Dispensa di immunologia

Riassunti del libro Abbas Immunologia

Dispensa di immunologia
6.2.1 Processamento per la presentazione MHC II 6.2.2 Processamento per la presentazione MHC I

Capitolo 1. Propriet delle risposte immunitarie, p.2

1.1 Immunit innata e adattativa, p.2 1.2 Tipologie di risposta adattativa, p.3 1.3 Elementi comuni delle risposte adattative, p.3 1.4 Componenti cellulari della risposta adattativa, p.3 1.5 Riassunto delle risposte immunitarie ai microbi, p.4 6.3 Significato della presentazione in complessi, p.29 6.4 Presentazione di antigeni lipidici delle molecole CD1, p.29

Capitolo 7. Recettori antigenici e molecole accessorie dei linfociti T, p.29

7.1 -TCR per antigeni MHC-associati, p.30
7.1.1 Ruolo del TCR nel riconoscimento dellantigene

Indice
1

Capitolo 2. Immunit innata, p.5

2.1 Caratteristiche generali, p.5
2.1.1 Recettori per PAMP

7.2 Proteine CD3 e del complesso TCR, p.31

7.2.1 Struttura 7.2.2 Funzione

2.2 Componenti dellimmunit innata , p.7

2.2.1 Barriere epiteliali 2.2.2 Fagociti e risposte infiammatorie 2.2.3 Cellule NK 2.2.4 Proteine circolanti

7.3 Recettori antigenici dei linfociti , p.31 7.4 Recettori antigenici delle cellule NK-T, p.32 7.5 Corecettori e recettori costimolanti nelle cellule T, p.32
7.5.1 CD4 e CD8: Corecettori coinvolti nellattivazione d elle cellule T MHC- ristrette 7.5.2 Recettori costimolanti ed inibitori della famiglia CD28 7.5.3 CD2 e la famiglia SLAM di recettori costimolanti 7.5.4 Altre molecole accessorie dei linfociti T

Capitolo 3. Cellule e tessuti del sistema immunitario adattativo, p.12

3.1 Cellule del sistema immunitario adattativo, p.12
3.1.1 Linfociti 3.1.2 APC

Capitolo 8. Sviluppo linfocitario, p.34

8.1 Riarrangiamento dei geni recettoriali, p.35
8.1.1 Organizzazione dei loci per le IG 8.1.2 Organizzazione dei loci per TCR 8.1.3 Ricombinazione V(D)J

3.2 Anatomia e funzioni dei tessuti linfoidi, p.14

3.2.1 Midollo osse 3.2.2 Timo 3.2.3 Linfonodi e sistema linfatico 3.2.4 Milza 3.2.5 Sistema immunitario cutaneo 3.2.6 Sistema immunitario mucosale

8.2 Sviluppo dei linfociti B, p.37 8.3 Maturazione dei linfociti T, p.39
8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.4 8.3.5 Ruolo del timo Stadi di maturazione linfocitaria Processi di selezione Linfociti T Cellule NK-T

3.3 Vie e meccanismi di homing e ricircolo linfocitario, p.16

3.3.1 Homing dal sangue ai linfonodi dei linfociti T 3.3.2 Migrazione ai siti infiammatori 3.3.3 Migrazione delle cellule della memoia 3.3.4 Homing dei linfociti B

Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T, p.41

9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 Attivazione dei linfociti CD4, p.41 Attivazione dei linfociti CD8, p.41 Molecole costimolatorie, p.41 Trasduzione del segnale, p.42 Attenuazione della risposta, p.45

Capitolo 4. Anticorpi ed antigeni, p.17

4.1 Produzione e distribuzione degli anticorpi, p.17 4.2 Struttura molecolare, p.18
4.2.1 Interazione con lantigene 4.2.2 Riconoscimento dellantigene

Capitolo 5. Complesso maggiore di istocompatibilit, p.21

5.1 Scoperta dellMHC, p.21
5.1.1 Scoperta nel topo 5.1.2 Scoperta nelluomo

Capitolo 10. Attivazione delle cellule B e produzione di anticorpi, p.45

10.1 Caratteristiche generali della risposta umorale, p.45 10.2 Riconoscimento dellantigene e attivazione antigene-indotta, p.46
10.2.1 Trasduzione del segnale 10.2.2 Ruolo dei recettori CR2/CD21 come corecettori per le cellule B 10.2.3 Risposte funzionali dei linfociti B agli antigeni

5.2 Struttura delle molecole MHC, p.22

5.2.1 Molecole MHC di classe I 5.2.2 Molecole MHC di classe II

5.3 Legame con il peptide, p.23 5.4 Organizzazione genomica ed espressione dellMHC, p.23

10.3 Risposte anticorpali helper-dipendenti ad antigeni proteici, p.48

10.3.1 Sequenza degli eventi nelle risposte anticorpali T-dipendenti 10.3.2 Attivazione degli helper 10.3.3 Presentazione dellantigene dalle cellule B e migrazione 10.3.4 Effetto aptene-carrier 10.3.5 Attivazione delle cellule B helper-dipendente 10.3.6 Reazione del centro germinativo 10.3.7 Switching dellisotipo delle catene pesanti 10.3.8 Maturazione dellaffinit 10.3.9 Differenziazione dei linfociti B in plasmacellule secernenti anticorpi 10.3.10 Generazione di cellule della memoria e risposte umorali

Capitolo 6. Processamento dellantigene e presentazione ai linfociti T, p.24

6.1 APC, p.25
6.1.1 Presentazione ai linfociti T naive 6.1.2 Presentazione ai linfociti T differenziati

6.2 Biologia del processamento antigenico, p.26

secondarie

10.4 Risposte anticorpali ad antigeni Tindipendenti, p.53 10.5 Feedback anticorpale: regolazione della risposta umorale, p.54

15.5 Immunit ai virus, p.76

15.5.1 Immunit innata ai virus 15.5.2 Immunit adattativa ai virus 15.5.3 Evasione immunitaria dei virus

15.6 Immunit ai parassiti, p.77

15.6.1 Immunit innata ai parassiti 15.6.2 Immunit adattativa ai parassiti

Capitolo 11. Tolleranza immunologica, p.54

11.1Caratteristiche generali e meccanismi della tolleranza, p.54 11.2 Tolleranza dei linfociti T, p.55
11.2.1 Tolleranza centrale nei linfociti T 11.2.2 Tolleranza periferica nei linfociti T

Capitolo 16. Immunologia dei trapianti, p.77

16.1Risposta al trapianto allogenico, p.77
16.1.1 Riconoscimento degli alloantigeni. 16.1.2 Attivazione dei linfociti alloreattivi

11.3 Tolleranza dei linfociti B, p.57

11.3.1 11.3.2 Tolleranza centrale nei linfociti B Tolleranza periferica nei linfociti B

11.4 Tolleranza indotta da antigeni proteici estranei, p.58 11.5Omeostasi del sistema immunitario: terminazione delle normali risposte immuni, p.58

16.2 Meccanismi effettori del rigetto, p.78 16.3 Prevenzione e trattamento del rigetto da allotrapianto, p.79
16.3.1 Ridurre l'immonogenicit. 16.3.2 Immunosoppressione 16.3.3 Induzione di tolleranza.

Indice
2

16.4 Trapianti, p.80

Capitolo 17. Immunit e tumori, p.80 Capitolo 12. Citochine, p.59

12.1 Recettori, p.59 12.2 Citochine che regolano l'immunit innata, p.60 12.3 Citochine che mediano la risposta adattativa, p.61 12.4 Citochine che stimolano l'ematopoiesi, p.63 17.1 Antigeni tumorali, p.81 17.2 Risposta immunitaria, p.82
17.2.1 Risposta innata 17.2.2 Risposta specifica.

17.3 Elusione delle risposte immunitarie, p.83 17.4 Immunoterapia dei tumori, p.83

Capitolo 18. Malattie causate dalle risposte immunitarie: ipersensibilit ed autoimmunit, p.84
18.1 Patologie causate da anticorpi, p.85 18.2 Patologie causate da linfociti T, p.85 18.3 Patogenesi dellautoimmunit , p.86

Capitolo 13. Meccanismi effettori dell'immunit cellulomediata, p.63

13.1 Tipi di reazioni cellulo-mediate, p.63 13.2 Linfociti CD4 effettori, p.64
13.2.1 Risposte immunitarie mediate da th1 13.2.2 Risposte immunitarie mediate dai linfociti Th2

Capitolo 19. Ipersensibilit immediata, p.87

CD8 19.1 Produzione di IgE, p.88 19.2 Legame delle IgE a mastociti e basofili, p.89 19.3 Ruolo di mastociti, basofili ed eosinofili, p.89
19.3.1 Mediatori derivati dai mastociti

13.3.Risposte mediate dai linficiti effettori:CTL, p.65 13.4 Linfociti T della memoria, p.66

Capitolo 14. Meccanismi effettori dellimmunit umorale, p.66

14.1 Caratteristiche generali dellimmunit umorale, p.66 14.2 Neutralizzazione di microbi e tossine, p.67 14.3 Opsonizzazione anticorpo-mediata e fagocitosi, p.67
14.3.1 Fagociti e recettori Fc 14.3.2 Citotossicit cellulomediata anticorpo dipendente

19.4 Reazioni dellipersensibilit immediata, p.91 19.5 Suscettibilit genetica, p.92 19.6 Patologie allergiche nelluomo , p.92

Capitolo 20. Immunodeficienze congenite ed acquisite, p.93

20.1 Immunodeficienze congenite, p.93
20.1.1 D ifetti dellimmunit innata 20.1.2 Immunodeficienze gravi combinate 20.1.3 Deficienze anticorpali: difetti nello sviluppo e nellattivazione dei linfociti B 20.1.4 Difetti nellattivazione e nella funzione dei linfociti T 20.1.5 Disordini multisistemici con immunodeficienza: atassia telangectasia

14.4 Il sistema del complemento, p.68

14.4.1 14.4.2 14.4.3 14.4.4 14.4.5 Vie di attivazione del complemento Recettori per proteine del complemento Regolazione dellattivazione del complemento Funzioni del complemento Evasione del complemento

14.5 Funzione degli anticorpi in siti anatomici specici, p.72

14.5.1 Immunit mucosale 14.5.2 Immunit neonatale

Appendice. Schema delle citochine, p.97

A.1 Risposta innata, p.97 A.2 Risposta adattativa, p.100 A.3 Citochine ematopoietiche, p.101

Capitolo 15. Immunit ai microbi, p.73

15.1 Caratteristiche generali, p.73 15.2 Immunit ai batteri extracellulari, p.73
15.2.1 15.2.2 15.2.3 15.2.4 Immunit innata ai batteri extracellulari Immunit adattativa ai batteri extracellulari Effetti dannosi delle risposte immunitarie Evasione immunitaria dei batteri extracellulari

15.3 Immunit ai batteri intracellulari, p.74

15.3.1 Immunit innata ai batteri intracellulari 15.3.2 Immunit adattativa ai batteri intracellulari 15.3.3 Evasione immunitaria dei batteri intracellulari

15.4 Immunit ai funghi, p.75

15.4.1 Immunit innata ed adattativa ai funghi

Capitolo 1. Propriet delle risposte immunitarie

1.1 Immunit innata e adattativa
Le cellule e le molecole responsabili dellimmunit costituiscono il sistema immunitario e la loro risposta collettiva e coordinata allintroduzione di sostanze estranee detta risposta immunitaria. Una definizione pi precisa di risposta immunitaria reazione a componenti microbiche cos come a macromolecole (proteine/polisaccaridi) e piccole molecole che vengono riconosciute come estranee, senza tener conto delle conseguenze fisiopatologiche di tale reazione. Limmunit innata fornisce la prima linea di difesa contro i microbi. Questi meccanismi reagiscono solamente ai microbi e rispondono essenzialmente nello stesso modo alle infezioni ripetute. I principali componenti dellimmunit innata sono: 1. Barriere fisiche e chimiche 2. Cellule fagocitiche, cio neutrofili e macrofagi, e natural killer 3. Proteine plasmatiche, tra le quali quelle del complemento 4. Citochine, che regolano e coordinano molte delle attivit delle cellule dellimmunit innata Esistono risposte immunitarie che sono stimolate invece dallesposizione ad agenti infettivi e che aumentano in grandezza ed efficacia ad ogni successiva esposizione: si tratta dellimmunit acquisita/adattativa. Limmunit acquisita in grado di riconoscere un grande numero di sostanze microbiche e non, e la capacit di riconoscimento talmente alta da giustificare il titolo di immunit specifica. I principali agenti dellimmunit acquisita sono i linfociti e i loro prodotti di secrezione, come gli anticorpi. Le sostanze estranee in grado di indurre risposte immunitarie specifiche sono dette antigeni. Evoluzione del sistema immunitario I meccanismi specializzati di difesa che costituiscono la risposta adattativa sono esclusivi dei vertebrati. Diverse cellule degli invertebrati rispondono ai microbi circondandoli e distruggendoli; queste cellule ricordano i fagociti e, a seconda della specie, sono state chiamate fagociti ameboidi, emociti, coelomociti o leucociti del sangue. Gli invertebrati non contengono linfociti antigene-specifici e non producono immunoglob- uline o proteine del complemento: contengono tuttavia molecole solubili che legano e lisano i microbi.

I fagociti in alcuni invertebrati possono secernere citochine che somigliano a quelle derivanti dai macrofagi nei vertebrati. Tutti gli organismi pluricellulari esprimono i toll-like receptor, responsabili dellavvio delle reazioni di difesa Gli invertebrati sono in grado di riconoscere trapianti di tessuto estraneo, attivit che nei vertebrati dipendente dalla risposta immunitaria adattativa. Negli invertebrati queste reazioni sono mediate da cellule di tipo fagocitico che per non sono in grado di generare una memoria per il tes- suto trapiantato. Queste evidenze indicano che anche gli invertebrati sono in grado di esprimere molecole (forse precursori del MHC) per distinguere il self dal non self. La svolta nellevoluzione immunitaria si ha con la comparsa di recettori antigenici riarrangiati somaticamente, evento che accade con i pesci pi evoluti. Buona parte dei componenti del sistema immunitario adattativo sembra essere apparsa in un tempo breve e in maniera coordinata nei ver tebrati dotati di mandibola. Dal momento della comparsa degli antigeni generati per ricombinazione genica il sistema immunitario si evoluto costantemente: si passa da un singolo tipo di anticorpo nei pesci fino agli otto dei mammiferi.

1.2

Tipologie di risposta adattativa

Immunit umorale Limmunit umorale mediata da molecole presenti nel sangue e nelle secrezioni dette anticorpi, prodotte da cellule dette linfociti B. Limmunit umorale la principale difesa contro microbi extracellulari e le loro tossine in quanto gli anticorpi secreti possono legare e assistere nellelim inazione di queste molecole tossiche. Gli anticorpi di loro sono specializzati e differenti tipi di anticorpi possono attivare diversi meccanismi. Immunit cellulo-mediata Limmunit cellulo-mediata legata ai linfociti T. Microbi intracellulari che sopravvivono e proliferano allinterno di fagociti o altre cellule sono inaccessibili per gli anticorpi: per queste infezioni la difesa legata allimmunit cellulo mediata che ne promuove la distruzione. Immunizzazione Limmunit protettiva nei confronti di un microbo pu essere indotta dalla risposta dellospite o dal trasferimento di anticorpi/linfociti specifici. Limmunit indotta dallesposizione diretta allantigene detta immunit attiva in quanto lindividuo immunizzato gioca un ruolo attivo; linoculazione di anticorpi/linfociti specifici crea invece un tipo di immunit che non prevede lesposizione dellimmunizzato allantigene: si parla di immunit passiva. Un esempio di immunit passiva naturale il trasferimento di anticorpi materni al feto. In ambito clinico limmunit ad un microbo viene sempre misurata in maniera indiretta, cercando la presenza dei prodotti dellimmunit o amministrando derivati purificati del microbo e misurando la reazione indotta.

1.3

Elementi comuni delle risposte adattative

Specificit e diversit. Le risposte sono specifiche per i diversi antigeni; le parti degli antigeni che vengono specificamente riconosciute dai singoli linfociti sono dette determinanti od epitopi. I singoli linfociti esprimono sulle loro membrane recettori che sono in grado di riconoscere le sottili differenze tra gli antigeni. Il numero totale di epitopi riconoscibili, detto repertorio linfocitario , enorme: si stima tra 107 e 109 . Memoria. Lesposizione ad un antigene migliora la capacit di risposta del sistema: le risposte alle infezioni successive sono solitamente pi rapide, ampie e spesso qualitativamente diverse dalla risposta primaria. La memoria immunologica in parte dovuta allespansione dei cloni linfocitari specifici per quellantigene e in parte alla produzione delle cellule della memoria. Espansione clonale. I linfociti proliferano molto dopo esposizione ad un antigene. Il termine espansione clonale indica che la crescita limitata alle cellule che esprimono recettori per lantigene. Specializzazione . Immunit umorale e cellulo-mediata sono stimolate da classi microbiche diverse (o diverse fasi dellinfezione). Contrazione ed omeostasi. Tutte le risposte immunitarie devono svanire nel tempo, facendo ritornare il sistema immunitario allo stato basale, cio alla sua condizione di omeostasi. La riduzione/contrazione della reazione dovuta soprattutto al fatto che le risposte innescate dagli antigeni distruggono gli antigeni stessi, eliminando dunque lo stimolo. Non reattivit al self. I linfociti non reagiscono a molecole self grazie alla propriet della tolleranza. La tolleranza viene mantenuta eliminando i linfociti autoreattivi: riduzioni di questa capacit sono alla base delle malattie autoimmuni.

1.4

Componenti cellulari della risposta adattativa

Le cellule principali del sistema immunitario sono i linfociti, le APC e le cellule effettrici. I linfociti sono cellule che riconoscono gli antigeni estranei e mediano quindi limmunit innata e quella umorale. Esistono diverse popolazioni linfocitarie che differiscono nel modo in cui riconoscono il non-self: Linfociti B. Questi linfociti sono gli unici in grado di produrre anticorpi. Riconoscono gli antigeni extracellulari e si differenziano in plasmacellule secernenti gli anticorpi: mediano dunque limmunit umorale.

 Linfociti T. Questi linfociti mediano la risposta cellulo-mediata in quanto riconoscono antigeni intracellulari e si attivano per distruggere microbi e cellule infettate. I linfociti T non producono anticorpi e hanno una specificit ristretta per gli antigeni: riconoscono solo antigeni peptidici attaccati a proteine codificate dallMHC. I linfociti T consistono di popolazioni funzionalmente distinte, tra le quali quelle codificate meglio sono le cellule T-Helper e le cellule T-Citotossiche. Le cellule T -Helper in risposta ad uninfezione secernono citochine che servono a stimolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule T stesse e lattivazione di altre cellule tra cui cellule B, macrofagi ed altri leucociti. I linfociti T citotossici agiscono uccidendo le cellule che producono antigeni non-self. Lavvio e lo sviluppo dellimmunit adattativa richiede il sequestro e la presentazione degli antigeni ai linfociti da parte delle APC. Le APC pi specializzate sono le cellule dendritiche, che catturano gli antigeni in arrivo dallambiente esterno e lo trasportano agli organi linfoidi per presentarlo ai linfociti T naive (vergini ed aspecifici) per iniziare la risposta immunitaria. Lattivazione dei linfociti da parte degli antigeni porta allattivazione di vari meccanismi. Leliminazione dellantigene richiede spesso la partecipazione di cellule dette effettrici in quanto mediatrici delleffetto finale della risposta immunitaria. Linfociti T attivati, fagociti mononucleati e altri leucociti funzionano da cellule effettrici in differenti risposte immunitarie.

1.5

Riassunto delle risposte immunitarie ai microbi

Risposta precoce dellimmunit innata Limmunit innata blocca lingresso di microbi e ne limita lespansione qualora riuscissero a passare. I principali tratti a rischio sono la cute, il tratto GI e quello respiratorio: sono tutti ricoperti di epitelio continuo che fornisce una barriera efficace. Se il microbo sfonda la barriera trova i macrofagi che esprimono sulle loro membrane recettori che legano e fagocitano il microbo o attivano altre cellule. I macrofagi attivati producono ROS e enzimi lisosomiali per distruggere il microbo, ma secernono anche citochine che promuovono il reclutamento di altri leucociti. Le citochine sono responsabili di molti aspetti delle reazioni immunitarie e sono quindi molecole messaggere. Laccumulo locale di leucociti e la loro attivazione per distruggere i microbi parte di ci che causa linfiammazione. La risposta innata ad alcuni virus consiste nella produzione di citochine antivirali dette interferoni e nellattivazione di cellule NK. I microbi che resistono a questo primo intervento possono entrare nel sangue dove vengono riconosciuti dalle proteine circolanti dellimmunit innata: tra di esse le pi importanti sono quelle facenti parte del sistema del complemento. Il complemento pu essere attivato direttamente dai microbi (via alternativa) con il risultato dello stimolo infiammatorio e della fagocitosi del patogeno, oppure pu essere attivato dagli anticorpi (via classica). Risposta adattativa La risposta adattativa ruota intorno a tre strategie:

1. Anticorpi. Gli anticorpi secreti legano i microbi extracellulari, bloccandone la capacit infettiva e promuovendone la distruzione. 2. Fagociti. I fagociti digeriscono e uccidono i microbi e le cellule T -Helper li favoriscono in questo. 3. Linfociti T -Citotossici. I linfociti T -Citotossici uccidono le cellule infette inaccessibili agli anticorpi. Limmunit adattativa produce un grande numero di linfociti durante la maturazione e, a seguito di stimolo antigenico, seleziona i pi utili per combattere il microbo: questo aumenta lefficacia del sistema. Il numero di linfociti naive per ogni antigene basso (uno per milione) e la quantit di antigene spesso anchessa limitata: esistono meccanismi specializzati nel catturare e concentrare microbi nella giusta posizione per una stimolazione ottimale. Le cellule dendritiche sono le APC che portano gli antigeni ai linfociti naive C D4+ e C D8+ e quindi fanno iniziare la risposta adattativa. Queste cellule catturano i microbi, ne digeriscono le proteine in peptidi e li esprimono sulla loro superficie in associazione a molecole MHC: si dirigono poi ai linfonodi dove stazionano. I linfociti specifici per un gran numero di antigeni esistono gi prima dellesposizione e, quando entra lantigene, questo seleziona e attiva cellule specifiche: questa la base dellipotesi della selezione

clonale. Lattivazione dei linfociti T -Naive richiede il riconoscimento del complesso antigene-MHC delle cellule dendritiche: questo passaggio garantisce specificit allimmunit e non autoreattivit. I linfociti C D4+ attivati proliferano e si differenziano i cellule effettrici le cui funzioni sono mediate dalle citochine secrete. Una delle prime azioni la secrezione di interleuchina-2 (IL-2), un fattore di crescita che agisce sui linfociti antigene-attivati e ne stimola lespansione clonale. Queste cellule effettrici lasciano lorgano linfoide dove sono state generate e migrano ai siti di infezione e infiammazione. Ai siti di infiammazione le cellule effettrici compiono vari atti: alcune secernono interferon- , un potente attivatore macrofagico. Altri CD4+ attivati secernono citochine che stimolano la produzione di IgE e attivano gli eosinofili, cio leucociti in grado di uccidere parassiti troppo grandi per essere fagocitati. I linfociti C D8+ attivati proliferano e differenziano in linfociti T -Citotossici che uccidono le cellule infette nel citoplasma. I linfociti B attivati proliferano e si differenziano in cellule che secernono diverse classi di anticorpi con diverse funzioni. La risposta dei linfociti B agli antigeni proteici richiede segnali di attivazione dai linfociti T C D4+ Helper. Parte della progenie dei cloni di cellule B si differenzia in plasmacellule che producono anticorpi; gli antigeni polisaccaridici e lipidici stimolano soprattutto la produzione di IgM, mentre quelli proteici, grazie allinterazione delle cellule helper, inducono la produzione di IgG, IgA ed IgE. La risposta umorale agisce su vari fronti. Gli anticorpi si legano ai microbi impedendo loro di infettare cellule sane. Le IgG avvolgono i microbi e li destinano alla fagocitosi, in quanto i fagociti (neutrofili e macrofili) riconoscono le code delle IgG. IgG e IgM attivano il complemento lungo la via classica, e il complemento promuove la fagocitosi e la distruzione dei microbi. Le IgG sono trasportate attivamente attraverso la placenta e proteggono i neonati fino alla maturazione del sistema. La maggior parte degli anticorpi ha emivita intorno alle tre settimane, anche se le cellule della memoria vivono per anni.

Capitolo 2. Immunit innata

Limmunit innata il meccanismo filogeneticamente pi antico di difesa dai microbi e si evoluta con essi per difendere tutti i microorganismi pluricellulari. I ruoli di questo tipo di immunit sono fondamentalmente due: 1. Iniziare le risposte ai microbi che prevengono, controllano ed eliminano le infezioni. Questo ruolo fondamentale in quanto se viene eliminata limmunit innata e mantenuta la sola adattativa lorganismo risulta comunque molto pi suscettibile alle infezioni. 2. Stimolare le risposte adattative e influenzarne meccanismi ed efficacia. Alcune componenti dellimmunit innata sono sempre funzionanti, anche prima dellinfezione: queste componenti sono le barriere fornite dalle superfici epiteliali della cute, del tratto GI e di quello respiratorio. Altre componenti sono inattive ma pronte a rispondere rapidamente ai microbi: queste includono i fagociti e il sistema del complemento.

2.1 Caratteristiche generali

Limmunit innata riconosce strutture caratteristiche dei microbi patogeni e per questo non presenti sulle cellule dei mammiferi: il numero di caratteristiche riconoscibili limitato. Le sostanze microbiche che stimolano limmunit vengono definite PAMPs, acronimo di Pathogen Associated Molecular Patterns, mentre i recettori che le legano sono definiti pattern recognition receptors. Tra i PAMPs principali si includono: Acidi nucleici esclusivamente non-self, tra cui ds-RNA o con sequenze non-self, tra cui sequenze non metilate di CpG DNA. Proteine che iniziano con N-formilmetionina LPS, acidi teicoici e oligosaccaridi ricchi in mannosio Grazie alla specificit per strutture microbiche limmunit innata non potr mai reagire contro il self; per contrasto limmunit adattativa non reagisce contro il self solamente perch i linfociti autoreattivi vengono eliminati: per questo motivo limmunit adattativa alla base delle malattie

autoimmuni mentre quella innata non presenta questo problema. Limmunit innata riconosce strutture microbiche fondamentali alla sopravvivenza del patogeno, in modo da evitare che questo possa disfarsene per evitare il controllo immunitario. I recettori per i PAMPs includono sia molecole associate alla cellula sulle membrane cellulari che proteine solubili nel sangue e nei fluidi extracellulari. In generale lattivazione di questi recettori produce una trasduzione del segnale che attiva funzioni infiammatorie e antimicrobiche oppure facilita lassorbimento del microbo allinterno delle cellule. I recettori per i PAMPs sono codificati da DNA non riarrangiato somaticamente, quindi il numero di combinazioni possibili basso: sono riconoscibili circa 1000 pattern molecolari. Limmunit adattativa, sfruttando un riarrangiamento somatico dei geni, invece in grado di riconoscere almeno 107 pattern molecolari diversi. In sostanza dunque limmunit innata riconosce classi di microbi, mentre quella adattativa riconosce antigeni diversi dei diversi microbi e perfino antigeni diversi dello stesso microbo. Limmunit innata riconosce anche le cellule host danneggiate o stressate in quanto queste esprimono molecole normalmente rare nelle cellule sane. Tra queste molecole vanno inserite le HSP (Heat Shock Protein), alcune molecole simil MHC-1 e alcuni fosfolipidi di membrana. In questo modo limmunit innata pu contribuire alleliminazione di cellule infette anche se i prodotti microbici non sono esposti in superficie. 2.1.1 Recettori per PAMP La classe pi importante, anche se non lunica, di recettori PAMPs quella dei TLRs. Toll-Like receptors Toll un gene identificato inizialmente nella Drosophila la cui proteina media risposte antimicrobiche. Esistono undici diversi TLR nelluomo, chiamati TLR1-11, e tutti con- tengono un dominio TIR (Toll/Il-1 receptor) nel lato citoplasmatico che fondamentale per la tras- duzione del segnale. Le pi importanti classi di cellule che esprimono i TLR sono i macrofagi, le cellule dendritiche, i neutrofili, le cellule delle mucose epiteliali e le cellule endoteliali. I TLR si trovano sulle membrane cellulari in genere, sia membrane plasmatiche che intracellulari: possono dunque ri- conoscere infezioni in varie posizioni. I TLR 3,7,8 e 9 si collocano sul RE e sulle membrane endosomiali dove riconoscono acidi nucleici esogeni; le tipologie di acido nucleico riconosciute non sono esclusive microbiche, ma la posizione lo : questi TLR riconoscono linfezione dunque non sulla base del prodotto ma su quella della sua collocazione cellulare. Lattivazione di un TLR in genere attiva diversi pathway di segnalazione che terminano nellattivazione di vari fattori di trascrizione. La segnalazione inizia con il legame ligando-recettore che porta alla dimerizzazione dei TLR e il reclutamento di proteine adat- tatrici contenenti un secondo dominio TIR; questo reclutamento facilita quello di varie protein kinasi che fosforilano diversi fattori di trascrizione, tra i quali i pi importanti sono: B e AP-1, che stimolano la produzione di citochine infiammatorie, chemochine e molecole di adesione endoteliale. IRF-3 e IRF-7 che stimolano lespressione dei geni dellinterferone / . Lectine tipo C Le lectine tipo C sono molecole C a++ -dipendenti che legano carboidrati e che sono espresse principalmente su macrofagi, cellule dendritiche ed altri leucociti. Queste molecole riconoscono strutture di carboidrati non presenti sulle cellule di mammifero: tra di esse quella pi nota il recettore per il mannosio. Recettori scavenger Molecole con la caratteristica comune di mediare luptake di lipoproteine ossi- date allinterno delle cellule. Recettori per N-formil-met/leu/phe Questi recettori riconoscono piccoli peptidi contenenti residui di N-formilmetionile che sono caratteristici delle proteine batteriche (ma anche delle proteine sintetiz- zate nel mitocondrio). Questi recettori sono espressi su neutrofili (FPR) e macrofagi (FPRL1): in entram- bi i casi consentono ai fagociti di riconoscere e rispondere alle proteine batteriche. Il

funzionamento di questi recettori quello di un recettore associato a proteina G: si attiva la via del fosfatidilinositolo e si promuovono riarrangiamenti del citoscheletro. NLRs Sono una famiglia di molecole citoplasmatiche che fungono da sensori intracellulari di infezione batterica. Molte NLRs riconoscono il peptidoglicano comunemente presente nelle pareti batteriche; a seguito del riconoscimento si ha il reclutamento della protein kinasi RICK che inizia la cascata che termina con lattivazione dei fattori di trascrizione B e AP-1 (gli stessi dei TLR, quindi produzione di citochine e altri mediatori). Proteine CARD Il dominio CARD (Caspase Activation and Recruitment Domain) contenuto in re- cettori citoplasmatici che legano RNA virale e che attivano cascate segnalatorie che terminano con lattivazione dei fattori di trascrizione IRF-3 e B che stimolano lespressione di interferoni antivirali di tipo I.

2.2 Componenti dellimmunit innata

Le principali cellule effettrici dellimmunit innata sono neutrofili, fagociti mononucleati e cellule NK. Alcune di queste cellule, soprattutto macrofagi e NK, secernono citochine in grado di attivare i fagociti e stimolare linfiammazione. Linfiammazione la reazione cellulare dellimmunit innata e consiste nel reclutamento di leucociti e nelluscita dai vasi di molte proteine plasmatiche verso il sito di infezione. Linfiammazione pu anche danneggiare tessuti normali. Le proteine circolanti legate allimmunit innata sono invece quelle del complemento e altre che riconoscono strutture microbiche, come le lectine leganti il mannosio. 2.2.1 Barriere epiteliali

Le tre principali sedi di contatto con lambiente esterno sono la cute, il tratto GI e quello respiratorio. Tutte e tre sono protette da un epitelio continuo: se questa continuit viene persa la suscettibilit alle infezioni aumenta. Gli epiteli, come alcuni leucociti, producono peptidi antimicrobici, soprattutto defensine e catelicidine. Defensine Le defensine sono piccoli peptidi caratterizzati da tre ponti disolfuro; esistono tre famiglie di defensine (, e ) distinte sulla base della posizione dei ponti. Grandi produttrici di defensine sono le cellule del Paneth nellintestino, questo per limitare il numero di microbi nel lume. Alcune defensine sono prodotte in modo costitutivo ma la loro secrezione pu essere stimolata da citochine o prodotti microbici. In altre cellule le defensine sono invece prodotte solo in risposta ad uno stimolo. Lazione protettiva delle defensine include sia tossicit diretta per i microbi che attivazione delle cellule coinvolte nelle risposte infiammatorie. Catelicidine Le catelicidine sono espresse dai neutrofili e dai vari epiteli. Un precursore di 18kD viene trascritto e digerito proteoliticamente in due peptidi, entrambi protettivi. Il frammento C- ter minale, detto LL-37, ha tossicit diretta per molti organismi e attiva diverse risposte leucocitarie, oltre alla capacit di legare e neutralizzare LPS. Laltro frammento potrebbe anchesso avere attivit antimicrobiche ma il suo ruolo meno chiaro. Gli epiteli delle barriere e le cavit sierose contengono certi tipi di linfociti, tra i quali i linfociti T intraepiteliali e il tipo B-1 delle cellule B che riconoscono e rispondono ai microbi comunemente incontrati. Alcune popolazioni dei linfociti T e B hanno bassa diversit perch c poca ricombinazione genica: queste riconoscono strutture comunemente espresse dalle specie microbiche, in pratica riconoscono i PAMPs. I linfociti T-intraepiteliali sono presenti nellepidermide della cute e negli epiteli delle mucose: queste cellule hanno ruolo immunitario in quanto secernono citochine, attivano i fagociti e uccidono le cellule infette. La cavit peritoneale contiene invece la popolazione B-1 dei linfociti B, i cui recettori antigenici sono immunoglobuline; molte cellule B-1 producono anticorpi specifici verso antigeni polisaccaridici e lipidici, tipo LPS. Individui normali hanno infatti anticorpi verso questi batteri, spesso presenti nellintestino, senza avere alcun segno di infezione: questi anticorpi sono detti anticorpi naturali e sono in gran parte prodotti dalle cellule B-1. Una terza popolazione di cellule presente sotto molti epiteli quella dei mastociti che rispondono alle infezioni secernendo citochine e

mediatori lipidici dellinfiammazione. 2.2.2 Fagociti e risposte infiammatorie

I fagociti, cio neutrofili e macrofagi, sono cellule il cui ruolo primario identificare, ingerire e distruggere i microbi. La loro risposta funzionale consiste in una serie di step: 1. Reclutamento al sito di infezione 2. Riconoscimento 3. Ingestione 4. Distruzione In aggiunta a questo i fagociti producono citochine che svolgono importanti ruoli nelle risposte innate ed adattative e nella riparazione dei tessuti. Neutrofili I neutrofili, detti anche leucociti polimorfonucleati, sono la popolazione pi abbondante dei globuli bianchi circolanti. Si tratta di cellule sferiche con diametro 1215m il cui nucleo si presenta segmentato in tre/cinque lobuli. Il citoplasma contiene due tipi di granuli; il tipo pi abbondante pieno di enzimi quali lisozima, collagenasi ed elastasi: questo granulo si colora molto poco e infatti i neutrofili appaiono con citoplasma chiaro. Il resto dei granuli formato da lisosomi contenenti enzimi microbicidi tra i quali defensine e catelicidine. I neutrofili vengono prodotti nel midollo osseo e originano dalla stessa linea dei fagociti mononucleati. Un uomo adulto produce pi di 1011 neutrofili al giorno, ciascuno dei quali circola nel sangue per circa sei ore. Se un neutrofilo circolante non viene reclutato entro queste sei ore va incontro ad apoptosi e viene fagocitato dai macrofagi residenti in milza e fegato. Fagociti mononucleati Queste cellule originano nel midollo osseo, circolano nel sangue e infine mat- urano e diventano attive nei vari tessuti. La prima cellula che entra nel sangue periferico dopo aver lasciato il midollo indifferenziata e prende il nome di monocita. Una volta entrati nei tessuti i monoc- iti maturano e diventano macrofagi, che assumono diverse forme dopo lattivazione da parte di stimoli esterni quali i microbi. I macrofagi attivati si possono fondere tra loro a formare cellule giganti multin- ucleate. La nomenclatura dei macrofagi varia a seconda del tessuto per indicarne la posizione: nel SNC si parla di cellule della microglia, nel fegato di cellule del Kupffer, nel polmone di macrofagi alveolari e nellosso di osteoclasti. Le cellule di tipo macrofagico sono le pi antiche filogeneticamente nel mediare limmunit innata: sono presenti ad esempio nella Drosophila e anche nelle piante. I macrofagi rispon- dono alle infezioni rapidamente quanto i neutrofili ma hanno un emivita molto pi lunga, grazie anche al fatto che a differenza di questi ultimi possono dividersi al sito infiammatorio. Per questo motivo i macrofagi sono le cellulle effettrici dominanti dopo uno o due giorni dallinfezione. Cellule dendritiche Le cellule dendritiche presentano lunghe proiezioni membranose e capacit fagocitiche e sono largamente distribuite nei tessuti linfoidi, nelle mucose e nel parenchima degli organi. Queste cellule derivano da precursori nel midollo osseo e la maggior parte legata alla linea dei fagociti mononucleati. Le cellule dendritiche esprimono recettori PAMPs e rispondono secernendo citochine. Reclutamento dei leucociti ai siti di infezione Neutrofili e monociti vengono reclutati per legame con molecole di adesione sulle cellule endoteliali e per chemotassi. Il reclutamento un processo a pi step, ciascuno dei quali orchestrato da diverse molecole.

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Rolling In risposta a microbi e citochine le cellule endoteliali delle venule postcapillari aumentano lespressione superficiale di proteine chiamate selectine. I fattori di stimolo pi importanti sono il TNF e linterleuchina1 (entrambi citochine). Due tipi di selectine sono espressi: la selectina P, che gi pronta in granuli e viene distribuita rapidamente, e la selectina E, che viene sintetizzata in risposta agli stimoli e viene resa disponibile entro un paio dore. Una terza selectina, chiamata selectina L, viene espressa sui linfociti e altri leucociti e media invece il direzionamento dei linfociti T naive verso i linfonodi. I leucociti esprimono i ligandi per le selectine sulle punte dei microvilli. Il legame selectina-ligando a bassa affinit e presenta grande rapidit di distacco grazie alla spinta del sangue: il risultato che i leucociti non si bloccano ma iniziano a rotolare sulla superficie endoteliale rallentando la loro corsa. Attivazione Le chemochine sono piccole citochine secrete dai macrofagi tissutali, dalle cellule en- doteliali e da altre tipologie cellulari in risposta a TNF e IL-1. La loro funzione principale stimo- lare la chemotassi. Le chemochine prodotte al sito di infezione vengono trasportate sulla faccia luminale delle venule postcapillari dove si accumulano in alte concentrazioni. In questa sede le chemochine legano specifici recettori espressi sulla superficie dei leucociti rotolanti. I leucociti es- primono una famiglia di molecole di adesione dette integrine che normalmente sono in uno stato di bassa affinit. Lattivazione dei recettori per le chemochine produce due effetti: laumento del- laffinit delle integrine per i loro ligandi e il loro accumulo superficiale in modo da aumentare lefficacia del legame del leucocita alla superficie endoteliale. Adesione Le citochine (TNF e IL-1) oltre allattivazione delle integrine aumentano lespressione endoteliale dei loro ligandi, in particolare VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule, il ligando dellintegrina VLA-4) e ICAM-1 (Intercellular Cell Adhesion Molecule, il ligando per le integrine LFA-1 e Mac- 1). Il risultato finale che i leucociti si attaccano saldamente allendotelio, riorganizzano il loro citoscheletro e si allontanano dalla superficie endoteliale. Trasmigrazione Le chemochine stimolano i leucociti adesi a migrare attraverso gli spazi endoteliali lungo il gradiente chimico; altre proteine, tra cui CD31, giocano un ruolo in questo passaggio. I leucociti presumibilmente producono enzimi che li aiutano nellattraversa re la barriera. Laccumulo di leucociti nei tessuti uno dei componenti fondamentali dellinfiammazione. Il processo di trasmigrazione basato sullespressione di varie moleole di adesione e varie chemochine; ad esempio la migrazione dei neutrofili si basa sul legame LFA-1/ICAM-1 e sui recettori per le chemochine CXCR1 e CXCR2, entrambi leganti CXCL8 mentre i monociti utilizzano il legame VLA-4/VCAM-1 e il recettore CCR2 legante CCL2. La progressione temporale di espressione di questi elementi garantisce che vengano prima reclutati i neutrofili (ore/giorni) e poi i monociti (giorni/settimane). Fagocitosi dei microbi La fagocitosi un processo attivo di inglobamento di grandi particelle (diametro oltre i 0.5m). Luccisione dei microbi avviene allinterno delle vescicole formate per fagocitosi, in modo da proteggere il fagocita dai processi potenzialmente dannosi. Il primo passo nella fagocitosi il riconoscimento del microbo. Neutrofili e macrofagi riconoscono

solo cellule non self perch esprimono recettori specifici per i microbi, recettori tra i quali si contano quelli per i PAMPs, le lectine tipo C e gli scavenger. Un secondo gruppo di recettori riconosce proteine dellhost che ricoprono i microbi: queste proteine sono dette opsonine e comprendono anticorpi, proteine del complemento e lectine. Il processo che porta alla copertura del microbo con opsonine detto opsonizzazione. Uno dei metodi pi efficaci di opsonizzare i microbi ricoprirli di anticorpi; queste molecole hanno da un lato una regione che lega lantigene e dallaltro una regione, detta regione Fc, che interagisce con le cellule effettrici del sistema immunitario. I fagociti esprimono recettori ad alta affinit (Fc RI) per gli anticorpi IgG: poich gli anticorpi sono prodotti della difesa adattativa, si ha qui un caso particolare in cui limmunit adattativa attiva quella innata. Quando un microbo o una particella lega un recettore sul fagocita la membrana plasmatica si redistribuisce e si estende intorno al microbo per poi chiudersi attorno ad esso formando una vescicola detta fagosoma. Il fagosoma viene portato allinterno della cellula dove si svolger luccisione del microbo da un lato e la presentazione ai linfociti T dallaltro.

