y 1 l de T4 DNA ligasa para preparar posteriormente el cultivo. Adems se prepar un control de ligacin (sin el fragmento, se reemplaz este volumen con agua).

TRANSFORMACIN
Debido a que en nuestros cultivos de colonias en placas con Kanamicina no se observ crecimiento, se debieron utilizar bacterias transformadas de un pre-paso prctico entregadas en tubos numerados del 1 al 5. A estas colonias se les realiz un cracking, para identificar si alguna result ser transformante positiva. Los resultados del cracking se pueden observar en la Figura 2.

E C1

C2

Figura 2: Resultado de la migracin en el gel con DNA de 5 colonias seleccionadas. El orden de carga fue: E equivale al estndar (el mismo que se puede observar en la Imagen 1), C1 es el DNA equivalente a una bacteria con el plasmidio pCGN-Nurr1 el cual sirve de control, los carriles del 1 al 5 representan las 5 colonias seleccionadas y C2 es un control con el plasmidio pCGN sin el vector Nurr1 (vector vaco). Las bandas de inters son las ltimas bandas de cada carril, el resto son RNAribosomales (bandas inferiores) y DNA genmico de las colonias (bandas superiores).

De la Figura 2, observamos que en el carril 1, 3 y 4 se produjo un retraso en la migracin de la ltima banda de DNA, que se encuentra a la misma altura que la ltima banda del C1, el cual equivale a pCGN-Nurr1 como control. En el carril 2 se observa la ltima banda ms abajo, a la misma altura que C2, el cual corresponde a pCNG vaco (sin vector). En el carril 5 no se observa ninguna banda a la altura de la ltima banda de C1 ni de C2.

DISCUSIN

En el prctico 7A se obtuvo los valores de DO para 260 y 280 nm, y de este modo, la relacin entre stos. 280nm corresponde a la absorbancia de las protenas, mientras que 260nm corresponde a la mxima absorbancia del DNA. En el caso de pCGN-Nurr1, la relacin fue de 1,06. Para pEGFP-C3, fue de 1,04. Ambos valores son menores a 1,8. Esto puede significar dos cosas. Que la concentracin de DNA en las muestras es muy bajo, o que las muestras estn contaminadas con Fenol y/o protenas. Esta mala calidad de las preparaciones de DNA puede afectar los resultados posteriores. Luego, a partir de eso, se obtienen las concentraciones para cada una de las muestras de DNA. Para Nurr1, es de . Para EGFP-C3, . Respecto al prctico 8, en primer lugar hablaremos del Gel de Nurr1. Se ve en el carril 1 la banda de DNA enrrollado, que corre ms distancia respecto a los carriles 2 y 3, en los que el plasmido se encuentra cortado por una sola enzima de restriccin respectivamente. En estos caso (2 y 3) el plasmidio se encuentra de manera lineal, obtenindose un solo fragmento. Esto quiere decir que ambas enzimas de restriccin cortan en un solo sitio. Respecto al carril 4, donde se usan las 2 enzimas, se ve muy mal el resultado. Se ve una banda a la altura de los otros plasmidos lineales tratados con una sola enzima, y varias bandas debajo de sta. El fragmento de DNA Nurr1 tiene un tamao de 5,8 kb aproximadamente, y las enzimas KpnI y PstI, al cortar en un sitio de restriccin cada una, generan un trozo de 4800 pb y otro de 1000 pb aproximadamente. Lo que se observa puede deberse a que la muestra se haya contaminado con nucleasas, que hayan degradado el DNA, y de este modo se ven esa gran cantidad de bandas. Respecto al Gel de pEGFP-C3, en el carril 1 se ve una banda correspondiente al DNA enrrolado, el cual corre ms lejos que los carriles 2 y 3. En los carriles 2 y 3 se ve una banda en cada uno, indicando que estas enzimas cortaron el plsmido en una sola zona, dejando un nico fragmento lineal. En la reaccin preparativa, se observa un solo fragmento a la misma altura que los del carril 2 y 3. El plsmido pEGFP-C3 tiene un tamao de 4800 pb aproximadamente, y al cortarse por ambas enzimas KpnI y PstI se generan dos fragmentos de 20 pb y de 4780 pb. Al ser el de 20 pb muy pequeo, quizs pas del gel y no se puede ver. El fragmento de 4780 pb tiene un tamao casi igual al de 4800, por lo que es poco probable que se observen diferencias en la distancia que corren ambos fragmentos. La cantidad de DNA obtenido para ambos plasmidios, fue muy poca. Al momento de correr muestras de DNA purificado para calcular su concentracin relativa, el gel apenas se vea. De este modo, al momento de realizar la ligacin y la transformacin, no se obtuvo colonias transformantes. La ligacin se produce entre el fragmento de 4780 pb del pEGFP-C3 y el fragmento de pNurr1 de 1000 pb, por lo que el plsmido recombinante debera ser de 5780 pares de bases, aproximadamente. Debido a la falta de colonias transformantes obtenidas, los ayudantes entregaron 5 muestras problemas de colonias. A partir del mtodo de cracking, se puede determinar las colonias recombinantes. Se puede ver en la figura 2, que las colonias 1,3 y 4, tienen una banda de migracin ms arriba (quiere decir que tiene mayor

tamao). Esto implica que estas colonias poseen el plsmido recombinante. La colonia 2, no presenta el plsmido recombinante. La colonia 5, presenta una forma diferente al resto. Por lo cual no se puede determinar si es colonia transformante o no. Puede tratarse de un defecto al correr el gel. Las bandas restantes en el gel pertenecen a DNA parental y a RNAs ribosomales, ya que en el mtodo de cracking se lisan las clulas, liberando stas todo sus cidos nucleicos.

CUESTIONARIO
Parte 7A 1.- Cules son las caractersticas de un plasmidio? Un plasmidio corresponde a una molcula de DNA doble hebra, de forma circular. Es propio de bacterias, las cuales pueden tomarlos y les puede conferir genes muy importantes. Puede ser la resistencia a algn antibitico, o la enzima para degradar algn sustrato. Son de pequeo tamao, generalmente menor a 10000 pb. La estructura de los plasmidios se caracteriza por 3 partes esenciales: un origen de replicacin, un marcador de seleccin (resistencia a antibiticos, por ejemplo) y un sitio de clonamiento mltiple (donde varias enzimas de restriccin pueden cortar, permitiendo la insercin de fragmentos de DNA). 2.- Qu ventajas representa para una bacteria poseer un plasmidio? Como se dijo anteriormente, los plasmidios entregan nuevas cualidades a la bacteria que los incorpore. La ms caracterstica es la resistencia a antibiticos. Esto es gracias a que el plsmido posee un gen capaz de anular el efecto del antibitico. Un ejemplo de eso es el gen que codifica para la B-Galactosidasa, capaz de degradar los antibiticos betalactmicos. Otra posibilidad es la capacidad de adquirir rutas metablicas para utilizar sustratos como fuente de energa. Todas estas ventajas le confieren a las bacterias un valor adaptativo respecto a las que no incorporaron el plasmidio. 3.- Qu es un plasmidio recombinante y qu caractersticas debe poseer para ser una buena herramienta en biologa molecular? Un plasmidio recombinante es uno al que se le ha integrado un DNA forneo a su genoma. Para esto, es necesario haber utilizado las enzimas de restriccin correspondientes, para cortar el sitio de clonamiento mltiple, y que el fragmento de DNA forneo posea secuencias en sus extremos capaces de acoplarse al Plasmidio. 4.- Por qu en la extraccin de DNA se utilizan reactivos con pH cercanos a neutro?, Qu efectos, si es que los hay, esperara usted que tuviesen pH cidos o bsicos en el DNA?

Se utilizan reactivos con pH cercanos a pH neutro, porque el DNA a dicho pH se encuentra disuelto. Esto permite la extraccin por centrifugacin para as poder purificarlo. Si el pH fuera acido, el DNA se degradara, ya que se rompen los enlaces N-glicosdicos entre los residuos de la desoxirribosa y las bases nitrogenadas, y por lo tanto, son hidrolizadas las uniones 3-5 fosfodiester. Si fuera un pH alcalino, el DNA se mantiene estable hasta un pH alto, pero a muy alto pH, se denatura. En un principio producto de la ruptura de los puentes de hidrogeno y finalmente por la hidrlisis de los enlaces.