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Uccisione dei microbi fagocitati La fusione del fagosoma con i lisosomi crea un fagolisosoma dove si concentrano quasi tutti i meccanismi microbicidi. I principali meccanismi sono: Produzione di enzimi proteolitici nel fagolisosoma. Tra i pi importanti nei neutrofili lelastasi, una serina proteasi. Un secondo enzima importante la catepsina G: topi KO mostrano incapacit di uccidere i batteri se mancano queste molecole. Conversione dellossigeno molecolare in ROS che distruggono i microbi. Il principale enzima coinvolto lossidasi fagocitica, un enzima indotto da molti stimoli tra cui interferone e segnali dai TLRs. Questo enzima converte lossigeno in radicali liberi con NADPH come cofattore nel processo chiamato burst respiratorio. Lossidasi agisce inoltre come pompa protonica generando un gradiente elettrochimico tra le membrane del vacuolo: questo crea il pH necessario per attivare elastasi e catepsina G. La malattia granulomatosa cronica il risultato di una deficienza ereditata di uno dei componenti del sistema dellossidasi. Oltre ai ROS vengono prodotti intermedi reattivi dellazoto, in particolare ossido nitrico (NO) grazie allazione della ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS). Nel fagolisosoma NO si combina con perossido o superossido di idrogeno per produrre molecole altamente reattive in grado di uccidere i microbi. Una forte attivazione di neutrofili e macrofagi pu danneggiare i tessuti normali dellospite per rilascio degli enzimi lisosomiali, di ROS e di NO: se questi prodotti entrano nellambiente extracellulare diventano estremamente pericolosi. Funzioni accessorie dei macrofagi attivati Oltre alluccisione fisica dei microbi i macrofagi attivati servono molte altre funzioni di difesa. In aggiunta al TNF e allIL1 gi citate i macrofagi producono IL-12 che stimola le cellule NK e le T a produrre interferone gamma. Alte concentrazioni di LPS inducono patologia sistemica caratterizzata da coagulazione disseminata, collasso vascolare e anormalit metaboliche: tutti risultati di alti livelli di citochine secrete dai macrofagi attivati. I macrofagi attivati producono infine fattori di crescita per fibroblasti e cellule endoteliali per aiutare il rimodellamento tissutale che segue le infezioni o i danni in generale. 2.2.3 Cellule NK

Le cellule NK fanno parte di una linea di cellule legata ai linfociti e riconoscono le cellule infette o stressate rispondendo con uccisione diretta o con la secrezione di citochine infiammatorie. Queste cellule costituiscono fino al 20% delle cellule mononucleate di sangue e milza e sono rare negli altri tessuti linfoidi. Oltre alluccisione diretta queste sono una grande fonte di interferone gamma che attiva i macrofagi per far uccider loro i microbi ingeriti. Le cellule NK sono derivate da precursori midollari e appaiono come grandi linfociti pieni di granuli citoplasmatici; queste cellule non sono linfociti T o B e non subiscono riarrangiamento somatico: usano recettori codificati nel DNA germinale. Attivazione Lattivazione delle cellule NK regolata dal bilancio tra i segnali in arrivo dai recettori attivanti e da quelli inibenti. In generale i segnali attivanti devono essere bloccati da quelli inibitori per evitare lattivazione della NK e lattacco a cellule normali. Molti dei recettori sulle cellule NK riconoscono

molecole MHC-1; queste molecole espongono vari peptidi tra cui quelli derivanti dai microbi per il riconoscimento da parte dei linfociti T C D8+ (le cellule NK usano per recettori di tipo diverso dai linfociti T per il riconoscimento). I recettori attivanti rilevano un vasto gruppo di molecole espresse da cellule stressate, infette o trasformate. Uno dei recettori pi studiati NKG2D che lega una famiglia di proteine simil MHC che si trovano nelle cellule infettate da virus e in quelle tumorali. Un altro tipo di recettore, CD16, lega le porzioni Fc di alcune classi di IgG e pertanto porta la cellula NK ad uccidere cellule ricoperte di anticorpi (opsonizzate). Quando la segnalazione ha inizio si attivano cascate kinasi-dipendenti che portano allavvio dellattivit citotossica verso le cellule portanti il ligando e alla produzione di citochine. I recettori inibitori si legano a molecole MHC-1 normalmente espresse nelle cellule sane. Lavvio di questi pathway porta allattivazione di fosfatasi che competono con le kinasi stimolate dalle vie attivanti: in questo modo le cellule sane sono protette dalluccisione NK-mediata. Il pi vasto gruppo di recettori inibitori quello dei KIRs (Killer cell Immunoglobulin-like Receptor) che legano appunto molecole MHC. Un secondo importante recettore CD94/NKG2A che lega una molecola MHC detta HLA-E. Lo sviluppo e le attivit delle NK sono stimolate anche da citochine, in particolare IL-15 e IL-12 prodotte dai macrofagi sono fattori di crescita per queste cellule. Citotossicit Il meccanismo di uccisione delle NK praticamente lo stesso dei linfociti T -Citotossici. Quando vengono attivate si ha esocitosi di proteine nelle vicinanze delle cellule bersaglio; una proteina, detta perforina, facilita ling resso delle altre, dette granzimi , allinterno del citoplasma della cellula. I granzimi sono enzimi in grado di iniziare lapoptosi nella cellula bersaglio. Le cellule NK possono uccidere cellule infette prima che i linfociti T -Citotossici specifici diventino completamente attivi, quindi nei primi giorni di infezione. Durante le prime fasi infettive le NK vengono stimolate dalle citochine dellimmunit innata, quali IL-12 e IL-15, inoltre linterferone da esse secreto attiva i macrofagi per la digestione dei microbi. 2.2.4 Proteine circolanti

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Sistema del complemento

Il sistema del complemento consiste in parecchie proteine plasmatiche che vengono attivate dai microbi e il cui ruolo distruggere il patogeno e generare infiammazione. Il riconoscimento avviene secondo tre vie: classica, alternativa e lectina dipendente. La via classica sfrutta una proteina, detta C1, che riconosce gli anticorpi IgM, IgG1 e IgG3 legati alla superficie di un microbo. La via alternativa, filogeneticamente pi antica ma scoperta dopo, innescata dal riconoscimento diretto delle strutture microbiche ed dunque parte dellimmunit innata. La via lectino-dipendente innescata da una proteina detta MBL (Mannose-Binding Protein) che riconosce i residui di questo zucchero: una volta avvenuto il riconoscimento si porta ad attivare una delle proteine della via classica in assenza di anticorpi grazie ad una serina proteasi associata. Il riconoscimento risulta nel reclutamento sequenziale di altre proteine in complessi di proteasi. La proteina centrale del complemento, C3, viene spezzata e il suo segmento maggiore, C3b, viene depositato sul microbo riconosciuto: questo serve da opsonina per promuovere la fagocitosi. Il segmento minore, C3a, viene rilasciato e promuove linfiammazione agendo da chemoattrattore per i neutrofili. C3b lega altre proteine del complemento per formare una proteasi che spezza la proteina C5 in C5a e C5b. C5a stimola lafflusso di neutrofili al sito di infezione mentre C5b inizia la formazione di un complesso delle proteine C6, C7, C8 e C9 che vengono assemblate in un poro di membrana che causa la lisi della cellula bersaglio.

Pentrassine Molte delle proteine che riconoscono i microbi fanno parte della famiglia delle pentrassine, allinterno della quale si include la proteina C reattiva (CRP), lamiloide P serico (SAP) e la pentrassi-na PTX3. Le concentrazioni plasmatiche di CRP sono molto basse negli individui sani ma possono aumentare di mille volte durante le infezioni: questo aumento dovuto allazione stimolante di IL-6 ed IL-1 sul fegato. In generale la sintesi delle pentrassine aumentata da queste interleuchine e si parla di reattivi di fase acuta. Sia CRP che SAP si legano a diverse specie differenti di batteri e funghi. CRP un opsonina e pu anche attivare il complemento lungo la via classica. Collectine e ficoline Le collectine sono una famiglia di proteine allinterno della quale tre riconoscono pattern molecolari nel sistema immunitario innato: si tratta di MBL, SP-A ed SP-D. MBL un opsonina che attiva il complemento lungo la via della lectina oltre che media una fagocitosi diretta. Le proteine surfactanti A e D si trovano negli alveoli del polmone e agiscono anchesse come opsonine per facilitare la fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari. Le ficoline sono proteine plasmatiche simili alle collectine ma con la differenza che non possiedono un dominio lectina tipo C (calcio dipendente).

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Capitolo 3. Cellule e tessuti del sistema immunitario adattativo

Le cellule del sistema immunitario adattativo sono normalmente presenti come cellule circolanti nel sangue e nella linfa, come aggregati negli organi linfoidi e come cellule sparse praticamente in ogni tessuto. Le caratteristiche salienti di questo sistema sono Presenza di tessuti specializzati, detti organi linfoidi periferici, che concentrano gli antigeni in ingresso. Gli antigeni vengono trasportati qui dalle APC per il riconoscimento da parte dei linfociti. I linfociti naive migrano attraverso gli organi linfoidi periferici dove riconoscono gli antigeni e iniziano le risposte immunitarie. Linfociti effettori e della memoria si sviluppano dalla progenie dei linfociti naive stimolati in questo modo. Linfociti effettori e della memoria circolano nel sangue verso i siti di ingresso antigenico dove vengono efficacemente trattenuti.

3.1

Cellule del sistema immunitario adattativo

3.1.1 Linfociti I linfociti sono le uniche cellule in grado di riconoscere e distinguere i vari determinanti antigenici e sono per questo le uniche responsabili della specificit e della memoria del sistema. A dimostrazione del ruolo linfocitario: Si pu ottenere immunit protettiva per trasferimento da individui immuni a individui suscettibili di linfociti e loro derivati. Alcune immunodeficienze, sia congenite che acquisite, sono associate a riduzione linfocitaria. La stimolazione in vitro dei linfociti produce reazioni simili a quelle in vivo. I recettori specifici per gli antigeni sono prodotti dai linfociti e da nessunaltra cellula. I linfociti consistono di diverse famiglie differenti in funzionalit e in prodotti proteici, tuttavia molto simili dal punto di vista morfologico. I linfociti B, le cellule che producono anticorpi, sono cos chiamati perch negli uccelli maturano nella borsa di Fabrizio. Nei mammiferi i primi stadi di maturazione di queste cellule si svolgono invece nel midollo osseo. I linfociti T sono cos chiamati per via dei loro precursori che originano nel midollo ma migrano e maturano nel timo. I linfociti B e T consistono poi di sottogruppi con funzioni e caratteristiche fenotipiche distinte. I maggiori gruppi dei B sono le cellule B follicolari, le cellule B marginali e le cellule B-1; per i linfociti T i maggiori sottogruppi sono i linfociti T-Helper e i linfociti T-Citotossici cui recentemente si sono aggiunti i linfociti T C D4+ regolatori. I linfociti B e T hanno recettori antigenici distribuiti in modo clonale, esistono cio molti cloni di queste cellule con diverse specificit. I geni che codificano i recettori sono formati per ricombinazione

di segmenti di DNA durante la maturazione: essendo questo un evento in parte random il numero di combinazioni generabile nellordine dei milioni. Alcuni sottogruppi, ad esempio le cellule B-1, sono limitati nelluso dei loro segmenti di DNA e quindi il loro repertorio molto limitato. Le proteine di membrana espresse dalle varie popolazioni linfocitarie possono essere usate per distinguere le varie classi. Ad esempio molti linfociti T -Helper presentano la molecola CD4 mentre molti dei T -Citotossici presenta la molecola CD8. La nomenclatura dei markers linfocitari usa il numero CD, dove CD sta per Cluster di Differenziazione. Classe Linfociti T C D4+ helper C D8+ citotox Regolatori Linfociti T Linfociti B Cellule NK Cellule NK-T Funzione Attivazione macrofagi Differenziazione linfociti B Uccisione diretta di cellule infette e tumorali Regolazione/tolleranza Helper e citotossica Produzione Ig Citotossicit diretta Regolazione Recettore/specificit TCR Complessi peptide-MHCII TCR Complessi peptide-MHCI TCR TCR Ig Rec. attivanti e inibitori TCR per lipidi-CD1 Markers C D3+ , C D4+ , C D8 C D3+ , C D4 , C D8+ C D3+ , C D4+ , C D25+ C D3+ , altri CD variabili Recettori Fc, MHCII, CD19 e 21 C D16+ C D16+ , C D3+

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Sviluppo e attivazione dei linfociti I linfociti, come ogni cellula del sangue dopo la nascita, originano da cellule staminali nel midollo osseo. Tutte le popolazioni vanno poi incontro ad una complessa maturazione durante la quale esprimono i recettori antigenici e acquisiscono le giuste caratteristiche morfofunzionali. I linfociti B maturano in parte nel midollo osseo, entrano in circolo, popolano gli organi linfoidi periferici e completano li la loro maturazione. I linfociti T maturano completamente nel timo ed entrano poi in circolo per popolare anchessi gli organi linfoidi periferici. Le cellule B e T mature sono dette linfociti naive. A seguito di attivazione antigenica, i linfociti vanno poi incontro a successive modifiche fenotipiche e funzionali. Lattivazione dei linfociti composta di una serie di step della quale il primo la sintesi di nuove proteine, tra le quali recettori per le citochine e citochine, passo richiesto per i cambiamenti successivi. Le cellule naive vanno incontro a proliferazione in un processo detto espansione clonale: il numero di cellule T specifiche pu aumentare di 5105 mentre quello di cellule B di 5103 . In associazione allespan - sione clonale si ha anche il differenziamento in cellule effettrici, la cui funzione eliminare lantigene. Alcuni linfociti stimolati si differenziano in cellule della memoria, la cui funzione invece mediare la risposta secondaria a esposizioni successive allo stesso antigene. Le caratteristiche fondamentali delle varie fasi linfocitarie sono: Linfociti naive. I linfociti naive sono linfociti T o B maturi che non hanno mai incontrato un antigene: questa condizione pu durare al massimo tre mesi prima di attivare lapoptosi. Questi linfociti sono difficili da riconoscere morfologicamente ma in generale sono abbastanza piccoli. Il loro ciclo cellulare bloccato in fase G0 e si sbloccher solo a seguito di stimolazione. La sopravvivenza dei linfociti naive dipende dallattivit dei recettori antigenici, probabilmente stimolati da auto antigeni, e dalle citochine. Probabilmente i naive riconoscono debolmente vari antigeni self in modo da garantirsi una sopravvivenza a livello basale. Le citochine sono fondamentali e i naive esprimono recettori in modo costituitivo: fondamentale in particolare IL-7 e il fattore attivante le cellule B (BAFF). Linfociti effettori. A seguito di attivazione i linfociti naive diventano pi grandi, proliferano e prendono il nome di linfoblasti . Alcune di queste cellule differenziano poi in linfociti effettori, tra i quali si inseriscono i linfociti T -Helper, i linfociti T -Citotossici e le cellule B secernenti anticorpi. Le cellule helper, solitamente C D4+ , esprimono in superficie molecole come CD40L e secernono citochine che interagiscono con macrofagi e linfociti B. Sia le cellule effettrici C D4+ che le C D8+ presentano proteine che ne indicano la recente attivazione, tra cui CD25 e molecole MHC-II. Dato importante che la maggior parte dei linfociti T effettori ha vita breve e non si rinnova. Molte delle cellule B secernenti anticorpi sono riconoscibili morfologicamente come plasmacellule: si tratta di cellule con citoplasma ricco e con un RE sviluppato. Si stima che in queste cellule met dellRNA messaggero sia dedicato agli anticorpi.

 Cellule della memoria. Le cellule della memoria possono sopravvivere per anni dopo lelimi- nazione dellantigene e possono essere identificate dalla loro espressione di proteine superficiali. I linfociti B della memoria esprimono certe classi di Ig di membrana, tipo IgG, IgE o IgA, mentre le cellule B naive esprimono solo IgM e IgD. Inoltre nelluomo la maggior parte dei linfociti T naive esprime unisoforma della proteina superficiale CD45 di 200kD mentre le cellule della memoria la esprimono di 180kD in quanto soggetta a splicing. Le cellule della memoria sono eterogenee; alcune, dette cellule T della memoria centrali, migrano preferenzialmente nei linfonodi, altre, dette cellule della memoria effettrici, circolano nel sangue o risiedono nelle mucose. 3.1.2 APC

Una APC una cellula che presenta gli antigeni ai linfociti T. Le principali APC sono le cellule dendritiche. Un tipo specializzato di APC, detto cellula dendritica follicolare, presenta gli antigeni ai linfociti B durante fasi particolari delle risposte umorali. Le APC collegano le risposte innate alle risposte adattative, e fanno parte dunque di entrambi i sistemi. Cellule dendritiche Le cellule dendritiche derivano da precursori midollari e si trovano in molti or gani, dove catturano gli antigeni estranei e li trasportano agli organi linfoidi periferici. Le cellule dendritiche presentano diversi recettori superficiali, tra i quali i TLR, che riconoscono i PAMPs e trasducono segnali di attivazione intracellulari. Una volta attivate queste cellule diventano mobili e migrano ai tessuti linfodi periferici, dove presentano lantigene ai linfociti T. Fagociti mononucleati I macrofagi contenenti microbi ne presentano gli antigeni alle cellule T differenziate effettrici, le quali attivano poi i macrofagi per uccidere i microbi stessi. Questo processo il pi importante meccanismo di immunit cellulo mediata nei confronti dei microbi intracellulari. La funzione dei fagociti mononucleati la fagocitosi e la produzione delle citochine che reclutano e attivano altre cellule nellambito della risposta innata; in ambito adattativo i macrofagi hanno ruolo nella digestione ad esempio dei patogeni opsonizzati. Cellule dendritiche follicolari Le FDC sono presenti nei follicoli linfatici di linfonodi, milza e tessuti linfoidi delle mucose e non sono derivate da precursori midollari. Le FDC intrappolano gli antigeni in complesso con gli anticorpi o i prodotti del complemento e li presentano per il riconoscimento da parte dei linfociti B.

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3.2

Anatomia e funzioni dei tessuti linfoidi

Nei mammiferi adulti i tessuti linfoidi primari, cio generativi, sono il midollo osseo e il timo; i tessuti linfoidi secondari sono invece i linfonodi, la milza, il sistema immunitario cutaneo e quello delle mucose. Aggregati poco definiti di linfociti si trovano poi nel connettivo e in quasi ogni altro organo ad eccezione del SNC. 3.2.1 Midollo osseo Il midollo osseo lunica sede di ematopoiesi nelladulto; gravi danni a questo tessuto o forte richiesta di nuove cellule ematiche causano il reclutamento di milza e fegato come sede di ematopoiesi extramidollare. Tutte le cellule ematiche originano da una comune cellula staminale ematopoietica, che si differenzia poi lungo particolari linee. Le cellule staminali mancano dei marker delle cellule differenziate, ed esprimono invece due proteine dette CD34 e Sca-1 (Stem Cell Antigen -1). La proliferazione e la maturazione dei vari precursori cellulari nel midollo sono stimolate dalle citochine. Le citochine ematopoietiche vengono prodotte dalle cellule stromali e dai macrofagi del midollo, creando cos un ambiente locale ematopoietico. 3.2.2 Timo La

Il timo la sede di maturazione delle cellule T e ha parenchima diviso in corticale e midollare.

corticale appare come una densa regione fatta di linfociti T, mentre la midollare meno densamente popolata. I linfociti nel timo, detti anche timociti, sono linfociti T a vari stadi di maturazione; in generale le cellule pi immature sono verso la corticale, e le pi pronte sono verso la midollare. 3.2.3 Linfonodi e sistema linfatico

Il fluido interstiziale riassorbito, la linfa, scorre lungo i vasi linfatici i quali drenano nei seni sottocapsulari dei linfonodi. I vasi linfatici efferenti dei vari linfonodi si congiungono poi per terminare nel dotto toracico che scarica la linfa nella vena cava superiore, riconsegnando al flusso ematico. Il volume di linfa prodotta al giorno circa due litri. Le cellule dendritiche catturano gli antigeni microbici ed entrano nei vasi linfatici (altri antigeni entrano invece in forma libera); i linfonodi agiscono da filtro e sondano la linfa: tutti gli antigeni e le citochine infiammatorie raggiungono dunque questi tessuti. Giunte nei linfonodi, le cellule dendritiche presentano gli antigeni ai linfociti T naive per iniziare le risposte immunitarie adattative. Ogni linfonodo avvolto da una capsula fibrosa perforata da parecchi vasi linfatici in arrivo, che svuotano la loro linfa nel seno sottocapsulare. Oltre il seno la corteccia esterna presenta aggregati di cellule detti follicoli, alcuni dei quali contenenti unarea centrale detta centro germinativo. I follicoli privi di centro germinale sono detti primari, quelli dotati sono detti secondari. I follicoli sono zone costituite da linfociti B; i follicoli primari contengono principalmente linfociti B naive, quindi maturi, mentre i centri germinali sono sedi di sviluppo che appaiono in seguito a stimolazione antigenica . I linfociti T sono collocati principalmente in profondit, nei cordoni paracorticali. Il 70% di questi C D4+ mentre i C D8+ sono pi rari anche se le proporzioni possono variare molto durante le infezioni. La segregazione anatomica delle diverse tipologie di linfociti dipendente da citochine. I linfociti T e B naive vengono consegnati al nodo attraverso unarteria, in particolare entrano nel tessuto attraver so vasi specializzati detti venule ad endotelio alto. I linfociti T naive esprimono il recettore CCR7 che lega le chemochine CCL19 e CCL21 prodotte nelle regioni delle cellule T. Le cellule dendritiche esprimono anchesse CCR7 e per questo migrano nella stessa regione delle cellule T. I linfociti B naive esprimono invece il recettore CXCR5 che riconosce la chemochina CXCL13, prodotta esclusivamente nei follicoli. La segregazione anatomica garantisce che ogni popolazione sia in contatto con la corretta APC: cellule dendritiche per i T, FDC per i B. A seguito di stimolazione antigenica i linfociti B e T perdono i loro confini anatomici e diventano liberi di migrare reciprocamente. 3.2.4 Milza

15

La milza, organo di 150g nelladulto, appare suddivisa in polpa bianca e polpa rossa. Le regioni ricche in linfociti dellorgano sono la polpa bianca e si presentano organizzate intorno ad unarteriola centrale. Larteria centrale circondata da un manicotto di linfociti, quasi tutti T, che forma la guaina linfoide periarteriolare. Numerosi piccoli rami dellarteriola centrale passano attraverso le guaine e drenano in un seno vascolare detto seno marginale. Oltre il seno marginale esiste una regione distinta, detta zona marginale, che forma il limite della polpa bianca ed costituita da linfociti B e macrofagi specializzati. La segregazione dei linfociti T nelle guaine e dei B nei follicoli e nelle zone marginali un processo dipendente da citochine e chemochine come nel caso dei linfonodi: CXCR5/CXCL13 per i B, CCR7/CCL19-CCL21 per i T. La milza anche un importante organo per la filtrazione del sangue. Rami arteriolari dellarteria splenica terminano in una vasta rete di sinusoidi al cui interno sono presenti molti eritrociti, macrofagi e cellule dendritiche oltre a linfociti e plasmacellule: questa la polpa rossa. La polpa rossa purifica il sangue dai microbi e dai globuli rossi danneggiati. La milza la principale sede di digestione dei microbi opsonizzati: individui che ne sono privi sono quindi particolarmente suscettibili a infezioni da preumococco e meningococco, batteri per i quali lopsonizzazione la principale via di eliminazione. 3.2.5 Sistema immunitario cutaneo

Le principali popolazioni cellulari dellepidermide sono cheratinociti, melanociti, cellule del Langer hans epidermiche e cellule T intraepiteliali. Le cellule del Langerhans sono le cellule dendritiche immature del sistema immunitario cutaneo: formano una sorta di rete continua capace di catturare antigeni. Quando queste cellule incontrano un antigene diventano mobili, iniziano ad esprimere il recettore CCR7 e seguono le chemochine fino ad arrivare ai linfonodi.

3.2.6

Sistema immunitario mucosale

Nella mucosa del tratto GI i linfociti sono reperibili in tre regioni principali: lo strato epiteliale, nella lamina propria come elementi sparsi o nella lamina propria in gruppi organizzati come le placche del Peyer. La maggior parte di quelli epiteliali di tipo T, quasi tutti C D8+ . La lamina propria intestinale contiene una popolazione mista di cellule che include linfociti T per la maggior parte C D4+ con fenotipo di cellula attiva; esiste anche un grande numero di linfociti B attivati e plasmacellule, ma anche macrofagi, cellule dendritiche, eosinofili e mastociti. In aggiunta ai linfociti sparsi esistono queste regioni organizzate tra le quali le pi importanti sono le placche del Peyer. Le regioni centrali di questi follicoli sono ricche in cellule B e spesso contengono centri germinali; le placche del Peyer presentano inoltre alcune cellule T C D4+ . Follicoli simili alle placche sono frequenti nellappendice e in buona parte dei tratti GI e respiratori. Le tonsille faringee sono infine follicoli linfoidi analoghi alle placche.

16 3.3 Vie e meccanismi di homing e ricircolo linfocitario

I linfociti naive si muovono dalla circolazione ai linfonodi e viceversa per parecchie volte, finch non incontrano lantigene che sono in grado di riconoscere. Questo ricircolo linfocitario permette al piccolo numero di linfociti naive di cercare il loro specifico antigene attraverso il corpo. Alcuni linfociti attivati migreranno poi verso particolari tessuti, come ad esempio la pelle o lintestino: questo processo di migrazione selettiva detto homing. I meccanismi di migrazione linfocitaria sono simili a quelli di migrazione degli altri leucociti ai siti infiammatori. Le molecole di adesione espresse sui linfociti sono spesso dette recettori homing e i loro ligandi espressi dalle cellule endoteliali sono detti adressine. Le chemochine coinvolte nel traffico linfocitario sono prodotte in maniera costituiva dagli organi linfatici secondari e in maniera inducibile ai siti di infezione. Il meccanismo di homing estremamente efficente, e il flusso netto di linfociti attraverso i linfonodi pari a 25 109 unit giornaliere. Uninfiammazione periferica in grado di generare un significativo calo nellafflusso linfocitario ai linfonodi e un contemporaneo aumento di quello ai siti infiammatori: questo meccanismo transiente coinvolge gli interferoni alfa e beta. 3.3.1 Homing dal sangue ai linfonodi dei linfociti T

I linfociti T naive migrano nello stroma dei linfonodi attraverso venule postcapillari modificate dette ad endotelio alto, le quali esprimono molecole di adesione e chemochine particolari. La sequenza di eventi sempre la stessa per qualsiasi passaggio, in particolare: 1. Il rolling in questo caso mediato dalla selectina-L che lega una adressina (PNAd, Peripheral Node Addressin) sulendotelio delle venule ad endotelio alto. 2. Ladesione stabile mediata dalle integrine LFA-1 e VLA-4. 3. Laffinit delle integrine aumentata dalle chemochine CCL19 e CCL21, delle quali in particolare la prima costitutivamente espressa dalle venule ad endotelio alto. Per entrambe queste molecole il recettore CCR7. Le cellule naive andate incontro ad homing ma che non hanno incontrato lantigene ritornano al flusso sanguigno in un processo dipendente da un chemoattrattore detto sfingosina 1-fosfato (S1P); questa molecola concentrata nel sangue e nei linfonodi rispetto ai tessuti. S1P lega un recettore (S1P1) accoppiato a proteina G specifico e i segnali che si generano stimolano il movimento delle cellule T naive lungo il gradiente S1P, quindi al di fuori del parenchima nodale. I linfociti T naive circolanti esprimono poco il recettore per S1P in quanto essendo la molecola concentrata nel sangue si ha internalizzazione del recettore. Quando un naive entra nel linfonodo servono poi ore per ripristinare il recettore e quindi si ha tempo di interagire con le APC. A seguito dellattivazione il linfocita riduce lespressione di S1P1 e rimane nel linfonodo per alcuni giorni, il tempo di differenziarsi; a differenziazione avvenuta S1P1 torna ad essere espresso e la cellula lascia il linfonodo in direzione dei tessuti periferici. La migrazione delle cellule T naive nella milza meno regolata, e il trasferimento guidato da fattori passivi piuttosto che dal coinvolgimento di selectine, integrine o chemochine. Pur essendo una migrazione meno efficiente, il numero di linfociti di passaggio per la milza enorme: almeno met del

totale attraversa lorgano ogni giorno. 3.3.2 Migrazione ai siti infiammatori Un aspetto fondamentale della differenziazione dei naive in effettori il cambiamento dei recettori per le chemochine e delle molecole di adesione: questo ne cambia il comportamento migratorio. Lespressione delle molecole coinvolte nellhoming delle cellule naive cala subito dopo lattivazione antigenica: le cellule effettrici in questo modo non sono pi costrette a stare nel linfonodo. Luscita dal nodo guidata anche dalla via di S1P e del suo recettore S1P1. Le cellule effettrici esprimono molecole di adesione e recettori per chemochine che legano molecole tipicamente presenti sulle cellule endoteliali ai siti infiammatori. Alcune cellule effettrici hanno propensione per tessuti particolari, e la selettivit acquisita nel processo di differenziazione. In questo modo il sistema adattativo dirige cellule specializzate alle loro sedi preferenziali in modo da gestire infezioni di tipo particolare. Ad esempio le cellule effettrici della pelle esprimono il ligando CLA-1 per la selectina E, e i recettori CCR4 e CCR10 per le chemochine CCL17 e CCL27, tutte molecole tipiche della cute infiammata. 3.3.3 Migrazione delle cellule della memoria

17

Sono state definite due tipologie di cellule della memoria: centrali ed effettrici. Le cellule centrali tipicamente migrano agli organi linfoidi secondari mentre le effettrici ai tessuti periferici. In generale le cellule dirette ai tessuti periferici rispondono a stimolazione antigenica con una rapida produzione di citochine mentre quelle dirette ai tessuti linfoidi secondari tendono a proliferare di pi e a fornire funzioni di supporto alle cellule B.

3.3.4

Homing dei linfociti B

I linfociti B immaturi abbandonano il midollo e entrano nella milza dove maturano come cellule B follicolari o cellule B marginali. Quando le cellule B follicolari maturano queste migrano nella polpa bianca in risposta ad una chemochina, CXCL13, che lega il recettore CXCR5 e alle chemochine CCL19 e CCL21 che legano il recettore CCR7. Quando la maturazione completa nella polpa bianca i linfociti B naive rientrano in circolo e si dirigono ai linfonodi. Lhoming dei B naive ai linfonodi coinvolge molecole gi viste: la selectina-L, CCR7, LFA1 (che lega PNAd), CCL19, CCL21 e ICAM-1. In aggiunta i naive esprimono il recettore CXCR4 che lega la chemochina CXCL12. Una volta entrati nello stroma degli organi linfoidi secondari i linfociti B migrano nei follicoli grazie alla chemochina CXCL13 (ma nel caso delle placche del Peyer la molecola CXCR5).

Capitolo 4. Anticorpi ed antigeni

Gli anticorpi sono proteine circolanti prodotte nei vertebrati in risposta allesposizione a strutture estranee. Queste molecole possono esistere in due forme: legate alla membrana dei linfociti B con funzione di recettori secrete in circolo dove agiscono neutralizzando tossine e prevenendo ling resso di agenti patogeni Assieme al complesso maggiore di istocompatibilit e ai recettori per lantigene dei linfociti T, costituiscono le tre classi di molecole coinvolte nel riconoscimento dellantigene. Le funzioni effettrici anticorpo mediate mirano alleliminazione dellantigene mediante processi diversi tra i quali lopsonizzazione, la citotossicit diretta, lattivazione del complemento e lipersensibilit immediata che attiva i mastociti.

4.1

Produzione e distribuzione degli anticorpi

Le uniche cellule in grado di produrre gli anticorpi sono i linfociti B in seguito ad esposizione con lantigene. Le prime fasi avvengono principalmente negli organi linfoidi, soprattutto milza e tessuti linfoidi associati a mucose, anche se plasmacellule di lunga durata si ritrovano nel midollo osseo. Una volta attivati i linfociti B diventano plasmacellule in grado di secernere anticorpi e tali cellule riescono

a persistere per lungo tempo. Un uomo adulto produce ogni giorno circa 2-3 g di anticorpi che tuttavia hanno una emivita molto breve, pari a circa tre settimane. Almeno i due terzi di questi anticorpi fanno parte della classe delle IgA. Gli anticorpi una volta prodotti spesso si attaccano a cellule effettrici del sistema immunitario quali cellule NK, fagociti mononucleati e mastociti.

4.2

Struttura molecolare

Prima di passare alla struttura vera e propria opportuno fare una parentesi sugli anticorpi monoclonali: questi sono stati essenziali per comprendere la struttura di tutti gli anticorpi. Visto che ogni linfocita B produce anticorpi con ununica specificit, e purtroppo questi hanno emivita molto breve, per studiare la struttura degli anticorpi sono stati creati linfociti B immortali detti ibridomi . Queste cellule sono state ottenute mediante fusione di linfociti B con cellule di mieloma multiplo, tumore monoclonale delle plasmacellule. Gli anticorpi prodotti da tali cellule sono detti anticorpi monoclonali. Per osservare la struttura di un anticorpo di uno specifico antigene, si immunizza un ratto con tale antigene e se ne isolano i linfociti B prodotti, utilizzati poi per la creazione dell ibridoma. Ogni ibridoma dar poi origine a progenie di ibridomi specifici per tali antigene. Per confermarne la specificit si effettuano saggi immunologici con lantigene in questione. Questa scoperta degli ibridomi stata utilizzata in molte applicazioni e tra le pi comuni ricordiamo: classificazione dei linfociti in base al fenotipo espresso mediante legame con anticorpi specifici. immunodiagnosi di molte malattie sistemiche mediante riconoscimento in circolo di determinati antigeni diagnosi di tumori terapia ad esempio di artriti reumatoide o tumore alla mammella evidenziare presenza di citochine mediante valutazione se lanticorpo stimola o inibisce una determinata cellula. Essendo gli anticorpi monoclonali proteine estranee al nostro organismo, questi creavano un certo grado di resistenza. Sono stati creati i cosiddetti anticorpi umanizzati mediante inserimento genetico del segmento che codifica per i siti di legami specifici dell antigene allinterno del segmento di DNA che codifica limpalcatura dellanticorpo. Lanticorpo ha cosi sembianze umane ma sito di legame specifico. Le immunoglobuline appartengono alla famiglia delle gammaglobuline (gamma per la velocita elettroforetica e globuline per la solubilit). Tutti gli anticorpi condividono la stessa struttura di base e differiscono solo nel sito di legame antigenico in cui vi elevatissima variabilit. Una molecola anticorpale ha una struttura simmetrica composta da due catene leggere e due pesanti. Queste catene sono costituite dai cosiddetti domini Ig costituiti da una serie di circa 110 amminoacidi disposti a sandwich. Ogni dominio costituito da due foglietti costituiti da 5 nastri polipeptidici uniti da eliche e ponti di solfuro. Molte proteine nel nostro organismo che mediano processi di riconoscimento sfruttano i domini Ig e tali proteine vengono classificate come appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline.

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Sia le catene pesanti che quelle leggere posseggono una regione variabile V amino terminale e una regione costante C carbossiterminale. Nelle catene pesanti la regione V composta da un dominio Ig e la regione C da tre domini Ig. Nelle catene leggere sia la V che la C da un dominio Ig. Le estremita C delle catene pesanti sono legate covalentemente tra di loro nella regione CH2 tra due cisteine vicino alla regione hinge o cerniera. Queste regioni C sono quelle che tengono ancorate le Ig ai linfociti B e sono le responsabili della maggior parte delle interazioni con le cellule effettrici. Le interazioni con le cellule effettrici (es linfociti citotossici) sono ristrette a queste regioni che non hanno niente a che fare con il riconoscimento dellantigene, evento legato alle regioni V. Le regioni C delle catene leggere sono legate alle regioni C delle catene pesanti ma non interagiscono n allancoraggio n alle interazioni con altre cellule. Se si tratta un Ig con la papaina questa viene tagliata a livello della cerniera e si formano tre pezzi separati: due pezzi identici detti Fab sono costituiti ciascuno da una catena leggera legata a una catena pesante; tali segmenti hanno mantenuto la capacit di legare lantig ene. Il terzo pezzo detto Fc costuito da due segmenti identici di catena pesante Ch2 e Ch3 legati da ponti di solfuro; tale segmento non ha capacita di legare antigeni. Regioni variabili V Ogni anticorpo ha due catene leggere e due pesanti che vanno a delimitare due siti di legame per due antigeni. La maggior parte delle differenze tra due anticorpi risiede in tre piccoli segmenti delle due regioni variabili: questi tre segmenti detti regioni ipervariabili sono situati nelle anse che connettono i foglietti adiacenti nel dominio Ig e hanno una lunghezza di circa 10 amminoacidi. Le tre regioni ipervariabili dette CDR1, CDR2, CDR3, della catena pesante si associano a quelle della catena leggera per formare quella struttura tridimensionale che costituisce il sito di legame per lantigene. Le sequenza adiacenti a tali regioni sono altamente conservate e mantengono la forma dei domini Ig pressoch identica nei diversi anticorpi. Regioni costanti C Gli anticorpi sono divisi in classi e sottoclassi in base alle differenze nella struttura presenti nelle regioni costanti delle catene pesanti. Le diverse classi anticorporali, dette isotipi, sono IgA, IgE, IgM, IgG e IgD. IgA e IgG sono ulteriormente divise in IgA 1 e 2 e IgG 1, 2, 3 e 4. Le catene pesanti di uno stessi isotipo hanno la medesima sequenza amminoacidica e tali catene vengono nominate con la lettere greca corrispondente al loro isotipo (, , , , ). Isotipi diversi svolgono funzioni diverse, infatti abbiamo visto essere le regioni C delle catene pesanti a determinare il tipo di interazione e quindi di risposta delle cellule effettrici. Gli anticorpi sono capaci nonostante la loro forma a Y di legare antigeni situati a 180 gradi tra loro grazie alla loro flessibilit dovuta a due fattori: capacit dei domini Vh (v delle catene pesanti) di ruotare attorno al corrispondente dominio Ch flessibilit della regione cerniera tra Ch1 e Ch2 Esistono due tipi di catene leggere, una e una . Ciascun anticorpo omogeneo per le due catene, ovvero non contiene mai una catena e una ma sempre due catene dello stesso tipo. Nelluomo il 60% delle Ig formato da catene . In pazienti con tumori delle cellule B ovviamente questo rapporto varia e dunque si usa questo dato per valutare la presenza di eventuali neoplasie. Abbiamo detto che le catene pesanti sono costituite da tre domini Ig, e che gli anticorpi esistono in forma secreta o in forma di membrana; la sequenza amminoacidica C terminale dellultimo dominio Ig delle catene pesanti quella che determina se un anticorpo sar di secrezione o di membrana. La porzione carbossiterminale idrofila, negli anticorpi di membrana in aggiunta vi una regione transmembrana idrofobica seguita da una regione intracellulare carica positvamente che la ancora alla membrana. Le IgG e IgE secrete sono semplici monomeri ovvero due catene leggere e due pesanti. Le IgD non esistono in forma secreta, mentre le IgA sono spesso dimeri (4e4)e IgM sono o pentameri o esameri dotate di un peptide addizionale detto catena j deputato a stabilizzare il complesso. 4.2.1 Interazione con lantigene

19

Un antigene una qualsiasi molecola che possa legarsi a un anticorpo o a un linfocita T. Gli anticorpi possono legarsi praticamente a qualsiasi tipo di molecola mentre i linfociti principalmente a peptidi, tuttavia solo determinati antigeni riescono ad attivare i linfociti e questi sono definiti immunogeni . Ad esempio perch si attivi un linfocita B serve che sia una macromolecola, composti di piccole dimensioni possono si legarvisi ma non attivarlo; neccessario che questi piccoli antigeni definiti apteni siano

accompagnati da una macromolecola definita carrier. Il complesso aptene-carrier molto piu grande della regione di legame dellanticorpo di conseguenza lanticorpo si lega solo a una regione definita determinante o epitopo. Se un antigene presenta piu determinanti identici contemporaneamente detto polivalente. Se i determinanti sono ben separati pi anticorpi identici potranno legarsi allo stesso antigene senza influenzarsi, se gli epitopi sono molto vicini ecco che compare un grado di interferenza. I determinanti costituiti dalla semplice sequenza amminoacidica sono detto determinanti lineari, quelli invece costituiti da una struttura tridimensionale sono detti determinanti conformazionali e sono dovuti alla disposizione spaziale e non lineare degli amminoacidi. Modificazioni quali glicosilazione ecc possono, alterando la struttura proteica, creare nuovi epitopi detti determinanti neo-antigenici. Il riconoscimento dellantigene da parte dellaticorpo costituito da legami non covalenti reversibili quali forze di van der Waals e interazioni idrofobiche. La forza di tale legame tra Ig e il suo antigene detta affinit ed espressa da una costante di dissociazione Kd: minore la K e maggiore la affinit. Un siero umano contiene una miscela di anticorpi per lo stesso antigene con affinit differenti. Antigeni polivalenti posseggono piu siti di legame e la forza di legame sar differente da quella di un singolo legame: tale forza complessiva detta avidit. In questo modo un Ig con bassa affinit pu comunque avere una grande avidit. Un antigene polivalente si associa con gli anticor pi e, a una determinata concentrazione detta zona di equivalenza, vanno a formare una rete detta immunocomplesso. Aumentando le concentrazioni di antigene o anticorpo tali immunocomplessi si rompono in complessi pi piccoli a causa della competitivit.

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4.2.2

Riconoscimento dellantigene

Gli anticorpi riconoscono una ampia variet di antigeni e la loro efficienza possibile grazie alle propriet delle loro regioni V: Specificit: Gli anticorpi sono estremamente specifici essendo in grado di distinguere minime differenze nella struttura chimica degli Ag, addirittura la variazione di un singolo residuo amminoacidico. Tuttavia alcuni possono legarsi anche a un Ag normalmente non correlati a causa della cosiddetta cross-reattivit, tale fenomeno pu essere la cause dellinsorgenza di malattie immunitarie. Diversificazione: Un individuo in grado di generare un numero enorme di anticorpi differenti e linsieme complessivo dei diversi isotipi detto repertorio anticorpale. Maturazione dellaffinit: In seguito a stimolazione dallantigene i linfociti B sono in grado di produrre anticorpi con maggiore affinit di quelli che erano gi in circolo per lo stesso antigene. Abbiamo detto che la porzione Fc a determinare la funzione effettrice. Tuttavia si visto che i sistemi effettori sono attivati dalla porzione Fc solo se lanticorpo contemporaneamente legato nella porzione Fab, inoltre per attivare i recettori Fc (FcR) delle cellule effettrici servono almeno due molecole anticorporali legate a ponteper ciascuna cellula. Nelle cellule B sono normalmente espressi le IgM e IgD, queste una volta legato lantigene possono andare incontro a una modificazione della Fc detta switching isotopico che fa variare la regione C ma non la V, quindi varia leffetto ma non il ligando.

Capitolo 5. Complesso maggiore di istocompatibilit

Il sistema umorale combatte gli antigeni extracellulari in due modi: ne blocca lazione e ne promuove leliminazione. Nel caso di antigeni extracellulari abbiamo visto che il testimone passa ai linfociti T che tuttavia necessitano di recettori esposti sulle cellule bersaglio che presentino lantigene ai propri recettori.Questa funzione svolta dal complesso maggiore di istocompatibilit (MHC). Vi sono due principali prodotti genici dellMHC :le molecole MHC di classe I che presentano gli Ag ai linfociti citotossici e le molecole di classe 2 che li presentano ai linfociti helper.

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5.1 Scoperta dellMHC

5.1.1 Scoperta nel topo Alcuni geni sono rappresentati da una unica sequenza di DNA identica in tutta la popolazione e tali sono geni non-polimorfici e in genere sono presenti in modo omozigote su entrambi i cromosomi; altri geni esistono in forme alternative, ciascuna variante detta allele, e vengono chiamati geni polimorfici. Individui detti imbred sono omozigoti di ogni locus genico e in ogni ceppo di tali individui ogni topo geneticamente identico a un ogni altro: questi organismi si ottengono tramite ripetuti incroci tra individui consanguinei. Trapianti cutanei all interno di un stesso ceppo imbred venivano accettati, mentre tra ceppi venivano rifiutati. I geni responsabili di tale rigetto sono detti geni di istocompatibilit; mediante trapianti tra ceppi che differivano un un solo locus stato possibile identificare quello responsabile del rigetto ed stato chiamato locus maggiore di istocompatibilit: esso era legato a un gene sul cromosoma 17 che codificava lantigene 2 quindi venne chiamato H2. Successivamente si visto che tale regione conteneva diversi geni correlati con la istocompatibilit, venne quindi ribattezzata complesso maggiore di istocompatibilit. Qual il ruolo dellMHC? I trapianti cutanei non sono qualcosa di naturale, quindi il vero ruolo del complesso rimase un mistero per molto tempo dopo la sua scoperta. Ceppi allogenici per MHC avevano grosse differenze nella capacit di sintesi di anticorpi specifici: i geni rilevanti in tali differenze, chiamati geni della risposta immunitaria Ir, furono anche essi mappati allinterno del MHC, chiarendone definitivamente il ruolo biologico. 5.1.2 Scoperta nelluomo

Le molecole umane del MHC sono chiamate antigeni leucocitari umani (HLA) corrispondono alle H2 del topo. Sieri di pazienti contenenti anticorpi contro antigeni espressi da individui allogenici sono detto alloantisieri, gli anticorpi alloanticorpi e gli antigeni alloantigeni. Questi antigeni sono i nostri HLA .I primi tre geni definiti sono HLA-A, HLA-B, HLA-C: questi sono identificati come geni MHC di classe I e sono gli omologhi dell H2 del topo responsabili del rigetto nel trapianto(non-self). I geni Ir del topo responsabili della produzione di anticorpi, nelluomo corrispondono ai geni MHC di classe II e sono HLA-DR, HLA-DP, HLA- DQ. Nelluomo il cromosoma che contiene tutto il complesso maggiore di istocompatibilit il cromosoma 6. In generale le propriet dei geni dellMHC possono riassumersi in: Codifica di due gruppi di proteine (I e II) strutturalmente distinte ma omologhe Sono i geni con il pi alto grado di polimorfismo dellintero genoma: per HLA-B esistono almeno 250 alleli differenti Sono geni espressi in codominanza in modo da massimizzare il numero di molecole MHC sintetizzabili

Il set di alleli MHC di un individuo definito aplotipo.

5.2

Struttura delle molecole MHC

Tutte le molecole Mhc hanno in comune determinate caratteristiche: Sono tutte formate da una tasca extracellulare per legare il peptide e da una coppia di domini Ig ancorati alla cellula. La tasca costituita da doppie eliche poggiate su un pavimento costituito da otto foglietti. Le regioni variabili sono situate allinterno di questa tasca. I domini Ig sono non-polimorfici e sono i reponsabili delle interazioni e legame con i linfociti T.

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5.2.1 Molecole MHC di classe I Queste molecole sono espresse su tutte le cellule nucleate .Sono costituite da due catene polipeptidiche legate non covalentemente, una catena codificata da MHC e una non codificata da MHC detta microglobulina. La catena per due terzi extracellulare mentre la parte carbossiterminale allinterno della cellula. La parte esterna costiuita da tre segmenti 1, 2 e 3. I segmenti ammino terminali 1 e 2 sono i siti in cui vi sono le regioni polimorfe e vanno a contribuire nella formazione della tasca. La regione 3 conservata identica e contiene unansa per il legame con i CD8. La catena non contribuisce n alla tasca n allansa di ancoraggio: essa legata non covalentemente con la regione 3. Affinche il complesso di classe I possa essere esposto sulla superficie necessita che sia in tal modo assemblato e che inoltre sia legato ad un peptide antigenico.

5.2.2

Molecole MHC di classe II

Queste molecole sono espresse solo dalle cellule del sistema immunitario. Le molecole di classe II sono formate da due catene, anche esse una e una , entrambe codificate da geni MHC polimorfi. Queste molecole sono perfettamente simmetriche: tasca e pavimento sono formati per met dal segmento 1 e per met dal segmento 1 ed su tali regioni che abbiamo i residui polimorfi . Le catene 2 e 2 sono costanti e unansa di 2 funge da legame con i linfociti CD4. Questi due segmenti continuano poi al livello citoplasmatico con una coda idrofila.

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5.3

Legame con il peptide

Tutte le proteine immunogeniche danno origine a peptidi che si legano alle MHC. Ogni molecola di MHC pu legare peptidi diversi in tempi diversi. Le molecole MHC legano peptidi diversi, tuttavia il linfocita T pu riconoscere solo uno dei peptidi legati: la specificit dunque non risiede nella molecola di MHC ma nel recettore dei linfociti T. I peptidi che si legano alla stessa MHC hanno caratteristiche strutturali comuni e residui amminoacidici molto simili. Il legame tra peptide e MHC un legame che si dissocia molto lentamente cos da dare il tempo ai linfociti specifici di arrivare nel sito di legame e riconoscere lantigene. Le molecole MHC non distinguono tra self e non quindi espongono entrambi, sta ai linfociti T riconoscere i self. Gli antigeni proteici vengono tagliati allinterno delle cellule che presentano lantigene ed esposti dalle MHC. Le MHC nel pavimento della tasca presentano delle nicchie nelle quali specifici residui amminoacidici dellantigene possono infilarsi: sono i cosiddetti residui ncora, generalmente uno o due per peptide.Tra peptide e MHC si instaura un legame non covalente. Il passo successivo linter azione con il linfocita T: la parte del peptide esposta deve essere riconosciuta dei recettori per lantigene dei linfocitiT specifici. I recettori dei linfociti non riconoscono soltanto lantigene ma anche i residui polimorfi delle eliche stesse delle MHC. Grazie allelevato polimorfismo delle MHC abbiamo la possibilit di riconoscere e legare moltissimi antigeni microbici riducendo la possibilit che questi possano sfuggire al sistema immunitario.

5.4

Organizzazione genomica ed espressione dellMHC.

LMHC localizzato sul braccio corto del cromosoma 6 e la 2-microglobulina sul cromosoma 15. I geni per HLA-A, B e C quindi di classe I sono pi telomerici mentre quelli di classe II sono pi ceentromerici nel locus HLA. Correlati ai locus di classe II vi sono i geni che codificano per svariate proteine coinvolte nella presentazione dellantigene: TAP: eterodimero che trasporta peptidi dal citosol al RE dove verranno associate alle MHC I Proteasoma: degrada le proteine a peptidi. HLA-DM coinvolto nel legame tra petpide e MHC II Geni che codificano per proteine del complemento e tre citochine complessivamente chiamati MHC di classe III. Geni a tipo classe I situati tra HLA-A e HLA-C che codificano proteine espresse in associazione alla 2- microglobulina chiamate molecole di classe IB,fra cui HLA-G importante nel riconoscimento da parte delle NK.

Lo straordinario polimorfismo delle molecole MHC si generato per conversione genica e non per mutazioni puntiformi, ovvero mediante sostituzione di intere sequenze geniche con altre provenienti da geni vicini senza per reciproca ricombinazione. Abbiamo detto che le molecole di classe I sono espresse costitutivamente su quasi tutte le cellule nucleate, i loro effettori, ovvero i linfociti CD8 che hanno lo scopo di uccidere le cellule infettate, devono essere in grado infatti di uccidere qualsiasi cellula infettata, quindi le molecole di classe I presentano microbi intracellulari. Le molecole di classe II invece sono espresse solo su cellule dendritiche, linfociti B e macrofagi. Le molecole di classe II forniscono un sistema per presentare peptidi derivati da micror - ganismi extracellulari ai linfociti C D4+ helper che hanno il compito di attivare i linfociti B a produrre anticorpi e i macrofagi a eliminare i microbi extracellulari fagocitati. Lespressione di queste molecole di MHC aumentata in presenza di citochine: IFN IFN , IFN ,TNF e LT prodotti precocemente durante la risposta innata vanno ad aumentare lespressione delle MHC di classe I. Questo uno dei meccanismi con il quale la immunit innata stimola la specifica. Le molecole di classe II sono stimolate principalmente da IFN prodotte da cellule NK e linfociti attivati, dunque una amplificazione dellimmunit innata stessa. Le citochine vanno ad aumentare la espressione delle MHC andando a stimolare la velocit di trascrizione mediante fattori di trascrizione. Diversi di questi sono assemblati nella proteina CIITA che agisce soprattutto sulle MHC II. Alterazioni di tali fattori di trascrizione sono la base di alcune malattie immunitarie tra cui la sindrome del linfocita nudo.

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Capitolo 6. Processamento dellantigene e presentazione ai linfociti T

Le caratteristiche pi importanti del riconoscimento antigenico da parte dei linfociti T sono: Riconoscimento (quasi) esclusivo di strutture peptidiche. I linfociti B sono invece in grado di riconoscere peptidi, proteine, acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi e piccole molecole. Riconoscimento di specifiche sequenze peptidiche. I linfociti B riconoscono invece strutture molecolari tridimensionali; i linfociti T sono quindi in grado di discriminare tra antigeni diversi anche per un solo aminoacido. Totale dipendenza dalle APC. I linfociti T riconoscono solamente i peptidi presentati sulle molecole MHC espresse dalle APC. Totale dipendenza dallMHC. Questa propriet alla base della cosiddetta restrizione al self MHC. La restrizione allMHC deriva dalla maturazione dei linfociti nel timo; in questa fase i lin- fociti che esprimono recettori per MHC vengono fatti sopravvivere, quelli che non riconoscono queste molecole vengono invece eliminati. Questo dimostra come le molecole MHC siano parte integrante dei ligandi dei linfociti T. Fondamentale poi la reattivit a molecole MHC non self: questo processo alla base del rigetto dei trapianti. I linfociti C D4+ riconoscono MHC II, i linfociti C D8+ riconoscono MHC I. La ragione che CD4 lega direttamente la classe due del MHC, mentre CD8 lega la classe I. I C D4+ legano soprattutto proteine extracellulari internalizzate dalle APC, mentre i C D8+ legano soprattutto proteine endogene. La ragione di questa differenza sta nel pathway seguito dalle APC per presentare questi due tipi di antigeni. Esiste inoltre un sistema di presentazione antigenico accessorio che specializzato per gli antigeni lipidici. La molecola CD1 (simil MHCI nonpolimorfica) viene espressa su molte APC ed epiteli e ha il compito di presentare i lipidi a una popolazione di cellule T stranamente non MHC-ristretta.

6.1

APC

Tutte le funzioni dei linfociti T dipendono dalle loro interazioni con altre cellule. In generale la risposta antigene specifica di queste cellule richiede la partecipazione delle APC che catturano, trasformano e presentano lantigene. Le APC svolgono due importanti lavori nellattivazione delle cellule T: Convertono antigeni proteici in peptidi e li presentano associati come complessi MHC. La conver sione prente il nome di processing. Alcune APC forniscono stimoli accessori per i linfociti T: questi costimolanti sono richiesti per una piena risposta dei linfociti, specialmente i C D4+ naive. La funzione di presentazione stimolata dallesposizione a prodotti microbici. Le cellule dendritiche e i macrofagi esprimono TLR che rispondono ai microbi aumentando lespressione dellMHC e dei costimolanti e attivando le APC che producono citochine. In aggiunta le cellule dendritiche e i macrofagi attivati esprimono recettori per chemochine che ne causano la migrazione ai siti di infezione. Per indurre una risposta dei linfociti T ad un antigene proteico per via sperimentale necessario somministrare anche sostanze chiamate adiuvanti. Gli adiuvanti possono essere prodotti microbici o sostanze che ne mimano le caratteristiche. Differenti tipologie cellulari agiscono da APC per attivare i linfociti T naive. Le cellule dendritiche sono le pi efficaci nellattivare i naive C D4+ e C D8+ . I macrofagi presentano antigeni ai C D4+ gi differenziati (effettori) mentre i linfociti B presentano gli antigeni ai linfociti T helper durante le risposte umorali. Cellule dendritiche, macrofagi e linfociti B esprimono sia MHC II che costimolanti e possono dunque attivare i linfociti T C D4+ : sono pertanto definite APC professionali. 6.1.1 Presentazione ai linfociti T naive

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Le cellule dendritiche sono presenti in quasi tutti i tessuti e si identificano per le proiezioni membranose. Tutte queste cellule probabilmente nascono da precursori midollari e quasi tutte sono legate alla linea dei fagociti mononucleati. Il prototipo di cellula dendritica epiteliale la cellula di Langerhans dellepidermide: queste cellule occupano fino al 25% della superficie dellepidermide pur essendo l% del totale. Normalmente queste cellule sono in condizione di riposo; in risposta allincontro di un componente microbico queste cellule maturano mentre migrano ai linfonodi diventando efficaci APC. Le cellule dendritiche mature risiedono nella zona T del linfonodo, dove presentano gli antigeni ai linfociti T. Le risposte dei C D4+ iniziano nei tessuti linfoidi periferici, dove gli antigeni vengono trasportati dopo essere stati catturati. Le APC immature esprimono recettori di membrana che legano i microbi: grazie a questi riescono a catturare e processare lantigene. Le cellule dendritiche attivate perdono la loro aderenza per gli epiteli e iniziano ad esprimere il recettore per chemochine CCR7: questo le far guidare verso la zona T del linfonodo (era lo stesso recettore che guidava i linfociti T naive verso la regione corretta). Il legame con lantigene converte le cellule dendritiche da cellule la cui funzione catturare a cellule la cui funzione presentare gli antigeni: le cellule dendritiche attivate esprimono alti livelli di molecole MHC II. Le cellule dendritiche sono le migliori APC per via di alcune loro caratteristiche: Sono strategicamente posizionate lungo le pi comuni vie di ingresso di patogeni. Esprimono recettori utili a legare i microbi. Migrano di preferenza nelle stesse regioni di linfonodo allinterno delle quali circolano i linfociti T naive. Esprimono ad alti livelli i costimolanti. Gli antigeni possono arrivare al linfonodo anche in soluzione nel plasma: una volta a destinazione verranno processati dai macrofagi e dalle cellule dendritiche residenti. Il processo di accumulo degli antigeni potenziato da due accorgimenti anatomici. Il primo rappresentato dalle collezioni di tessuto linfoide secondario che caratterizzano le superfici mucosali dei tratti GI e respiratorio; le collezioni di tessuto definite in modo pi chiaro sono le placche del Peyer dellintestino e le tonsille faringee. Il secondo accorgimento il costante controllo del sangue da parte della milza, allinterno della quale risiedono APC apposite.

Le cellule dendritiche possono ingerire cellule infette o tumorali e presentare gli antigeni di queste cellule ai linfociti T C D8+ . Le cellule dendritiche hanno la speciale abilit di ingerire queste cellule e di presentarne gli antigeni su molecole MHCI: questa via diversa dalla solita (normalmente le sostanze fagocitate finiscono su MHCII e riconosciute dai CD8+ ) e prende il nome di cross-presentazione. 6.1.2 Presentazione ai linfociti T differenziati

Nellimmunit cellulomediata i macrofagi presentano gli antigeni delle cellule fagocitate ai linfociti T differenziati, i quali attivano i macrofagi per uccidere i microbi. I monociti circolanti sono in grado di migrare ai siti di infezione dove differenziano in macrofagi per fagocitare e distruggere i microbi. Le cellule C D4+ amplificano le attivit microbicide. Quasi tutti i macrofagi esprimono MHC II a bassi livelli insieme ai costimolanti: questi livelli vengono aumentati dallinterferone gamma. Nelle risposte umorali i linfociti B internalizzano gli antigeni proteici solubili e li presentano ai linfociti T helper: questa funzione necessaria per la produzione di anticorpi dipendente dagli Helper. Tutte le cellule nucleate possono presentare peptidi (derivanti da antigeni proteici citosolici) associati a MHCI e attivare cos i linfociti T C D8+ : tutte le cellule nucleate esprimono infatti MHC I. Per il sistema immunitario fondamentale infatti la possibilit di riconoscere antigeni citosolici contenuti allinterno di qualsiasi tipo di cellula. Le cellule endoteliali vascolari esprimono inoltre MHC II e possono presentare antigeni alle cellule T in aderenza alle pareti.

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6.2

Biologia del processamento antigenico

Le vie di processamento e presentazione non sfruttano alcun organello cellulare esclusivo: le vie di presentazione, sia MHCI che MHCII, sono dunque adattamenti di funzioni cellulari di base. Gli antigeni proteici presenti nelle vescicole acide delle APC generano peptidi MHCII-associati mentre gli antigeni citosolici generano peptidi MHCI-associati. Questa segregazione delle vie dovuta alla completa separazione nella biosintesi delle molecole MHCI e MHCII. 6.2.1 Processamento per la presentazione MHC II

La generazione dei peptidi per MHCII a partire da antigeni endocitati prevede la degradazione proteolit- ica di queste molecole in una serie di step ben definita. Endocitosi delle proteine extracellulari nelle vescicole dellAPC Cellule dendritiche e macrofagi esprimono unampia gamma di recettori superficiali per riconoscere strutture microbiche; in aggiunta i macrofagi esprimono anche recettori per la porzione Fc degli anticorpi e recettori per la proteina C3b del complemento. A seguito dellinternalizzazione gli antigeni proteici si trovano localizzati in vescicole intracellulari dette endosomi . Gli endosomi sono vescicole a pH acido che contengono enzimi proteolitici. Processamento delle proteine allinterno di endosomi e lisosomi

La degradazione delle proteine nelle vescicole mediata dalle proteasi contenute, le quali lavorano ottimamente al basso pH di queste strutture. Molti enzimi differenti partecipano alla degradazione: le pi abbondanti proteasi sono catepsine, enzimi ad ampio spettro dazione. Raramente proteine citoplasmatiche e di membrana possono entrare in questa via: di solito si tratta di digestioni enzimatiche dei componenti citoplasmatici, cio si tratta di autofagia. In questi casi particolari le proteine vengono intrappolate in vescicole derivanti dal RE chiamate autofagosomi , vescicole fuse poi con i lisosomi. Biosintesi e trasporto di MHCII agli endosomi Le molecole MHC II vengono sintetizzate nel RE e trasportate agli endosomi in associazione ad una proteina detta catena invariante (Ii ) che occupa le sedi di legame con il peptide. Le catene e delle molecole MHC II vengono sintetizzate in maniera coordinata e si associano tra loro nel RE. I dimeri nascenti sono strutturalmente instabili e il loro folding viene assistito dalle chaperonine. La catena invariante si associa ai dimeri sempre allinterno del RE; questa molecola si trova in una posizione tale da impedire alle nuove molecole di legare antigeni eventualmente presenti nel RE. La catena invariante promuove inoltre il folding corretto e dirige le molecole neoformate verso gli endosomi e i lisosomi. Le molecole di MHC II vengono a questo punto secrete dal Golgi allinterno di vescicole dirette agli endosomi: queste si fonderanno poi insieme con il risultato che le molecole a questo punto si troveranno nella stessa vescicola che contiene i peptidi generati dalla proteolisi. La fusione delle vescicole porta alla formazione di quello che prende il nome di compartimento di classe MHCII o MIIC: questa struttura contiene tutto quello che serve per lassociazione peptide-MHC; i contenuti precisi del MIIC sono dunque 1. Enzimi proteolitici 2. Molecole MHCII 3. Catena invariante Ii 4. Peptidi di derivazione antigenica 5. Molecola HLA-DM Associazione dei peptidi alle molecole MHC II Allinterno del MIIC la catena Ii viene dissociata grazie allazione di enzimi proteolitici e della molecola HLA-DM: vengono cos scoperti i siti di legame e i peptidi si legano. Leliminazione della catena invariante lascia una catena di 24 aminoacidi associata allMHC: questa prende il nome di CLIP ed ancora in grado di bloccare il legame con i peptidi. La molecola HLA-DM si occupa di eliminare CLIP; questa molecola codificata allinterno del MHC ed simile alle molecole di classe due ma ha molte differenze: non polimorfica, non associa la catena invariante e non viene espressa sulla superficie cellulare. In breve HLA-MD uno scambiatore di peptidi : rimuove clip e facilita la sua sostituzione con il peptide digerito. Le molecole di MHCII presentano una sede aperta di legame peptidico, per questo grandi peptidi o anche proteine intere possono legarsi e venire poi tagliate alla lunghezza giusta per il riconoscimento: il risultato che normalmente vengono create catene lunghe dai dieci ai trenta aminoacidi. Espressione dei complessi sulla superficie Le molecole di MHC II vengono stabilizzate dal legame con il peptide, e questi complessi vengono indirizzati alla superficie per il riconoscimento: in questo modo solo le MHC II correttamente assemblate possono essere poste allesterno. Alla fine di questa serie di step la cellula presenta moltissimi complessi sulla sua superficie, la maggior parte dei quali presenta proteine self normali: non esiste infatti un meccanismo di riconoscimento del self dal non self in questo ambito. Come possibile dunque che i linfociti vengano attivati da cellule che mostrano soprattutto molecole self? Questo possibile perch i linfociti sono estremamente sensibili: bastano pochissimi riconoscimenti dei complessi giusti, anche meno di cento, per generare una risposta specifica; cento complessi rappresentano meno dello 0,1% di tutti i complessi espressi. Come possibile per che i linfociti non reagiscano contro le molecole self presentate? Questa seconda propriet dovuta al fatto che i linfociti in grado di riconoscere molecole self non esistono normalmente: vengono eliminati durante la fase di maturazione nel timo.

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6.2.2

Processamento per la presentazione MHC I

28

I peptidi associati a MHCI sono prodotti per degradazione di proteine citosoliche: trasportati nel RE e assemblati alle molecole MHCI nascenti. Fonti di antigeni citosolici

vengono poi

Gli antigeni estranei possono essere prodotti virali o di altri microbi intracellulari. Nelle cellule tumorali molti geni possono produrre proteine antigeniche che vengono riconosciute da CTL MHC I ristretti. Degradazione proteolitica delle proteine citosoliche Il meccanismo principale di degradazione la proteolisi ad opera del proteasoma. Il proteasoma un complesso enzimatico multiproteico che si trova nel citoplasma della maggior parte delle cellule. Esistono varie forme di proteasoma, uno semplice da sette subunit e 700kD e uno pi grande, da 1500kD, probabilmente il pi importante per questi scopi. Due subunit catalitiche presenti in molti dei proteasomi da 1500kD sono codificate nel MHC e prendono il nome di LMP2 e LMP7. Il proteasoma ha funzione housekeeping in quanto degrada le proteine danneggiate, non correttamente foldate o ormai inutili: tutte questi bersagli di degradazione vengono marcati dallubiquitina. Linterferone gamma aumenta la trascrizione e la sintesi di LMP2 e LMP7, aumentando dunque lattivit del proteasoma: in questo modo aumenta lefficacia della presentazione antigenica. Il fatto che questa via di presentazione sfrutti il proteasoma un esempio delladattamento a funzioni immunitarie di strutture gi esistenti. In aggiunta al metodo del proteasoma esistono antigeni proteici che apparentemente non richiedono questo enzima e nemmeno ubiquitinazione: probabilmente esistono altre vie non meglio definite che sfruttano direttamente il RE. Trasporto dei peptidi dal citosol al RE Due geni allinterno del MHC codificano proteine che mediano il trasporto ATP dipendente di composti a basso peso molecolare attraverso lemembrane cellulari. Questi geni in particolare codificano per due catene di un eterodimero detto trasportatore associato al processing dellantigene (TAP). La proteina TAP si trova sulla membrana del RE dove media il trasporto dei peptidi: loptimum si ha per il trasporto di catene lunghe da sei a trenta aminoacidi, perfette per il legame con lMHC. Sul lato luminale del RE, TAP legata in maniera non covalente alle neomolecole MHCI da una proteina linker detta tapasina: le molecole di MHC sono dunque nella posizione migliore per ricevere i peptidi. Assemblaggio dei complessi nel RE La sintesi e lassemblaggio delle molecole MHC I sono processi multistep che richiedono il legame con il peptide. Le catene e 2 vengono sintetizzate nel RE e il folding corretto viene garantito da varie chaperonine. Allinterno del reticolo i dimeri scarichi rimangono attaccati a TAP grazie alla tapasina; a seguito delling resso di un peptide attraverso TAP si ha il taglio di questo a una dimensione corretta da parte di una aminopeptidasi detta ERAP (Endoplasmic Reticulum Amino Peptidase). Il peptide a questo punto lega la molecola MHCI e il complesso viene rilasciato dalla tapasina, esce dal RE e viene trasportato sulla superficie cellulare. In assenza di peptide i dimeri sono instabili e non possono essere

trasportati fuori dal RE: vanno probabilmente incontro a degradazione in situ. Espressione superficiale dei complessi I complessi in uscita dal RE vengono mobilitati sulla membrana grazie allesocitosi di vescicole. Una volta posti nella sede definitiva i complessi vengono riconosciuti dai linfociti C D8+ .

6.3

Significato della presentazione in complessi

Le vie di presentazione di classe I e II esplorano le proteine disponibili per la presentazione ai linfociti T; la maggior parte di queste proteine sono self: quelle estranee sono relativamente rare. I linfociti esaminano tutte le molecole presentate in cerca di quelle esterne per rispondervi attivamente. Le molecole di MHC controllano sia lo spazio extracellulare che quello citosolico, in quanto i microbi possono risiedere in entrambe le sedi. La presentazione delle proteine vescicolari o citosoliche da parte dellMHC II o I rispettivamente determina quale sottogruppo delle cellule T risponder a quei determinati antigeni. Gli antigeni extracellulari seguono solitamente il pathway dellMHC II e attivano quindi i linfociti T C D4+ : queste cellule funzionano come aiutanti per stimolare i meccanismi effettori, quali anticorpi e fagociti. Gli antigeni intracellulari invece sono inaccessibili ad anticorpi e fagociti e stimolano una via diversa: vengono caricati su MHC I e stimolano i linfociti T C D8+ , la cui funzione uccidere la cellula che li ha attivati. Questa via garantisce che qualsiasi cellula, poich MHC I viene espresso in ogni cellula nucleata, possa impedire la diffusione di microbi facendosi eliminare dal sistema immunitario. La specificit dei linfociti T essenziale alle loro funzioni, in gran parte mediate da interazioni dirette tra cellule o da citochine a breve raggio. Le APC non solo presentano gli antigeni ai linfociti T ma sono anche il bersaglio delle loro funzioni effettrici: ad esempio i macrofagi presentano lantigene ai C D4+ i quali li attivano consentendo loro di distruggere il microbo. Le molecole di MHC determinano limmunogenicit di un antigene in due modi: Immunodominanza. Gli epitopi di proteine complesse che generano una risposta pi forte nelle cellule T sono i peptidi generati dalla proteolisi nelle APC e che legano pi avidamente le molecole di MHC. In un individuo esposto a un antigene proteico multideterminante la maggior parte delle cellule T sar specifica verso uno o due sequenze aminoacidiche dette epitopi immunodominanti. Responsivit immunitaria geneticamente controllata. Lespressione di particolari alleli MHC II in un individuo ne determina la capacit di rispondere a particolari antigeni. I geni della risposta immunitaria che controllano le risposte anticorpali sono infatti parte dellMHC II e determinano la capacit di risposta in quanto cambia la capacit di legare i diversi peptidi antigenici.

29

6.4

Presentazione di antigeni lipidici delle molecole CD1

Rare popolazioni di linfociti T, detti cellule NK-T, sono in grado di riconoscere antigeni lipidici e glicolipidici. Questi linfociti hanno parecchie propriet strane, ad esempio marker caratteristici sia delle cellule T che delle NK, e poca diversit nei loro recettori per gli antigeni. Le cellule NK-T riconoscono lipidi e glicolipidi presentati sulla molecola simil MHCI detta CD1. Esistono molte varianti di questa molecola, ma seguono tutte la stessa via di presentazione. Le molecole neosintetizzate caricano lipidi cellulari e li portano sulla superficie cellulare; da qui i complessi CD1lipide vanno incontro ad endocitosi in endosomi e lisosomi: le molecole CD1 acquisiscono dunque lipidi antigenici durante il riciclo e li presentano senza apparente processamento. Le cellule NK-T svolgerebbero un ruolo in particolare nella difesa dai micobatteri.

Capitolo 7. Recettori antigenici e molecole accessorie dei linfociti T

I linfociti T hanno una doppia specificit: per i residui di MHC e per lantigene. Il recettore che riconosce questi complessi MHC-antigene prende il nome di TCR (T -Cell Receptor) ed distribuito in maniera clonale, cio cloni di cellule T con diverse specificit avranno diversi TCR. Le cascate biochimiche di segnalazione iniziate dal TCR non sono da esso trasdotte: questo compito viene svolto dalle proteine invarianti CD3 e , che insieme al recettore formano il cosiddetto complesso TCR. La

segnalazione dunque legata a elementi estremamente variabili (il TCR) e a elementi costanti. Le cellule T esprimono altri recettori di membrana che non riconoscono lantigene ma che contribuiscono alla risposta: in generale si parla di molecole accessorie. Il ruolo fisiologico per alcune di facilitare la segnalazione del complesso TCR, per altre di fornire secondi segnali che attivano completamente le cellule. Altre molecole accessorie ancora servono a stabilizzare il legame con le APC, in modo da garantire il tempo necessario alla trasduzione del segnale.

30

7.1 -TCR per antigeni MHC-associati

Il recettore antigenico sia dei linfociti C D4+ che dei C D8+ un eterodimero costituito da una catena e una tra loro unite da un ponte disolfuro. Entrambe le catene sono costituite da un dominio simil-Ig N terminale variabile, uno simil Ig costante, un dominio transmembrana e una piccola regione citoplasmatica; la porzione extracellulare dunque simile alla porzione legante lantigene di un anticorpo, con una regione variabile e una costante sulla catena leggera e una variabile e una costante sulla catena pesante. Le regioni variabili V delle catene del TCR contengono piccole frazioni sulle quali la grande variabilit concentrata: si parla di CDR, o Complementarity Determing Regions. Tre CDR sulla catena sono giustapposte a tre regioni simili sulla catena a formare la parte del recettore che riconosce i complessi peptide-MHC. La regione variabile della catena contiene poi una quarta regione ipervariabile che il sito di legame per i cosiddetti superantigeni. Ogni catena del TCR codificata da pi segmenti genici che subiscono riarrangiamento somatico durante la maturazione dei linfociti. In entrambe le catene la terza regione ipervariabile composta da sequenze codificate dai segmenti genici V e J (catena ) o dai segmenti V, D, J (catena ). Le regioni costanti C di entrambe le catene formano cerniere che contengono i residui di cisteina per i ponti disolfuro. I TCR e gli anticorpi sono strutturalmente simili, ma vi sono delle profonde differenze. I TCR non esistono in froma secreta e non hanno funzioni effettrici da soli, inoltre non subiscono variazioni nella regione C e non hanno maturazione della loro affinit.

7.1.1

Ruolo del TCR nel riconoscimento dellantigene

Il riconoscimento mediato dalle regioni determinanti la complementariet, o CDR, formate da entrambe le catene del TCR. Queste catene formano un singolo recettore eterodimerico responsabile sia della specificit per il peptide che per lMHC. Il sito di legame per lantigene formato dalle sei CDR sulle due catene che formano uninterfaccia molto simile a quella degli anticorpi. Il contatto tra il TCR e il complesso peptide-MHC limitato a uno o due aminoacidi: le cellule T riconoscono dunque i loro substrati sulla base di differenze minime. Laffinit del TCR per i complessi bassa, molto pi di quella della maggior parte degli anticorpi. Questa bassa affinit probabilmente la ragione per cui sono necessarie le molecole di adesione per avere una risposta biologica. Il TCR e le sue molecole accessorie sul linfocita T si muovono in maniera coordinata ai loro ligandi sulle membrane delle APC per creare una struttura sopramolecolare detta sinapsi immunologica.

7.2

Proteine CD3 e del complesso TCR

31

Le proteine CD3 e trasducono il segnale che porta allattivazione del linfocita dietro stimolo del TCR. La molecola CD3 in realt un insieme di tre proteine designate , e . Le tre proteine CD3 e la sono sempre uguali in tutte le cellule T: non hanno infatti ruolo nel riconoscimento ma solo nella trasduzione del segnale. 7.2.1 Struttura

Le tre proteine CD3 sono omologhe tra loro, e le regioni extracellulari di tutte contengono un singolo dominio simil-Ig: queste tre proteine sono dunque membri della superfamiglia delle Ig. I domini citoplasmatici variano da 44 a 81 aminoacidi di lunghezza e ciascuno contiene una copia di una sequenza conservata detta ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) che gioca un ruolo fondamentale nella segnalazione da parte del complesso. La catena ha una piccola regione extracellulare, una transmembrana e una lunga regione citoplasmatica contentente tre ITAM. Lespressione del complesso TCR richiede la sintesi di tutti i suoi componenti. Nei linfociti T maturi infatti lintero complesso viene prodotto nel RE e trasportato sulla membrana.

7.2.2

Funzione

Il primo evento intracellulare a seguito del riconoscimento antigenico la fosforilazione dei residui di tirosina contenuti nei domini ITAM di CD3 e da parte di kinasi quali Lck o Fyn. Lck si associa alle code citoplasmatiche di CD4 e CD8, Fyn a CD3. Le fosfotirosine cos create diventano siti di attacco per una tirosin kinasi, ZAP-70, che viene reclutata dalla catena e porter alla variazione dellespressione genica delle cellule T.

7.3

Recettori antigenici dei linfociti

Il TCR un secondo tipo di eterodimero espresso in un piccolo set di linfociti T -negativi; questo recettore comunque associato alle proteine CD3 e . La maggioranza delle cellule con questo recettore

non esprimono CD4 o CD8. Le cellule che esprimono questo recettore sono linearmente distinte da quelle che esprimono il pi comune TCR: in totale meno del 5% dei linfociti esprime questa struttura. Queste cellule, insieme alle cellule NK-T, i linfociti B di tipo B-1 e le cellule MZ B, potrebbero rappresentare un importante collegamento tra limmunit innata e quella adattativa. Le cellule con recettore non riconoscono gli antigeni peptidici MHC-associati e non sono MHC ristrette; alcune riconoscono piccole molecole fosforilate o lipidi comuni nei batteri, altre riconoscono proteine che non richiedono processamento o collaborazione delle APC. Il ruolo di queste cellule comunque poco definito in quanto topi deficitari non si mostrano particolarmente immunodeficienti o maggiormente suscettibili alle infezioni batteriche.

7.4

Recettori antigenici delle cellule NK-T 32

Una piccola popolazione di linfociti T esprime i markers tipici delle cellule NK: si tratta delle cellule NK-T. Le catene alfa del TCR di queste cellule hanno una diversit limitata e sono caratterizzate da un riarrangiamento caratteristico nelluomo; queste cellule fanno ancora una volta da ponte tra limmunit innata e quella adattativa. Tutte i TCR delle cellule NK-T riconoscono lipidi legati alle molecole simil-MHCI CD1. Queste cellule producono rapidamente citochine quali IL-4 e IFN- a seguito della stimolazione.

7.5

Corecettori e recettori costimolanti nelle cellule T

I corecettori sono una categoria di proteine di membrana che amplificano il segnale di TCR; queste strutture legano le molecole di MHC. I costimolanti conducono anchessi dei segnali che attivano le cellule T, ma riconoscono molecole sulle APC che non sono parte del complesso MHC-peptide. 7.5.1 CD4 e CD8: Corecettori coinvolti nellattivazione delle cellule T MHC- ristrette

Le cellule T mature esprimono CD4 o CD8, ma mai entrambi. Queste strutture interagiscono con entrambe le classi di MHC quando i TCR della cellula riconoscono i complessi MHC-peptide dellAPC. La funzione principale nella trasduzione del segnale al momento del riconoscimento, ma possono anche aumentare lefficacia del legame tra cellula T ed APC. Nel pool dei linfociti maturi circa il 65% esprime CD4 e il 35% CD8. Struttura Entrambi i corecettori sono glicoproteine transmembrana facenti parte della superfamiglia Ig. CD4 viene espresso come monomero e presenta quattro domini simil-Ig extracellulari, una regione transmembrana e una coda basica citoplasmatica. I due domini simil-Ig amino terminali del CD4 legano il dominio 2 non polimorfico dellMHCII. Le molecole CD8 esistono quasi sempre sotto forma di eterodimeri di due catene dette CD8 e CD8 . Entrambe presentano un singolo dominio Ig extracellulare, una regione transmembrana e la coda citoplasmatica basica. Il dominio Ig di CD8 lega il dominio 2 non polimorfico delle molecole di MHCI.

Funzione La separazione delle risposte dei linfociti C D4+ e C D8+ dovuta alla capacit di queste molecole di legare solamente una classe di MHC e non laltra.

 CD4 in grado di legare MHCII e viene espresso sui linfociti i cui TCR riconoscono i complessi peptidici di questo tipo. Quasi tutti i linfociti C D4+ sono cellule di supporto che producono citochine. CD8 in grado di legare le molecole MHCI. Quasi tutti i linfociti C D8+ sono linfociti citotossici il cui ruolo sradicare le infezioni intracellulari. Esistono linfociti C D4+ con funzioni citotossiche ma sono comunque MHCII ristretti. CD4 e CD8 partecipano ai primi eventi segnalatori dopo il riconoscimento del complesso MHC-peptide. Queste funzioni sono mediate da una tirosin chinasi specifica dei linfociti T che prende il nome di Lck: questo enzima associato in modo non covalente alle code sia del CD4 che del CD8. Quando un linfocita riconosce il complesso MHC linterazione di CD4/8 con lMHC porta il corecettore e la sua Lck nelle vicinanze del CTR; Lck a questo punto fosforila i domini ITAM delle proteine CD3 e e da il via alla segnalazione. 7.5.2 Recettori costimolanti ed inibitori della famiglia CD28

33

CD28 una proteina che trasduce il segnale in associazione ai segnali in arrivo dal complesso TCR per attivare le cellule T naive. I linfociti T naive in generale necessitano di due segnali extracellulari distinti per proliferare e differenziare; il primo deriva dal legame dellantigene al recettore e garantisce la specificit della risposta. Il secondo segnale viene fornito da molecole che vengono definite in generale costimolatori. I costimolatori meglio definiti per i linfociti T sono chiamati B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) e sono espressi sulle cellule dendritiche, sui macrofagi e sui linfociti B; queste molecole hanno specifici recettori sul linfocita. Il primo recettore per B7 scoperto fu la molecola CD28, espressa su quasi tutti i C D4+ e su met dei C D8+ . Il legarsi delle molecole B7 delle APC a CD28 fornisce al linfocita il segnale per esprimere proteine anti apoptosi, per produrre fattori di crescita e citochine e per promuovere proliferazione e differenziazione. Un secondo recettore per molecole B7 venne successivamente scoperto e chiamato CTLA-4; questa struttura omologa a CD28 e viene espressa sui linfociti recentemente attivati: la sua funzione inibire lattivazione controbilanciando i segnali in arrivo dal complesso TCR e da CD28. Molte altre strutture sono state scoperte in grado di legare le molecole B7 e sono equamente divise tra vie di attivazione e vie di terminazione.

7.5.3

CD2 e la famiglia SLAM di recettori costimolanti

Unimportante famiglia di proteine che gioca un ruolo nellattivazione delle cellule T ed NK un gruppo di proteine strutturalmente legate ad un recettore detto CD2. Questo recettore contiene due domini Ig extracellulari, una regione di membrana e una lunga coda citoplasmatica. Nelluomo il principale ligando la molecola LFA-3 (Leukocyte Function-associated Antigen 3) che espressa in molte cellule ematopoietiche e non. CD2 esempio di molecola accessoria che funziona sia come una molecola di adesione che come trasduttore del segnale. Un sottogruppo distinto di protine CD2 detto SLAM (Signaling L ymphocytic Activation Molecule). Le SLAM sono proteine integrali di membrana con due domini Ig extracellulari e una coda citoplas-

matica che contiene un dominio detto ITSM (Immunoreceptor Tyrosin-based Switch Motif); il dominio si lega ad un adattatore detto SAP (SLAM Associated Protein) che contiene un dominio SH2 in grado di fare da ponte tra SLAM e Fyn, una chinasi. Un importante membro della famiglia SLAM 2B4, mutazioni in questa molecola possono seriamente danneggiare il sistema immunitario. 7.5.4 Altre molecole accessorie dei linfociti T

CD44 una glicoproteina espressa in varie cellule, tra cui linfociti T maturi, timociti, cellule B, granulociti, macrofagi, eritrociti e fibroblasti. Questa molecola lega lo ialuronato e questa propriet responsabile della detenzione dei linfociti T nei siti extravascolari di infezione. Le cellule C D4+ attivate esprimono una proteina della famiglia del TNF detta CD40L, che lega CD40 dei linfociti B e di altre cellule e le attiva. CD40L quindi un importante mediatore delle funzioni helper di questi linfociti. I linfociti attivati esprimono anche il FAS ligand; lattivazione di FAS da parte di FASL porta allapoptosi ed importante per eliminare le cellule T iperstimolate.

34

Capitolo 8. Sviluppo linfocitario e riarrangiamento ed espressione dei geni dei recettori antigenici
La maturazione consiste in una serie di eventi che avvengono negli organi linfoidi generativi o primari: 1. Orientamento verso linfociti T o B. A partire da cellule staminali dette HSC (Hematopoietic Stem Cells) nel midollo osseo e nel fegato fetale si ha la maturazione a CLP (progenitore linfoide comune) che poi a seconda degli stimoli ricevuti dai recettori di membrana si differenzier in linfocita B o T. I linfociti T terminano la loro maturazione allinterno del timo. 2. Riarrangiamento dei geni per il recettore. Elemento chiave della maturazione linfocitaria che avviene nei linfociti B immaturi nel midollo osseo e nei linfociti T immaturi nel timo. A partire da un numero modesto di geni grazie a tagli, ricongiungimenti ed aggiunte si genera un numero elevatissimo di esoni differenti che codificano per il recettore, tutto questo prima dellincont ro con lantigene. 3. Selezione dei linfociti utili ed eliminazione di quelli pericolosi. Le cellule che non esprimono un recettore o pre-recettore corretto muoiono per apoptosi; quelle che sono in grado di legare con bassa avidit gli MHC vengono portate avanti nella maturazione dalla selezione positiva; quelle che legano con elevata avidit antigeni self vengono eliminate dalla selezione negativa fenomeno detto delezione clonale; Possono anche andare incontro a un successivo riarrangiamento del recettore detto editing recettoriale. 4. Proliferazione. 5. Differenziazione in sottogruppi (CD4, CD8, etc).

Orientamento verso le linee B e T Lorientamento dipende dalle istruzioni ricevute dalla superficie della cellula seguite dallinduzione di specifici fattori trascrizionali. Lo stadio precoce dello sviluppo

 caratterizzato dalla proliferazione stimolata soprattutto dallIL-7 prodotta dalle cellule stromali di midollo e timo. Mutazioni nel recettore per questa citochina portano ad immunodeficienze quali le SCID.

8.1

Riarrangiamento dei geni recettoriali

I geni che codificano per il recettore per l antigene sono generati per riarrangiamento di regioni diverse del gene che codifica per la regione variabile(V) con segmenti di geni della diversit (D) e quelli della ricongiunzione(J).Tale processo detto ricombinazione V(D)J. 8.1.1 Organizzazione dei loci per le IG

Esistono tre loci genici separati su cromosomi diversi che codificano per le tre catene delle IG (pesante, , ). Ciascun locus contiene una regione costante (C) che codifica la parte C delle catene e una regione V che codifica la parte variabile composta da copie multiple di segmenti V e J, nel locus per la catena pesante sono presenti anche segmenti D. Nelluomo nei segmenti o geni V al 5 di ognuno vi una sequenza L che codifica per un peptide leader che caratterizza tutte le proteine neo-sintetizzate e svolge un ruolo essenziale nellindirizzamento verso lER. Nel 3 della regione V cio tra i geni V e quelli C vi sono segmenti J e nei loci per le catene pesanti vi sono anche dei segmenti D. La regione C della catena pesante costituita da circa 9 geni C, solo 3 o 4 bastano per codificare lintera regione C della catena pesante e altri 2 per la regione carbossi-terminale di membrana. Nel locus per le catene leggere vi un unico esone C che basta da solo a codificare lintera regione C della catena leggera. Nelle catene leggere il dominio V codificato dai segmenti V e J mentre quelle pesanti da V(D)J.

35

8.1.2

Organizzazione dei loci per TCR

Lorganizzazione molto simile a quella per le Ig. I geni che codificano per le catene , e sono su cromosomi separati, mentre quello per la catena contenuto in quello per la catena . La struttura di questi uguale a quella detta prima: regione V con segmenti V, J e D solo nelle catene e e una regione C con 2 geni nelle catene , e uno solo nelle altre due. Ciascun gene V preceduto in 5 da una sequenza L che codifica per il peptide leader. 8.1.3 Ricombinazione V(D)J

La ricombinazione V(D)J d origine alla specificit e variabilit del recettore e consiste nellunione di segmenti V, D(se presente) e J presi a caso. Siccome i segmenti scelti si trovano lontani sul cromosoma devono essere effettuate rotture e riallacciamenti. Durante la ricombinazione sono aggiunti o rimossi nucleotidi che aumentano enormemente la variabilit dell esone V(D)J. Il risultante esone V(D)J codificher la regione variabile, in associazione con le regione C che sono invece costanti.Tale

ricombinazione effettuata da un complesso detto ricombinasi.

Il complesso della ricombinasi riconosce specifiche sequenze dette RSS situate nel 3 del segmento V e 5 del segmento J; tali sequenze sono costituite da una sequenza altamente conservata di 7 nucleotidi detta eptamero distaccata da una sequenza spaziatrice d 12 o 23 nucleotidi da una seconda sequenza conservata di 9 nucleotidi detta nonamero. Un enzima specifico una volta avvicinati i due eptameri (uno adiacente a V e uno adiacente a J) taglia lelica tra il segmento V e J e il rispettivo eptamero, successivamente segue lunione dei due segmenti codificanti e leliminazione del frammento contentente le RSS sotto forma di anello. In alcuni casi gli eptameri sono situati entrambi a destra sia di V che di J in tal caso necessaria una inversione del Dna intermedio e le RSS tagliate non vengono eliminate ma rimangono nel cromosoma. La ricombinazione tra due segmenti si verifica solo uno fiancheggiato da uno spaziatore di 12 e l altro di 23: la cosiddetta regola 12/23.