5.- El DNA eucarionte se encuentra en la naturaleza asociado a histonas, las cuales poseen un carcter bsico, Qu mtodos considerara usted adecuados para separar las histonas del DNA? Para separar las histonas, en primer lugar, agregara NaCl al medio, a modo de salting-out. De este modo precipitaran las histonas. Para el DNA, utilizara un solvente como el alcohol, el que permite que el DNA se desenrolle y se ubique en la interfase alcohol-agua. 6.- Considerando la relacin DO260/DO280 discuta la calidad de sus preparaciones de DNA. La relacin de las densidades pticas obtenidas revela que la relacin DO260/DO280 est debajo de 1,8. Esto indica que es una preparacin pobre en DNA. Una explicacin es la baja concentracin de DNA en la muestra, o la alta cantidad de protenas y fenol. Parte 7B 1.- Qu es un isoesquismero? Los isoesquismeros son enzimas que poseen la misma secuencia de reconocimiento, pero cortan en distintas posiciones. No se refiere a si deja extremos cohesivos con la otra enzima, sino simplemente a su secuencia de reconocimiento. 2.- Qu es el sistema de restriccin modificacin, cules son sus componentes y cul es su mecanismo de accin? Es un sistema propio de bacterias que protege el DNA propio de ataques de DNA exgenos. Este sistema destruye el DNA extrao en la clula, que generalmente es vrico. Est compuesto por dos enzimas que reconocen y actan en una secuencia especfica de DNA y realizan tareas diferentes: una enzima de restriccin, que corta o degrada efectivamente el DNA del virus que ataca a la bacteria, y otra enzima de modificacin, que identifica y metila el DNA bacteriano en los posibles sitios de corte, de forma de protegerlo ante la actividad de las enzimas de restriccin(4). 3.- Qu secuencia reconocen las enzimas utilizadas en esta experiencia prctica, desde qu organismos fueron aisladas por primera vez? Kpnl se aisl de Klebsiella Pneumoniae, y su secuencia de reconocimiento es 5 GGTACC 3 y 3CCATGG 5. Pstl se aisl de Providencia stuartii, y su secuencia de reconocimiento es 5CTGCAG3 y 3GACGTC5. 4.- Cmo est compuesto el nombre de las enzimas de restriccin? Las primeras tres letras refieren a la especie bacteriana de donde se aisl por primera vez la enzima de restriccin. La letra siguiente refiere a la cepa de dicha bacteria de la cual se aisl la enzima. El nmero romano al final identifica diferentes enzimas de la misma especie.

Parte 9 1.- De qu tamao debera ser el fragmento a obtener en el plsmidio recombinante? El plsmido pEGFP-C3 tiene un tamao de 4800 pb aproximadamente, y al cortarse por ambas enzimas KpnI y PstI se generan dos fragmentos de 20 pb y de 4780 pb. El fragmento de DNA Nurr1 tiene un tamao de 5,8 kb aproximadamente, y las enzimas KpnI y PstI, al cortar en un sitio de restriccin cada una, generan un trozo de 4800 pb y otro de 1000 pb aproximadamente. La ligacin se produce entre el fragmento de 4780 pb del pEGFPC3 y el fragmento de pNurr1 de 1000 pb, por lo que el plsmidio recombinante debera ser de 5780 pares de bases, aproximadamente.

2.- Qu otros ensayos realizara usted para determinar que el plsmido codifica para el fragmento de Nurr1 en marco de lectura con GFP? Para determinar que el plsmido codifica para el fragmento Nurr1 en marco de lectura con GFP se puede transfectar una lnea celular con el plsmido recombinante. Al observarse con microscopio de fluorescencia, si el plsmido realmente codifica para el fragmento Nurr1 en marco de lectura con GFP, veremos la seal fluorescente en una sola parte de la clula que correspondera donde se expresa la protena Nurr1. Si no se observa fluorescencia, o se detecta en toda la clula, quiere decir que no codifica en el mismo marco de lectura. 3.- Qu experimentos hara para ver si la protena recombinante se produce? Se puede realizar un ensayo por Western Blot. De este modo, se podra detectar por inmunodeteccin, la produccin de la protena en la bacteria.

CONCLUSIN
En el proceso de purificacin de DNA plasmidial, se obtuvo una muestra de ambos DNA, el cual se pudo cuantificar. Se concluye que es una tcnica muy importante en la biologa molecular actual. Pero result ser una preparacin de baja calidad, producto de su baja concentracin de DNA y/o su contaminacin con protenas o fenol. Respecto a la digestin con enzimas de restriccin, el proceso se pudo llevar a cabo correctamente. Se pudo correr ambos geles para cada plsmido, obtenindose los resultados de cortes de enzimas esperados tericamente. Al momento de realizar la ligacin y la transformacin, se presentaron problemas por la poca cantidad de DNA obtenido, lo que se tradujo en la ausencia de colonias tranformantes. De todas formas de detectaron colonias transformantes entregadas por los ayudantes, mediante el mtodo de cracking. Se concluye que es un mtodo eficaz para identificar bacterias positivas transformantes.

BIBLIOGRAFA
(1) Passarge, E., Genetica .3 edicin .Editorial Medica Panamericana. Espaa. 2007. Pginas 66-70 (2)Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick. Biologa molecular del gen. 5 Edicin. Editorial Medica Penamericana. Espaa. 2008. Pgina 697. (3) Gua de Trabajos Prcticos: Laboratorio de Bioqumica y Biologa Celular (BIO297C-1). Primer Semestre. 2013. Pgina 49 y 54. (4) Biologa molecular: antes y despus de la doble hlice. Ondarza, R. Siglo veintiuno editores, 1994. Pg. 145