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Il processo di ricombinazione V(D)J si pu riassumere in quattro eventi fondamentali: 1. sinapsi: i due segmenti codificanti e le RSS adiacenti vengono in contatto tra loro grazie alla formazione di un anello sul cromosoma. 2. taglio: rottura del doppio filamento di Dna. 3. codifica e processazione: le estremit tagliate vengono modificate mediante aggiunta o rimozione di nucleotidi. 4. unione:le estremit codificanti vengono unite in un processo detto NHEJ (Non Homolgous End Joining). In tali processi svolgono un ruolo centrale due proteine dette Rag-1 e Rag-2 che formano il complesso ricombinasi V(D)J. Rag-1 e Rag-2 mantengono uniti i segmenti genici durnte la ricombinazione e poi

Rag-1 riconosce le sequenze tra leptamero e la sequenza codificante e le taglia. Il taglio viene effettuato solo su una delle eliche e lestremit tagliata si lega allaltra formando una struttura a forcina detta hairpin. Laltra estremit da origine a una terminazione blunt ancora legata alle RSS e non processata. Le due hairpin chiuse, una del V e laltra di J si trovano a essere una di fronte allaltra e vengono a essere modificate con aggiunta di nucleotidi. I geni per Rag sono attivi solo nei linfociti immaturi, in fase proliferativa o matura sono silenti proprio per minimizzare il rischio di rotture inapropriate del Dna. Le hairpin vengono aperte e modificate da un enzima detto Artemis, attivato da Dna-Pk (protein chinasi DNA dipendenti) a sua volta attivato dalle due proteine Ku70 e Ku80 che svolgono un ruolo chiave nel riparo della rottura. Generazione della diversit linfocitaria Lenorme diversificazione dei linfociti B e T dovuta soprattutto al riarrangiamento dei geni per il recettore (IG e TCR). Questa diversificazione dovuta a una diversit combinatoria dovuta semplicemente alle diverse combinazioni possibili tra i diversi segmenti V,J e D e a una diversit giunzionale data dalla aggiunta e rimozione di nucleotidi dai segmenti V, J e D. Questultima mediata da diversi meccanismi: primo meccanismo la rimozione di nucleotidi dalla sequenza germinale alle estremit del gene a opera di una endonucleasi. un secondo la aggiunta di nuove sequenze nucleotidiche alle giunzioni scisse da Artemis. Se la scissione asimmetrica i nucleotidi aggiunti devono essere complementari a quelli del tratto parallelo e tali nucleotidi sono detti nucleotidi P. ultimo meccanismo di diversit giunzionale la aggiunta casuale di un massimo di 20 nucleotidi non codificati da alcuno stampo detti nucleotidi N mediata da unenzima chiamato TdT. La massima diversificazione si ha nella regione CDR3 delle Ig e TCR che si forma nei siti di ricombinazione V(D)J. Proprio per la sua elevata specificit la sequenza dei nucleotidi contenuta in questa regione funziona come marcatore clonale specifico: in questo modo nei tumori linfocitari si pu stabilire quale clone la causa.

37

8.2

Sviluppo dei linfociti B

Durante la maturazione, le cellule della linea linfocitaria B passano attraverso stadi distinti caratter izzati da markers specifici e Ig caratteristiche. Il precusore pi precoce destinato a diventare linfocita B detto linfocita pro-B; queste cellule non producono alcuna Ig e possono essere distinte per lespressione di molecole di superficie quali CD19 e CD10. Le proteine Rag sono espresse per la prima volta a questo stadio e la prima ricombinazione nei geni delle Ig ha luogo nel locus della catena pesante. I passi di questa prima ricombinazione sono: 1. Avvicinamento di un segmento D e un segmento J con eliminazione del DNA interposto

2. Aggiunta di un gene V 5 allunit DJ appena creata: tutto i segmenti V e D interposti vengono eliminati 3. Aggiunta di nucleotidi da parte di TdT 4. Trascrizione di VDJ (se laggiunta di nucleotidi ha generato una sequenza produttiva) Se il riarrangiamento della catena pesante ha successo la cellula smette di essere chiamata linfocita pro-B e passa alla fase di linfocita pre-B . I linfociti pre-B sono cellule B in sviluppo che esprimono la proteina Ig ma che devono ancora riarrangiare il locus per la catena leggera. La catena pesante infatti associata con le proteine 5e VpreB dette surrogati delle catene leggere. Linsieme di catena pesante, catene leggere surrogate e proteine trasduttrici dette Ig e Ig formano quello che prende il nome di recettore pre-B. Nelle cellule con riarrangiamenti in frame del locus IgH il pre-BCR a fornire i segnali di transizione da fase pro-B a fase pre-B. I segnali in arrivo da questo recettore sono responsabili dellespansione in termini numerici di questa popolazione linfocitaria. Numerose molecole segnalatrici sono necessarie sia al BCR che al pre-BCR per superare il checkpoint. Una tirosin chinasi detta Btk (Brutons tyrosine kinase) attivata a valle di questi recettori ed necessaria per la sopravvivenza e la maturazione della cellula oltre la fase di linfocita pre-B. Mutazioni nel gene Btk portano alla patologia detta agammaglobulinemia X-linked. Il complesso pre-BCR regola i successivi riarrangiamenti dei geni Ig in due modi. In primo luogo se una proteina viene prodotta da un locus ricombinato in un cromosoma il pre-BCR blocca la ricombinazione sullaltro cromosoma omologo. Se il primo arrangiamento non invece produttivo viene consentita la ricombinazione V(D)J sullomologo. Grazie a questa attivit in ogni clone solo un allele espresso mentre laltro in configurazione germinale e non utilizzato: ci si riferisce a questo processo con il termine di esclusione allelica. Il secondo sistema in cui il pre-BCR regola la ricombinazione lo stimolo al riarrangiamento del gene per la catena leggera. Nel successivo stadio di maturazione si ha il riarrangiamento dei geni delle catene leggere che producono le rispettive proteine: queste vanno ad associarsi alla catena pesante formando lIgM completa. La cellula a questo punto esprime IgM e viene detta cellula B immatura. La produzione di una catena leggera inibisce il riarrangiamento del locus per la catena e viceversa: le Ig hanno dunque sempre la stessa catena leggera grazie a questo processo detto di esclusione dellisotipo della catena leggera.

38

Sottogruppi diversi di linfociti B sviluppano a partire da progenitori diversi. Le HSC derivate dal fegato fetale sono precursori delle cellule B tipo B-1; le HSC derivate dal midollo danno invece origine alla maggior parte dei linfociti B. Questo secondo gruppo di cellule passa rapidamente attraverso due stadi che lo orienta verso lo sviluppo o di cellule B della zona marginale o di cellule B follicolari . La maggior parte dei linfocti B maturi di tipo follicolare e coesprime le catene pesanti e : presentano dunque sia IgD che IgM nella forma di membrana. Lespressione simultanea delle due diverse catene pesanti dovuta a splicing alternativo dello stesso mRNA. La coespressione di IgD ed IgM si accompagna allacquisizione di competenza funzionale e abilit di ricircolo: a questo punto si parla dunque di linfocita B maturo. I linfociti B maturi naive sono capaci di rispondere agli antigeni e sono destinati a morire in pochi mesi se non incontrano lantigene per il quale hanno grande affinit. Selezione dei linfociti B maturi La selezione nei linfociti T maturi molto ben definita e precisa,

mentre nellambito dei linfociti B un processo molto meno rigido. Le cellule B immature che riconoscono antigeni self con troppa avidit vengono indotte a cambiare la loro specificit tramite il processo di editing recettoriale. In questo processo si ha riattivazione dei geni Rag, con una seconda ricombinazione dei geni della catena leggera: normalmente viene modificata la catena leggera e questo altera la specificit del recettore. Se lediting fallisce si ha selezione negativa, un processo responsabile almeno in parte del mantenimento della tolleranza dei linfociti B; il riconoscimento dellantigene in questo caso porta a morte apoptotica. Quando la transizione a linfocita B maturo I gD + I gM + completata, il riconoscimento dellantigene non porta pi ad apoptosi o a editing ma a proliferazione e differenziazione. Linfociti B-1 e linfociti della zona marginale Molte delle cellule B-1 esprimono la molecola CD5 che pu essere usata come marker; nelladulto grandi quantit di queste cellule si trovano nel peritoneo e nelle mucose. Questi linfociti secernono spontaneamente IgM che spesso reagiscono con polisaccaridi e lipidi: questi anticorpi sono detti anticorpi naturali in quanto prodotti senza immunizzazione, anche se si sospetta che sia la flora intestinale ad indurne la produzione. I linfociti della zona marginale si trovano nella milza e rispondono ad antigeni polisaccaridici generando anticorpi naturali. Il marker per queste cellule CD21.

39

8.3 Maturazione dei linfociti T

8.3.1 Ruolo del timo Il timo il pi importante sito di maturazione dei linfociti T e a dimostrazione di questo: 1. Se viene rimosso il timo in un topo neonato questo non sviluppa linfociti T maturi 2. Lassenza congenita di timo, come nella sindrome di DiGeorge, porta a un ridotto numero di linfociti T in circolo e nei tessuti linfoidi e a pesanti carenze di risposte mediate da questo tipo di cellula Il timo involve spontaneamente con lavanzare dellet, ma poich i linfociti T della memoria hanno una vita anche di oltre ventanni il bisogno di nuovi linfociti T diminuisce negli anziani. I linfociti T in fase di sviluppo nel timo sono detti timociti e non esprimono TCR e nemmeno CD4 o CD8. Nella corteccia timica queste cellule esprimono per la prima volta il TCR ( o ) e per quelle che esprimono il tipo inizia anche la maturazione verso il sottogruppo C D4+ o C D8+ . Lambiente del timo fornisce gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione dei timociti; molti di questi stimoli arrivano direttamente dalle cellule del timo, cio cellule epiteliali, macrofagi o cellule dendritiche. La migrazione dei timociti in questo tipo di ambiente garantisce interazioni fisiche con le altre cellule, passaggio necessario per la maturazione. Due tipologie di molecole prodotte dalle cellule timiche non linfoidi sono importanti per la maturazione: Le molecole MHC di classe I e II espresse su cellule epiteliali e dendritiche. Le interazioni tra i timociti in maturazione e queste molecole sono essenziali per la selezione del repertorio linfocitario. Citochine e chemochine secrete dalle cellule stromali. La pi importante IL-7, inoltre le chemochine CCL19 e CCL21, legandosi al recettore CCR7, guidano i timociti nellattraversamento del timo.

8.3.2

Stadi di maturazione linfocitaria

I timociti corticali pi immaturi, di recente giunti dal midollo, contengono i geni per il TCR in configurazione terminale e quindi non esprimono TCR, CD3 o catene e nemmeno CD4 o CD8: queste cellule vengono dette timociti doppio negativi o cellule pro-T. Come nel caso dei linfociti pro-B, le proteine Rag vengono espresse per la prima volta in questa fase: il riarrangiamento dei geni porta alla transizione verso la fase pre-T e il seguente sviluppo del linfocita . Il riarrangiamento, se svolto con successo, porta alla traduzione di una catena beta funzionante che viene espressa sulla superficie della cellula in associazione con una proteina invariante detta pre-T. Linsieme di catena beta, catena invariante pre-T, proteine CD3 e proteina prende il nome di complesso pre-TCR. I segnali dal pre-

TCR mediano la sopravvivenza dei timociti e la loro espansione proliferativa; i segnali mediano inoltre linizio della ricombinazione del locus per la catena alfa e guidano la transizione da fase doppio negativa a fase doppio positiva. I segnali del pre-TCR inibiscono inoltre ulteriori riarrangiamenti della catena limitando laccessibilit della cromatina. Nello stadio successivo di maturazione i timociti esprimono sia CD4 che CD8 e sono dunque detti timociti doppio positivi. Questi timociti esprimono inoltre il recettore per chemochine CCR7 e quindi migrano verso la midollare del timo. A questa fase la cellula esprime leterodimero completo del TCR. In caso di incapacit di riarrangiare la catena del TCR il timocita muore per apoptosi. Importante, il riarrangiamento del gene per la catena alfa causa la delezione del locus : questa cellula non potr quindi mai pi diventare un linfocita . In virt della neo acquisita capacit di rispondere agli antigeni, i timociti doppio positivi subiscono selezione positiva o negativa: le cellule che subiscono il processo maturano in linfociti C D4+ o C D8+ , quindi diventano timociti singolo positivi. I timociti singolo positivi entrano nella midollare e lasciano infine il timo per andare a popolare i tessuti linfoidi periferici.

40
8.3.3 Processi di selezione Il repertorio linfocitario immaturo non selezionato consiste di linfociti T i cui recettori possono riconoscere qualsiasi antigene peptidico presentato su una molecola MHC qualsiasi. In ogni individuo gli unici linfociti T utili sono quelli specifici per i peptidi non-self presentati dalle molecole MHC self; par allelamente, i linfociti T che riconoscono antigeni self con troppa avidit sono potenzialmente pericolosi perch possono innescare processi autoimmuni. Quando i timociti doppio positivi esprimono per la prima volta il TCR questo incontra peptidi self presentati su molecole MHC delle cellule timiche epiteliali. La selezione positiva il processo per cui i timociti i cui TCR riconoscono blandamente questi peptidi e le molecole MHC associate vengono stimolati a sopravvivere. La selezione negativa invece il processo in cui i timociti i cui TCR riconoscono troppo avidamente i peptidi self o le molecole MHC vengono eliminati per prevenire reazioni contro lorganismo stesso. Selezione positiva Se il TCR di un timocita riconosce le molecole MHC I associate al peptide e allo stesso tempo il CD8 interagisce con lMHC, questo riceve segnali che ne evitano la morte e promuovono il proseguimento della maturazione. Per procedere il linfocita doppio positivo pu continuare ad esprimere CD8 e il TCR ma pu smettere di esprimere CD4; il risultato un linfocita T C D8+ MHC I ristretto. Un processo totalmente analogo avviene per produrre un linfocita C D4+ MHC II ristretto. Durante la transizione da doppio positivo a singolo positivo gli helper diventano C D4+ C D8 mentre i citotossici C D4 C D8+ . Selezione negativa La conseguenza di un riconoscimento troppo avido lo scatenarsi dellapoptosi: questo processo elimina i linfociti T autoreattivi e garantisce la tolleranza al self. La tolleranza indotta nei timociti dal riconoscimento degli antigeni self nel timo detta tolleranza centrale, per differenziarla dalla tolleranza periferica indotta nei linfociti gi maturati. La selezione negativa pu avvenire sia nella fase doppio negativa che nella fase singolo positiva. Nella midollare, le cellule epiteliali del timo esprimono una proteina nucleare detta AIRE che induce lespressione di parecchi geni tessuto-specifici in modo da rendere questi peptidi disponibili per la presentazione. 8.3.4 Linfociti T

Questo tipo di linfociti ha una linea di sviluppo totalmente a parte: una esclude laltra. La diversit del repertorio di queste cellule limitata perch vengono usati solo pochi dei segmenti V, D e J disponibili: questi linfociti servono infatti a difendersi da un numero limitato di microbi il cui incontro molto frequente alle barriere epiteliali. 8.3.5 Cellule NK-T

Le cellule NK-T esprimono TCR non MHC ristretto ma CD1 ristretto: riconoscono infatti antigeni lipidici legati a questa molecola.

Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T

I linfociti T maturi che non hanno mai incontrato lantigene si concentrano negli organi linfoidi secondari dove hanno la possibilit di riconoscere antigeni presentati dalle MHC di cellule dentritiche mature e quindi di attivarsi. Una volta attivate seguono i processi di espansione e la differenziazione in cellule effettrici o della memoria. Sia i linfociti T naive che le cellule dentritiche mature sono attratti nelle aree T per azione di chemochine che interagiscono con i recettori CCR7. Una volta avvenuto lincontro, il riconoscimento dellantigene presentato dalle MHC e linterazione tra le proteine B7 espresse dalla cellula dendritica e il corecettore CD28 determinano lattivazione dei linfociti T. Una volta attivato il linfocita inizia a secernere IL-2 (interleuchina 2), una citochina autocrina che avvia lespansione clonale. Alcuni linfociti T lasciano gli organi linfoidi ed entrano in circolo, altri rimangono l per aiutare i linfociti B a differenziarsi in plasmacellule. Le risposte T terminano principalmente per apoptosi dei linfociti T attivati dovuta alla eliminazione dellantigene che li depriva dello stimolo di sopravvivenza.

41

9.1

Attivazione dei linfociti CD4

Lattivazione presuppone che antigene e linfociti naive si trovino nello stesso tessuto linfoide. Lantigene raggiunge i linfonodi mediante drenaggio linfatico oppure raggiunge la milza attraverso il circolo ematico. Lantigene si sposta trasportato dalle cellule dendritiche e viene presentato in associazione alle molecole MHC di classe II per lattivazione dei CD4. Per lattivazione dei linfociti CD4 sono necessari due segnali: riconoscimento dellantigene associato a MHC e molecole costimolatorie B7-1 e B7-2. Per la proliferazione necessaria inoltre la autosecrezione di IL-2; affinch vi sia secrezione di Il-2 e parallela espressione del suo recettore prima necessario che il linfocita abbia riconosciuto lantigene. In questo modo abbiamo proliferazione delle sole cellule specifiche e necessarie, proliferazione che coinvolge dunque un unico clone cellulare e definita espansione clonale. Con leliminazione degli antigeni la maggior parte dei T attivati muore riportando il numero di linfociti a condizioni basali.

9.2

Attivazione dei linfociti CD8

Affinch vi sia attivazione questa volta serve che lantigene sia presentato da molecole MHC di classe I. I linfociti T CD8 hanno il compito di eliminare cellule infettate. Le risposte da questo gruppo di linfociti sono sollecitate da peptidi microbici presenti nel citosol delle cellule infette: questo pone un problema perch gli antigeni riconosciuti possono essere prodotti anche allinterno di una cellula che non una APC professionale; le cellule dendritiche hanno per la speciale capacit di catturare e ingerire le cellule infette o tumorali e di presentarne gli antigeni ai CD8 naive in un processo detto cross-presentazione. Lattivazione dei CD8 facilitata dallazione dei CD4: nel caso di una forte risposta innata questulti- ma superflua ma diventa indispensabile per risposte a infezioni latenti,tumori ecc. I linfociti T helper producono citochine che stimolano la differenziazione dei CD4, inoltre esprimono la proteina CD40L che viene riconosciuta dal recettore CD40 sulle APC: questo ne aumenta lefficacia nello stimolare la differenziazione dei CD8. Alla pari dei CD4, anche i CD8 vanno incontro ad espansione clonale tuttavia in modo molto pi massiccio: si passa da un linfocita specifico ogni 106 linfociti a uno ogni dieci. In seguito allespansione si ha la differenziazione in cellule effettrici CTL caratterizzate dalla presenza di granuli citoplasmatici legati alla membrana contenenti proteine citolitiche quali la perforina e granzimi. Inoltre sono in grado di produrre citochine tra cui IFN- e TNF. Due fattori di trascrizione sono richiesti per questa nuova espressione genica: T-Bet e Eom.

9.3

Molecole costimolatorie

La differenziazione e proliferazione dei linfociti T naive richiedono molecole costimolatorie espresse dalle APC: in assenza di costimolazione, anche in caso di incontro con lantigene, i linfociti T muoiono per apoptosi in quanto incapaci di rispondere. La molecola meglio caratterizzata sui linfociti T il recettore di membrana CD28 che lega le glicoproteine costimolatorie B7-1 e B7-2 espresse sulle APC; B7-2 espressa costitutivamente mentre B7-1 solo in cellule attivate. Prodotti microbici che legano il TLR e citochine, soprattutto IFN- , aumentano lespressione delle B7, cos come linterazione CD40L:CD40. Le cellule dendritiche sono quelle che presentano la maggior espressione di queste glicoproteine e

quindi rappresentano le cellule pi potenti nellattivare i linfociti T naive. Molti adiuvanti hanno come funzione lo stimolare lespressione di molecole costimolatorie sulle APC. Lassenza di molecole costimolatorie sulle APC contribuisce alla tolleranza verso gli antigeni self, poich ogni APC presenta antigeni self ai linfociti T proprio la mancanza di molecole costimolatorie che assicura che le cellule T non si attivino in associazione alla selezione negativa durante la fase di maturazione. I linfociti T effettori e della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione di B7 e sono quindi in grado di rispondere ad APC in tessuti non linfoidi in cui non sono espresse le B7. Il controllo delle funzioni delle cellule T effettrici effettuato da linfociti T regolatori deputati a inibire le funzioni effettrici. Il meccanismo di azione pro attivatorio dellinterazione CD28:B7 compreso in modo parziale. I segnali prodotti aumentano la produzione di citochine, specialmente lautocrina IL-2, inoltre si ha laumentata espressione della proteina anti apoptotica Bcl-x. Oltre alle molecole attivatrici CD28 esistono anche molecole costimolatorie inibitrici sempre appartenenti alla famiglia delle CD28, primo esempio la CTLA-4. Questa lega sempre molecole B7 tuttavia funge da regolatore negativo nella attivazione. Altra molecola inibitoria PD-1 che lega molecole appartenenti alla famiglia delle B7 chiamate B7-DC e B7-H1 andando a regolare negativamente lattivazione del linfocita. Ultimo recettore costimolatore chiamato ICOS e lega il ligando di ICOS con particolare rilevanza nellattivare funzioni effettrici quali la produzione di IL-10 e IL-4. Lattivazione di CD28 cruciale per dare inizio alla risposta dei linfociti CD4 mentre quella di ICOS per le cellule T effettrici. Si ipotizza che CTLA-4 inibisca rispote acute negli organi linfoidi mentre PD-1 quelle croniche e quelle in tessuti non linfoidi.

42

9.4

Trasduzione del segnale

La trasduzione del segnale in cellule naive attiva geni normalmente silenti i cui prodotti sono responsabili della risposta e delle funzioni del linfocita attivato. Prima abbiamo visto come citochine e molecole costimolatorie fossero un punto chiave nellespansione clonale e nella differenziazione: lattivazione del TCR responsabile invece della specificit.

Il TCR non possiede attivit enzimatica intrinseca e si trova associato al complesso CD3 formando il complesso del TCR che possiede, nel versante citoplasmatico, strutture ITAM: la fosforilazione di questi domini d inizio alla trasduzione del segnale. Si assiste di via di trasduzione parallele che confluiscono nellattivazione di determinati fattori di vie sono principalmente tre: la via della calcineurina che attiva NFAT la via della PKC che attiva NF-B

e alla catena dette domini allattivazione trascrizione;le

 la via delle MAP chinasi che attivano AP-1 Queste tre vie sono a loro volta attivate mediante specifiche tirosin chinasi che mediano il segnale tra TCR e gli enzimi sopra citati. Tirosin chinasi Una volta formato il complesso del TCR quando il recettore si lega allantigene e MHC una tirosin chinasi chiamata Lck associata a CD4 e CD8 si sposta vicino alle sequenze ITAM del complesso CD3 e della catena attivandosi e fosforilando le tirosine in esse contenute. Queste tirosine fosforlate fungono da ancoraggio per unaltra tirosin chinasi chiamata ZAP -70 che una volta legatasi viene anche essa fosforilata da Lck attivandosi e andando a fosforilare numerosi substrati che fungono da proteine adattatrici di altre molecole coinvolte nella trasduzione del segnale. Altro gruppo di chinasi importanti sono le PI-3 chinasi attivate dalla costimolazione di CD28: questi enzimi catalizzano la generazione di fosfatidil inositolo tre fosfato (PIP3 ) a partire dal PIP2 di membrana. Le attivit delle chinasi citate sono regolate da specifiche tirosine fosfatasi reclutate dal complesso TCR e chiamate SHP-1 e SHP-2 che inibiscono la trasduzione del segnale e unaltra la SHIP. Formazione della sinapsi immunologica La regione di contatto tra il linfocita T e la sua APC prende il nome di sinapsi immunologica. Le molecole che vengono subito spostate verso il centro di questa struttura sono il complesso TCR, i corecettori CD4 o CD8, i recettori per i costimolatori (CD28) e vari enzimi associati. La segnalazione viene avviata allinterno di questa struttura sovramolecolare. Reclutamento e attivazione delle proteine adattatrici ZAP-70 si porta a fosforilare parecchie proteine adattatrici in grado di legarsi a molecole segnalatorie. Le proteine adattatrici presentano domini ricurrenti di tipo SH2 o SH3 che consentono loro di formare cluster di enzimi in tempi rapidi. Un evento chiave dellattivazione del linfocita T la fosforilazione da parte di ZAP-70 della proteina adattatrice LAT, la quale in grado di legarsi direttamente alla fosfolipasi C 1; la fosfolipasi una molecola fondamentale che recluta altre proteine tra le quali SLP-76 e Grb-2. Via della MAP chinasi La via Ras iniziata a seguito del legame del TCR e porta allattivazione di ERK, membro fondamentale della famiglia delle MAP kinasi che porta alla mobilitazione di diversi fattori di trascrizione. Ras nella sua forma inattiva legato ad una molecola di GDP che, quando viene sostituita da una di GTP, responsabile dellattivazione. Lattivazione di Ras coinvolge le proteine LAT e Grb-2, in quanto la catena di eventi la seguente: 1. Fosforilazione di LAT da parte di ZAP-70 2. Reclutamento di Grb-2 su LAT 3. Reclutamento del fattore Sos da parte di Grb-2/LAT 4. Scambio di GTP per GDP su Ras grazie alla catalisi di Sos 5. Attivazione delle MAP kinasi Esistono tre MAP kinasi principali nei linfociti T, delle quali il prototipo ERK. Lattivazione di ERK lo porta a traslocare nel nucleo e a fosforilare una proteina detta Elk, la quale stimola la trascrizione di Fos, un componente del fattore di trascrizione AP-1. In parallelo allattivazione lungo la via Ras si ha il reclutamento di una piccola proteina detta Vav, la quale scambia GTP per GDP su una proteina detta Rac. Rac in forma attiva inizia una cascata segnalatoria parallela che termina nellattivazione della MAP kinasi JNK che si porta a fosforilare c-Jun, il secondo membro del fattore di trascrizione AP-1.

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44

Segnali calcio e fosfolipasi dipendenti La fosfolipasi C 1 un enzima citosolico reclutato da LAT fosforilata e fosforilato da ZAP-70 e altre chinasi. La fosfolipasi fosforilata si porta ad idrolizzare il fosfolipide di membrana PIP2 producendo cos IP3 e DAG. Il ruolo fisiologico di IP3 laumento del calcio citoplasmatico per apertura di canali nel reticolo endoplasmatico; questa fuoriuscita dal reticolo attiva i canali CRAC che facilitano larrivo di altro calcio dal reparto extracellulare (difetti nel gene che codifica Orai, componente del canale CRAC, sono alla base di alcune rare immunodeficienze umane). Il calcio citoplasmatico agisce da molecola segnalatoria legandosi a varie calmoduline delle quali una fondamentale la calcineurina. Il DAG attiva invece lenzima PKC che coinvolto nellattivazione e nella traslocazione nucleare di NF-B.

Attivazione dei fattori di trascrizione I fattori di trascrizione che sono attivati nei linfociti T a seguito del riconoscimento antigenico sembrano critici per quasi tutte le risposte di queste cellule e sono: NFAT Questo fattore richiesto per lespressione di IL-2, IL-4, e TNF. Questo fattore presente in for ma inattiva serina-fosforilata nei linfociti T a riposo. La sua attivazione legata alla calcineurina, che defosforila la molecola e ne svela la sequenza di localizzazione nucleare. AP-1 Questo fattore in realt una famiglia di molecole leganti DNA. La molecola meglio compresa quella formata dalle subunit c-Jun e Fos. AP-1 sembra essere un punto di convergenza di

parecchie vie segnalatorie attivate dal riconoscimento antigenico. NF-B Questo fattore essenziale per la sintesi di parecchie citochine. Nei linfociti a riposo la molecola presente in complesso con inibitori specifici (IB) che ne bloccano lingresso nel nucleo; i segnali del TCR causano lubiquitinazione degli inibitori, quindi la loro degradazione e quindi il ripristino della capacit del fattore di entrare nel nucleo.

9.5

Attenuazione della risposta

I meccanismi inibitori sono mediati da varie strategie quali il reclutamento delle fosfatasi SHP-1, lattivazione dei recettori inibitori di famiglia CD28 e il reclutamento di proteine dette E3 ubiquitin ligasi che degradano certe molecole. Recettori inibitori Il prototipo del recettore inibitorio CTLA-4, di cui per si sa poco del meccanismo di azione. Normalmente questa molecola sequestrata in vescicole intracellulari che vengono rapidamente mobilitate con la formazione della sinapsi immunologica. Nella sinapsi CTLA-4 potrebbe competere con CD28 per legare le molecole B7 o reclutare fosfatasi che bloccano lattivazione dei domini ITAM. Laltro recettore inibitorio di interesse PD-1, indotto in linfociti B, T e monociti a seguito dellattivazione. PD-1 ha due ligandi, PD-L1 e PD-L2, omologhi ai B7 ed espressi su cellule dendritiche attivate, monociti e altre cellule. Il recettore contiene sul lato citoplasmatico dei domini ITIM che contribuiscono al reclutamento delle fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che attenuano il segnale.

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Capitolo 10. Attivazione delle cellule B e produzione di anticorpi

10.1 Caratteristiche generali della risposta morale
Il processo di attivazione delle cellule B sequenziale. I linfociti B maturi e in grado di rispondere agli antigeni si sviluppano da precursori midollari prima di incontrare lantigene e popolano poi i tissuti linfoidi periferici, sede della futura interazione antigenica. Gli antigeni legano le IgM e IgD di membrana sui linfociti naive e li attivano; lattivazione pu avvenire sia in dipendenza che in indipendenza dai linfociti T. Lattivazione pu portare a proliferazione, cio allespansione del clone antigene specifico, e a differenziazione, cio alla generazione di plasmacellule e cellule della memoria. Alcune cellule B attivate iniziano a produrre anticorpi diversi da IgM e IgD in un fenomeno detto switching (switching dellisotipo della catena pesante). I linfociti in grado di produrre anticorpi con la pi alta affinit per lantigene vengono inoltre preferenzialmente espansi: si parla di maturazione dellaffinit. Un singolo linfocita pu, in sette giorni, dare origine a quattromila plasmacellule che producono oltre 1012 anticorpi al giorno. Le risposte anticorpali agli antigeni proteici richiedono i linfociti T helper C D4+ che riconoscono gli antigeni e hanno ruolo fondamentale nellattivazione dei B. Per questo motivo le proteine sono classificate come antigeni timo dipendenti. Le risposte anticorpali agli antigeni multivalenti, con epitopi polisaccaridici e lipidici, non richiedono i linfociti helper. Per questo motivo gli antigeni polisaccaridici e lipidici sono definiti timo indipen- denti. I linfociti attivati differenziano in plasmacellule, alcune delle quali continuano a produrre anticorpi per anni, e in cellule della memoria. Le risposte umorali originano agli organi linfoidi periferici, ma alcune plasmacellule migrano da questi al midollo osseo dove si stabiliscono per anni producendo bassi livelli di anticorpi che forniscono protezione immediata per i microbi da essi riconosciuti. Lo switching degli isotipi e la maturazione dellaffinit sono tipici delle risposte T -dipendenti agli antigeni proteici. Lo switching stimolato direttamente dai segnali in arrivo dalle cellule T, tra i quali la molecola CD40L e varie citochine. La maturazione riguarda la generazione di mutazioni somatiche ad alta frequenza in geni Ig V riarrangiati e la consequente selezione delle cellule B con grande affinit per lantigene originale. La natura della risposta umorale varia inoltre in funzione del distretto anatomico: ad esempio i tessuti linfoidi mucosali sono adattati a produrre

grandi quantit di IgA. Le risposte anticorpali primarie e secondarie differiscono quantitativamente e qualitativamente. Le risposte primarie derivano dallattivazione di cellule B naive, le secondarie dalla stimolazione di cloni espansi delle cellule della memoria; per questo motivo le risposte secondarie sono pi rapide e legate a quantit maggiori di anticorpi. In aggiunta a questo sia lo switching che la maturazione aumentano con ripetute esposizioni allo stesso antigene. Set differenti di linfociti rispondono preferenzialmente a diverse tipologie di antigene. Le cellule B follicolari degli organi linfoidi periferici preferiscono gli antigeni proteici; le cellule della zona marginale della milza riconoscono antigeni multivalenti.

10.2 Riconoscimento dellantigene e attivazione antigeneindotta

I linfociti circolano attraverso i follicoli degli organi linfoidi periferici in cerca del loro antigene. Lin- gresso nei follicoli guidato dalla chemochina CXCL13 prodotta dalle cellule dendritiche follicolari e da quelle stromali; questa molecola si lega al recettore CXCR5 e attrae i linfociti nella giusta sede. La sopravvivenza dei linfociti follicolari dipende dai segnali in arrivo dal B cell receptor (BCR) ma anche da quelli mediati da una citochina detta BAFF (appartenente alla famiglia del TNF); BAFF e il ligando correlato, APRIL , possono attivare altri due recettori, TACI e BCMA, che hanno ruolo nelle fasi pi tardive della maturazione. Gli antigeni entrano negli organi linfoidi tramite le APC o in forma solubile e attivano i linfociti grazie allinterazione con il BCR. Questo recettore ha due ruoli nella fase di attivazione: 1. Laccumulo di recettori antigene-indotto rende possibile la segnalazione biochimica 2. Il recettore lega e internalizza lantigene per processarlo in peptidi per la presentazione ai linfociti T helper

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10.2.1

Trasduzione del segnale

I recettori dei linfociti B naive, cio IgM e IgD, hanno code citoplasmatiche troppo corte per trasdurre il segnale, il compito viene infatti svolto da altre due molecole dette Ig e Ig . Queste molecole sono tra loro legate da ponti disolfuro e sono associate in modo non covalente alla membrana; sono anche richieste per lespressione superficiale delle molecole Ig e insieme ad esse formano il complesso recettoriale delle cellule B (complesso BCR). Ig e Ig sono dunque analoghe a CD3 e per i linfociti T. I domini citoplasmatici di queste due molecole contengono i motivi ITAM gi visti per le cellule T e sono anche blandamente associati a tirosin chinasi della famiglia Src.

Il cross-linking delle Ig di membrana porta le chinasi citoplasmatiche ad avvicinarsi e questo le attiva

facendo loro fosforilare i domini ITAM. La fosforilazione di ITAM fornisce un sito di attacco per i domini SH2 della tirosin chinasi Syk, lequivalente nelle cellule B di ZAP-70 dei linfociti T. Syk attivata va a fosforilare dei residui di tirosina su una proteina adattatrice detta SLP-65 facilitando il reclutamento su questa di altri domini SH2 di vari enzimi. Le principali molecole che interagiscono con SLP-65 sono: 1. Il fattore SOS viene reclutato da SLP-65 e catalizza la sostituzione di GDP in GTP sulla proteina RAS e sulla proteina RAC. Queste proteine in forma GTP-legata attivano la via della chinasi JNKMAP. 2. Una fosfolipasi, PLC 2, viene attivata quando si lega a SLP-65 e viene fosforilata da Syk e Btk. Questo enzima si porta a demolire il fosfatidilinositolo di membrana (PIP2) generando inositolo 3-fosfato e diacilglicerolo. Linositolo mobilita il calcio, il DAG in presenza di calcio attiva la protein chinasi C che fosforila varie altre proteine. 3. La protein chinasi C fosforila una proteina detta CARMA1 contentente un dominio CARD che ne media le interazioni con le altre proteine. Le attivit di CARMA1 culminano infine con lattivazione del complesso IKK (IB chinasi); il complesso critico per lattivazione di NF-B in quanto in grado di fosforilare IB, un inibitore di NF-B, e destinarlo al proteasoma: in questo modo NF-B libero di entrare nel nucleo. 4. Questa serie di cascate porta allattivazione di fattori di trascrizione che inducono lesp ressione di geni i cui prodotti sono richiesti per le risposte delle cellule B. Queste vie di segnalazione funzionano con qualsiasi recettore Ig, in quanto tutti si associano ad Ig e Ig per poter trasdurre il segnale. 10.2.2 Ruolo dei recettori CR2/CD21 come corecettori per le cellule B

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I linfociti B esprimono un recettore per la proteina del complemento C3d che prende il nome di CR2 o CD21. Il complesso C3d+antigene o quello C3d+antigene+anticorpo lega il linfocita in modo che lIg riconosca lantigene e CR2 riconosca la proteina del complemento. CR2 espresso sotto forma di complesso con altre due proteine, CD19 e CD81: questo complesso viene spesso chiamato complesso corecettoriale delle cellule B perch lega C3d allo stesso momento in cui BCR lega lantigene. Il legame di C3d al corecettore porta CD19 in prossimit delle chinasi associate al BCR e la coda di CD19 diventa in questo modo fosforilata; la fosforilazione risulta nel reclutamento della chinasi Lyn, che pu amplificare il segnale di BCR fosforilando direttamente i domini ITAM. CD19 fosforilata attiva anche altre vie di segnalazione, tra le quali una legata a P I P3 , che aumentano ulteriormente i pathway aperti dalle Ig. Il risultato netto un grande stimolo della risposta della cellula B stimolata.

10.2.3

Risposte funzionali dei linfociti B agli antigeni

Il riconoscimento dellantigene stimola lingresso delle cellule nella fase G1 del ciclo cellulare, uscendo

cos dalla precedente fase G0. La sopravvivenza delle cellule B viene migliorata grazie allinduzione di vari geni anti apoptotici. I linfociti B attivati mostrano unaumentata espressione di molecole MHCII e di costimolanti (B7-2 prima e B7-1 dopo, ed questa la ragione per cui sono in grado di attivare i linfociti helper). Lespressione dei recettori per le citochine derivanti dai linfociti T viene anchessa aumentata in modo da rendere le cellule B recettive, inoltre cambia anche lespressione dei recettori per le chemochine in modo da permettere la mobilitazione. Limportanza del BCR nelle risposte diversa a seconda dellantigene. Gli antigeni multivalenti hanno di solito parecchi epitopi uguali sulla stessa molecola e sono quindi in grado di stimolare in modo efficace il linfocita. Gli antigeni peptidici sono invece spesso dotati di un solo epitopo e quindi non sono in grado di stimolare il linfocita: in questo caso il BCR si limita ad internalizzare lantigene per presentarlo al linfocita helper, il quale poi si occuper di attivare la cellula B.

10.3

Risposte anticorpali helper-dipendenti ad antigeni proteici

48

Le prime fasi delle risposte helper -dipendenti avvengono ai bordi delle zone T e dei follicoli primari e risultano nella proliferazione delle cellule B, nella secrezione di anticorpi iniziale e in un limitato switching. Le fasi pi tardive avvengono invece nei centri germinativi allinterno dei follicoli linfoidi e risultano nella maturazione dellaffinit, nella generazione di cellule della memoria e nello switching pi evidente. 10.3.1 Sequenza degli eventi nelle risposte anticorpali T-dipendenti 1. Assunzione dellantigene dalle cellule dendritiche e presentazione ai linfociti T helper. 2. Attivazione degli helper e espressione di CD40L e citochine. 3. Migrazione degli helper verso il follicolo grazie alle chemochine. 4. Attivazione delle cellule B da antigeni solubili o presentati dalle cellule dendritiche. 5. Processamento e presentazione dellantigene delle cellule B e migrazione verso la zona T grazie ai recettori per chemochine. 6. Interazione tra cellule B e T e attivazione delle prime grazie a CD40L e citochine. 7. Inizio dello switching e della secrezione di Ig. 8. Migrazione delle cellule B attive verso il follicolo, formazione di centri germinali nel follicolo. Nei centri germinali si ha marcato switching, mutazioni somatiche, maturazione dellaffinit e generazione delle cellule della memoria. 9. Generazione di plasmacellule a lunga vita che migreranno poi nel midollo osseo. 10.3.2 Attivazione degli helper Le cellule che per prime riconoscono lantigene sono le cellule dendritiche, che lo processano e lo caricano sulle molecole MHCII per farlo riconoscere ai linfociti C D4+ naive. Le cellule dendritiche sono inoltre stimolate a produrre B7-1 e B7-2 che forniranno secondi segnali per lattivazione degli helper. I linfociti attivati dalle cellule dendritiche sono indotti a proliferare, esprimere CD40L e secernere varie citochine. Queste cellule modificano inoltre il loro set di recettori per chemochine, aumentando lespressione di CXCR5 e diminuendo quella di CCR7; in questo modo la cellula segue il gradiende di concentrazione di CXCL13, prodotto dalle cellule dendritiche follicolari, che la porta nel follicolo. 10.3.3 Presentazione dellantigene dalle cellule B e migrazione Il BCR un recettore ad alta affinit in grado di internalizzare efficacemente lantigene per endocitosi rendendolo disponibile al processamento e al caricamento sullMHCII. Sono molti i segnali secondari che permettono ad un linfocita B di rispondere ad antigeni proteici dannosi e non a quelli innocui: 1. Laiuto dagli helper viene fornito solo da linfociti T che hanno risposto a cellule dendritiche che esprimono B7; lespressione di B7 a sua volta indotta dal coinvolgimento del TCR che riconosce strutture non-self.

2. I linfociti B percepiscono direttamente i patogeni grazie alla presenza di uno o pi TLR, tra i quali TLR4, TLR5 e TLR9. I linfociti B antigene attivati downregolano lesp ressione di CXCR5 e aumentano lespressione di CCR7: questo comportamento, opposto a quello dei linfociti T C D4+ , li attira verso linterfaccia T -B del linfonodo. In una qualsiasi risposta umorale le cellule B specifiche per lantigene che ha iniziato la risposta vengono attivate preferenzialmente; esistono varie ragioni per giustificare questo fatto: 1. Solo i linfociti B le cui molecole Ig legano lantigene possono ricevere i segnali di attivazione. 2. I linfociti B sono in grado di presentare il loro antigene a concentrazioni anche 106 volte minori rispetto allantigene che non riconoscono in quanto linternalizzazione via BCR estremamente efficiente. 3. I linfociti B nei coniugati cellula T -cellula B sono esposti ai segnali portati da CD40L e da alte concentrazioni di citochine T -derivate, in parte per via della formazione delle sinapsi immunologiche. 10.3.4 Effetto aptene-carrier Gli apteni, come il dinitrofenolo, sono piccole molecole che possono legare anticorpi specifici ma non sono immunogeni da soli. Se un aptene si lega ad una proteina carrier il loro complesso diventa per immunogeno. Tre sono le caratteristiche importanti delle risposte anticorpali verso questi complessi: 1. Sono necessarie sia cellule B specifiche per laptene che per il carrier. 2. Per avere risposta carrier e aptene devono essere fisicamente associati, la somministrazione separata non fornisce reazione. 3. Linterazione MHCII ristretta, cio gli helper collaborano solo con i linfociti B che esprimono queste molecole che vengono riconosciute come self dai T. I linfociti aptene-specifici legano lantigene attraverso il determinante dellaptene, lo internalizzano e presentano i peptidi derivati dalla proteina carrier ai linfociti T carrier -specifici: i due linfociti cooperanti riconoscono dunque due epitopi diversi dello stesso antigene. Leffetto carrier -aptene alla base dello sviluppo dei vaccini coniugati. 10.3.5 Attivazione delle cellule B helper-dipendente I linfociti helper attivati esprimono una molecola detta CD40L, il cui recettore CD40, espresso sui linfociti B che presentano lantigene: linterazione tra i due alla base dellattivazione. CD40 un membro della famiglia dei recettori TNF; CD40L una proteina trimerica. CD40 espresso in modo costituivo dalle cellule B mentre il suo ligando viene espresso dagli helper solo dopo che questi sono stati attivati. Il legame tra ligando e recettore induce alterazioni conformazionali dei trimeri di CD40 e questo causa lassociazione di una proteina citosolica detta TRAF; TRAF inizia una cascata enzimatica che porta allattivazione e alla traslocazione nucleare dei fattori di trascrizione, tra i quali NF-B e AP-1. Linduzione dei fattori di trascrizione CD40-dipendente cruciale per la formazione dei centri germinativi e anche per lespressione di un gene codificante la deaminasi attivazione-indotta (AID), un enzima critico per lo switching e le mutazioni somatiche. Questo sistema di risposta cellulare contatto-mediata il meccanismo generale di attivazione di cellule bersaglio da parte degli helper e non dunque unico per la produzione di anticorpi. Il virus di Epstein-Barr (EBV) infetta i linfociti B e ne induce proliferazione che pu portare a linfoma. La coda citoplasmatica di una proteina trasformante del virus, LMP1, si associa alle stesse molecole TRAF attivate da CD40 e in questo modo stimola la proliferazione dei linfociti. I linfociti helper attivati secernono citochine che agiscono insieme a CD40L per stimolare la proliferazione e la produzione di anticorpi di diversi isotipi. Le citochine servono per due scopi principali in ambito di risposte anticorpali: 1. Aumentano la proliferazione e la differenziazione delle cellule B

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2. Promuovono lo switching verso differenti isotipi delle catene pesanti Il riconoscimento dellantigene nei linfociti B aumenta lespressione dei recettori per le citochine, molecole presenti ad alte concentrazioni nelle sedi di contatto con il linfocita helper. Le citochine helper -derivate, soprattutto IL-2, IL-4 e IL-21, potenziano proliferazione e differenziazione dei linfociti B, allo stesso modo delle citochine BAFF e APRIL della famiglia del TNF. La citochina IL-6, prodotta da macrofagi, linfociti T e altre cellule, invece un fattore di crescita per cellule B gi differenziate e secernenti anticorpi. Lattivazione contribuisce alliniziale formazione di foci extrafollicolari di cellule B attivate che possono andare incontro a differenziazione e switching dellisotipo. Ognuno dei foci formati contiene qualche centinaio di plasmablasti e plasmacellule, i cui anticorpi prodotti possono contribuire a for mare immunocomplessi che hanno un ruolo nelliniziare la reazione di formazione del centro germinale. 10.3.6 Reazione del centro germinativo Liniziale risposta agli antigeni dei linfociti B si ha nella zona tra i follicoli linfoidi e le zone T; dopo quattro-sette giorni dallesposizione alcuni dei linfociti B attivati migrano in profondit del follicolo e iniziano a proliferare rapidamente, formando il centro germinativo. Allinterno del centro germinativo la zona scura contiene cellule B rapidissime a proliferare: in cinque giorni un singolo linfocita pu generare cinquemila cellule figlie. Ogni centro germinativo contiene cellule derivate da un unico clone o al massimo da un paio. La progenie, formata da cellule pi piccole, va incontro a differenziazione e selezione nella zona chiara del centro.

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Larchitettura dei follicoli linfoidi e dei centri germinativi dipende dalla presenza delle cellule dendritiche follicolari. Le FDC si trovano solo nei follicoli ed esprimono recettori per il complemento (CR1, CR2 e CR3) e per Fc ma non esprimono molecole MHCII. Le lunghe code citoplasmatiche di queste cellule formano unimpalcatura attorno alla quale si forma il centro germinativo. Le cellule B proliferanti

si posizionano nella zona scura del centro, che presenta poche FDC, mentre la progenie si distribuisce nelle zone pi esterne. La formazione del centro germinativo impedita in soggetti con difetti nello sviluppo dei linfociti T o con mutazioni in CD40 o CD40L; questo fenomeno dovuto al fatto che il centro viene costruito solo a partire da cellule B attivate, e linterazione CD40:CD40L fondamentale nelle prime fasi dellattivazione. 10.3.7 Switching dellisotipo delle catene pesanti

In risposta a CD40 e alle citochine, alcune delle cellule figlie dei linfociti B attivati (che esprimono solo IgD ed IgM) vanno incontro a switching, portando alla produzione di altre catene pesanti quali , , . In soggetti KO per CD40 si nota come lo switching sia deficitario e le risposte anticorpali siano dominate da anticorpi IgM. Le citochine hanno ruolo essenziale nello switching di particolari isotipi. IL-4 il principale agente inducente la produzione di IgE, mentre la produzione di IgG2 nel topo dipendente dallinterferone secreto da linfociti T e cellule NK. Il principale meccanismo grazie al quale CD40 induce lo switching lo stimolo alla trascrizione del gene AID. Il gene AID viene dunque trascritto dietro stimolo di CD40, sono per le varie citochine a indurre i fattori di trascrizione che identificano quale catena pesante sar il target dello switching mediato da AID. Lo switching in risposta a diverse tipologie di microbo regolato dal tipo di cellula helper che viene attivata dai microbi stessi, ad esempio: Batteri con capsule ricche in polisaccaridi stimolano la produzione di IgM i quali poi favoriscono il complemento, la fagocitosi e lopsonizzazione. Gli antigeni polisaccaridici, che non necessitano laiuto degli helper, stimolano IgM. Molti virus e batteri stimolano la produzione di IgG, che bloccano ling resso dei patogeni nella cellula e ne facilitano la fagocitosi. Virus e batteri attivano gli helper del sottogruppo TH 1 che producono interferone , il principale induttore di switching a catena nelle cellule B. I parassiti elmintici generano risposte di tipo principalmente IgE, anticorpi che partecipano alluccisione eosinofilo-mediata dei patogeni. Gli anticorpi IgE sono anche alla base delle reazioni allergiche. Gli elminti attivano gli helper del sottogruppo TH 2 i quali producono IL-4, principale induttore di switching verso la catena pesante . In aggiunta a questo meccanismo, anche la sede anatomica influenza lo switching. I linfociti B delle mucose producono soprattutto IgA, lanticorpo pi efficace nellessere trasportato attraverso gli epiteli; lo switch stimolato dal transforming growth factor (TGF- ) prodotto da parecchie cellule nelle mucose. Il recettore TACI (substrato sia per APRIL che per BAFF) ha anchesso un ruolo critico nello switch verso IgA. Il principale meccanismo molecolare di switching un processo detto ricombinazione switch in cui il segmento genico riarrangiato VDJ di una cellula B si ricombina con un gene della regione C a valle mentre il DNA in mezzo viene eliminato. Questi eventi ricombinatori coinvolgono sequenze nucleotidiche dette regioni switch poste negli introni J-C alle estremit 5 di ogni locus CH ; queste regioni sono lunghe 1-10kb, contengono numerose ripetizioni di GC e si trovano a monte di ogni gene codificante catene pesanti ad eccezione del gene . A monte di ogni regione di switch c un piccolo esone detto esone I (per iniziatore della trascrizione) preceduto da un promotore. CD40 e le citochine stimolano lo switching rendendo pi accessibile il DNA di una specifica regione C e inducendo poi la trascrizione attraverso lesone I, la regione di switch e lesone CH . Questi trascritti, detti trascritti germinali, non codificano proteine ma hanno un ruolo fondamentale nello switch. La trascrizione germinale accompagnata dallaccessibilit di un particolare gene C a rotture e riparazioni del DNA; come risultato lesone riarrangiato VDJ giusto a monte della regione di switch si accoppia con la regione C a valle trascrizionalmente attiva. Lenzima chiave richiesto per lo switching la deaminasi attivazione-indotta (AID). AID una DNA deaminasi che converte la citosina in uracile allinterno di template di DNA a singolo filamento. La trascrizione produce sempre una piccola bolla di DNA a singolo filamento mentre il complesso della polimerasi scorre lungo il filamento codificante; dato che il DNA nella bolla a singolo filamento ecco che pu subire lazione di AID. Un enzima detto uracil N-glicosilasi rimuove a questo punto i residui di uracile creati da AID generando siti abasici che vengono eliminati dallendonucleasi Ape1. I buchi

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su entrambi i filamenti contribuiscono alle rotture sia alla regione S che al locus a valle coinvolto nello switching di quel particolare isotipo. Lesistenza di rotture nelle due regioni di switch causa la delezione del DNA interposto e lunione delle due giunzioni da parte dei sistemi di riparazione di questo tipo di danno. 10.3.8 Maturazione dellaffinit

Il processo di maturazione dellaffinit genera anticorpi con crescente capacit di legare gli antigeni e quindi di neutralizzare i microbi. I linfociti helper e le interazioni CD40:CD40L sono richieste per procedere e quindi la maturazione avviene solo in risposta ad antigeni proteici T-dipendenti. Nella zona scura proliferativa dei centri germinativi i geni IgV vanno incontro a mutazioni puntifor- mi ad un tasso di una ogni 103 coppie di geni, cio da mille a diecimila volte pi frequentemente del normale: questo significa che ci sar una mutazione nelle regioni V in media ogni divisione cellulare. Le mutazioni nel gene continuano anche nella progenie, quindi ogni clone di cellula B pu accumulare parecchie mutazioni nella sua vita al centro germinativo. I meccanismi di mutazione somatica sono poco conosciuti. Si sa che il DNA Ig VDJ diventa altamente mutabile probabilmente a seguito di legame con fattori mutageni. Non si sa se i centri germinativi forniscano segnali contatto-mediati o citochine per stimolare le mutazioni ma si sa che lenzima AID fondamentale. I residui di uracile creati da AID possono essere convertiti a residui di timina o possono essere eliminati dalla glicosilasi, in ogni caso favorendo la mutazione. In sostanza si crede che le ripetute esposizioni allantigene generino parecchie mutazioni, di cui la maggior parte inutili mentre alcune effettivamente portano ad un anticorpo pi efficace: il passo successivo dunque la selezione delle cellule che producono gli anticorpi migliori. Le cellule dendritiche follicolari dei centri germinativi presentano gli antigeni, e le cellule B che sono in grado di legarli con alta affinit vengono selezionate per la sopravvivenza. La prima fase di risposta allantigene la produzione di anticorpi, alcuni dei quali formano complessi con lantigene e attivano il complemento. Le FDC hanno recettori per la porzione Fc dellanticorpo e per i prodotti di attivazione del complemento; questi recettori legano e presentano gli antigeni complessati con anticorpi o prodotti del complemento. Nel frattempo i linfociti B dei centri germinativi che hanno subito le mutazioni migrano verso la zona ricca di FDC: queste cellule moriranno di apoptosi se non verranno salvate dal riconoscimento dellantigene. In questo modo le cellule che riconoscono in maniera specifica lantigene mostrato sulle FDC sono selezionate per vivere. Laumento della produzione di anticorpi va di pari passo con leliminazione dellantigene che sar sempre pi raro sulle FDC: si ha dunque necessit di linfociti B sempre pi specifici per la sopravvivenza perch dovranno avere unaffinit sempre pi alta per legare i pochi antigeni rimasti. Le mutazioni somatiche avvengono nella zona scura basale del centro germinativo nei centroblasti che contengono lenzima AID; terminata la mutazione le cellule migrano verso la zona chiara apicale dove vengono selezionate dalle FDC e possono andare incontro ad un ulteriore switching. Le cellule escono infine dal centro germinativo e diventano cellule della memoria o plasmacellule ad altissima affinit. 10.3.9 Differenziazione dei linfociti B in plasmacellule secernenti anticorpi

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La sintesi degli anticorpi, come la proliferazione dei linfociti B, stimolata da segnali mediati da CD40 e dalle citochine. Molte citochine, tra le quali IL2, IL4 e IL6, sono state individuate come stimolatrici di questo processo. Allinterno degli organi linfoidi le plasmacellule si trovano soprattutto in sede extrafollicolare, come la polpa rossa della milza o la midollare del linfonodo. Le plasmacellule sono linfociti B differenziati in maniera terminale e destinate alla sola produzione di anticorpi. Lo sviluppo di queste cellule dipende allinduzione di un fattore di trascrizione detto BLIMP-1. Esistono due tipologie di plasmacellula. Le plasmacellule a vita breve vengono ritrovate negli organi linfoidi secondari e nei tessuti non linfoidi periferici. A seguito della reazione del centro germinale alcune plasmacellule ottengono la capacit di dirigersi al midollo osseo dove vengono mantenute grazie al recettore BCMA, e queste cellule prendono il nome di plasmacellule a vita lunga. Tipicamente dopo due o tre settimane dallinfezione da parte di un antigene T -dipendente il midollo diventa una sede chiave di produzione di anticorpi. Le plasmacellule midollari continuano a secernere antibodi per mesi o anni dopo la scomparsa dellantigene per fornire protezione immediata in caso di nuovo incontro; quasi la met degli anticorpi circolanti di un adulto prodotto da plasmacellule a vita lunga. Gli anticorpi secreti entrano nella circolazione e nelle secrezioni delle mucose ma le cellule che li hanno prodotti non sono circolanti.

Le molecole Ig secrete e di membrana differiscono per via della loro regione carbossi terminale. Ad esempio nelle IgM secrete il dominio C 4 seguito da una coda contenente aminoacidi polari. Nelle IgM di membrana invece lo stesso dominio seguito da una sequenza pi corta e idrofobica transmembrana e da una coda citoplasmatica di tre aminoacidi. La transizione da Ig di membrana a secreta riflette una variazione nel processing dellRNA messaggero per la catena pesante. Il trascritto primario di tutte le cellule B produttrici di IgM contiene infatti VDJ, i quattro esoni C per i domini costanti e due esoni per i domini citoplasmatici e transmembrana. Il processing dellRNA determina se gli esoni transmembrana e citoplasmatico saranno o meno inclusi nellmRNA finale. In sostanza tutti i linfociti B possono sintetizzare anticorpi sia di membrana che di secrezione; con il procedere della differenziazione la quantit di anticorpi di secrezione tende per ad aumentare. I segnali che regolano il processo dello splicing alternativo non sono conosciuti. Nota: la forma secretoria della catena pesante raramente espressa, infatti le IgD sono tipicamente proteine di membrana.

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10.3.10 Generazione di cellule della memoria e risposte umorali secondarie

Alcuni dei linfociti B attivati acquisiscono labilit di sopravvivere per lunghi periodi apparentemente senza stimolazione antigenica: sono le cellule della memoria. Alcune di queste cellule possono rimanere negli organi linfoidi mentre altre ricircolano tra la milza ed i linfonodi. Le cellule della memoria tipicamente portano recettori antigenici ad alta affinit e molecole Ig di isotipi switch con pi frequenza dei linfociti naive. Molte delle caratteristiche delle risposte umorali secondarie riflettono la precedente attivazione dei linfociti B da parte degli helper C D4+ . Lo switching delle catene pesanti tipico delle risposte secondarie in quanto indotto dai linfociti helper e dalle loro citochine. La maturazione dellaffinit anchessa secondaria allattivazione T -dipendente dei linfociti B. Per neutralizzare molti microbi e le loro tossine sono richiesti anticorpi ad alta affinit; un vaccino effettivo contro tali microorganismi deve dunque indurre maturazione dellaffinit e produzione di cellule della memoria: entrambi questi processi avverranno solo in caso di attivazione degli helper. Nel caso di infezioni batteriche in cui lantigene bersaglio un polisaccaride (incapace di stimolare i linfociti T), si sfrutta il sistema aptene-carrier e si parla di vaccini coniugati.

10.4

Risposte anticorpali ad antigeni T-indipendenti

Gli anticorpi prodotti in questo tipo di risposte hanno generalmente bassa affinit e sono soprattutto IgM con un limitato switch verso alcuni sottotipi di IgG. I pi importanti antigeni TI sono polisaccaridi, glicolipidi ed acidi nucleici, tutti in grado di indurre produzione specifica di anticorpi in animali privi di linfociti T. Tutti questi antigeni non possono essere processati sulle molecole MHC e quindi essere riconosciuti dagli helper. La maggior parte degli antigeni TI polivalente, e questo induce cross-linking massimale del complesso BCR sui linfociti B, portando ad attivazione senza aiuto degli helper. In aggiunta molti polisaccaridi attivano il complemento seguendo la via alternativa, generando C3d che lega lantigene e aumenta lattivazione dei linfociti B. Le risposte delle cellule B dipendono infine dai segnali in arrivo dai recettori della famiglia BAFF che rispondono a fattori di crescita prodotti dalle cellule dendritiche, dai macrofagi e dai TLR. Le risposte agli antigeni TI sono diverse a seconda del sito anatomico; possono avere inizio nella milza, nel midollo, nel peritoneo o nelle mucose. I macrofagi in associazione alla milza sono particolar mente efficienti nellintrappolare polisaccaridi. Le cellule B della zona marginale sono un sottogruppo delle cellule B che risponde soprattutto ai polisaccaridi producendo IgM. Unaltra linea di cellule B che risponde bene agli antigeni TI quella delle cellule B B-1, in gran parte derivate dalle cellule staminali del fegato fetale e sono esposte allantigene principalmente nel peritoneo e nelle mucose. Il senso pratico degli antigeni TI che molti polisaccaridi parietali dei batteri vi appartengono; individui con deficienze congenite o acquisite dellimmunit umorale sono infatti molto suscettibili ad infezioni di batteri capsulati, quali Pneumococcus, Meningococcus e Haemophilus. In aggiunta gli antigeni TI contribuiscono alla generazione degli anticorpi naturali, normalmente presenti in circolo e apparentemente indotti senza esposizione ai patogeni. La maggior parte degli anticorpi naturali ha bassa affinit ed prodotta dalle cellule B di tipo B-1 del peritoneo stimolate dai batteri del tratto GI. Alcuni antigeni TI inducono isotipi diversi da IgM. Nelluomo lanticorpo principale indotto dal polisaccaride di capsula del pneumococco IgG2. In assenza di cellule T, BAFF e APRIL possono

indurre nelle cellule di origine mieloide (cellule dendritiche, macrofagi) la sintesi di AID per dar luogo allo switch. Nonostante lincapacit di attivare gli helper, molti vaccini polisaccaridici producono immunit protettiva di lunga durata. Risposte secondarie rapide e ampie tipiche della memoria si sviluppano per esposizione secondaria a questi antigeni. Il fenomeno della memoria IgM stato dimostrato e in topi e uomo possibile evidenziare le cellule B della memoria per antigeni TI; nelluomo queste cellule esprimono alti livelli di CD27 e IgM o IgD.

10.5 Feedback anticorpale: regolazione della risposta umorale da parte dei recettori Fc
Gli anticorpi secreti inibiscono la continua attivazione delle cellule B formando complessi antigeneanticorpo che si legano in simultanea ai recettori antigenici ed ai recettori Fc sui linfociti B antigene specifici: questa la spiegazione del fenomeno di feedback anticorpale, cio della downregolazione della produzione di anticorpi da parte delle IgG secrete. Gli anticorpi IgG inibiscono i linfociti for mando appunto complessi che si legano ad un recettore per la forzione Fc della molecola chiamato recettore Fc II (Fc RIIB o CD32). Il dominio citoplasmatico del recettore contiene un dominio a sei amminoacidi condiviso con altri recettori di questo tiipo che mediano segnali negativi; per analogia con gli ITAM questo dominio viene chiamato ITIM (Immunoreceptor Tyrosin-based Inhibition Motif). Quando il recettore viene stimolato il dominio ITIM viene fosforilato formando un sito di attacco per linositolo 5-fosfatasi SHIP; SHIP idrolizza un fosfato su PIP3 e in questo modo termina la risposta del linfocita allantigene. Il complesso antigene anticorpo interagisce simultaneamente sia con il recettore antigenico che con quello per la porzione Fc, portando la fosfatasi inibitoria vicina al recettore antigenico da bloccare. Limportanza dellinibizione attraverso Fc RIIB dimostrata nei topi KO per questo gene. Un polimorfisfmo in questo gene stato collegato al lupus eritematoso sistemico nelluomo. I linfociti B esprimono un altro recettore inibitorio detto CD22, una lectina che lega acido sialico. Il ligando naturale non conosciuto e non si sa come si attivi ma si sa che topi KO mostrano una enorme attivazione dei linfociti B. Il lato citoplasmatico della molecola contiene un ITIM che da fosforilato lega la tirosin fosfatasi SHP-1; questa fosfatasi si porta a rimuovere un fosfato sui domini ITAM e quindi blocca il segnale del BCR.

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Capitolo 11. Tolleranza immunologica

La tolleranza immunologica definita come la mancanza di risposta ad un antigene indotta dalla precedente esposizione a quello stesso antigene. Quando un linfocita incontra un antigene pu essere attivato, e quindi dare risposta immunitaria, o disattivarsi/morire dando luogo alla tolleranza. Gli antigeni in grado di dare tolleranza vengono chiamati tollerogeni per distinguerli dagli immunogeni. La tolleranza verso i propri antigeni, o self tolleranza, infine una propriet fondamentale del sistema immunitario. La tolleranza immunitaria fondamentale per diverse ragioni: Gli individui normali tollerano i loro antigeni perch i linfociti autoreattivi vengono uccisi, inattivati o cambiano la loro specificit. Antigeni estranei possono essere somministrati in modo da inibire le risposte immunitarie inducendo tolleranza in linfociti specifici. Linduzione della tolleranza immunologica pu essere sfruttata per prevenire risposte immunitarie dannose. un approccio terapeutico nel

11.1

Caratteristiche generali e meccanismi della tolleranza

La tolleranza risulta dal riconoscimento degli antigeni da parte di linfociti specifici. I primi studi sul tema dimostrarono che si pu indurre tolleranza facendo riconoscere gli antigeni durante la vita fetale o neonatale. Ad esempio se un topo adulto A riceve un trapianto di pelle da un topo B geneticamente diverso si avr reazione immunitaria per via del mancato riconoscimento dellMHC; se invece il topo A riceve cellule del sangue di B durante la vita fetale non si ha rigetto (il feto immunodeficiente) e un piccolo numero di soggetti sopravvive normalmente come chimera, accettando innesti anche da adulto.

 Lauto tolleranza pu essere indotta in linfociti self-reattivi immaturi nei siti linfoidi centrali (tolleranza centrale) o in linfociti maturi in siti periferici (tolleranza periferica). La tolleran- za centrale assicura che il repertorio di linfociti maturi non riconosca gli antigeni self presenti negli organi linfoidi primari tuttavia non pu contare nella mancata risposta ad antigeni espressi solamente in periferia: questo tipo di tolleranza mantenuta da meccanismi periferici. La tolleranza centrale si ha perch tutti i linfociti in maturazione passano in una fase in cui incontrano antigeni che portano alla morte cellulare o allespressione di nuovi recettori o a variazioni nelle funzionalit. I soli antigeni nel timo e nel midollo sono antigeni self in quanto quelli estranei sono trasportati agli organi linfoidi periferici: i linfociti in sviluppo incontrano solo antigeni self ad alte concentrazioni. Questa interazione ha dunque vari possibili esiti: Morte per apoptosi, detta delezione clonale Cambio dei recettori, detto editing recettoriale Differenziazione di alcune cellule CD4+ in cellule T regolatorie che migrano in periferia per prevenire le reazioni al self. La tolleranza periferica si ha quando il linfocita maturo che riconosce il self diventa incapace di riconoscere tale antigene, o quando viene indotto allapoptosi o ne viene ridotta lemivita. La tolleranza periferica come detto serve a garantire la non risposta ad antigeni non presenti negli organi linfoidi primari. Alcuni antigeni self possono essere totalmene ignorati dal sistema immunitario, cos che i linfociti incontrano lantigene ma non vi rispondono e rimangono dunque circolanti e funzionali. Non si sa nulla di questo meccanismo.

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11.2 Tolleranza dei linfociti T

La tolleranza dei linfociti helper un modo efficace per prevenire risposte immunitarie agli antigeni proteici: molte terapie per indurre tolleranza ai tessuti trapiantati hanno come bersaglio queste cellule. Molto poco invece noto della tolleranza nei linfociti citotossici. 11.2.1 Tolleranza centrale nei linfociti T Durante la maturazione nel timo molte delle cellule T che riconoscono gli antigeni con troppa avidit vengono eliminate grazie al processo di selezione negativa (capitolo 8). I due fattori principali che determinano la selezione negativa dei timociti autoreattivi sono la concentrazione dellant igene nel timo e laffinit dei TCR del timocita per tali antigeni. Gli antigeni self vengono processati e presentati sulle molecole MHC dalle APC del timo; questi antigeni includono molte proteine circolanti o associate alle cellule. Alcune proteine inizialmente credute espresse solo nei tessuti periferici sono invece presenti nelle cellule epiteliali timiche sotto controllo del gene regolatore autoimmune (AIRE). La proteina AIRE funziona come fattore di trascrizione per promuovere lespressione di antigeni selezionati nel timo. Il processo di selezione interessa sia le cellule MHCI ristrette che quelle MHCII ristrette ed dunque importante sia per le popolazioni CD4+ che CD8+ . Limportanza della selezione negativa evidente nelle patologie autoimmuni che si sviluppano a seguito di fallimenti di tale processo: La sindrome autoimmune poliendocrina raccoglie una serie di malattie causate da mutazioni nel gene AIRE ed caratterizzata da danni anticorpo e linfocita-mediati a organi endocrini multipli. Topi con mutazioni nella chinasi TCR-associata ZAP-70 sviluppano artriti e altre manifestazioni di autoimmunit. La ragione che la mutazione diminuisce il segnale TCR-indotto quanto basta per interferire con la selezione negativa facendo scappare linfociti autoreattivi. Alcuni dei linfociti T CD4+ che riconoscono gli antigeni self nel timo non vengono eliminati ma differenziano invece in cellule regolatrici che lasciano il timo e inibiscono risposte ai tessuti self in periferia. Difetti nella proteina AIRE non sembrano prevenire lo sviluppo di queste cellule: questo suggerisce che i requisiti per il loro sviluppo siano diversi, anche se quel che determina la scelta tra morte e destino regolativo resta sconosciuto.

11.2.2 Tolleranza periferica nei linfociti T I meccanismi di tolleranza periferica sono responsabili per la mancata reazione ad antigeni self tessuto specifici che non sono abbondanti nel timo. La tolleranza dovuta ad anergia, delezione o soppressione delle cellule T, ma non noto se su ogni cellula agisca uno solo di questi metodi o tutti insieme.

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Anergia indotta da riconoscimento di antigeni self Lesposizione di cellule CD4+ ad un antigene senza costimolazione o immunit innata pu rendere tali cellule incapaci di rispondere. La piena attivazione delle cellule T richiede il segnale dal TCR e il riconoscimento dei costimolatori, principalmente B7-1 e B7-2, da parte di CD28. Una segnalazione prolungata del solo TCR pu portare ad anergia: questa situazione plausibile per gli antigeni self che non generano immunit innata o forte costimolazione. Evidenze sperimentali dellanergia: Cellule CD4+ esposte in vitro a complessi sintetici MHC+peptide in assenza di costimolanti rimangono disponibili ma non sono in grado di rispondere allantigene. Lanergia pu essere evitata per aggiunta di APC attivate in coltura o se i recettori per i costimolanti vengono attivati con gli anticorpi. Lanergia pu essere ottenuta somministrando antigeni non self in maniera da farli riconoscere evitando costimolazione o infiammazione. Un metodo trasferire linfociti T con TCR specifico per un antigene conosciuto in un topo normale da un topo transgenico. Se lantigene amministrato per via sottocutanea con adiuvanti i linfociti antigene specifici proliferano nei linfonodi di zona, diventano effettori, migrano nei follicoli linfoidi e interagiscono con le cellule B. Se lantigene viene somministrato in forma acquosa senza adiuvanti i linfociti mostrano una abilit ridotta di proliferare, differenziare e migrare. Un antigene, come una glicoproteina virale, pu essere espressa nei tessuti di un topo transgenico. Se il topo esprimente lantigene viene incrociato con un topo normale che esprime il TCR antigene specifico come transgene, molti linfociti T incontreranno lantigene self. Queste cellule diventano anergiche e perdono la capacit di rispondere allantigene virale. Presumibilmente anche qui si tratta di livelli inadeguati di costimolazione. Un antigene proteico pu anche essere espresso come self antigene sistemico, associato alle cellule o secreto in topi transgenici. Se un linfocita incontra questi antigeni perde la sua capacit di rispondervi. Lanergia il risultato di alterazioni biochimiche o genetiche che riducono la capacit del linfocita di rispondere. Sono numerose le alterazioni biochimiche ritenute necessarie per mantenere questo stato di mancata risposta: 1. Le cellule anergiche mostrano un blocco nella trasduzione del segnale del TCR. Non si sa a cosa sia dovuto, a volte sembra legato a una sottoespressione del TCR, a volte al reclutamento di molecole inibitorie quali le fosfatasi. 2. Gli antigeni self potrebbero attivare ubiquitina-ligasi cellulari che potrebbero ubiquitinare le proteine TCR associate portandole a degradazione: il risultato ancora una volta una riduzione del segnale del TCR.

3. Quando il linfocita riconosce lantigene self potrebbe attivare i recettori inibitori della famiglia di CD28, le cui funzioni sono di terminare la risposta. I due recettori il cui ruolo nella tolleranza self meglio descritto sono CTLA-4 e PD-1. In particolare CTLA-4 compete con CD28 per i costimolanti B7 escludendolo dalla sinapsi immunitaria, inoltre porta diversi segnali inibitori che bloccano quelli che attivano il TCR. PD-1 riconosce invece due ligandi espressi sulle APC e su altre cellule e questo riconoscimento porta allinattivazione del linfocita T. Le cellule dendritiche residenti nei tessuti linfoidi e non possono presentare gli antigeni self ai linfociti T per mantenere la tolleranza: le cellule dendritiche mature presentano infatti pochissimi costimolatori. Le cellule dendritiche attivate sono dunque le principali APC per scatenare la risposta dei linfociti T, mentre quelle a riposo potrebbero avere ruolo tollerogenico. Soppressione dei linfociti autoreattivi da parte delle cellule T regolatrici La maggior parte delle cellule T regolatrici esprimono alti livelli di recettore per IL-2 e CD25 ma non altri markers di attivazione. Queste cellule sono generate principalmente per riconoscimento del self nel timo, ma si sviluppano occasionalmente anche in periferia. La genesi e la sopravvivenza di queste cellule dipendente dalle citochine TGF- e IL-2 e dalla costimolazione B7:CD28. Un fattore di trascrizione chiamato FoxP3 critico per lo sviluppo e la funzionalit della maggior parte di queste cellule. Le cellule T regolatrici riconoscono gli antigeni self e da essi sono generate. Un meccanismo di controllo delle risposte immunitarie di queste cellule la secrezione della citochina immunosoppressiva IL-10, che inibisce la funzione di macrofagi e cellule dendritiche. Altri esperimenti indicano che queste cellule lavorano per contatto diretto con le APC o con i linfociti rispondenti, ma non si sa come eseguono la soppressione. Delezione dei linfociti T per apoptosi I linfociti T che riconoscono il self senza infiammazione o che sono ripetutamente stimolati muoiono per apoptosi: questo tipo di morte stata chiamata morte cellulare attivazione-indotta. La morte apoptotica pu avvenire secondo due vie biochimiche: via recettoriale e via mitocondriale (Pinton). I linfociti T che riconoscono il self senza costimolazione o senza una risposta innata ad accompagnarli possono attivare la proteina pro-apoptotica Bim, imboccando cos la via mitocondriale per lapoptosi. Nelle normali risposte linfocitarie i segnali del TCR stimolano lesp ressione di proteine anti apoptotiche della famiglia di Bcl-2 che promuovono la sopravvivenza e la proliferazione della cellula. Bim pu essere attivata dal riconoscimento del self in assenza di costimolazione o fattori di crescita e attiva a sua volta proteine effettrici che fanno scattare la morte programmata. In assenza di forte stimolazione infatti non ci sono fattori di crescita e gli effetti di Bim non sono bilanciati dalle proteine antiapoptotiche. Il ripetuto stimolo ai linfociti determina lespressione dei recettori di morte e dei loro ligandi, e lattivazione di tali recettori porta a morte apoptotica. Nelle cellule CD4+ il recettore di morte fondamentale Fas, il cui ligando FasL. A seguito di molte attivazioni FasL viene espresso sulla superficie cellulare e si va a legare a Fas sulla superficie della cellula stessa o di quelle adiacenti. Linterazione Fas:FasL attiva la cascata delle caspasi che porta a morte la cellula. Mutazioni in Fas o FasL portano a malattie autoimmuni simili al lupus.

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11.3
11.3.1

Tolleranza dei linfociti B

Tolleranza centrale nei linfociti B

I linfociti B immaturi che riconoscono gli antigeni self nel midollo osseo con alta affinit possono cambiare la loro specificit o essere eliminati. Se il linfocita riconosce antigeni presenti ad alte dosi e specialmente se multivalenti, reagisce attivando i geni RAG1 e RAG2 ed esprime una nuova catena leggera dellIg, ottenendo cos una diversa specificit. Questo processo detto editing recettoriale (capitolo 8) ed fondamentale nelleliminare lautoreattivit: se questa via fallisce il linfocita viene eliminato. Un riconoscimento pi blando degli antigeni self porta invece ad anergia piuttosto che a morte.

11.3.2

Tolleranza periferica nei linfociti B

I linfociti B maturi che riconoscono il self in periferia in assenza di helper possono essere resi inoffensivi o portati a morte per apoptosi. Lincontro con lantigene self riduce la sopravvivenza del linfocita e ne promuove la porte lungo la via mitocondriale. I linfociti che incontrano il self in periferia mostrano minor capacit di migrare nei follicoli: probabilmente il riconoscimento cronico dellantigene porta alla sottoespressione del recettore CXCR5 per chemochine che normalmente porta i linfociti B nei follicoli. Le cellule escluse dai follicoli non ricevono i segnali sufficienti per sopravvivere e muoiono. Le cellule B anergiche che incontrano una cellula helper antigene specifica possono poi andare incontro a morte grazie al FasL dei linfociti T che attiva il recettore Fas. Si sospetta che molte malattie causate da anticorpi contro il self siano legate a fallimenti della toller anza dei linfociti B, ma non se ne sa molto. Individui normali non producono autoanticorpi patogenici ad alta affinit contro antigeni self, e questo potrebbe essere legato alla delezione o alla tolleranza degli helper anche in presenza di linfociti B funzionanti. In questi casi difetti nel mantenimento della tolleranza T possono risultare nella produzione di autoanticorpi.

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11.4

Tolleranza indotta da antigeni proteici estranei

Antigeni estranei possono essere somministrati in modo da indurre tolleranza piuttosto che risposta immunitaria. In generale gli antigeni consegnati per via sottocutanea o intradermica con adiuvanti favoriscono limmunit; dosi massicce di antigene per via sistemica senza adiuvanti tendono invece ad indurre tolleranza. La ragione che gli adiuvanti stimolano la risposta innata e lespressione dei costimolatori sulle APC. La somministrazione orale di un antigene proteico spesso porta a soppressione delle risposte immunitarie umorali e cellulomediate verso lantigene: si parla di tolleranza orale. Questo fenomeno potrebbe essere necessario per evitare risposte immuni agli antigeni del cibo o ai batteri commensali dellintestino. Diverse dosi di antigeni per via orale possono indurre anergia o indurre cellule producenti citochine che inibiscono le risposte.

11.5 Omeostasi del sistema immunitario: terminazione delle normali risposte immuni
Lattivazione e la morte dei linfociti sono aspetti importanti per mantenerne costante il numero durante la vita nonostante la produzione continua di nuove cellule. Le risposte immunitarie agli antigeni estranei sono autolimitanti e si affievoliscono durante leliminazione degli antigeni facendo tornare il sistema allo stato basale di attivit. A seguito della fase di eliminazione vi una fase di contrazione in cui la maggior parte delle cellule che hanno risposto allantigene vengono perdute; questa fase dovuta soprattutto alla morte per apoptosi dei linfociti attivati. Gli antigeni, i costimolatori e le citochine prodotte nelle risposte immunitarie prevengono lapoptosi del linfocita soprattutto stimolando lespressione di proteine anti-apoptotiche (soprattutto quelle della famiglia di Bcl-2). Quando viene eliminato lantigene vengono dunque a mancanare i necessari stimoli alla sopravvivenza e si scatena lapoptosi, che principalmente il risultato dellattivazione di sensori di morte come Bim e della riduzione di proteine per la sopravvivenza quali Bcl-2 e Bcl-x. A seguito del ritorno alla normalit lunico segno di una risposta precedente la persistenza di cellule della memoria quiescenti ma dalla lunga vita media. Gli antigeni hanno anche la capacit di scatenare meccanismi attivi per terminare la risposta immunitaria; due di questi meccanismi sono stati gi visti come legati alla tolleranza periferica dei linfociti T. Le cellule T attive esprimono CTLA-4, il quale interagisce con le molecole B7 per inibire la continua proliferazione linfocitaria; CTLA-4 appare dopo tre o quattro giorni dallattivazione e pu dunque avere ruolo nel declino della risposta linfocitaria. Altri recettori inibitori, ad esempio PD-1, possono servire a funzioni analoghe. Le cellule T attivate possono inoltre esprimere recettori di morte come Fas o ligandi per questi recettori, cos che le interazioni possano portare ad apoptosi. Le risposte dei linfociti B sono inoltre attivamente controllate poich gli anticorpi IgG prodotti dalle cellule B formano complessi con gli antigeni che si legano ai recettori Fc sul linfocita inibendolo: si tratta del processo di feedback degli anticorpi ( capitolo 10) Un altro meccanismo di regolazione per le risposte immunitarie adattative prende il nome di ipotesi network. Questidea basata sul fatto che i recettori antigenici sui linfociti sono estremamente vari e che ognuno ha diversa specificit basata su sequenze diverse di aminoacidi. Queste sequenze uniche

formano determinanti detti idiotipi che possono essere riconosciuti da altri linfociti come complementari, o anti idiotipici: in altre parole i linfociti sono in grado di rispondere ai recettori di altri linfociti. Secondo questa ipotesi dunque le varie interazioni tra idiotipi e anti-idiotipi portano ad un sistema di stato stazionario che caratterizza lomeostasi. Non si sa con certezza se questa cosa accada sul serio.

Capitolo 12. Citochine

Le citochine sono proteine prodotte dalle cellule dell'immunit sia innata che specifica in risposta ad antigeni.Uno specifico antigene(es intra o extracellulare)stimola la produzione di citochine specifiche che attivano precise risposte difensive. Le citochine nella fase di attivazione stimolano proliferazione e differenziazione,mentre nella fase effettrice attivano le cellule deputate all'eliminazione del microrganismo. Alcune inoltre stimolano il processo di ematopoiesi.Nonostante tra loro abbiamo moltissime differenze condividono alcune propriet biologiche. La loro secrezione un evento di breve durata e generalmente autolimitante. Non vengono immagazzinate ma prodotte exnovo ogni volta mediante nuova sintesi o meccanismi di modifiche post-trascrizionali. Le loro attivit sono pleiotropiche,ovvero una citochina agisce su diversi tipi cellulari e ridondanti ,ovvero lo stesso effetto pu essere indotto da diverse citochine. Le citochine possono influenzare la sintesi e le attvit di altre citochine agendo in sinergia o in antagonismo. Le loro azioni possono essere locali o sistemiche a seconda che la secrezione sia autocrina ,paracrina o endocrina. Svolgono le loro azioni legandosi a specifici recettori sulla cellula bersaglio con elevata affinit cos che una bassa espressione di recettori sia sufficiente.I livelli di espressione dei recettori possono variare in risposta a segnali esterni. Nel caso dei linfociti ad esempio il riconoscimento dell'antigene ad aumentarne l'espressivit. La risposta cellulare in seguito a legame con citochine consiste generalmente in modificazioni dell'espressione genica spesso attivando geni silenti,inoltre specifiche citochine dette chemochine inducono modificazioni di affinit di specifici recettori senza interagire con la trascrizione.La risposta cellulare a citochine fortemente controllata da meccanismi a feedback -negativo come fosfatasi,molecole che bloccano chinasi,inibizione dell'interazione dei fattori di trascrizione e attivazione di recettori inattivi che competono con le citochine.

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Classificazione:
Citochine che regolano l'immunit innata:prodotte soprattutto dai macrofagi in risposta ad agenti infettivi che si legano ai TLR(LPS,Rna virale ecc).Queste agiscono sulle cellule endoteliali e leucociti per richiamare e attivare la risposta adattativa e mediano l'infiammazione. Sono responsabili dello shock settico. TNF,IFN-,IL-1 e IL-12 le principali. Citochine che regolano l'immunit adattativa:sono prodotte soprattutto dai linfociti T e stimolano crescita e differenziamento delle diverse popolazioni linfocitarie e l'attivazione delle cellule effettrici. Responsabili del danno tissutale e infiammazione granulomatosa. IFN-,IL-2,IL-4 e IL-5 le principali. Citochine che stimolano l'emopoiesi: prodotte da cellule stromali del midollo osseo e leucociti e stimolano crescita e differenziazione dei leucociti immaturi.

12.1 Recettori
Tutti i recettori per le citochine sono composti da una o pi proteine transmembrana contenenti un dominio extracellulare per il legame con la citochina e uno intracellulare per l'attivazione del segnale responsabile della ridondanza delle citochine.I recettori sono classificati mediante omologia strutturale: -Recettori di tipo 1:definiti anche dell'emopoietina legano citochine di tipo 1 ovvero che si ripiegani in quattro catene ad elica.Questi recettori attivano la via del Jack-STAT. -Recettori di tipi 2:condividono mole analogie con quelli di tipo 1 ma cambiano le citochine leganti. Importante la famiglia delle IFN. -Recettori della famiglia di IL-1:condividono una sequenza citoplasmatica detta TIR. -Recettori per il TNF: -Recettori a sette domini transmembrana:sono accoppiati a proteine G. -Recettori per la superfaglia delle Ig.

12.2 Citochine che regolano l'immunit innata.

-TNF(fattore di necrosi tumorale): La principale sorgente costituita dai fagociti mononucleati attivati.Lo stimolo pi efficace il legame ai TLR di componenti microbiche.L' IFN- prodotto dai linfociti T e Nk potenzia la produzione di TNF.Questo viene prodotto come proteina non glicosilata associata alla membrana e poi in seguito a scissione mediata a TACE viene secreto sotto forma di tronco di piramide .Esistono 2 recettori per TNF ,TNFR1 e TNFR2,l'1 espresso su quasi tutti i tipi cellulari,il 2 solo sulle cellule del sistema immunitario.Il legame ligando recettore provoca l'associazione citoplasmatica del recettore con le proteine TRAF che inducono l'attivazione del fattore NF-B e AP-1 che codificano per una serie di proteine coinvolte nella risposta infiammatoria e nell'azione antiapoptotica.Infatti l'interazione di TNF pu anche scatenare apoptosi se legata al recet tore poich presente a livello citoplasmatico un cosiddetto dominio di morte che porta all'apoptosi.I suoi prodotti genici sono in competizione con quelli di Ap-1. Il ruolo biologico di TNF quello di indurre il reclutamento di neutrofili e monociti nel sito di infezione.Esso stimola le cellule endoteliali a esprimere molecole di adesione,le pi imporanti sono le selettine e i ligandi per le integrine linfocitarie.Inoltre stimola queste cellule e i macrofagi alla produzione di chemochine che aumentano l'affinit delle integrine per i ligandi endoteliali. Nelle reazioni infiammatorie il TNF svolge un ruolo centrale tanto che quelle dannose per l'ospite come quelle autoimmuni possono essere minimizzate con anticorpi anti TNF. Se secreto in grandi quantit in grado di entrare in circolo e scatenare numerose reazioni: -A livello ipotalamico sviluppa l'insorgenza della febbre stimolandolo a secernere prostaglandine -A livello epatico stimola la sintesi di proteine della fase acuta quali fibrinogeno e proteina amieloide. A concentrazioni elevate -A livello muscolare e adiposo causa un deperimento fisico detto cachesia andando a inibire l'appetito. -Pu causare trombosi vascolare inibendo i fattori anticoagulanti e promuovendo la sintesi del fattore tissutale.Questa sua capacit di causare necrosi tissutale proprio quella che gli ha dato il nome. Il cosiddetto shock settico caratterizato da collasso cardiocircolatorio,coagulazione intravascolare e alterazioni metaboliche proprio dovuto in caso di sepsi gravi da una abnorme produzione di TNF. Alla famiglia dei TNF appartengono altri ligandi implicati in processi di attivazine cellulare come Fas,CD40,BAFF , APRIL e RANK.

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-Interleuchina 1: Ha moltissime cose in comune a TNF,i principali produttori sono i fagociti mononucleati e in aggiunta anche neutrofili e cellule endoteliali.Le attivit biologiche sono pressoch identiche se non che IL-1 non in grado di indurre apoptosi e a livello sistemico da sola non riesce a scatenare shock settico.Il recettore invece differente ed rappresentato dei recettori di tipo IL-1.Esitono due forme secrete di IL-1, e ,quest'ultima necessita dell'enzima ICE per essere generata.L'interazione con il recettore fa associare una proteina adattarice al dominio TIR che poi andr ad attivare i fattori di trascrizione AP-1 e NF-B.Esiste un antagonista naturale alla IL-1 prodotto dai fagociti detto IL-1 ra utilizzato nella terapia soprattutto dell'artrite reumatoide giovanile. -Chemochine: Sono le citochine responsabili del direzionamento dei linfociti e della migrazione dal circolo ai tessuti.Alcune sono prodotte in risposta a una infezione e richiamano i linfociti nel focolaio,altre sono espresse costituitivamente e regolano il normale traffico leucocitario.Esistono 50 chemochine raggrupate in 4 famiglie:CC,CXC,C,CX3C.CC e CXC sono prodotte dai linfociti e cellule tissutali principalmente in risposta a citochine infiammatorie quali TNF e IL-1 o attraverso l'attivazione di TLR.I recettori per le chemochine sono costituiti da 7 domini transmembrana associati a una proteina G. Le chemochine coinvolte alla risposta infiammatoria sono prodotte da linfociti T e vanno ad aumentare l'affinit delle integrine linfocitarie per i lignadi endoteliali.TNF e IL-1 stimolano la produzione sia delle chemochine che dei ligandi per le integrine. Le chemochine regolano anche il normale processo di migrazione celllulare agli organi linfoidi.Essenziale ad esempio per l'incontro APC linfocita.Molte infezioni virali codificano recettori per chemochine che le sequestrano e che quindi rappresentano un valido meccanismo di elusione del sistema immunitario.Es herpes virus,citomegalovirus ecc.Inoltre cellule atipiche possono esprimere il cosiddetto recettore D6 che tuttavia un falso recettore poich non invia alcun segnale

intracellulre.

-Interleuchina 12: Principale mediatore delle risposte innate a microrganismi intracellulari.Svoge inoltre un ruolo fondamentale in quelle cellulo mediate favorendo la produzione di IFN- da parte di NK e linfociti T e promuove il differenziamento dei CD4 a th1 che producono IFN-.Essa appartiene a una famiglia di 5 citochine le quali collaborano con lei ,da ricordare IL-23 per i Th 17. Le principali sorgenti di IL-12 sono i fagociti mononucleati e le APC attivate.La sua sintesi indotta dall'attivazione di TLR e da infezioni intracellulari,alternativamente dal legame con CD40L espresso dai linfociti T CD4 o con IFN.Il recettore per IL-12 appartiene ai recettori di tipo 1 quindi attiva la via Jack STAT principalmente STAT4. Il-12 induce cellule Nk e linfociti T a produrre IFN- che andr ad attivare nei macrofagi meccanismi battericidi.IL-12 assieme a IFN- induce il differenziamento in Th1 dei CD4 le quali a loro vola producono IFN-.IL-12 potenzia inoltre l'attivit citotossica dei CTL. Risulta evidente come questa citochina rappresenti un importante punto di collegamento tra immunit innata ed adattativa stimolandole entrambe. -Interferoni di tipo 1. Gli IFN 1 (NB IFN- non vi appartiene)sono una grande famiglia che mediano le fasi precoci della risposta innata a infezioni virali.Sono codificati da geni sul cromosoma 9.Il recettore per gli IFN1 appartiene ai recettori di tipo 2 associati a Jack1 e Tyk 2 che attivano STAT1 e STAT 2 che attivano IRF9 che causa la trascrizione di geni detti ISRE.Esistono tuttavia altre vie di trasduzione.La produzione di IFN scatenata dal riconoscimento di Rna virale da parte di TLR associate alle membrane endosomiali e RIG-1 e MDA a livello citoplasmatico e attivano IRF che ne induce l'espressione. Gli IFN vanno a inibire la replicazione virale mediante trascrizione di enzimi che degradano l'Rna virale,inoltre potenziano l'espressione di molecole MHC di classe 1 .Stimolano inoltre la sintesi di recettori per IL-12 potenziando la differenziazione in Th1 e ne promuovono il sequestro nei linfonodi.IFN inibisce infine la proliferazione di molte cellule tra le quali i linfociti. Interleuchina10: Rappresenta uno dei principali inibitori delle risposte dell'ospite.Viene prodotta principalmente dai linfocti regolatori e macrofagi attivati.Il suo recettore appartiene ai recettori di classe 2.Agisce sui macrofagi attivati bloccandone le attivit in modo da riportare il sistema immunitario allo stato di quiescienza.Lo fa inibendo la produzione di IL-12 e inibendo l'espressione delle molecole MHC 2 e costimolatorie. Interleuchina 6: Prodotta dai fagociti mononucleati coinvolta nell'immunit sia specifica che innata.Viene prodotta principalmente in risposta a TNF e IL-1 e con essi si rende responsabile dell'artrite reumatoide.Stimola la produzione di proteine dlla fase acuta dal fegato e la differenziazione dei neutrofili.Stimola la crescita dei linfociti B e la proliferazione delle plasmacellule neoplastiche.Per questa propriet molto utile nella produzione di ibridomi. Riassumendo TNF e IL-1 e chemochine agiscono nelle infezioni extracellulari sull'endotelio e sui linfociti per facilitare migrazione,Il-12 e IFN- in quelle intracellulari attivando i macrofagi e la produzione di IFN-.

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12.3 Citochine che mediano la risposta adattativa.

Nella fase di attivazione dell risposta immunitaria specifica le citochine stimolano la proliferazione e differenziazione dei linfociti attivati dagli antigeni.La produzione di citochine la risposta principale dei linfociti T dopo aver riconosciuto l'antigene. Interleuchina 2: Importante fattore di crescita,sopravvivenza e differenziazione dei linfociti T.Agisce principalmente sulle cellule che la producono o su quelle vicine.L'espressione del suo anticorpo stimolata dal processo di attivazione dei linfociti naive mediato dal riconoscimento dell'antigene.Nel caso dei linfociti regolatori essi esprimo costantemente i recettori per IL-

2.Quest'ultima indispensabile per la loro sopravvivenza e quindi anche per la salvaguardia delle risposte immunitarie contro antigeni self controllate da questi ultimi.Negli altri linfociti IL-2 stimola proliferazione e sopravvivenza inducendo la sintesi della proteina anti-apoptotica Bcl-2 e promuovendone l'entrata nel ciclo cellulare.Ugualmente nelle Nk dove ne stimola anche l'attivit citotossica generando le cosiddette cellule killer attivate da linfochine.Induce infine proliferazione e sintesi di anticorpi nei linfocit B. Interleuchina 4. Viene principalmente prodotta dai linfociti Th2 ed la principale citochina responsabile dello scambio isotopico verso le IgE nei linfociti B. Le IgE sono i principali effettori verso elminti o artropodi,infezioni verso le quali si attivano Th2.Le IgE sono inoltre responsabili delle allergie(ipersensibilit immediata).IL-4 induce lo sviluppo dei CD4 verso i Th2 e ne induce la proliferazione inibendo invece lo sviluppo dei Th1.IL-4 assieme a IL-13 costituisce l'attivazione alternativa dei macrofagi. Si ipotizza inoltre stimoli la peristalsi Interleuchina 13. Questa associata alla IL-4 ed prodotta sempre dai Th2 nelle infezioni da elminti e artropodi.Essa promuove la fibrosi nelle fasi di riparazione nei processi infiammatori cronici,stimola la produzione di muco e induce lo scambio di classe verso IgE nei linfociti B. Contribuisce dunque significatamente nella patogenesi dell'asma cronico. Interleuchina 5 Citochina di tipo 1 prodotta anch'essa dai Th2 ha come principale azione la stimolazione alla proliferarzione e differenziazione degli eosinofili. Interferone . Rappresenta la principale citochina per l'attivazione dei macrofagi e svolge importanti funzioni sia nella immunit innata che cellulo-mediata contro i microrganismi intracellulari.La sua azione principale quella di attivare le cellule effettrici,non rappresenta lui stesso una citochina antivirale.Viene prodotta dalle cellule Nk,CD8 e CD4th1 di cui ne rappresenta la principale funzione.Le cellule Nk la producono nell'ambito della risposta innata in seguiti a molecole attivatrici presenti su cellule danneggiate o infettate oppure in risposta a IL-12.Nella risposta adattativa prodotta dai linfociti T in risposta al ricoscimento dell 'antigene e potenziata da IL-12.Il recettore appartiene ai recettori di tipo 2. Una volta prodotto IFN attiva i macrofagi a uccidere i microrganismi fagocitati assieme al legame CD40L- CD40.IFN promuove inoltre la differenziazione dei linfociti T naive verso i Th1 attraverso l'attivazione del fattore di trascrizione T-bet e inibisce quella dverso Th2.Questa promozione effettuata anche mediante stimolazione dei fagociti a produrre IL-12. Verso i linfociti B IFN promuove lo scambio isotopico verso determinate sottoclassi di IgG come le IgG2 e inibisce quello verso sottoclassi IL-4 dipendenti come le IgE.Le IgG indotte da IFN si legano ai recettori per Fc espressi sui fagociti e attivano il complemento.IFN stimola infine le APC nell'espansione delle MHC di classe 1, e 2 e di molecole costimolatorie.Complessivamente dunque promuove le reazioni infiammatorie in cui l'azione macrofagica prevalente e inibisce quelle in cui prevale l'azione eosinofila.

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TGF-:fattore di crescita trasformante. Assieme a IL-10 il secondo importante inibitore del sistema immunitario.Possiede tuttavia anche capacit proinfiammatorie.Viene prodotto da linfociti T stimolati dall'antigene (in particolare da una sottopopolazione detta Th3o regolazivi)e macrofagi attivati.Viene sintetizzato come precursore poi attivati proteoliticamente.Il suo recettore costituito da 2 proteine ALK5 e TGF-R2 che trasducono il segnale attraverso una serina/treonina chinasi che attiva dei fattori detti Smad .TGF- inibisce la proliferazione e differenziazione dei linfociti T e l'attivazione dei macrofagi.In questo modo svolge l'importante ruolo di attenuare e terminare le risposte immunitarie e infiammatorie.Pu bloccare la differenziazione in th1 e th2 promuovendo inoltre quella verso th17 che sono linfociti porinfiammatori.Agendo sui linfociti B promuove lo scambio isotopico verso le IgA che sono quelle coinvolte nelle risposte immunitarie a livello delle mucose.Regola infine il processo di riparo del danno tissutale mediante stimolazione nei macrofagi e fibroblasi alla sintesi di collagene.Per tutte queste sue capacit possiede capacit sia oncogeniche che antitumorali. Altre citochine: Lt prodotta dai linfociti T mostra omologia con TNF e interviene nella regolazione dell'infiammazione acuta attivando cellule endoteliali e neutrofili fungendo da ponte tra l'infiammazione e l'attivazione dei linfociti T.Tuttia questa non rilevabile in circolo e non dunque in grado di indurre danni a livello sistemico come invece fa TNF.LT necessaria per lo sviluppo degli organi linfoidi. BAFF e APRIL appartengono alla famiglia di TNF e sono strettamente correlati con la sopravvivenza dei linfociti B

IL-17 prodotta da i linfociti Th17 e comprende 6 citochine con propriet di difensa nella infezioni batteriche ma anche in grado di promuovere gravi danni tissutali durante reazioni di ipersensitivit. Riassumendo microrganismi intracellulari stimolano i Th1 a produrre IFN che attiva i macrofagi all'eliminazione dei batteri intracellulari e stimola la produzione di anticorpi.Tutto amplificato da IL-12. Microrganismi extracellulare pluricellulari stimolano i Th2 a produrre IL-4 e IL-5 stimolando la produzione di IgE.

12.4 Citochine che stimolano l'ematopoiesi.

Siccome durante le risposte immunitarie vi il comsumo di leucociti in periferia, necessario che vi sia una temporanea nuova produzione di leucociti a livello centrale.Temporanea perch deve solo riportare il numero a valori normali.Questa stimolazione svolta da determinate citochine chiamate CSF(colony stimulating factors) Ligando c-Kit: Le cellule staminali esrimono un recettore codificato dal proto-oncocene c-Kit.La citochina che interagisce con tale recettore prodotta principalmente dalle cellule stromali del midollo GM-CSF,M-CSF,G-CSF G-CSF:Appartiene al gruppo dei fattori di crescita, che hanno il compito di indurre differenziazione delle cellule staminali totipotenti, determinando anche l'attivazione dei corrispondenti elementi maturi. Tutti i fattori di crescita inoltre sinergizzano le azioni di molte altre citochine, come IL-1, IL-4, IL-5, IL-6. Viene prodotto da linfociti T, fibroblasti, cellule endoteliali,monociti e, come dimostrato recentemente, dai linfociti B. Le sue principali funzioni si possono cos riassumere: a- attivit sui precursori dei granulociti neutrofili; b- attivazione dei neutrofili e loro attivit fagocitaria; c- stimolazione dell'ADCC (nei neutrofili). GM-CSF:E E' il fattore stimo lante le co lonie macrofagiche-granulocitar ie.Prodotto prevalentemente da linfo cit i T attivati, fibroblast i, cellule endotelia li e linfo cit i B, in grado di st imo lare la produzione sia di granulocit i che d i macrofagi, nonch la loro attivit. Eccone di seguit o le principali funzioni: a- proliferazio ne delle co lonie granulocit iche e macrofagiche; b- incremento dell'attivit di neutrofili, eosino fili, baso fili e macro fagi; c- stimo lazione dell'ADCC(con varie cellule effettrici). d- azione sulla linea megacar iocit ica e sulla produzio ne di piastrine; e- azione sulle cellu le del Langerhans(in quanto cellu le processant i l'ant igene a livello cutaneo. Vengono utilizzate per il recupero delle funzionalit midollari in pazienti sottoposti a chemio o trapianto di midollo. Eritropoietina(Epo) Promuove la produzione di globuli rossi ed prodotta dal rene in seguito a ipossia.

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Capitolo 13. Meccanismi effettori dell'immunit cellulo-mediata.

La risposta cellulo-mediata la funzione effetttrice dei linfociti T e serve come meccanismo di difesa contro i microrganismi che sopravvivono all 'interno delle cellule.Tale risposta viene attivata dal riconoscimento degli antigeni espressi sulla superficie delle cellule infettate da parte dei linfociti T .Molte reazioni mediate dai linfociti T sono importanti anche nel rigetto da trapianto e malattie autoimmuni. La risposta consiste nello sviluppo di Linfociti T effettori a partire da linfociti T naive negli organi linfoidi secondari e successiva migrazione di questi nel focolaio di infiammazione .Qui avviene l'attivazione di questi linfociti T effettori che porta all'eliminazione del microrganismo o della cellula infettata.

13.1 Tipi di reazioni cellulo-mediate

La risposta cellulo-mediata verso microrganismi fagocitati e collocati nei fagosomi mediata dai linfociti CD4 Th1.Avendo molti microrganismi sviluppato la capacit di sopravvivere all'interno dei fagociti resa necessaria questa cooperazione con i TH1 che rappresenta un punto di communicazione tra immunit innata ed ascuisita. La risposta verso microrganismi che invece sopravvivono nel citosol (soprattutto virus) mediata dai linfociti CD8 detti CTL che vanno ad uccidere l'intera cellula infettata.

La reazione verso gli elminti mediata dai linfociti CD4 Th2.Alcune risposte intracellulari innate sono date dalle cellule Nk. L'attivazione macrofagica e la risposta infiammatoria mediata dai linfociti T possono provocare un danno tissutale,reazione detta ipersensibilit di tipo ritardato o DTH e rappresenta il principale meccanismo di danno tissutale in malattie autoimmuni.

13.2 Linfociti CD4 effettori.

Esistono distinte popolazioni di linfociti TCD4 che si distinguoni sia per il tipo di citochine prodotte che per le funzioni effettrici. Sottopopolazioni Th1 e TH2. Le sottopopolazioni meglio definite sono le Th1 e Th2:IFN- contraddistignue i TH1 mentre IL-4 e IL-5 i TH2.Queste citochine determinano le funzioni effettrici delle due sottopopolazioni ,inoltre partecipano attivamente al loro sviluppo ed espansione.Queste citochine fanno si che la risposta sia polarizzata verso una sola delle due sottopopolazioni favorendone lo sviluppo e attivazione della propria e inibendo quello dell'altra. Entrambe le popolazioni originano da precursori comuni e sono proprio queste citochine a rappresentare lo stimolo che determina in quale popolazione si differenzieranno: -Th1:la differenziazione a Th1 stimolata dalla presenza di batteri intracellulari.Queste infezioni vanno attivare le risposte immunitarie innate e la consequente produzione di citochine come IL-12 ,IL 18 e interferoni di tipo 1.Il principale segnale determinante il riconoscimento dell'antigene associato a IL-12 e IFN-. Alcuni microrganismi legano i TLR macrofagici e attivano direttamente la secrezione di queste citochine. Altri stimolano le Nk a produrre IFN- che poi stimola i macrofagi a produrre IL12. I linfociti possono ulteriormente potenziare la produzione di citochine da parte dei macrofagi e attivare risposte supplementari mediante l'interazione CD40-CD40.Il fine ultimo delle cellule TH1 quello di attivare i macrofagi all'eliminazione del microrganismo mediante secrezione di IFN- e legame CD40l-CD40. Il riconoscimento dell'antigene(quindi stimolo del complesso TCR=tcr+CD28) e la contemporanea stimolazione di IFN- attiva il fattore di trascrizione STAT1 che ativa il fattore T-bet che induce la produzione di IFN-.La stimolazione con IL-2 indispensabile per innescare la risposta attiva il fattore STAT4 che anch' esso andr a indurre T-bet e quindi la produzione di IFN-. -Th2:la differenziazione avviene in risposta ad elminti.Il fattore scatenante IL-4 che attiva STAT6 che assieme al segnale inviato dal TCR in seguito al ricoscimento dell'antigene mi va ad attivare il fattore di trascrizione GATA-3 quale attiva l'esspressione di geni per IL-4,IL-5,IL13,inoltre rende la differenziazione unidirezionale andando a inibire la sintesi della catena per il recettore di IL-12.Le prime molecole di IL-4 necessarie per dare via all'attivazione si presume siano secrete dal linfocita a partire dalla loro iniziale attivazione e se poi l'antigene stimolante persiste la concentrazione di IL-4 aumenta e innesca il processo di differenziazione.Quindi alte concentrazioni di antigene anche senza adiuvanti riescono a portare la differenziazione verso Th2.

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Sottopopolazione Th17: Recentemente identificata la sottopopolazione Th17 distinta dalle due sopracitate tant' che le citochine prodotte da Th1 e Th2 vanno a inibire la differenziazione in Th17.Questa popolazione produce IL-17,IL22.Si differenziano a partire dagli stessi progenitori di TH1e2 in seguito a stimolazione dell'antigene e in presenza di TGF-, IL-6 e IL-1.Si ipotizzato che IL-6 sia prodotta precocemente dal tessuto danneggiato che sia da sola sufficiente ad innescare la differenziazione mediata dai fattori di trascrizione RORt e STAT3.La citochina IL-23 favorisce il mantenimento e la sopravvivenza dei TH17 e dunque in mancanza di T regolatori si instaura una risposta infiammatoria la cui durata dipende da Il-6 e Il-23.Lo scopo principale dei Th17 di proteggere contro infezioni batteriche extracellulari e fungine.Si scoperto essere la causa della sclerosi multipla(anche se proprio il Prof Zamboni a Ferrara avrebbe confutato tale ipotesi trovandovi la cura) in cui ondate di Th17 danneggiavano la mielina cerebrale. 13.2.1 Risposte immunitarie mediate da th1 La principale funzione dei Th1 la difesa mediata contro microrganismi intracellulari.L' IFN- prodotto attiva le attivit microbicidiche dei fagociti e stimola inoltre la produzione di IgG opsonizzanti che fissano il complemento e facilitano la fagocitosi.I linfociti T esprimono dei recettori per chemochine e molecole di adesione che ne indirizzano l'azione.Inizialmente i macrofagi durante la reazione infiammatoria secernono TNF e IL-1 che stimolano le cellule endoteliali nel focolaio di infezione a esprimere selectine e liganti per integrine in grado di riconoscere i recettori di homing espressi sui linfociti T. Durante la maturazione i Th1 acqistano capacit di esprimere i recettori per E e P selettina,inoltre solo i Th1 esprimono recettori per le chemochine CXCR3 e CXCR5 che assicurano loro la corretta migrazione verso il

focolaio infettivo. Una volta migrati e attivati dall'antigene loro stessi producono grandi quantita di citochine e chemochine per facilitare il complessivo processo di migrazione.Il passaggio dal circolo al focolaio indipendente dalla specificit per l'antigene e assicura la massima possibilit di avere linfociti utili.I linfociti che riconoscono l'antigene ricevono segnai che aumentano l'affinit per le integrine soprattutto VLA-4 e VLA-5 rimanendo trattenuti in sede extravascolare mentre gli altri ritornano in circolo.In sede i linfociti Th1 attivano i macrofagi per mezzo sia di segnali provenienti dall'interazione con IFN- sia dall'interazione CD40L-CD40(CD40L espresso solo dopo l'attivazione).L' IFN- attiva STAT-1 e IRF-1 metre CD40 attiva i fattori AP-1 e NK-B.Questi fattori di trascrizione vanno ad attivare enzimi che creano intermedi reattivi dell'ossigeno come ossido di azoto ed enzimi lisosomiali che uccidono i microrganismi.Tali intermedi tuttavia creano un certo danno tissutale che viene per riparato mediante rimozione delle componenti danneggiate,formazione di nuovi capillari e sintesi di collagene.Tutti effettuati dai macrofagi attivati.I macrofagi attivati innescano inoltre un processo infiammatorio mediante secrezione di TNF e IL-1,chemochine e mediatori lipidici finalizzato a richiamare neutrofili e monociti. DTH:il danno tissutale e l'infiammazione causati dai Th1 e macrofagi attivati sono i segni caratteristici delle cosiddette reazioni di ipersensibilit di tipo ritardato o DTH.Queste appartengono alle malattie infiammatorie immuno-mediate.Una volta attivato il sistema cellulo -mediato nel caso lo stesso antigene si ripresenti detto richiamo questo stimoler la risposta immunitaria in modo massiccio e andr a provocare appunto una reazione DTH.La caratteristica risposta DTH evolve nell'arco di 24-48 ore.Dopo 4 ore dal contatto con l'antigene i neutrofili si raccolgono attorno alle venule post-capillare;dopo 2 ore anche linfociti T e macrofagi.Le cellule endoteliali diventano permeabili alle macromolecole plasmatiche. L'accumulo di fibrina e linfociti T a livello extravascolare determina un rigonfiamento della zona e successivo indurimento evidenti a circa 18 ore dal richiamo e raggiungono la massima entit nelle 24-48 ore successive. La rezione DTH utilizzata per diagnosticare eventuali infezioni pregresse a determinati antigeni.Nel caso si sfruttino antigeni ubiquitari normale la reazione DTH e dunque una sua assenza evidenzia un deficit immunologico noto come anergia.Nel caso in cui i macrofagi attivati non riescano comunque a eliminare i microrganismi fagocitati in quel caso pu instaurarsi una reazione DTH cronica causando oltre al danno tissutale anche deposito di tessuto connettivo(fibrosi)come ad esempio nella tubercolosi;si aggiunge la formazione di noduli di tessuto infiammatorio formato dai macrofagi che circondano l'antigene detti granulomi. 13.2.2 Risposte immunitarie mediate dai linfociti Th2. La risposta immunitaria mediata dai Th2 ha la principale funzione di promuovere la produzione di IgE e attivare le risposte immunitari mediate da mastociti e eosinofili nei confronti di infezioni elmintiche.Gli elminti sono troppo grandi per essere fagocitiati e troppo resistenti per i comuni microbicidi.I Th2 secernono Il-4 e Il13 che stimolano la produzione di IgE che opsonizzano il parassita e interagiscono con i recettori Fc dei mastociti che possono degranulare i loro contenuti:ammine vasoattive,TNF,e mediatori lipidici tutti in grado di produrre infiammazione. I Th2 producono inoltre IL-5 la quale va ad attivare direttamente gli eosinofili in contatto con l'elmina che iniziano a secernere proteina basica maggiore e proteina cationica maggiore in grado di intaccare i robusti elminti. Il-13 e IL-4 sono anche in grado di attivare i macrofagi M2 mediante la attivazione alternativa(quindi non la classicamediante IFN- che attiva i macrofagi M1)a esprimere i recettori per il mannosio ed enzimi che promuovono la sintesi di collagene,fibrosi e citochine antiinfiammatorie. Questi contribuiscono alla formazione dei granulomi e al rimodellamento dl tessuto danneggiato.IL-13 pare stimoli anch ela produzione di muco mentre IL-4 la peristalsi intestinale. L'homing selettivo dei Th2 mediato da particolari recettori per chemochine CCR3,4 e 8 che legano particolari citochine espresse nei focolai di infezione da elminti o nel corso di allergie. Le risposte di tipo TH2 sono infatti la principale causa di allergia.

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13.3.Risposte mediate dai linficiti CD8 effettori:CTL

I CTL CD8 sono linfociti T effettori che eliminano le cellule infettate da microrganismi intracellulari.La modalit di sviluppo simile ai CD4:vi stimolazione dei CD8 naive con l'antigene nel linfonodo,si assiste a una proliferazione,differenziazio e migrazione nel sito di infezione alla ricerca delle cellule infettate e successiva uccisione di quest'ultime. L'uccisione di una cellula antigene -specifica e contatto-dipendente.I CTL uccidono solo le cellule che presentano associato a Mhc di classe 1 l'antigene che ne ha indotto la differenziazione nel linfonodo.Affinch vi sia la liberazione dei granuli citotossici i CTL devono legarsi alla cellula bersaglio.I punti di ancoraggio sono il legame TCR antigene-Mhc,il legame del cofattore CD8 e l'adesina LFA-1 che si lega a ICAM-1 espresso sul bersaglio.Questi legami vanno a definire la cosiddetta sinapsi immunologica che rappresenta un punto di contatto tre le due membrane.Il legame LFA-1 e ICAM-1 va a costituire uno spazio isolato in questo anello di contatto nel quale si possono identificare due regioni:la regione di trasduzione del segnale e quella del dominio secretorio.I CTL esprimono anche recettori KIR tipici delle NK che riconoscono MHC di classe 1 anche in assenza di peptide e inviano segnali inibitori alle CTL in modo da salvaguardare cellule non infettate e gli stessi CTL.I CTL esprimono inoltre il recettore NKG2D che riconosce molecole MHC modificate magari da tumori o dall'infezione. Entro pochi minuti dal riconoscimento la cellula bersaglio va incontro ad alterazioni che la porteranno nell'arco di 2-6 ore

alla morte.Nel frattempo le CTL si distacca dal bersaglio.Il CTL trasmette il cosiddetto colpo letale costituito dal rilascio di granuli contenenti vari enzimi tra cui granzimiA,BeC,perforina,serglicina,granulisina,catepsina B. La perforina e la granulisina associate ai granzimi e alla serglicina perforano la membrana e distruggono le proteine.La catepsina B impedisce l'autodegradazione. Un secondo meccanismo di uccisione sfrutta il legame tra FasL espresso dai CTL attivati e il suo recettore espresso da vari tipi cellulari attivando una caspasi che induce apoptosi cellulare e degradazione del Dna con conseguente eliminazione della potenziale sorgente infettante.

13.4 Linfociti T della memoria

Le risposte immunitarie portano alla produzione di linfociti T della memoria a partire da intermedi sia di CD4 che di CD8.Possono derivare da Th1 o Th2 gia differenziati o meno e da CD8.I linfociti T della memoria si possono dividere in due popolazioni: Linfociti T di memoria centrali:che esprimono CCR7 e L-selettina e ch quindi migrano nei linfonodi dove non svolgono particolari funzioni effettrici ma piuttosto in caso di riincontro dell'antigene danno via a una decisa proliferazione che dar origine a una numerosa progenie effettrice. Linfociti T di memoria effettrici:questi non esrpimo n CCR7 n L selettina e dunque continuano a migrare attraverso i tessuti periferici e una volta riattivati secernono IFN- senza per proliferare attivamente. La rispota vera e propria dunque attuata da queste ma dipende direttamente dal grado di proliferazione attuato a monte da quelli centrali. Le cellule della memoria possono permanere per anni e questo mantenimento dipende da citochine costitutivamente presenti nei tessuti.La principale IL-7 necessaria anche per il mantenimento dei linfociti naive.Per i linfociti di memoria Cd8 pare sia richiesta anche IL-15.Queste citochine assicurano un basso ma costante livello proliferativo indipendente dal riconscimento antigene-MHC.

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Capitolo 14. Meccanismi effettori d ellimmuni t umorale

Limmunit umorale mediata dagli anticorpi di secrezione nel suo ruolo di difesa da microbi extra- cellulari e tossine microbiche. I tipi di organismi che vengono combattuti con questo tipo di difesa sono batteri extracellulari, funghi e occasionalmente parassiti intracellulari obbligati nel momento di esposizione al di fuori della cellula.

14.1 Caratteristiche generali dellimmunit umorale

Le funzioni principali degli anticorpi sono la neutralizzazione e leliminazione di microbi infettivi e tossine microbiche. Le caratteristiche principali di questi meccanismi sono: 1. Gli anticorpi sono prodotti dai linfociti B e dalle plasmacellule negli organi linfoidi e nel midollo, ma la loro azione si svolge a siti distanti da quelli di produzione. Gli anticorpi sono inoltre at- tivamente trasportati attraverso la placenta nella circolazione del feto in sviluppo. Per contrasto nellimmunit cellulomediata i linfociti T non sono trasportati nelle secrezioni delle mucose e non sono in grado di varcare la barriera placentare. 2. Gli anticorpi possono derivare sia da plasmacellule a lunga vita che a breve a seguito dellatti- vazione di linfociti B naive o della memoria. La prima esposizione allantigene porta allattivazione dei linfociti B naive e alla loro differenziazione in plasmacellule o cellule della memoria. Una suc- cessiva esposizione porta allattivazione delle cellule della memoria e a una pi ampia e rapida risposta anticorpale. Le plasmacellule derivate prima nelle risposte immunitarie di solito hanno vita breve mentre quelle pi tardive e con swtich dellisotipo tendono a migrare nel midollo e a persistere per anni; in un individuo sano almeno la met delle IgG circolanti sono dovute alla produzione da parte di queste cellule a lunga vita midollari. 3. Molte delle funzioni effettrici degli anticorpi sono mediate dalle regioni costanti delle catene pe- santi; diverse catene possono avere diverse funzioni effettrici. Il sistema umorale specializzato in modo tale che diversi microbi o antigeni stimolino lo switch da parte dei

linfociti verso il tipo di Ig migliore per combatterli. I principali stimoli allo switch sono le citochine derivate dagli helper insieme a CD40L; diversi tipi di microbi stimolano la differenziazione degli helper in diversi sottogruppi, ad esempioT H 1oT H 2, che producono citochine diverse e inducono switch diversi, esempi: (a) I virus e molti batteri stimolano le risposteT H 1con produzione di I gG che legano fagociti, natural killer e attivano il complemento. (b) I parassiti elmintici stimolano risposteT H 2con produzione di Ig E che legano e attivano mastociti e basoli le cui citochine attivano gli eosinoli, particolarmente ef caci nelleliminare questi patogeni. 4. Anche se molte delle funzioni effettrici sono mediate dalle regioni costanti, tutte sono scatenate dal legame dellantigene alle regioni variabili.

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14.2 Neutralizzazione di microbi e tossine

Gli anticorpi contro microbi e tossine bloccano il legame di questi a recettori cellulari in modo da neu- tralizzarne linfettivit. Molti microbi entrano nella cellula ospite legando particolari molecole di super - cie a proteine o lipidi di membrana; gli anticorpi che legano queste strutture microbiche interferiscono con la loro capacit di interagire con i recettori cellulari e possono dunque prevenire linfezione a causa dellingombro sterico. In alcuni casi bastano pochissime molecole di anticorpo per avere variazioni conformazionali nelle molecole del patogeno che interagiscono con la cellula: si pu avere dunque un effetto allosterico dovuto agli anticorpi. Molte tossine microbiche mediano inoltre i loro effetti patologi- ci sempre legando specici recettori cellulari: gli anticorpi anti-tossine bloccano stericamente queste interazioni e impediscono alla tossina di danneggiare lospite. La neutralizzazione anticorpo mediata di microbi e tossine richiede solamente le regioni leganti lanti gene dellantic orpo, quindi pu essere mediata da qualsiasi isotipo circolante o nelle secrezioni mucosali. La maggior parte degli anticorpi neutralizzanti nel sangue di tipo IgG, mentre nelle mucose la maggior parte IgA. Gli anticorpi pi efcaci nellatto della neutralizzazione sono quelli a pi alta af nit, quelli cio risultanti dal processo di maturazione.

14.3 Opsonizzazione anticorpo-mediata e fagocitosi

Le IgG ricoprono, cio opsonizzano, i microbi e ne promuovono la fagocitosi legandosi ai recettori Fc dei fagociti. I fagociti mononucleati e i neutr oli ingeriscono i microbi come preludio alluccisione e degradazione; queste cellule esprimono di loro una variet di TLR che legano direttamente i microbi, anche in assenza di anticorpi, fornendo uno dei meccanismi dellimmunit innata. I microbi possono essere opsonizzati anche dal prodotto di attivazione del complemento C3b e fagocitati grazie al recettore per questa molecola presente sui leucociti. Il processo di copertura del microbo detto opsonizzazione e le sostanze in grado di farlo, tra le quali gli anticorpi e le proteine del complemento, sono dette opsonine. 14.3.1 Fagociti e recettori Fc Recettori Fc per diversi isotipi delle catene pesanti degli anticorpi sono espressi su molte popolazioni leucocitarie; di questi recettori i pi importanti nella fagocitosi delle particelle opsonizzate sono quelli per le catene pesanti delle IgG, detti recettoriF c. Esistono tre recetto riF ccon diverse afnit per le varie sottoclassi di IgG. Il principale recettoreF c dettoF cRIe lega fortemente ne lluomo sia IgG1 che IgG3.F cRI composto da una catena alfa contenente la regione che lega Fc in associazione con un omodimero di una protein a segnalatrice detta catenaF cR, omologa alla catenadel TCR. Le sottoclassi di IgG che legano in modo pi efcace i recettori sono le opsonine pi efcienti per promuovere la fagocitosi: IgG1 ed IgG3.F cRIlega gli anticorpi leg ati agli antigeni in modo pi efcace rispetto agli anticorpi liberi. Inoltre lattivazione del recettore richiede che questo si raggruppi nel piano della membrana, qualcosa che pu succedere solo se lattivazione mediata da un antigene legato ad IgG. Il legame del recettore Fc sul fagocita con lantigene opsonizzato porta alla fagocitosi della particella e alla sua internalizzazione in un fagosoma che si porta a fondersi con il lisosoma generando un fagolisosoma. Il legame di particelle opsonizzate al recettore attiva i fagociti grazie al segnale trasdotto dalla catena F cR; questa catena

contiene dei domini ITAM sul suoi lato citoplasmatico. Laccumulo dei recet - tori dovuto allantigene opsonizzato porta allattivazione di una chinasi che fosforila il dominio ITAM contribuendo al reclutamento e allattivazione del la tirosin chinasi Syk e la conseguente apertura di vie di segnalazione. Linduzione del segnale delF cRIfa scattare la produ zione di diverse molecole microbicide. 1. Inizia la produzione dellossidasi fagocitica che catalizza la produzio ne di ROS citotossici per i microbi fagocitati. 2. Inizia la secrezione di enzimi idrolitici e ROS allesterno del fagocita in modo da poter uccidere microbi extracellu lari troppo grandi per la fagocitosi Lespressione diF cRIsui macrofagi stim olata dallinterferon-. Gli isotipi anticorp ali che meglio legano i recettoriF csono prodotti dallo s witching indotto dallo stesso inteferone, inoltre questo stimola direttamente le attivita microbicid e dei fagociti. Il recettoreF cRI I B un recettore inibit orio (10.5) gi visto nel co ntesto dei segnali inibitori per i linfociti B; si trova espresso in molte altre cellule immunitarie e presenta anchesso un dominio ITIM. Nei fagociti la sua attivazione va ad attenuare la segnalazione da parte dei recettori attivanti tra i quali ancheF cRI. Un trattamento em pirico ma utile per molte malattie autoimmuni la somministrazione intravenosa di IgG che inducono lespressione nei fagociti diF cRI I Be quindi la consegn a di segna li inibitori che mitigano linammazione.

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14.3.2 Citotossicit cellulomediata anticorpo dipendente Le cellule NK e altri leucociti legano le cellule opsonizzate con i recettori Fc e le distruggono nel processo di citotossicit cellulo mediata anticorpo dipendente (ADCC). Le NK usano il loro recettore per Fc, cio F cRI I I, per legare le cellule opsonizzate: questo un recettore in grado di legare solo i complessi e mai lanticorpo monomerico. Lattivazione del recettore porta le NK a sintetizzare e secernere citochinequali linterferon-oltre che a scaricare i contenuti dei loro granuli che mediano luccisione delle cellule bersaglio. Eliminazione degli elminti anticorpo mediataI parassiti elmintic i (vermi) sono troppo grossi per essere fagocitati e resistono ai prodotti microbicidi di neutroli e macrofagi ma possono essere uccisi da una proteina estremamente basica (detta proteina basica principale) contenuta nei granuli degli eosinoli. Le IgG e le IgA che ricoprono gli elminti po ssono legarsi ai recettori Fc degli eosinoli causan- done la degranulazione e il rilascio della proteina. In aggiunta le IgE riconoscono gli antigeni superciali degli elminti e possono dar vita alla degranulazione locale dei mastociti le cui chemochine e citochine possono attrarre gli eosinoi nella sede di infezione.

14.4 Il sistema del complemento

Il sistema del complemento costituito da proteine sieriche e di membrana che interagiscono tra loro e con altre molecole immunitarie in modo regolato per generare prodotti la cui funzione eliminare i microbi; le proteine del complemento sono in generale proteine plasmatiche normalmente inattive. Le principali caratteristiche di questo sistema sono: 1. Lattivazione del complemento richiede la proteolisi sequenziale di vari enzimi per generare nuovi complessi con attivit proteolitica. Le proteine che acquisiscono attivit catalitica a seguito di azione di una proteasi sono dette zimogeni. 2. I prodotti dellattivazione del complemento sono covalentemente attaccati alle superci dei microbi o agli anticorpi a loro volta legati a microbi o ad antigeni. La piena attivazione e le funzioni biologiche del complemento sono limitate alle superci microbiche o ai siti dove gli anticorpi legano gli antigeni e non capitano mai nel sangue. 3. Lattivazione del complemento inibita da proteine regolatrici presenti normalmente sulle cellule dellospite ma assenti su quelle microbiche. Queste proteine minimizzano i danni derivanti dal complemento allhost e allo stesso tempo permettono lattivazione del sistema a danno dei microbi. 14.4.1 Vie di attivazione del complemento Esistono tre vie di attivazione del complemento: quella classica mediata da certi isotipi di anticorpi, quella alternativa3 mediata direttamente dai microbi e quella della lectina attivata dallriconoscimento di residui di mannosio. Le vie di attivazione convergono nello spezzare la proteina pi abbondante del complemento, C3. La via alternativa e della lettina

sono meccanismi effettori dellimmunit innata mentre quella classica un componente fondamentale della risposta umorale adattativa. Levento centrale nellattivazione del complemento la proteolisi di C3 a generare prodotti biologi- camente attivi e il seguente legame covalente di uno di questi, C3b, alle superci microbiche o allan - ticorpo legato allantigene. Lenzima C3 convertasi spezza C3 nei due frammenti C3a e C3b, mentre lenzima C5 convertasi fa lo stesso con C5; i fram menti sono nominati a per il pi piccolo e b per il pi grande. C3b diviene covalentemente legato al microbo o allanticorpo nella sede di attivazione del comple - mento. Tutte le funzioni biologiche del complemento dipendono dalla rottura proteolitica di C3. Le vie di attivazione differiscono nel modo in cui C3b viene prodotto, ma seguono una sequenza comune a partire dalla rottura di C5.

La via alternativaQuesta via risulta nella proteolisi di C3 e nel legame stabile di C3b alle sup erci microbiche senza intervento di un anticorpo. La proteina C3 contiene un legame tioestere reattivo se- polto sotto un ampio dominio detto domino tioestere. Quando C3 viene spezzata, C3b subisce modiche conformazionali che espongono il legame tioest ere. Normalmente nel plasma C3 viene continuamente spezzata a bassi regimi per generare C3b nel processo detto di tickover. Una piccola quantit di C3b pu dunque legarsi alle superci cellulari attraverso il legame tioestere che reagis ce con gruppi am- minici o polisaccaridici di proteine o polisaccaridi. Se questi legami non si formano C3b rimane in fase uida e il legame tioestere viene velocemente idrolizzato rendendo la proteina inattiva: lattivazione del complemento non pu procedere. Quando C3b subisce le modiche conformazionali espone anche un sito di legame per una proteina plasmatica detta fattore B. Il fattore B legato viene a sua volta spezzato da una serina proteasi plasmat- ica detta fattore D: questo genera un frammento Ba e un frammento Bb che rimane attaccato a C3b. Il complesso C3bBb la C3 convertasi della via alternativa: spezza pi molecole di C3 che generano C3b che rimane attaccato alla cellula e C3a che viene invece rilasciato. Se il complesso C3bBb viene formato su cellule di mammifero viene rapidamente degradato grazie a diverse proteine; la mancanza di queste proteine sui microbi consente lattivazione della convertasi. In aggiunta unaltra proteina della via alternativa, la properdina, pu legarsi e stabilizzare il complesso e questo favorito sulle cellule microbiche: la properdina lunico regolatore positivo conosciuto per il complemento. Alcune delle molecole di C3b generate in questo modo si legano alla convertasi stessa con formazione di un complesso che contiene un misto di una molecola di Bb e due di C3b: questo la C5 convertasi della via alternativa che spezza C5 iniziando gli ultimi step delattivazione del complemento.

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La via classica La via classica in iziata dal legame della proteina del complemento C1 ai dominiC H 2 delle IgG o aiC H 3delle IgM che hanno legato un antigene. Nelluomo le IgG pi efcaci in questo amboto sono IgG1 ed IgG3. La proteina C1 un complesso composto da C1q, C1r e C1s; C1q lega lanticorpo me ntre le altre due subunit sono proteasi. La subunit C1q lega in modo specico le regioni Fc delle catene pesantie di alcune. Ogni regione Fc de lla Ig ha un singolo sito di legame per C1q e ogni C1q deve legare almeno due catene pesanti per essere attivata: questo spiega perch il complemento si attiva solo per anticopi legati ad antigeni e non per quelli liberi. La struttura pentamerica delle IgM pu legare due molecole C1q alla volta e questa una delle ragioni per cui questo anticorpo pi efcare nel legare il complemento rispetto ad IgG. C1r e C1s sono serina proteasi. Lattivazione di C1q porta allattivazione enzimatica di C1r che spez - za e attiva C1s. La forma attiva di C1s spezza la proteina successiva della cascata, C4, generando C4a e C4b. C4 omologa a C3 e C4b ha un legame tioestere interno simile a C3b che in grado di legare complessi antigene-anticorpo: questo garantisce che lattivazione proceda solo in caso controllato. La proteina successiva, C2, poi compl essa con C4b legata alla cellula e viene spezzata da una molecola C1s vicina in un frammento C2a solubile e uno C2b che rimane associato a C4b. Il complesso risul- tante C4b2b la C3 convertasi della via classica. Il legame di questo complesso a C3 mediato dal frammento C4b mentre la proteolisi catalizzata da C2b. La rottura di C3 risulta nella rimozione del frammento C3a mentre C3b pu formare legami covalenti con le superci cellulari o con lanticorpo dove il complemento stato attivat o. Quando C3b stato depositato questo pu legare il fattore B e generare altra C3 convertasi lungo la via alternativa; leffetto nale lamplicazione e centinaia o migliaia di C3b niscono con il depositarsi. Alcune delle molecole di C3b generate lungo la via classica si legano alla convertasi e formano il complesso C4b2b3b che funziona da C5 convertasi classica. Esiste una insolita via anticorpo indipendente della via classica nelle infezioni da pneumococco. I macrofagi splenici marginali esprimono una lectina di supercie detta SIGN-R1 che lega polisaccaridi pneumococcici e C1q; il legame del batterio o del polisaccaride alla lectina attiva la via classica e promuove la copertura del pneumococco con C3b.

La via della lectina La via della lectina ativata in assenza di anticorpi dal legame di polisaccaridi microbici a lectine circolanti, come la lectina plasmatica legante mannosio (MBL) o le coline. Queste lectine solubili sono membri di una famiglia di collectine e strutturalmente somigliano a C1q. MBL lega il mannosio insieme a serina proteasi MBL associate (MASP) come MASP-1, MASP-2 e MASP-3. Queste proteasi formano complessi tetramerici simili a quelli formati da C1r e C1s e MASP-2 si porta a spezzare C4 e C2. Gli eventi seguenti sono identici a quelli della via classica.

Passi successivi dellattivazioneLa C5 convertasi g enerate nelle varie vie da il via agli ultimi passi dellattivazion e del complemento che culminano nella formazione del complesso di attacco alla mem- brana (MAC). La convertasi genera un frammento C5a che viene rilasciato e uno C5b che rimane at- taccato alle proteine del complemento depositate sulla supercie cellulare. Le rimanenti proteine della cascate del complemento (C6, C7 e C8) sono strutturalmente correlate e non hanno attivit enzimatica. C5b mantiene transientemente una conformazione in grado di legare C6 e C7. La componente C7 del risultante complesso C5b,6,7 idrofobica e si inserisce nel doppio strato fosfolipidico della membrana dove diventa un recettore ad alta afnit per C8. C8 un trimero composto da tre diverse catene, una delle quali lega il complesso C5b,6,7 e forma un eterodimero con la seconda catena; la terza si inserisce invece nel doppio strato fosfolipidico. Il complesso cos creato, C5b-8 ha limitata capacit di lisare le cellule. La formazione del MAC ottenuta dal legame di C9 al complesso. C9 una proteina del siero che polimerizza al sito dove legato il complesso C5b-8 e forma pori nelle membrane plasmatiche; questi pori permettono il passaggio di acqua e ioni e quindi la rottura delle cellule sulle quali MAC depositato. 14.4.2 Recettori per proteine del complemento Il recettore complemento di tipo 1 (CR1 o CD35), funziona principalmente per promuovere la fagocitosi delle particelle coperte da C3b o C4b. Questo recettore ad alta afnit per C3b e C4b espresso soprattutto sulle cellule del sangue ma anche sulle cellule dendritiche follicolari. I fagociti usano questo recettore per fagocitare le particelle opsonizzate. Il legame ligando-recettore trasduce inoltre segnali che attivano i meccanismi microbicidi del fagocita, soprattutto se anche il recettore Fc simultaneamente attivato. La funzione di CR1 negli eritrociti invece di catturare gli immunocomplessi per consegnarli a milza e fegato dove vengono rimossi dai fagociti. Il recettore complemento di tipo 2 (CR2 o CD21) stimola le risposte immunitarie umorali migliorando latti vazione dei linfociti B e promuovendo la ritenzione dei complessi antigene-anticorpo nei centri germinativi. CR2 si trova nei linfociti B e nelle cellule dendritiche follicolari. Il recettore lega i prodotti di degradazione di C3b, cio C3d, C3dg e iC3b, che vengono generati dalla proteolisi mediata dal fattore I. Nei linfociti il recettore espresso come parte di un complesso trimolecolare che include anche CD9 e TAPA-1; questo complesso consegna segnali al linfocita che ne migliorano la risposta allantigene. Nelluomo questo recettore il bersaglio del virus di Epstein -Barr, causa della mononucleosi infettiva come anche di molti tumori maligni. Il recettore complemento di tipo tre (Mac-1, CR3) un integrina con funzione recettoriale per il frammento iC3b. Mac-1 espresso su neutroli, fagociti e mastociti e sulle cellule NK. Il recettore consiste in una catena alfa legata non covalentemente ad una beta. Mac-1 sui neutroli e sui monociti promuove la fagocitosi dei micr obi opsonizzati con iC3b, inoltre lega la molecola ICAM-1 promuovendo ladesione stabile dei leucociti allendotelio anche senza attivazione del complemento: questo porta a reclutamento leucocitario ai siti di infezione e danno tissutale. Il recettore complemento di tipo quattro (CR4) unaltra integrina con la stessa catena beta di Mac -1 ma diversa catena alfa. Le funzioni sono simili a quelle di Mac-1. Il recettore del complemento della famiglia delle immunoglobuline (CRIg) espresso sui macrofagi del fegato, cio sulle cellule del Kupffer. Si tratta di un recettore che lega i frammenti C3b e iC3b ed fondamentale per la clearance dei batteri opsonizzati e di altri patogeni ematici. SIGN-R1 una lectina dei macrofagi marginali che riconosce polisaccaridi derivanti da preumococ- chi e lega anche C1q: fondamentale nella clearance di questo tipo di batteri. 14.4.3 Regolazione dellattivazione del complemento La regolazione del complemento mediata da parecchie proteine circolanti e di membrana di cui molte appartengono alla famiglia RCA (Regulators of Complement Activity) e sono codicate da geni omologhi collocati adiacenti nel genoma. La regolazione del complemento necessaria per due motivi:

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1. Il sistema si attiva spontaneamente in maniera blanda, ma se lasciato continuare potrebbe dan- neggiare cellule e tessuti normali. 2. Quando il sistema viene attivato opportunamente necessario controllarlo perch la degradazione delle varie proteine potrebbe farle diffondere verso le cellule vicine e danneggiarle.

Molti meccanismi di controllo sono tesi a impedire la formazione o lattivit della C3 convertasi nelle prime fasi di attivazione, o analogamente della C5 convertasi o inne del MAC. Lattivit proteolitica di C1r e C1s inibita da una proteina detta C1 inibitore (C1 INH), una serina proteasi che mima i normali substrati di questi enzimi. Se C1q lega un anticorpo e comincia latti- vazione, C1 INH diventa bersaglio della attivit enzimatica: linibitore viene spezzato e diviene legato covalentemente alle proteine del complemento, con il risultato che il complessoC1r 2 C1s 2 si dissocia da C1q e la via classica viene inibita. Una patologia autosomica dominante, ledema angioneurotico ereditario, dovuto a una carenza di C1 INH. Le manifestazioni cliniche comprendono accumuli intermittenti acuti di uido nella cute e nelle mucose che causano dolori addominali, vomito, diarrea e ostruzione delle vie aeree. In questi pazienti i livelli plasmatici di C1 INH sono ridotti a meno del 30% del normale: lattivazione di C1 non controllata e nemmeno il complemento in generale. Lassemblaggio delle C3 e C5 convertasi inibito da proteine regolatrici che legano C3b e C4b sulle super ci cellulari. Se C3b si lega alla super cie di una cellula normale di mammifero viene legato da parecchie proteine, tra cui MCP (Membrane Cofactor Protein), il recettore complemento tipo 1 (CR1), DAF (Decay Accelerating Factor) e fattore H. C4b in maniera simile viene legato da DAF, CR1, da C4BP (C4 Bingind Protein). Tutte queste proteine inibiscono per via competitiva il legame degli altri componenti del complesso convertasi, bloccando ulteriori progressi nella cascata di attivazione. Ovviamente queste proteine sono espresse nelle cellule di mammifero ma non in quelle batteriche. DAF una proteina di membrana legata a lipidi espressa su cellule endoteliali ed eritrociti. La carenza dellenzime richiesto a formare i legami proteina-lipide porta al fallimento nella sua espressione ed alla base della patologia detta emoglobinuria parossistica notturna. La patologia caratterizzata da episodi ricorrenti di emolisi intravascolare, almeno in parte legati allattivazione incontrollata del complemento a danno dei globuli rossi: si ha cos anemia emolitica cronica e trombosi venosa. C3b associato alle cellule viene degradato per via proteolitica dal fattore I, una serina proteasi plas- matica attiva solo in presenza di altre proteine regolatrici. MCP, il fattore H, C4BP e CR1 sono tutti cofattori per la degradazione mediata da fattore I di C3b e C4b. Lazione di questo fattore produce i frammenti C3b, C3dg e iC3b che non attivano il complemento ma sono comunque riconosciuti dai recettori su fagociti e linfociti B. La formazione del MAC inibita dalla proteina CD59 che funziona incorporando in se stessa il MAC in fase di assemblaggio subito dopo linserzione del complesso C5b-8, in pratica inibisce laggiunta di C9. Lassemblaggio di MAC inibito inoltre da proteine plasmatiche quali la proteina S che lega il complesso C5b,6,7 impedendone linserimento nella membrana. 14.4.4 Funzioni del complemento Opsonizzazione e fagocitosiI microbi sui quali il complemento stato attivato diventano ricoperti da C3b, iC3b o C4b e fagocitati dal legame di queste proteine a recettori specici su macrofagi e neutr oli. C3b e C4b legano CR1 mentre iC3b lega Mac-1 e CR-4. Preso singolarmente CR1 non suf ciente a indurre fagocitosi, ma lo diventa se gli stessi microbi sono coperti da IgG che simultaneamente attivano i recettori Fc. La fagocitosi C3b e iC3b dipendente un meccanismo fondamentale di difesa sia per limm unit innata che per ladatt ativa. Esempio di questa via la difesa contro pneumococchi e meningococchi. Questi batteri vengono legati dagli anticorpi IgM i quali attivano la via classica del complemento causando la clearance dei patogeni nella milza: questo anche il motivo per cui i soggetti privi di milza sono pi a rischio in queste infezioni. Stimolazione delle risposte inammatorieI frammenti C5a, C4a e C3a inducono risposte

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in- ammatorie acute attivando mastociti e neutr oli. Tutti e tre questi peptidi legano i mastociti causan- done degranulazione e rilascio di mediatori vasoattivi quali listamina; questi peptidi sono anche detti analatossine perch scatenano risposte caratteristiche dellanalassi. Nei neutroli C5a stimola in- oltre la motilit, ladesione alle cellule endoteliali e (ad alte dosi) il burst respiratorio con produzione di ROS; questa molecola potrebbe inoltre agire direttamente sullendotelio e indurre un aumento di permeabilit e lespressione della selectina P che promuove il legame dei neutr oli. Gli effetti proin- ammatori di C5a, C4a e C3a sono mediati da recettori specici tra i quali il pi studiato quello per C5a. Questo recettore di tipo accoppiato a proteina G e viene espresso su moltissime tipologie cellulari. Citolisi complemento-mediataLa citolisi media ta da MAC. La maggior parte dei patogeni ha sviluppato spesse pareti o capsule per impedire laccesso a MAC alle loro membrane, per questo in realt il sistema protegge verso pochissimi tipi di batteri, tra i quali le Neisserie. Altre funzioni del complementoLegandosi ai comp lessi antigene anticorpo le proteine del comple- mento ne promuovono solubilizzazione e clearance fagocitaria. Piccole quantit di questi complessi si formano frequentemente in circolo e se lasciate accumulare rischiano di portare a reazioni inamma- torie e danni tissutali. La formazione di questi immunocomplessi richiede interazioni tra le porzioni Fc di molecole Ig vicine: il complemento evita questo grazie allingombro sterico delle sue componenti. La proteina C3d generata da C3 lega CR2 sui linfociti B facilitandone lattivazio ne e lavvio delle risposte immunitarie umorali. C3d viene generata quando il complemento attivato da un antigene o da un complesso antigene-anticorpo. I linfociti B possono legare lantigene grazie alle loro Ig ma possono legare anche C3d grazie a CR2, potenziando in tal modo la segnalazione. 14.4.5 Evasione del complemento I meccanismi di evasione sfruttati dai microbi possono essere divisi in tre categorie: 1. Reclutamento delle proteine regolatrici dellhost. Molti patogeni esprimono acid i sialici che reclu- tano il fattore H inibendo cos la via alternativa (il fattore H separa C3b da Bb). Alcuni patogeni sottraggono acido sialico dalle cellule dellhost mentre altri hanno evoluto metodi di produzione autonomi. 2. Produzione di proteine speciche che mimano quelle regolatrici umane.E.Coliproduce una pro teina che lega C1q e impedisce il legame con C1r e C1s.S.Aureusproduce la proteina SCIN che inibisce la C3 convertasi. 3. Inibizione dellinammazione complemento -mediata grazie a prodotti di geni microbici.

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14.5 Funzione degli anticorpi in siti anatomici specici

14.5.1 Immunit mucosale IgA la pi importante classe di anticorpi in questo ambito. I tratti GI e respiratorio sono le pi importanti sedi di ingresso di microbi. Nelle secrezioni mucosali le IgA legano i microbi e le tossine nel lume e le neutralizzano impedendone lingresso. Il sistema immunitario mucosale una collezione di linfociti e altre cellule organizzato in strutture anatomich e distinte sotto gli epiteli dei tratti GI e respiratorio. Si stima che un adulto produca due grammi di IgA al giorno, cio il 70% del totale. Lo switch allisotipo IgA stimolato da citochine della famiglia del TNF tra le quali BAFF. La r agione dellabbondanza di IgA nelle mucose che lo switch avviene in modo pi efciente in questi tessuti mucosali, inoltre i plasmablasti IgA hanno particolare propensione per la lamina propria intestinale. Le IgA secrete sono trasportate attraverso le cellule epiteliali grazie a un recettore Fc IgA specico detto recettore poli -Ig. Questo recettore sintetizzato dalle cellule epiteliali delle

mucose ed espresso sulle superci basali e laterali. Quando lIgA si lega al recettore questo viene endocitato e trasportato attivamente dallaltra parte dove viene poi spezzato per via proteolitica e si ha il rilascio dellIgA in asso - ciazione ad un residuo del recettore detto componente secretorio. Questo recettore funziona soprattutto per le IgA ma capace di trasportare anche le IgM e questo ne giustica il nome.

14.5.2 Immunit neonatale I neonati non hanno la capacit di rispondere ai microbi per parecchi mesi dopo la nascita e la loro principale linea di difesa limmunit passiva dov uta agli anticorpi materni. Le IgG materne sono trasportate dalla placenta mentre un mix di IgA ed IgG viene trasportato nel latte. Le IgA ed IgG ingerite possono neutralizzare i patogeni che tentano di colonizzare i visceri, e le stesse IgG sono poi trasportate in circolo; in sostanza un neonato contiene essenzialmente le stesse IgG della madre. Il trasporto delle IgG attraverso la placenta mediato da un recettore detto recettore Fc neona- tale, unico in quanto assomiglia alle molecole MHCI. Nel periodo postnalate il recettore funziona nel proteggere gli anticorpi plasmatici dal catabolismo; si lega alle IgG circolanti, promuove lendocitosi dei complessi e in questo modo protegge lanticorpo internalizzato dalla degradazione intracellulare, riciclandolo poi di nuovo in circolo.

73

Capitolo 15.
15.1

Immunit ai microbi

Caratteristiche generali

1. La difesa contro i microbi mediata sia dallimmunit innata che dalli mmunit adattativa. Il sistema innato fornisce la prima linea di difesa mentre quello adattativo fornisce una risposta pi sostenuta e vigorosa. Molti microbi hanno evoluto sistemi per sfuggire alle risposte innate. Le risposte adattative sono generalmente pi potenti per varie ragioni, tra le quali lespansione del pool antigene-specico dei linfociti e la specializzazione. 2. Il sistema immunitario risponde a microbi diversi in modo distinto e specializzato per massimiz- zare lef cacia. 3. La sopravvivenza e la patogenicit del microbo nellospite sono inuenzate in modo critico dalla capacit del patogeno di sfuggire o resistere al sistema immunitario. 4. In molte infezioni il danno tissutale e la patologia possono essere causate dalla risposta dellhost pi che dal microbo in se.

15.2

Immunit ai batteri extracellulari

I batteri extracellulari sono in grado di replicare al di fuori della cellula ospite. La patologia causata da due meccanismi principali: 1. Induzione dellinammazione. Questo causano infezioni suppurative nelluomo. il meccanismo per cui molti cocchi piogeni

2. Produzione di tossine. Le tossine possono essere endotossine, cio componenti delle pareti del batterio, o esotossine, cio prodotti di secrezione attiva.

15.2.1 Immunit innata ai batteri extracellulari I principali meccanismi sono lattivazione del complemento, la fagocitosi e la risposta inammatoria. Il peptidoglicano dei batteri Gram+ attiva la via alternativ a del complemento promuovendo la formazione della C3 convertasi. Il LPS attiva anchesso la via alternativa in assenza di anticorpi. I batteri che esp- rimono mannosio sulla loro

supercie possono legare la lectina attivando il complemento lungo ques ta via. Uno dei risultati dellattivazione del complemento lopsonizzazione dei batteri, inoltre lassemblag- gio del MAC in grado di uccidere direttamente batteri quali le Neisserie. I prodotti del complemento sono inoltre potenti pro-inammatori che causano il reclutamento e lattivazione dei leucociti. I fagociti usano vari recettori, tra cui quelli per il mannosio e i TLR, per riconoscere i batteri e sfruttano quelli Fc e per il complemento per legare cellule opsonizzate. In aggiunta i f agociti secernono citochine, che inducono ltrazione leucocitaria ai siti di infezione, quindi inammazione. I danni tissutali sono il lato patologico di questo comportamento, inoltre le citochine sono anche responsabili delle manifestazioni sistemiche, tra le quali febbre e sintesi di proteine di fase acuta. 15.2.2 Immunit adattativa ai batteri extracellulari

Limmunit umorale la risposta protettiva principale ai batteri extracellulari e alle loro tossine. Le risposte anticorpali sono dirette contro gli antigeni della parete o direttamente alle tossine che possono essere polisaccaridiche o proteiche. Le tossine polisaccaridiche sono prototipi di antigeni timo indipen- denti, e una funzione principale dellimmunit umorale la difesa contro batteri la cui parete ricca di polisaccaridi. I meccanismi principali sono neutralizzazione, opsonizzazione, fagocitosi e attivazione del complemento. La neutralizzazione mediata da IgG ed IgA, lopsonizzazione da IgG e lattivazione del complemento da IgM ed IgG. Gli antigeni proteici attivano inoltre i linfociti T helper che producono citochine per stimolare la sintesi di anticorpi, linammazione e lattivit fagocitica. 15.2.3 Effetti dannosi delle risposte immunitarie

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I principali effetti collaterali delle risposte a batteri extracellulari sono linammazione e lo shock settico. Le reazioni inammatorie, dovute agli stessi meccanismi che sradicano linfezione, sono normalmente controllate e autolimitanti. Lo shock settico la conseg uenza di infezioni disseminate da parte di batteri Gram- (e qualche Gram+) ed caratterizzato da collasso cardiocircolatorio e coagulazione intravascolare disseminata. La fase precoce causata dalle citochine macrofagiche prodotte soprattutto in rispos ta allLPS; TNF la principale citochina mediatrice dello shock, ma anche IFN-e IL-12 hanno ruol o. Alcune tossine batterische stimolano tutti i linfociti T in un individuo che esprimono una particolare famiglia genica di recettori: sono i superantigeni. La loro importanza sta nel fatto che possono attivare moltissimi linfociti, con conseguente iperproduzione di citochine e shock. Una complicazione tardiva della risposta umorale pu essere la generazione di anticorpi patogeni. La febbre reumatica la sequela di uninfezione faringea da parte di alcuni streptococchi-emolitici; lin- fezione porta alla produzione di anticorpi contro una proteina della parete batterica ma alcuni di questi cross-reagiscono con proteine del sarcolemma cardiaco con conseguente endocardite. La glomerulone- frite streptococcica la sequela anchessa di infezioni con streptococchi -emolitici in cui gli a nticorpi formano complessi che si vanno a depositare nel rene causando la nefrite. 15.2.4 Evasione immunitaria dei batteri extracellulari

Il principale meccanismo di evasione dellimmunit umorale la variazione genetica degli antigeni superciali. Esempio il principale antigene dei pili di batteri tipo gonococco ed escherichia: la pilina. I geni che la codicano subiscono pesante conversione e la progenie di uno di questi organismi pu produrre pi di un milione di varianti che garantiscono levasione allattacco degli anticorpi anti-pilina. Altre vie di evasione sono linibizione dellattivazione del complemento o la resistenza alla fagocitosi.

15.3

Immunit ai batteri intracellulari

fagociti:

I batteri intracellulari facoltativi possono sopravvivere e anche replicare nei necessaria limmunit cellulo-mediata.

15.3.1 Immunit innata ai batteri intracellulari Questa risposta mediata soprattutto da fagociti e natural killer. I fagociti, prima neutroli e poi macrofagi, ingeriscono e cercano di distruggere questi microbi che per resistono al loro interno. I batteri intracellulari attivano le NK in ducendo lespressione di molecole NK attivanti o stimolando le cellule dendritiche e i macrofagi a produrre IL-12. Le cellule NK producono IFN-che a sua volta attiv a i macrofagi e promuove luccisione dei batteri fagocitati. Le cellule NK forniscono una prima linea di difesa, ma solitamente questa immunit fallisce nello sradicare queste infezioni. 15.3.2 Immunit adattativa ai batteri intracellulari

Limmunit cellulo-mediata consiste di due tipi di reazione: 1. Attivazione dei macrofagi grazie ai segnali dei linfociti T quali CD40L o IFN- 2. Lisi delle cellule infette da parte dei linfociti citotossici Sia le celluleC D4 + che leC D8 + rispondono agli antigeni proteici dei microbi fagocitati che sono presen- tati come peptidi sulle molecole MHCII o I. Le celluleC D4 + differenziano in effettoriT H 1dietro stimolo di IL-12 prodotta dai macrofagi e dalle cellule dendritiche. I linfociti T esprimono CD40L e secernono IFN-e questi due stimoli attivano i macrofagi per produrre varie so stanze microbicide. Linterferone stimola inoltre la produzione di isotipi anticorpali che attivano il complemento e opsonizzano i batteri per aiutarne la fagocitosi. I batteri fagocitati stimolano i linfocitiC D8 + se gli antigeni passano dal fagosoma al citosol o se il batterio scappa dal fagosoma. Nel citoplasma i meccanismi microbicidi del fagocita sono inutili e linfezione va estirpata uccidendo la cellula. Lattivazione macrofagica si ha in risposta a microbi intracellulari che possono anc he causare danno tissutale. Il danno pu essere il risultato di ipersensibilit ritardata. I batteri intracellulari si sono evo- luti per resistere alluccisione, e persistono spesso per lunghi periodi causando stimolazione antigenica cronica dei linfociti e attivazione dei macrofagi che possono risultare nella formazione di granulomi. La formazione di granulomi, principale segno istologico per alcune patologie, serve a evitare la diffusione dei microbi ma anche causa di pesanti disfunzioni tissutali. Le differenze individuali nei pattern di risposta linfocitaria ai microbi intracellulari sono determi- nanti importanti per la progressione e lesito della malattia: esempio la lebbra. Esistono due forme di lebbra, lepromatosa o tubercoloide. Nella forma lepromatosa i pazienti hanno alti titoli di anticor - pi specici ma deboli risposte cellulomediate; lesito evidente la formazione di lesioni distruttive di cute e tessuti annessi. I pazienti con lebbra tubercolosa hanno invece forte immunit cellulomediata e pochi anticorpi: si sviluppano danni ai nervi periferici ma la distruzione tissutale molto minore. La differenza tra le due patologie il modo in cui lorganismo risponde. 15.3.3 Evasione immunitaria dei batteri intracellulari

75

I meccanismi includono linibizione della fusione del fagolisosoma o la fuga nel citosol. La resistenza al- leliminazione per fagocitosi la ragione per la quale questi batteri tendono a causare infezioni croniche che durano anni.

15.4

Immunit ai funghi

Sono diversi i funghi che infettano luomo e possono vivere sia in ambiente extracellulare che dentro i fagociti: le risposte sono dunque spesso combinazioni di quelle per batteri intra ed extracellulari. La differenza che si sa poch issimo dellattivit antifungina delle varie sostanze.

15.4.1

Immunit innata ed adattativa ai funghi

I principali mediatori dellimmunit innata ai funghi sono neutroli e macrofagi. I neutroli probabil- mente liberano sostanze antifungine come i ROS e fagocitano i funghi. Limmunit cellulomediata il meccanismo principale di protezione per queste in fezioni.

15.5
15.5.1

Immunit ai virus
Immunit innata ai virus

I principali meccanismi sono linbizione dellinfezione grazie agli interferoni di tipo I e luccisione diretta delle cellule infette grazie alle NK. Sono molti i meccanismi biochimi ci che portano alla sintesi degli IFN, ad esempio il riconoscimento di genomi esogeni grazie ai TLR o lattivazione di chinasi citoplasmatiche. La funzione dellinterferone di tipo I linbizione della replicazione virale sia in cellule infette che sane attivando uno stato antivirale. Una molecola chiave indotta dallinterferone PKR, una chinasi che deve legare dsRNA per essere attivata, un tipo di acido nucleico presente nelle sole cellule infette. Lattivazione di PKR blocca la sintesi prot eica e causa quindi la morte della cellula. Le cellule NK riescono invece a riconoscere le cellule infette e ad ucciderle prima che limmunit adattativa si scateni. 15.5.2 Immunit adattativa ai virus

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Gli anticorpi bloccano il legame del virus ai recettori cellulari e i linfociti T citotossici uccidono le cellule infette. Gli anticorpi sono efcaci solo durante la fase extracellulare della vita virale, cio prima dellinfezione o nel passaggio da cellula a cellula. Gli anticorpi di isotipo IgA sono importanti per questa risposta nellambito delle mucose. Ruoli aggiuntivi degli anticorpi sono lopsonizzazione pro -fagocitosi e lattivazione del complemento. Limportanza dellimmunit umorale evidente in quanto la resistenza ad un vi rus spesso speci- ca per quel tipo sierologico di virus: ad esempio esporsi al virus dellinuenza di un certo tipo non immunizza per gli altri. Quando il virus entra in una cellula diventa irraggiungibile per lanticorpo: i vaccini dunque possono prevenire uninfezione ma mai curarne una gi in atto. Leliminazione di virus intracellulari mediata dai linfociti citotossici che uccidono la cellula infetta. Quasi tutti i linfociti citotossici sonoC D8 + che risconoscono antigeni citosolici in associazione a MHCI. Se la cellula che presenta lantigene non una APC professionista pu essere fagocitata da una di queste per attivare meglio i linfocitiC D8 + naive: si parla di cross-priming o cross-presentazione. La piena differenziazione a linfociti citotossici richiede limmunit innata o le citochine prodotte dagli helper o i costimolatori sulle cellule infette. Le risposte immunitarie alle infezioni virali possono produrre danni per azione dei linfociti citotossici o per altre vie. Una consequenza di alcune infezioni a lungo termine, tipo epatite B, la formazione di immunocomplessi che si depositano nei vasi e portano a vasculite sistemica. 15.5.3 Evasione immunitaria dei virus

1. Alterazioni degli antigeni per non essere pi bersaglio immunitario. Gli antigeni pi alterati sono le glicoproteine superciali e i meccanismi pi frequenti sono mutazioni puntiformi o riassortimento dellRNA nei virus con tale genoma. 2. Inibizione della presentazione antigenica su MHCI. In questo modo i linfocitiC D8 + non riconoscono pi la cellula infettata, ma c da dire che le NK sono fortemente stimolate da cellule che non presentano queste molecole. 3. Produzione di molecole che inibiscono la risposta immunitaria. Alcuni virus (ad esempio

poxvirus) producono proteine leganti citochine che funzionano da antagonisti competitivi. Altri virus pro- ducono molecole simil MHCI che competono per la presentazione, altri molecole che inibiscono lattivazione dei macrofagi. 4. Blocco delle risposte citotossiche in infezioni croniche. Alcuni virus potrebbero aver imparato a sfruttare i normali meccanismi di regolazione immunitaria e ad attivarli a piacimento. 5. Infezione e uccisione/inattivazione delle cellule immunocompetenti.

15.6 Immunit ai parassiti

Molti parassiti hanno cicli vitali complessi, parte dei quali non avvengono nelluomo. Linfezione si ha di solito per morsi di ospiti intermediari o per condivisione di un particolare habitat. Molte delle infezioni da parassita sono croniche per via della debole immunit innata e dellabilit del parassita di evadere le risposte.

77

15.6.1

Immunit innata ai parassiti

Quasi tutti questi organismi evadono la risposta innata perch sono ben adattati al resistere ai mec- canismi di difesa. Il meccanismo principale la fagocitosi, e i fagociti tentano anche la secrezione di sostanze microbicide per luccisione di parassiti troppo grossi per lingestione. Molti elminti hanno spesse corazze che li rendono resistenti ad atta cchi esterni.

15.6.2

Immunit adattativa ai parassiti

I parassiti sono molto diversi tra loro, cos come le risposte che scatenano. La principale difesa contro i protozoi che sopravvivono allinterno dei macrofagi limmunit cellulomediata, in particolare latti- vazione macrofagica tramite citochine derivate dalle celluleT H 1. La difesa dalle infezioni elmintiche invece mediata dallattivazione delle celluleT H 2che portano alla prod uzione di IgE e allattivazione degli eosinoli.

Capitolo 16. Immunologia dei trapianti

Per trapianto si intende il trasferimento di cellule,tessuti oppure organi da un individuo detto donatore a uno detto ricevente.Il fallimento di tale trasferimento detto rigetto, stato dimostrato che questo causato da una risposta immunitaria specifica. trapianto autologo : trapianto da un individuo allo stesso individuo(quindi cambiando solo la sede) singenico: tra due individui geneticamente identici. allogenico : tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti. xenogenico: tra individui di specie differenti. Le molecole riconosciute come estranee nel trapianto allogenico sono dette alloantigeni,quelle in quelli xenogenici xenoantigeni. I linfociti e anticorpi che reagiscono contro tali molecole sono detti alloreattivi e xenoreattivi. Lo studio del rigetto ai trapianti ha portato a importanti scoperte sia per aiutare la riuscita di molti interventi che nella comprensione del funzionamento del sistema immunitario

16.1Risposta al trapianto allogenico.

16.1.1 Riconoscimento degli alloantigeni. Le molecole MHC sono le responsabili della maggior parte delle reazioni di rigetto.Esse vengono presentate per il riconoscimento ai linfociti T in due modi differenti: -nel modo diretto:ovvero esposte sulle APC del donatore e riconosciute dai linfociti T del ricevente. -nel modo indiretto:ovvero vengono processate come normali proteine antigeniche dalle APC del ricevente ed espresse dalle

MHC del donatore come semplicissimi peptiti e riconosciute dai linfociti T del ricevente. Riconoscimento diretto. Il riconoscimento diretto il risultato della cross-reattivit dei linfociti T verso MHC allogenici.Il risultato che invece di riconoscere un complesso MHC self-antigene non self riconosce un MHCnon self- antigene self.Questo dovuto al fatto che durante lo sviluppo nel timo la selezione positiva e successivamente la negativa selezionano linfociti T capaci di legare le MHC self con bassa affinit ed eliminano quelle che le legano con affinit elevata o che non le legano.Tuttavia questo processo non garantisce l'eliminazione di linfociti T che possono legare MHC estranee(le chiameremo allogeniche).Si viene a creare un repertorio maturo con intrinseca bassa affinit per MHC self ma al contempo include linfociti T capaci di legare MHC allogenici con alta affinit. Abbiamo visto che i sistemi di tolleranza inattivano o eliminano i linfociti T che rispondono a MHC self legate a peptidi self. L'obbiettivo riconoscere MHC self con peptidi non self specifici..Essendo tale riconoscimento dovuto a interazioni allosteriche o tra singoli amminoacdi possibile che linfociti T riconoscano MHC allogenici legati a peptidi self scambiandoli per MHC self legati a peptidi estranei specifici. Questo perch o l'MHC allogenico da solo mima la struttura di MHCself-antigene estraneo(in questo caso l'antigene serve solo da stabilizzatore),o l'intero complesso MHC allogenico-antigene self ha complessivamente stessa struttura di MHC-self- antigene estraneo specifico. In questo caso vista l'enormit degli antigeni presentabili,una singola cellula allogenica,la qualche esprime circa 10^5 MHC potr esprimere 10^5 antigeni differenti e quindi essere riconosciuta da 10^5 cloni differenti di linfociti T. Riconoscimento indiretto Le molecole MHC essendo comunque proteine possono venir processate ed espresse dalle APC del ricevente come se si trattasse di semplicissimi antigeni microbici legati a MHC2.Per il fenomeno della cross-presentazione possono venire anche presentate da MHC1 ai CD8.In questo caso sono le intere cellule del donatore a venire fagocitate da APC professionali e poi viene presentato un antigene processato. 16.1.2 Attivazione dei linfociti alloreattivi Abbiamo visto come sia la via diretta che indiretta vadano ad attivare i linfociti T alloreattivi.Il punto fondamentale sappiamo essere l'esistenza di APC che presentino questi antigeni allogenici.Una volta attivati i i linfociti alloreattivi migrano nel sito di trapianto e ne causano il rigetto.Il contributo maggiore lo danno i linfociti CD4 che differenziati in cellule effettrici secernono citochine che danneggiano il trapianto con una reazione simile a quella di DTH. I linfociti CD8 attivati dalla via diretta da APC del donatore esprimenti MHC1 si differenziano in CTL che eliminano le cellule che esprimono MHC allogenici di classe 1; mentre quelli attivati dalla via indiretta sono ristretti per MHC self quindi non possono eliminare le cellule estranee ma solo cellule dell'ospite che esprimo antigeni del donatore. Queste risposte vengono studiate in vitro mediante la MLR(reazione linfocitaria mista).Tale processo usato come processo predittivo nel rigetto in un trapianto e si basa sull'incontro delle popolazioni linfocitarie dei due individui e nell'osservazione se si assiste o meno a proliferazione. La produzione di alloanticorpi molto limitata e consiste nella azione dei linfociti B la quale mima l'azione delle APC presentando frammenti di MHC allogenico ai linfociti T helper attivandoli a produrre anticorpi contro dagli antigeni. Particolarmente interessante la mancanza di rigetto del feto da parte di madri incinte.Il feto esprime molecole MHC paterne e come tali vengono riconosciute come allogenici per la madre,Tuttavia non accade alcun rigetto.Le ipotesi sono multiple ma le pi accreditate sono 2: -le cellule trofoblastiche,ovvero quelle nella zona di comunicazione placenta-madre sono prive di MHC e nel caso le esprimessero sono comunque prive di molecole costimolatorie. -la decidua potrebbe essere un sito immunologicamente privilegiato in cui cellule deciduali inibiscono le funzioni di macrofagi e linfociti secernendo TGF-. inoltre provato che nel feto le risposte immunitarie dipendono dai livelli di triptofano e si formulata l'ipotesi che bassi livelli di triptofano nella placenta le inibiscano.

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16.2 Meccanismi effettori del rigetto

Il rigetto da trapianto classificato in base alle caratteristiche istopatologiche e cinetiche in iperacuto,acuto accelerato,acuto e cronico. Rigetto iperacuto: caratterizzato dall'occlusione trombotica dei vasi del trapianto e inizia entro pochi minuti dalla formazione dell'anastomosi.Il tutto mediato da anticorpi preesistenti nel ricevente che si legano all'endotelio del trapianto attivando il complemento il quale provoca trombosi vascolare e danno tissutale.Si ha l'esposizione di proteine della

membrana basale che attivano le piastrine e innescano il meccanismo di adesione e aggregazione piastrinica.Nei primi giorni il rigetto mediato da alloanticorpi IgM diretti principalmente verso gli antigeni della famiglia ABO presenti sulla superficie dei globuli rossi e delle cellule endoteliali.In questo caso si assistito a un trapianto tra due soggetti appartenenti a gruppi sanguigni differenti.Oggigiorno questo problema superato e il rigetto iperacuto mediato pi che altro da alloanticorpi IgG diretti contro alloantigeni come MHC.Questi si sono formati in seguito a precedenti trasfusioni ,trapianti o gravidanze multiple ovvero ogni contatto con cellule contenenti MHC diversi dai propri. Rigetto acuto:Il rigetto acuto un processo di danno sia vascolare che parenchimale mediato sia da anticorpi che da linfociti T e inizia dopo circa una settimana dal trapianto.In questo caso gli anticorpi non sono preesistenti bens vengono sviluppati dalla risposta immunitaria umorale ed per questo che il tempo di risposta pi lento.Il quadro istologico caratterizzato da necrosi transmurale e infiammazione acuta dei vasi del trapianto senza tuttavia il verificarsi di trombosi come nel caso del rigetto iperacuto.Sia linfociti CD4 che CD8 contribiscono al rigetto acuto:i CD8 nella lisi delle cellule endoteliali e i CD4 nella infiammazione e e nelle reazioni DHT. Rigetto cronico e vasculopatia:i trapianti che sopravvivono pi di 6 mesi sviluppano una lenta occlusione arteriosa risultato di una proliferazione delle cellule muscolari lisce.Queste modificazioni prendono il nome di vasculopatie del trapianto. Questa proliferazione dovuta a una serie di interazioni tra citochine e fattori di crescita prodotti macrofagi e cellule endoteliali stimolati da linfociti T alloreattivi.Con il progredire della ischemia il parenchina viene sostituito da tessuto fibroso ;questo processo fibrotico viene anche chiamato rigetto cronico.

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16.3 Prevenzione e trattamento del rigetto da allotrapianto.

Fisiologicamente se il ricevente di un trapianto ha un sistema immunitario funzionante il trapianto va in contro a qualche forma di rigetto.Alcune strategie usate nella pratica per prevenire tale rigetto consistono nell'induzione di momentanee immunosoppressioni. Attualmente uno degli obbietti principali in trapiantologia quello di indurre uno stato di tolleranza specifiche senza bisogno di immunosoppressioni.Prima abbiamo visto quali potevano essere le cause del rigetto,conoscendole dunque possibile attuare una forma di prevenzione per ridurre l'immunogenicit dell allotrapianto. 16.3.1 Ridurre l'immonogenicit. Alcuni test vengono effettuati per verificare la compatibilit donatore-ricevente: -tipizzazione del gruppo sanguingo ABO.Questo test effettuato per prevenire l'insorgenza di rigetto iperacuto dato da IgM. -Tipizzazione tissutale:tipizzazione HLA:ridurre al minimo le differenze alleliche HLA espresse dalle cellule del donatore e ricevente.Solo la tipizzazione HLA-A,B e DR sono importanti. -Screening per la presenza di anticorpi preformati:viene mischiato il siero del ricevente con quello di diversi donatori e si valuta la PRA,ovvero la percentuale di anticorpo reattivo che la percentuale di cellule del donatore contro le quali il paziente reagisce. -Crossmatching: il test sopracitato specifico tuttavia solo tra un donatore e il ricevente.La negativit a tale test essenziale per il trapianto. 16.3.2 Immunosoppressione Il principio base su cui si basa questa tecnica quello di inibire o uccidere il linfociti T momentaneamente. -L'uso di farmaci immunosoppressori il metodo pi usato e tra i pi comuni sono da ricordare ciclosporina e FK-506 entrambi importanti inibitori della calcineurina. La calcineurina essenziale per la trasmissione del segnale di IL-2 e altre citochine.Bloccando la calcineurina si va a inibire attivazione e proliferazione dei linfociti T. -Altri inibitori della proliferazione vanno ad agire su mTor e la prima scoperta stata la rapamicina. -Un altro metodo quelli di utilizzare tossine che uccidono i linfociti T in proliferazione e il primo usato l'aziatropina ma

vista la sua tossicit il pi comunemente usato il MMF. -Sono stati creati anche anticorpi che uccidono o inibiscono i linfociti T ad esempio OKT3 si lega al CD3 oppure un'altro riconosce e blocca la subunit CD25. -Ultima via quella di bloccare le vie costimolatorie dei linfociti T ad esempio con CTLA-4 solubile o con bloccanti di CD28. In associazione ai farmaci T bloccanti sono regolarmente usati farmaci antinfiammatori tra cui i potenti sono i corticosteroidi,i quali agiscono bloccando la sintesi e la secrezione di citochine soprattutto TNF e IL-1. Ovviamente l'immunosoppressione prolungata richiesta per una sopravvivenza a lungo termine d un trapianto aumenter molto la suscettibilit a infezioni virali e quindi a tumori virali.Per questa ragione a soggetti trapiantati vengono somministrate terapie antivirali come profilassi.In soggetti trapiantati,i linfomi a cellule B e a cellule della cute sono i pi frequenti. 16.3.3 Induzione di tolleranza. L'induzione di tolleranza costituisce un enorme vantaggio rispetto all'immunosoppressione in quanto diminuisce la suscettibilit a infezioni e anche di evoluzione di rigetto cronico. Essa consiste nell'induzione di anergia periferica e delezione di cellule T alloreattive.Sono in corso inoltre studi per la creazione di linfociti T regolatori specifici per gli alloantigeni del trapianto.

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16.4 Trapianti
Il trapianto xenogeno rappresenterebbe un importantissimo serbatoio vista la scarsit di donatori di trapianti. Tuttavia uno dei principali ostacoli per l'utilizzo di tali trapianti proviene dalla presentza di anticorpi naturali che mediano il rigetto iperacuto indirizzati verso determinanti carboidratici espressi sulle cellule di specie non concordanti.Per l'uomo ad esempio un trapianto di organi di scimpanz risulterebbe poco immunogenico tuttavia l'ostacolo qui rappresentato dalle grosse diversit anatomiche.La miglior compatibilit anatomica si ha con il maiale che risulta cosi l'animale prediletto per gli xenotrapianti.Nel caso di xenotrapianti si osserva lo stesso rigetto iperacuto che si osserva negli allotrapianti. Un particolare tipo di trapianto quello della trasfusione sanguigna.In questo caso bisogna fare particolarmente attenzione alla compatibilit ABO.Questi antigeni ABO sono presenti su tutte le cellule compresi i globuli rossi.Una trasfusione di sangue non compatibile provoca lisi dei globuli rossi estranei che comporta comparsa di reazioni trasfusionali che possono essere letali per il paziente.Un'esempio la presenza di emoglobina libera che causa grossi danni renali. Di particolare rilevanza infine il trapianto di midollo osseo in quanto l'unico che possa essere effettuato in vivo.Esso consiste nel trapianto di cellule staminali pluripotenti attraverso inoculo di cellule raccolte per aspirazione dal midollo osseo. Questo trapianto particolarmente utile per correggere deficit del sistema ematopoietico o immunitario;oppure per correggere deficit o anomalie ereditarie in enzimi o proteine. Prima di effettuare tale trapianto necessario sopprimere il pi possibile le difese immunitarie dell'ospite.Di particolare rischio l'insorgenza del cosiddetto GVHD che consiste nella reazione dei linfociti T maturi contenuti nell'inoculo contro gli alloantigeni del paziente.Si presenta in quanto il paziente essendo immunocompromesso non in grado di rigettare tali cellule che dunque possono svolgere questa azione di distruzione.Si pu assistere a una GVHD acuta caratterizzata dalla morte di cellule epiteliali epatiche ,di cute e del tratto gastrointestinale che pu essere letale;oppure di GVHD cronica in cui si ha fibrosi e atrofia di questi stessi organi senza apparente morte cellulare che comunque nella forma pi grave pu anche essa essere fatale.Per questo motivo si cerca di eliminare ogni forma di linfociti T maturi dall'inoculo. Questa reazione distruttiva tuttavia utilizzata anche nella cura di neoplasie del midollo osseo(leucemie) e di tumori solidi disseminati sfruttando questi linfociti T estranei per uccidere le cellule proliferanti anomale.I riceventi di trapianto di midollo osseo sono spesso accompagnati da immunodeficeza clinica probabilmente dovuta alle tecniche preparatorie al trapianto.

Capitolo 17. Immunit e tumori.

I tumori maligni rappresentano un problema prioritario per la salute della popolazione poich rappresentano uno dei principali fattori di morte.Essi sono dovuti alla proliferazione incontrollata di determinate cellule trasformate.Le risposte immunitarie svolgono la cosiddetta immunosorveglianza che consiste nel riconoscimento ed eliminazione delle cellule trasformate mediante riconoscimento di specifici antigeni segnale da esse espressi.Tuttavia queste cellule hanno specifiche capacit di eludere il sistema immunitario ed tale caratteristica a rendere possibile l'insorgenza di tumori.

Dunque abbiamo detto che le cellule tumorali esprimono antigeni riconosciuti come estranei dall'ospite,proprio questo alla base della immunogenicit dei tumori.Tuttavia le risposte imunitarie spesso non riescono a eradicare il tumore.Le ragioni di questo fallimento sono multiple: -Essendo le cellule tumorali derivati di cellule normali dell'ospite esse possono esprimere pochi antigeni riconosciuti come non-self e quindi passare inosservate. -La rapidit di crescita delle cellule tumorali spesso superiore a quella di eliminazione del sistema immunitario. -Molti tumori hanno messo a punto sistemi di elusione delle risposte immunitarie. Sono stati effettuati studi che hanno reso possibile l'attivazione del sistema immunitario contro un determinato tumore per via esogena.

17.1 Antigeni tumorali.

Nei tumori umani sono stati ritrovati antigeni riconosciuti sia dai linfociti T che dai B.L'identificazione di antigeni tumorali essenziale per lo sviluppo di vaccini e anticorpi. Gli antigeni espressi solo dalle cellule tumorali sono detti TSA,quelli espressi costitutivamente da tutte le cellule sono detti TAA e nei tumori si vede una espressione sregolata di codesti. Gli antigeni tumorali possono derivare da molti processi differenti e causare tumori differenti. Prodotti di geni mutati Alcuni antigeni tumorali sono il risultato di una mutazione di geni normali che vanno quindi a esprimere proteine oncogeniche. Possono essere il risultato di mutazioni a carico di proto-oncogeni o geni oncosoppressori come le proteine Ras,p53,BcrAbl.Tali proteine se alterate non riescono pi a controllare il ciclo cellulare e vengono processate ed esposte associate a MHC1 oppure l'intera cellula pu essere fagocitata ed gli antigeni esposti d MHC2. Gli antigeni tumorali possono essere il risultato anche di mutazioni casuali a carico di geni non implicati nel controllo del ciclo cellulare.Le dimostrazioni sono state che cellule trattate con cancerogeni identici sviluppavano tumori diversi esprimenti antigeni diversi. Vuol dire che il cancerogeno va a modificare casualmente geni.Le proteine risultanti vengono sintetizzate nel citosol e presentate mediante molecole MHC di classe 1 alle CTL. Antigeni sviluppati in seguito a trapianto di tumori indotti da cancerogeni sono detti TSTA.In seguito a somministrazione di tali cellule in topi che avevano gia sviluppato quel tumore e che era stato espiantao,si assisteva alla mancata comparsa nuovamente di tumore. Ugualmente se si impiantavano i linfociti TCD8 derivati da un topo portatore di tumore in un altro portatore dello stesso,si assisteva all'annientamento del tumore. Questa la prima dimostrazione dell'esistenza dell'immunit anti tumorale,oltre che un utile strumento per la lotta ai tumori mediante creazione di cloni CD8 specifici. Proteine cellulari espresse in modo anomalo. Alcuni antigeni tumorali sono proteine normali,normalmente espresse a bassi livelli o addirittura non espresse che in cellule tumorali sono invece espresse in modo anomalo.Ricordiamoci sempre che non sono queste proteine a indurre il tumore o rappresentarne meccanismo effettivo,sono solo un risultato di mutazioni che hanno portato poi alla trasformazione tumorale e che vengono utilizzate dal sistema immunitario come segnali di neoplasia. Dunque una di queste proteine normalmente espressa a bassi livelli la tirosinasi.Cloni di linfociti T ottenuti da pazienti con melanoma riconoscono peptidi derivati dalla tirosinasi. Il fatto che tali linfociti rispondano a un antigene self senza venire eliminato dalla selezione negativa o esserne indotto tollerante dato dal fatto che tale antigene in condizioni fisiologiche espresso talmente poco e talmente poche cellule da non essere nemeno riconosciuta dal sistema immunitario e da non indurre tolleranza. Altre proteine espresse dalle cellule tumorali sono risultato di geni normamente silenti,che per nelle cellule tumorali vengono attivati senza comunque modificazioni della sequenza.Quindi sono proteine appartenenti al patrimonio di cellule normali. Antigeni prodotti da virus oncogeni. I prodotti dei virus oncogeni si comportano da antigeni ed evocano risposte immunitarie.In quetso caso molte delle proteine che fungono da antigene svolgono anche un ruolo cruciale nella immortalizzazione della cellula.Molti virus sono implicati nello sviluppo di una serie di tumori nell'uomo. Es Epstein -Bar o Papiloma virus.Le proteine antigeniche codificate dal Dna virale vengono processate e presentate da Mhc di classe1.L'immunosorveglianza agisce in questo caso uccidendo le cellule infettate. Epstein-Barr virus:virus che appartiene alla famiglia degli herpes virus e che infetta i linfociti B causandone una incontrollata replicazione. trasmesso tramite saliva ed ubiquitario nella popolazione mondiale.Esistono due tipi di

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inbfezione:litica e latente.La prima caratterizzata dalla lisi della cellula infettata mentre la seconda no.Molti antigeni espressi dal Dna virale sono rilevati dal sistema immunitario.Vi sono 6 antigeni nucleari detti EBNA,due espressi sulla membrana detti LMP,e altri espressi all'interno della cellula detti VCA.Alcuni di questi sono cruciali per la immortalizzazione delle celulle colpite.L'infezione da EBV uno dei fattori eziologici nello sviluppo di tumori maligni come ad esempio il linfoma di Burkit. In soggetti giovani e sani si sviluppa la mononucleosi infettiva che poi rimrr latente per tutta la vita. Sono state stabilizzate in vitro linee cellulari di CTL in grado di lisare cellule infettate da EBV.La mutazione alla base del linfoma di Burkitt la traslocazione del gene MYC al locus per le Ig portandone a una produzione e trascrizione sregolata.Tuttavia in alcuni casi sufficiente la semplice trascrizione del genoma virale senza ulteriori traslocazione per l'insorgenza del tumore. Ovviamente deficit immunitari come malaria o HIV costituiscono un importante legame tra l'infezione da EBV e l'insorgenza di tumore. Antigeni oncofetali. Gli antigeni oncofetali sono proteine altamente espresse dalle cellule fetali in via di sviluppo assenti poi nei tessuti adulti.Si ritiene che i geni corrispondenti vengano repressi durante lo sviluppo ma durante la trasformazione maligna vengano riattivati.Tali antigeni sono infatti espressi in cellule neoplastiche.C' da puntualizzare che essi sono anche normalmente presenti in alcuni tessuti adulti. I due antigeni meglio caratterizzati sono CEA eAFP.CEA fa parte della famiglie delle Ig ed espressa sulla membtana cellulare in molti carcinomi di colon,pancreas,stomaco e mammella.AFP una proteina solubile normalmente non presente nel siero che invece presente in tumori epatici o gastrici. Antigeni costituiti da glicoproteine o glicolipidi alterati. La maggior parte dei tumori esprime livelli elevati di glicoproteine o glicolipidi anomali.Queste forme alterate costituiscono importanti fattori neoplastici essendo essenziali per invasione e metastasi neoplastica.Anticorpi monoclali utilizzati in terapia ha come bersaglio proprio tali antigeni.Tra i principali glicolipidi alterati vi sono GM2,GD2,GD3.Tra le glicoproteine abbiamo le mucine alterate in cui le catene laterali sono modificate a casua della modificazione degli enzimi che le sintetizzano. Antigeni di differenziazione tissutale. Molecole normalmente presenti sulle cellule di origine che permangono anche nelle cellule differenziate.

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17.2 Risposta immunitaria

17.2.1Risposta innata Cellule NK:sebbene il loro ruolo in vivo non sia stato ancora ben chiarito in vitro stato dimostrato che queste sono in grado di uccidere molti tipi di cellule tumorali,in particolare quelle cellule che non presentano MHC 1 sulla loro superficie e quindi mancano del segnale inibitorio su NK.Inoltre molte cellule tumorali esprimono altri segnali attivatori delle NK come MICA,MICB, eULB i quali vengono riconosciuti dal recettore attivatorio NKG2D espresso sulle NK.L'azione delle NK fortemente potenziata in presenza di citochine come IL-2 e IL-12. Macrofagi:in vitro i macrofagi sono in grado di uccidere numerose cellule tumorali nello stesso modo in cui uccidono i microrganismi patogeni.La loro attivazione mediata da IFN-.Essi producono inoltre TNF che abbiamo visto promuovere l'uccisione di cellule tumorali mediante trombosi dei vasi che le irrorano. 17.2.2 Risposta specifica. Linfociti T:il principale meccanismo dell'immunit anti-tumorale l'uccisione delle cellule tumorali da parte dei linfociti T CD8 CTL.Questi uccidono le cellule potenzialmente dannose che esprimono i peptidi mutati sulle MHC1.Poich la maggior parte delle cellule maligne sono cellule normali,queste non esprimono le molecole costimolatorie necessarie all'attivazione dei linfociti T quindi necessitano di molecole presentanti tali antigeni come le APC che svolgono la cosiddetta crosspresentazione.Tale processo o la stimolazione dei CD4 sono indispensabili per l'attivazione,Linee di APC specifiche vengono coltivate in vitro a partire da soggettti affetti da tumore per essere utilizzate come vaccini.I linfociti CD4 svolgono un ruolo soprattutto nella produzione di citochine quali TNF e IFN- che aumentano l'espressione di MHC1 e altre che mediano il corretto sviluppo dei CD8.

Anticorpi:Gli anticorpi possono uccidere le cellule maligne mediante attivazione del complemento oppure tramite citotossicit cellulare attivando NK e macrofagi contenenti recettori per Fc.In vivo i risultati sono comunque ancora scarsi.

17.3 Elusione delle risposte immunitarie.

Nei tumori maligni vi sono diversi meccanismi che consentono alle cellule tumorali di eludere le risposte immunitarie(tumor escape).Viene a crearsi una pressione selettiva nei confronti di tali cellule detta tumor editing,la quale promuove lo sviluppo di varianti con ridotta immunogenicit.I meccanismi attuati per eludele l'immunit sono molteplici: -Gli antigeni tumorali possono indurre tolleranza immunologica o perch sono antigeni self gi incontrati che hanno solo variato frequenza di espressione o perch tali cellule tumorali riescono a presentarli in forma tollerogenica. -I linfociti T regolatori ,i quali aumentano in caso di tumore,vanno a inibire l'attivit dei linfociti T tumore-specifici. -Antigeni riconosciuti come tumore-specifici dai linfociti T ,in seguito a mutazioni avvenute nelle numerosissime mitosi ,cessano di essere espressi.Si pu inoltre assistere a diminuita espressione di MHC,microglobulina e componenti dell'apparato di presentazione dell'antigene. -Mancata espressione di molecole costimolatorie necessarie per attivazione di CD8 e CD4.Vengono a essere indispensabili le APC che per spesso hanno capacit captative ridotte. -Cellule tumorali possono sopprimere le risposte tumore-specifiche ad esempio mediante secrezione di TGF- che abbiamo visto inibire proliferazione e attivazione di macrofagi e linfociti.Alcuni tumori esprmono inoltre il ligando Fas(FasL) che riconosce il dominio di morte Fas presente sui linfociti e ne induce l'apoptosi.

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17.4 Immunoterapia dei tumori

Nella lotta contro i tumori attualmente le principali terapie utilizzate consistono nel blocco delle cellule in corso di divisione cellulare.Ovviamente tale processo non distingue cellule tumorali da cellule sane ed quindi particolarmente invasivo e dannoso.Un metodo molto pi specifico e efficace consiste nel riuscire a indirizzare le risposte immunitarie verso le cellule tumorali.Questo processo ottenuto mediante due principali principi:stimolare le risposte immunitarie dell'ospite oppure immunizzare l'ospite passivamente con anticorpi e linfociti T. Prendiamo in considerazione la prima strada;andiamo a vedere i diversi processi che si possono intraprendere: -immunizzazione con cellule o antigeni tumorali:Per aiutare il lavoro dei linfociti T si possono somministrare cellule tumorali uccise o antigeni tumorali quindi entrambi innocui a livello proliferativo per aumentare le risposte immunitarie.Ultimamente si procede anche alla somministrazione di APC coltivate in vitro con l'antigene tumore-specifico che rendono la presentazione ancor pi efficace.Altra tecnica innovativa la somministrazione di vaccini a Dna,ovvero plasmidi contenenti Dna complementare a quello virale oncogeno che codifica quindi per gli stessi antigeni tumorali senza pero stimolare proliferazione e immortalizzazione. Tuttavia tali vaccini sono particolarmente utili nella prevenzione dei tumori, ma ancora spesso incapaci di stimolare una risposta immunitaria abbastanza potente da eradicare il tumore gia espanso. -potenziamento dell'immunit anti-tumorale con citochine e costimolanti:vista la difficolt di attivazione dei linfociti T durante il tumore si procede alla stimolazione dei linfociti tumore- specifici mediante fornitura di citochine sia per infusione diretta che indirettamente mediante trasfettazione di geni codificanti citochine nelle cellule tumorali per indirizzare gli effetti del sistema immunitario.L'altro meccanismo quello di trasfettare i geni codificanti le molecole costimolatorie mancanti ,necessarie all'attivazione dei linfociti T. Le citochine maggiormente utilizzate sono IL-2eIL-12(stimola CTL e NK),IFN-,TNF e soprattutto GM-CSF. -blocco dei circuiti inibitori:bloccando soprattutto CTLA-4 che normalmente inibisce le risposte immunitarie,tuttavia si osservano spesso sviluppi di risposte autoimmuni poich CTLA-4 coinvolto nel mantenimento alla tolleranza al self -stimolazione aspecifica del sistema immunitario:somministrazione soprattutto topica di sostanze infiammatorie o agenti che funzionano come attivatori poloclonali dei linfociti. Molti batteri svolgono bene questo ruolo in particolare il bacillo BCG.Anche anticorpi verso CD3 sono in grado di attivare ottimamente i linfociti T. Il secondo meccanismo consiste nel somministrare direttamente linfociti T o anticorpi al paziente attuando una cosiddetta

immunoterapia passiva. -Terapia cellulare adottiva:trasferimento di leucociti tumore-specifici in pazienti affetti da tumori.Le cellule trasferite vengono ottenute a partire da cellule del paziente principalmente provenienti da due fonti: leucociti circolanti detti LAK coltivati ad alte concentrazioni di IL-2 e reimpiantati oppure leucociti provenienti dall'infiltrato infiammatorio detti TIL. -Effetto Graft versus leukemia(GVF):in pazienti affetti da leucemia vengono impiantati leucociti provenienti da un donatore che siano alloreattivi nei confronti delle molecole MHC del ricevente quindi anche delle cellule tumorali. -Terapia con anticorpi tumore-specifici:Gli anticorpi monoclonali possono eliminare le cellule tumorali con gli stessi meccanismi usati per eliminare i microrganismi,quindi opsonizzazione,attivazione del complemento,fagocitosi e inoltre possono anche lisare direttamente la cellula tumorale.Tuttavia essendo tali anticorpi derivati da ibridomi di topo spesso si assisteva alla formazione di anticorpi anti-anticorpo.Si superava tale problema con l'uso di anticorpi umanizzati.Gli anticorpi vengono spesso accoppiati a molecole tossiche o farmaci anti-tumorali per promuovere il rilascio specifico di questi in corrispondenza delle cellule tumorali. Tali complessi prendono il nome di Immunotossine.Queste iniettate per via sistemica vengono endocitate dalle cellule tumorali e le tossine vengono liberate. Tuttavia affinch tale processo funzioni serve una elevatissima specificit degli anticorpi e si rischia l'attacco delle tossine contro cellule normali. Inoltre possono insorgere anticorpi anti-tossine che le eliminano prima dell'azione oppure che l'intera immunotossina venga fagocitata da fagociti presentanti il recettore Fc appropriato. Specifici anticorpi sono stati creati contro specifici idiotipi delle cellule B senza pero grandi risultati.Altri contro i fattori VEGFche mediano la formazione di nuovi vasi che alimentino i tumori. Paradossalmente il sistema immunitario oltre a rappresentare un importante sistema di lotta contro i tumori ne rappresenta anche una importante fonte.Molti tumori nascono infatti a seguito di processi infiammatori cronici ,angiogenesi e rimodellamento tissutale mediati proprio dall'immunit innata.

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Capitolo 18. Malattie causate dalle risposte immunitarie: ipersensibilit ed autoimmunit

Le risposte immunitarie possono essere patologiche a causa di parecchie e diverse anormalit. 1. Autoimmunit. Le reazioni immunitarie contro le cellule dello dette autoimmuni. 2. stesso organismo sono

Reazioni contro i microbi. Le risposte contro gli antigeni microbici possono causare malattia se eccessive o se linfezione insolitamente persistente. La formazione di immunocomplessi pu portare ad accumulo nei tessuti e scatenare infiammazione, cos come le risposte dei linfociti T ai microbi persistenti. Raramente un anticorpo o una cellula T pu cross-reagire con i tessuti dellhost. Reazioni contro antigeni ambientali. Il 20% della popolazione risponde in modo normale a sostanze innocue dellambiente. Le reazioni contro tali sostanze possono essere causate sia dallipersensibilit immediata che da quella ritardata.

3.

Il problema nelle patologie di ipersensibilit lattivazione incontrollata ed inappropriata delgli stessi meccanismi normalmente utilizzati nelle infezioni; poich gli stimoli per queste risposte aberranti sono spesso difficili o impossibili da eliminare, le patologie di questo tipo sono tipicamente croniche. Le patologie da ipersensibilit si dividono fondamentalmente in quattro categorie a seconda della loro causa: Ipersensibilit Tipo I (Immediata) Tipo II Tipo III Tipo IV Causa IgE Anticorpi Immunocomplessi Linfociti T

Molte delle patologie da ipersensibilit sono mediate dai TH 1: i linfociti T causano direttamente

linfi- ammazione o stimolano la produzione di anticorpi che danneggiano i tessuti e quindi li infiammano. Per contrasto le reazioni allergiche (ipersensibilit immediata) sono prototipi di patologie TH 2 mediate nelle quali il linfocita T stimola la produzione di anticorpi di tipo IgE.

18.1

Patologie causate da anticorpi

Le patologie mediate dagli anticorpi possono essere dovute sia allatto delle Ig di legarsi a quel che riconoscono sia alla formazione e deposito di complessi antigene-anticorpo. Nelle patologie dovute al legame degli anticorpi agli antigeni tissutali sono tre i meccanismi pato- genici: 1. Gli anticorpi possono opsonizzare le cellule attivando i fagociti per la loro distruzione: questo il principale meccanismo nellanemia emolitica autoimmune e nella trombocitopenia porpora autoimmune. 2. Gli anticorpi possono reclutare neutrofili e macrofagi i quali legano Ig o proteine del comple- mento con i loro recettori e con i loro prodotti mediano infiammazione acuta e danno tissutale: questo il principale meccanismo nella glomerulonefrite anticorpo mediata. Gli anticorpi possono legarsi a normali recettori cellulari interferendone con la funzionalit e causando malattia senza infiammazione o danno tissutale: questo il principale meccanismo dellipertiroidismo o malattia di Graves.

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3.

Nelle patologie dovute alla formazione e al deposito di complessi si nota che il quadro riflette il sito di formazione del complesso e non lantigene: queste patologie sono dunque spesso sistemiche e non presentano particolare specificit tissutale o dorgano. I complessi antigene-anticorpo sono prodotti costantemente durante le normali risposte immunitarie, diventano causa di malattia solo quando sono prodotti in quantit eccessive, non vengono eliminati e si accumulano nei tessuti. I capillari renali sono tra i siti pi comuni di deposito degli immunocomplessi per via della loro funzione di filtrazione. Il deposito sulle pareti dei vasi porta ad infiammazione mediata sia dal complemento che dalle varie cellule che riconoscono il frammento Fc; molte malattie immunologiche sistemiche hanno questo aspetto alla base, il prototipo il lupus erimatoso sistemico. Le manifestazioni cliniche di questa patologia includono glomerulonefrite ed artrite che sono da attribuire alla formazione di immunocomplessi tra DNA self o nucleoproteine e anticorpi specifici.

18.2 Patologie causate da linfociti T

I linfociti T danneggiano i tessuti tramite lipersensibilit ritardata o tramite luccisione cellulare diretta. Le reazioni di ipersensibilit sono stimolate sia dai C D4+ sottogruppo TH 1 che dai C D8+ in quanto entrambi secernono citochine che attivano i macrofagi (IFN- ) e inducono infiammazione (TNF). In alcune patologie T -mediate i linfociti T C D8+ citotossici uccidono le cellule bersaglio che presentano antigeni MHC1-associati. Malattie causate da ipersensibilit Nelle reazioni di ipersensibilit il danno tissutale deriva dai prodotti dei macrofagi attivati, quali enzimi lisosomiali, ROS, NO e citochine infiammatorie. Reazioni croniche di questo tipo spesso producono fibrosi per via della secrezione di citochine e di fattori di crescita. Molte patologie autoimmuni organo specifiche sono causate da reazioni di ipersensibilit indotte dai linfociti T autoreattivi, tra le pi importanti: 1. Il diabete mellito di tipo 1 dovuto alla presenza di linfociti e macrofagi intorno alle isole del Langerhans i quali distruggono le cellule produttrici di insulina. 2. La sclerosi multipla dovuta allazione di linfociti T C D4+ sotto gruppo TH 1/TH 17 che reagiscono ad antigeni self della mielina nel SNC. 3. Lartrite reumatoide probabilmente1 legata a linfociti T che riconoscono il collagene delle cartilagini. Le risposte immunitarie cellulomediate possono portare a danno tissutale al sito di infezione: il caso della tubercolosi, in cui le risposte dei linfociti T e dei macrofagi risultano in fibrosi e infiammazione

del parenchima polmonare con conseguente perdita di funzionalit. Malattie causate da linfociti T citotossici I linfociti citotossici possono danneggiare i tessuti uccidendo cellule infette il cui virus non avrebbe effetti citopatici. Alcuni virus danneggiano direttamente le cellule infette e vengono definiti citopatici , altri sono innocui allospite e vengono definiti non citopatici. I linfociti non possono riconoscere a priori la categoria cui appartiene un virus e quindi uccidono anche le cellule infettate da patogeni non citopatici. Alcune forme di epatite nelluomo sono dovute a questo tipo di meccanismo.

18.3 Patogenesi dellautoimmunit

Gli eventi chiave nello sviluppo di una risposta autoimmune sono: 1. Riconoscimento dellantigene self da parte dei linfociti autoreattivi 2. Attivazione, proliferazione e differenziazione in cellule effettrici 3. Danno tissutale da parte delle cellule effettrici e dei loro prodotti Lautoimmunit un evento comune: dal 2 al 5% della popolazione ne soffre. Le caratteristiche pi importanti di questo fenomeno sono: Lautoimmunit il risultato del malfunzionamento o del blocco dei meccanismi normalmente responsabili della tolleranza nei linfociti B, T o entrambi. Lattenzione si focalizza soprattutto sui linfociti T per due motivi: sono regolatori fondamentali di tutte le risposte immunitarie alle proteine, inoltre sono dipendenti dallMHC nella loro funzionalit, e questo complesso legato a parecchie patologie genetiche. I fattori principlai che contribuiscono allo sviluppo dellautoimmunit sono la suscettibilit genetica e gli eventi scatenanti ambientali, quali le infezioni. Le patologie autoimmuni possono essere sia sistemiche che organo specifiche. I meccanismi effettori delle patologie autoimmuni sono vari: immunocomplessi, autoanticorpi, linfociti T autoreattivi sono i principali. Le reazioni autoimmuni verso un antigene che danneggiano i tessuti possono risultare nellalter azione degli antigeni di quel tessuto e quindi nellattivazione di altri linfociti: il fenomeno della diffusione dellepitopo. Questo meccanismo spiega come mai le malattie autoimmuni siano spesso croniche e progressive. Suscettibilit genetica allautoimmunit Le malattie autoimmuni hanno forte componente genetica; il diabete mellito di tipo 1 ad esempio ha concordanza 50% nei gemelli monozigotici e 5/6% in quelli dizigotici. La maggior parte di queste patologie poligenica e affligge individui che ereditano pi polimorfismi genetici. Il primo gene associato alla patologia ad essere identificato nel diabete un gene MHC II, il che conferma come la malattia sia causata dai linfociti MHC II ristretti C D4+ . Tra i geni associati allautoimmunit le associazioni pi forti sono in quelli che mappano nellMHC, in particolare quelli di classe II. Lo studio dei geni HLA in pazienti affetti da varie patologie mostra che alcuni alleli sono in essi pi frequenti che nella popolazione normale. Lassociazione pi forte tra la spondilolite anchilosante e lallele B27 dellHLA di classe I. Malattia Artrite reumatoide Diabete mellito insulino dipendente Allele HLA DR4 DR3 DR4 DR3/DR4 DR2 DR2/DR3 DR4 B27 Rischio relativo 4 5 5-6 25 4 5 14 90-100

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Sclerosi multipla Lupus eritematoso sistemico Pemphigus vulgaris [???] Spondilolite anchilosante

Le caratteristiche principali dellassociazione patologia-HLA sono: Lassociazione di una patologia allHLA pu essere identificata mappando un locus, ma lassociazione reale potrebbe esserci con alleli linked a quello mappato e ereditati insieme. Ad esempio un soggetto con un particolare allele HLA-DR potrebbe avere una maggior probabilit di ereditare un particolare allele HLA-DQ: si tratta degli effetti del linkage disequilibrium . In molte patologie autoimmuni le molecole di HLA associate a malattia differiscono da quelle sane nelle sedi di legame al peptide: questo conferma il concetto che le molecole MHC influenzano lautoimmunit controllando la selezione e lattivazione dei linfociti T. Sequenze associate a patologia di HLA sono riscontrabili in individui sani: lespressione di un certo gene HLA non dunque mai causa da sola di malattia, ma solo uno dei tanti fattori. Non sono solo i geni MHC a determinare la suscettibilit genetica allautoimmunit, ne esistono infatti moltissimi altri esempi: Topi KO per CTLA-4, il recettore inibitorio dei linfociti T per B7, sviluppano autoimmunit fatali con distruzione di cuore, pancreas ed altri organi. CTLA-4 normalmente induce e mantiene lanergia dei linfociti T agli antigeni self, se questa funzione viene compromessa si ha la patologia. Mutazioni nel gene AIRE portano nelluomo alla sindrome autoimmune poliendocrina, caratterizzata da distruzione di parecchi organi endocrini. AIRE richiesta per la presentazione di proteine tessuto-specifiche sulle cellule epiteliali del timo, quindi per la selezione negativa dei linfociti T autoreattivi. Topi mancanti di IL-2 (o del recettore) sviluppano splenomegalia, linfadenopatia, anemia emolitica autoimmune e autoanticorpi anti DNA perch mancano di cellule T regolatrici: queste cellule necessitano di questa citochina per sopravvivere e funzionare. Carenze genetiche di parecchie proteine del autoimmuni simili al lupus. complemento sono associate a patologie

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Topi con mutazioni omozigoti ai geni per Fas o FasL hanno fornito la prova che la mancanza di apoptosi porta a malattie autoimmuni. Ruolo delle infezioni Nei pazienti lo scatenarsi delle malattie autoimmuni spesso associato o pre- ceduto da infezioni. Nella maggior parte dei casi i microorganismi infettanti non sono presenti nelle infezioni o in generale quando si scatena lautoimmunit: non sono dunque responsabili direttamente e la patologia solamente il risultato delle risposte immunitarie scatenate o disturbate dal patogeno. I principali meccanismi di promozione autoimmune delle infezioni sono: 1. Induzione di risposte innate locali che richiamano leucociti e attivano le APC: queste secernono citochine attivanti i linfociti T. Linfezione finisce dunque per scatenare lattivazione di linfociti T non specifici per il patogeno infettante.

2. I microbi infettanti possono contenere antigeni crossreattivi, cio simili agli antigeni self: il patogeno mima dunque antigeni dellhost. Esempio di questa strategia la febbre reumatica derivante dalle infezioni da streptococco: si formano anticorpi anti streptococco che reagiscono anche a proteine del miocardio. 3. I microbi possono attivare i TLR delle cellule dendritiche, portando a produzione di citochine, o i linfociti B autoreattivi, portando alla formazione di autoanticorpi. Altri fattori Alterazioni anatomiche, a causa di infezioni, ischemie o traumi, possono esporre antigeni self normalmente nascosti: esempi sono le proteine intraoculari o lo sperma. Gli ormoni possono inoltre avere un qualche ruolo: molte malattie autoimmuni mostrano unincidenza maggiore nelle donne, anche se non si sa esattamente il motivo.

Capitolo 19. Ipersensibilit immediata

Alcune malattie umane sono causate da risposte immunitarie ad antigeni ambientali che portano alla

differenziazione C D4+ TH 2 e alla produzione di anticorpi IgE specifici per questi antigeni che vanno a legarsi ai recettori Fc di mastociti e basofili; lattivazione di queste cellule causa un rapido rilascio di vari mediatori che causano collettivamente aumento della permeabilit vascolare, vasodilatazione , broncocostrizione e contrazione della muscolatura liscia viscerale: tutti questi effetti vanno sotto il nome di ipersensibilit immediata. In ambito clinico queste reazioni sono comunemente dette allergiche. Le allergie sono le pi comuni alterazioni del sistema immunitario e affliggono intorno al 20% della popolazione. Tutte le reazioni di ipersensibilit immediata condividono caratteristiche comuni: Il principale evento lattivazione delle cellule TH 2 con produzione di anticorpi IgE. La sequenza di eventi tipica di queste reazioni : Esposizione allantigene Attivazione dei TH 2 e dei linfociti B antigene specifici Produzione di IgE Legame delle IgE ai recettori Fc di mastociti e basofili (sensibilizzazione) Attivazione dei mastociti per successiva esposizione allo stesso antigene Rilascio dei mediatori e manifestazione patologica Esiste una forte predisposizione genetica per lo sviluppo di allergie. Gli antigeni che scatenano lipersensibilit, detti allergeni, sono proteine ambientali o molecole comuni. Le citochine prodotte dai TH 2 sono responsabili di molte caratteristiche dellipersensibilit immediata. Le manifestazioni cliniche e patologiche consistono in reazioni vascolari e muscolari che si sviluppano rapidamente (reazione immediata) e nellinfiammazione (reazione tardiva). Mediatori differenti sono responsabili delle diverse componenti di reazione immediata e tardiva. Le reazioni si manifestano in modi diversi, tra i quali le allergie della cute e delle mucose, le allergie alimentari, lasma e lanafilassi sistemica. Nella forma sistemica pi estrema, lanafilassi, i mediatori derivati dai mastociti possono restringere le vie aeree al punto di portare a morte per asfissia.

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19.1

Produzione di IgE

Le IgE sono le immunoglobuline pi efficaci nel legare i recettori Fc dei mastociti e nellattivarli. Negli individui allergici la produzione di IgE in risposta ad allergeni ambientali alta, mentre in quelli normali di solito vengono prodotte IgM ed IgG. Natura degli allergeni Gli antigeni che stimolano le risposte di ipersensibilit immediata sono proteine o molecole legate a proteine alle quali lindividuo allergico cronicamente esposto. Due sono le caratteristiche importanti degli allergeni: Esposizione cronica Non stimolano la risposta immunitaria innata, la quale promuoverebbe lattivazione macrofagica con secrezione di IL-12 che induce lo sviluppo di risposta TH 1. Lattivazione cronica o ripetuta dei linfociti T in assenza di immunit innata porta le cellule C D4+ verso la via TH 2 in quanto i linfociti stessi producono IL-4, la pi importante citochina nellinduzione di TH 2. Le reazioni di ipersensibilit immediata sono dipendenti dai linfociti T, pertanto gli antigeni T-indipendenti (ad esempio i polisaccaridi), non possono scatenarle a meno che non si associno a proteine sfruttando leffetto aptene-carrier. Lesposizione ripetuta ad un particolare antigene necessaria per lo sviluppo di una reazione allergica in quanto lo switch ad IgE e la sensibilizzazione dei mastociti deve verificarsi per poter avere questo tipo di risposta. Lesempio pi evidente quello della puntura dape; le proteine del veleno dellinsetto

non danno problemi al primo incontro in quanto lindividuo non ha ancora IgE specifiche: una risposta pu invece instaurarsi agli incontri successivi, e anche una sola puntura pu a questo punto portare ad anafilassi fatale. Attivazione dei TH2 Le cellule dendritiche epiteliali catturano gli allergeni trasportandoli ai linfonodi dove vengono presentati ai linfociti T naive che differenziano in cellule T effettrici del sottogruppo TH 2. Le cellule TH 2 differenziate promuovono lo switch ad IgE soprattutto tramite la secrezione di IL-4 ed IL13. Queste cellule sono coinvolte anche in altri aspetti della risposta immediata; lIL-5 secreta attiva gli eosinofili mentre IL-13 oltre allo switch stimola le cellule epiteliali (ad esempio delle vie aeree) a produrre pi muco. Oltre a stimolare la produzione di IgE, le cellule TH 2 contribuiscono allinfiammazione della reazione tardiva: vengono infatti accumulate ai siti di infezione in risposta alle chemochine in quanto esprimono i recettori CCR4 e CCR3. Attivazione dei linfociti B e switch I linfociti B specifici per gli allergeni vengono attivati dalle cellule TH 2 sotto linfluenza di CD40L e di altre citochine, soprattutto IL-4: si ha a questo punto anche lo switch allisotipo IgE (quindi catena pesante ). Le IgE allergene-specifiche prodotte dai linfociti B entrano in circolo e si legano ai recettori Fc dei mastociti tissutali che diventano cos sensibili e pronti a reagire ad un secondo incontro con lantigene.

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19.2 Legame delle IgE a mastociti e basofili

Mastociti e basofili esprimono un recettore Fc ad alta affinit specifico per le catene pesanti : il recettore Fc RI. Le IgE funzionano come recettori antigenici sulla superficie delle cellule dellipersen sibilit immediata: questa funzione mediata dal legame dellanticorpo al recettore FcRI. I mastociti tissutali in tutti gli individui sono normalmente ricoperti di IgE legate al recettore, ma negli individui allergici molte di queste Ig sono specifiche per uno o alcuni antigeni: lesposizione a questi antigeni dunque in grado di fare un cross-link sui recettori e attivare la cellula. Ogni recettore FcRI composto da una catena che media il legame con lIgE e da una catena e due catene che mediano la segnalazione. La catena beta contiene un singolo ITAM, mentre le due catene gamma, omologhe alla catena del TCR, ne contengono uno a testa. La fosforilazione di una tirosina sui domini ITAM delle tre catene del recettore inizia la segnalazione richiesta per lattivazione dei mastociti. Lespressione del recettore FcRI stimolata dalle IgE in un meccanismo che amplifica dunque questo tipo di reazioni.

19.3 Ruolo di mastociti, basofili ed eosinofili

Mastociti, basofili ed eosinofili sono le cellule effettrici dellipersensibilit immediata e delle patologie allergiche. Tutti e tre i tipi di cellula contengono granuli i cui contenuti sono i mediatori principali di queste reazioni e tutti sono in grado di produrre mediatori lipidici e citochine che inducono infiammazione. Propriet di mastociti e basofili Normalmente i mastociti maturi non si trovano in circolo in quanto i progenitori migrano nei tessuti periferici come cellule immature e differenziano in situ. Esistono due principali sottogruppi di mastociti che differiscono per collocazione anatomica, contenuto dei granuli ed attivit. Nei roditori un sottogruppo si trova nella mucosa del tratto GI; queste cellule hanno poca istamina nei granuli e molto coindrotin solfato. Lo sviluppo di questi mastociti mucosali dipende in vivo dalla citochina IL-3 prodotta dai linfociti T. La controparte umana di questi mastociti mucosali di solito si identifica per la presenza di triptasi nei granuli ma assenza di altre proteasi neutre. Un secondo sottogruppo di mastociti si trova nel polmone e nella sierosa delle cavit corporee e viene definito gruppo dei mastociti tissutali. Il maggior proteoglicano nei loro granuli leparina, e producono inoltre molta istamina. Questi mastociti tissutali mostrano pochissima dipendenza dai linfociti T. Nelluomo il sottogruppo si identifica per la presenza di parecchie proteasi neutre nei granuli: triptasi, chimasi, proteasi simil catepsina-G e carbossipeptidasi. La suddivisione in sottogruppi alla base di differenze funzionali. I mastociti mucosali sono presumibilmente coinvolti nelle reazioni di ipersensibilit immediata che coinvolgono le vie aeree e altre mucose, mentre quelli tissutali sono coinvolti nelle reazioni cutanee. I basofili maturi circolano nel sangue e costituiscono meno dell1% dei globuli bianchi totali. Normalmente non sono presenti nei tessuti ma possono essere richiamati nelle sedi di infiammazione.

I basofili sono capaci di sintetizzare molti dei mediatori prodotti dai mastociti e, come questi, esprimono il recettore FcRI per legare le IgE e quindi possono essere attivati nello stesso modo. Attivazione dei mastociti Lesposizione allantigene in un soggetto allergico in grado di realizzare un cross-link tra un numero sufficiente di IgE e attivare il mastocita; negli individui non allergici le IgE associate al mastocita sono specifiche per molti antigeni diversi e quindi un singolo antigene difficilmente riuscira ad attivare la cellula. Lattivazione del mastocita ha tre effetti biologici: 1. Secrezione dei contenuti dei granuli per esocitosi 2. Sintesi e secrezione di mediatori lipidici 3. Sintesi e secrezione di citochine La tirosin chinasi Lyn associata in modo costituitivo alla catena beta del FcRI. Quando il recettore subisce cross-link la chinasi si porta a fosforilare i domini ITAM delle catene beta e gamma: questo attira la tirosin chinasi Syk ai domini della catena gamma e la rende attiva. Syk attiva responsabile della fosforilazione e dellattivazione di molte delle proteine della cascata di segnalazione. Una proteina adattatrice esseziale attivata da Syk LAT (Linker for activation of T cells). Uno degli enzimi reclutati da LAT lisoforma gamma della fosfolipasi C (PLC ) che catalizza la rottura di P I P2 a dare I P3 e DAG. I P3 causa laumento del calcio citoplasmatico mentre DAG attiva la protein chinasi C. Una seconda proteina adattatrice fondamentale che viene fosforilata da Fyn la proteina Gab2: questa si porta ad attivare la fosfoinositide-3 chinasi che porta anchessa allattivazione di PKC. La fusione dei granuli dei mastociti alla membrana plasmatica mediata da membri della famiglia proteica SNARE. La formazione di complessi SNARE regolata da molte molecole accessorie tra le quali le guanosin-fosfatasi Rab3 e le chinasi e fosfatasi Rab-associate. Nei mastociti a riposo questi enzimi inibiscono la fusione dei granuli alla membrana plasmatica; lattivazione di PKC blocca le funzioni regolatorie e permette la fusione. La sintesi di mediatori lipidici controllata dallattivazione della fosfolipasi A2 da parte di due segnali: il calcio citoplasmatico e la fosforilazione da parte di ERK. ERK a sua volta attivata come conseguenza della cascata iniziata dai domini ITAM del recettore. Una volta attivata, la fosfolipasi idrolizza i fosfolipidi di membrana per rilasciare substrati che saranno convertiti a mediatori da vari enzimi. Il principale substrato lacido arachidonico, convertito a vari mediatori da cicloossigenasi e lipoossigenasi. La produzione di citochine nei mastociti il risultato della trascrizione dei geni corrispondenti. Il reclutamento e lattivazione di parecchie molecole adattatrici e chinasi in risposta ai segnali recettoriali porta alla traslocazione nucleare del fattore nucleare dei linfociti T attivati (NFAT) e del fattore nucleare B, oltre allattivazione della proteina AP-1. Questi fattori di trascrizione stimolano la trascrizione di diverse citochine: IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e TNF, ma non IL-2. Lattivazione dei mastociti regolata da parecchi recettori inibitori che contengono domini ITIM. Uno di questi recettori inibitori Fc RIIb che si aggrega a FcRI e viene anchesso fosforilato da L yn: questo porta al reclutamento della fosfatasi SHIP che inibisce la normale segnalazione. I mastociti possono essere attivati direttamente anche da altre sostanze biologiche in modo indipendente da FcRI. Alcuni mastociti e basofili rispondono ad esempio a chemochine derivanti da fagociti mononucleati, ad esempio MIP-1, e a chemochine T -derivate. Alcuni elementi del complemento, soprattutto C5a, stimolano inoltre la degranulazione dei mastociti tramite recettori appositi. Molti neuropeptidi, tra i quali la sostanza P e la somatostatina, inducono infine rilascio di istamina da parte dei mastociti. Lattivazione di queste cellule non un fenomeno tutto o nulla ma presenta diversi gradi che corrispondono a presentazioni cliniche variabili. 19.3.1 Mediatori derivati dai mastociti

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I mediatori si possono dividere in mediatori preformati (ammine biogene e macromolecole dei granuli) e mediatori neosintetizzati (mediatori lipidici e citochine). Ammine biogene Nei mastociti umani il principale mediatore di questa famiglia listamina. Lis tamina agisce legandosi a recettori sulle cellule bersaglio; differenti tipi cellulari esprimono recettori diversi (H1, H2, H3) riconoscibili per la loro risposta farmacologica. Le azioni legate allistamina sono

di breve durata perch questa viene rimossa da un sistema di trasporto ammina-specifico. Listamina inizia una serie di eventi intracellulari come la rottura di P I P2 a I P3 e DAG. Il legame di questa ammina alle cellule dellendotelio ne causa contrazione con conseguente aumento degli spazi endoteliali, aumento della permeabilit vascolare e fuoriuscita di plasma verso i tessuti. Listamina stimola inoltre le cellule endoteliali a sintetizzare miorilassanti e vasodilatatori quali la prostaciclina o lossido nitrico e quindi causa vasodilatazione . Listamina infine causa costrizione della muscolatura liscia intestinale e bronchiale. La broncocostrizione nellasma per pi prolungata degli effetti dellistamina, suggerendo che altri mediatori siano importanti in alcune forme di ipersensibilit immediata. Enzimi granulari e proteoglicani Le serine proteasi neutre, tra le quali triptasi e chimasi [?], sono i costituenti pi abbondanti dei granuli dei mastociti e contribuiscono ai danni tissutali. La triptasi in particolare si sa essere presente esclusivamente nei mastociti e il suo ritrovamento segno di attivazione di queste cellule. In vitro questo enzima spezza il fibrinogeno ed attiva la collagenasi. I proteoglicani, tra i quali eparina e condroitin solfato, sono altri importanti contenuti dei granuli. Queste molecole sono contenute in associazione agli altri enzimi: i vari mediatori sono rilasciati dai proteoglicani a diverse velocit e quindi queste molecole controllano la cinetica delle reazioni di ipersensibilit immediata. Mediatori lipidici Il pi importante mediatore derivato dallacido arachidonico lungo la via delle cicloossigenasi la prostaglandina D2 : questa molecola agisce come vasodilatatore e broncocostrittore ma promuove anche la chemotassi e laccumulo dei neutrofili ai siti infiammatori. La sintesi di questa prostaglandina pu essere evitata bloccando la cicloossigenasi con aspirina o altri FANS. I pi importanti mediatori derivati dallacido arachidonico lungo la via delle lipoossigenasi sono i leucotrieni, in particolare LT C4 e i suoi prodotti di degradazione LT D4 e LT E4 . Queste molecole legano recettori specifici sulle cellule muscolari lisce e causano una broncocostrizione prolungata. Un terzo tipo di mediatore lipidico prodotto nei mastociti il fattore attivante le piastrine (PAF) che ha effetti di broncocostrizione diretta: le sue azioni biologiche sono per limitate perch viene degradato per via enzimatica. Citochine Le citochine prodotte dai mastociti e dai basofili sono TNF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 MIP-1 e MIP-1. Queste molecole sono responsabili soprattutto della fase tardiva della reazione. Il NTF attiva lespressione endoteliale di molecole di adesione e, insieme alle chemochine, giustifica linfiltrazione di neutrofili e monociti. Gli eosinofili sono abbondanti negli infiltrati infiammatori della fase tardiva e contribuiscono a molti processi patologici. Le citochine prodotte dai linfociti TH 2 promuovono lattivazione di queste cellule e il loro reclutamento: in particolare IL-5 un forte attivatore e migliora la capacit degli eosinofili di rilasciare i loro granuli. Gli eosinofili legano le cellule endoteliali che esprimono la selectina-E e il ligando per lintegrina VLA-4. Il reclutamento ai siti infiammatori dipende inoltre dalla chemochina CCL11 prodotta dalle cellule epiteliali che si lega al recettore CCR3. I contenuti dei granuli degli eosinofili contengono idrolasi specifiche cos come proteine particolarmente tossiche agli elminti, tra le quali la proteina basica principale. Gli eosinofili attivati producono inoltre mediatori lipidici tra i quali PAF, prostaglandine e leucotrieni.

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19.4 Reazioni dellipersensibilit immediata

Reazione immediata Quando un individuo sensibile subisce uniniezione intradermica dellantigene per il quale ha prodotto IgE, il sito di ingresso diventa immediatamente rosso per via dei vasi sanguigni dilatati e si gonfia a causa delluscita di plasma dalle venule. Il gonfiore prende il nome di pomfo [che cazzo di parola ?] e pu interessare unarea di diversi centimetri di diametro. Successivamente i vasi ai margini del pomfo si dilatano e producono un caratteristico arrossamento. La reazione pomfoide completa appare in cinque o dieci minuti e tipicamente svanisce in meno di unora. Questa reazione dipendente da IgE e mastociti: i mastociti dellarea del pomfo hanno infatti rilasciato i loro mediatori preformati, quindi hanno svuotato i granuli. Un mediatore fondamentale listamina, che lega i recettori sulle cellule endoteliali venulari facendo loro sintetizzare prostaglandine, ossido nitrico e PAF che causano vasodilatazione e fuoriuscita di plasma.

Reazione tardiva La reazione immediata seguita dopo alcune ore da quella tardiva che consiste nellaccumulo di leucociti, cio neutrofili, eosinofili, basofili e cellule TH 2. Linfiammazione raggiunge il picco in 24 ore e poi declina. I mastociti produconi citochine, tra le quali il TNF, che possono stimolare lespressione di molecole endoteliali di adesione leucocitaria, tra le quali la selectina-E e ICAM-1. Questa fase della reazione pu avvenire anche senza evidenza di una reazione immediata, ad esempio nellasma.

19.5 Suscettibilit genetica

La sintesi abnorme di IgE spesso familiare con una chiara trasmissione autosomica dominante, anche se il pattern completo di ereditariet comunque multigenico. Uno dei loci interessati si trova sul cromosoma 5q, vicino al cluster genico che codifica per parecchie citochine. Polimorfismi nel gene che codifica IL-13 sono associati fortemente allasma. La tendenza a produrre IgE contro alcuni antigeni, ad esempio alcuni pollini, pu inoltre essere legata a particolari alleli di MHC di classe II. Alcuni geni i cui prodotti regolano la risposta immunitaria innata sono associati ad allergia ed asma: tra essi CD14, un componente per il recettore di LPS, e Tim-1, probabilmente coinvolto nellinfluenzare la differenziazione degli helper. Forti risposte immunitarie innate stimolano lo sviluppo di TH 1, quindi se vengono diminuite si favorisce TH 2 e lipersensibilit.

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19.6 Patologie allergiche nelluomo

Le pi comuni forme di patologie allergiche sono la rinite allergica (febbre da fieno), lasma bronchiale, leczema e le allergie alimentari. Le caratteristiche cliniche e patologiche dipendono dal sito anatomico di reazione: antigeni inalati causano rinite o asma, antigeni ingeriti causano vomito o diarrea, antigeni iniettati causano effetti sistemici. Anafilassi sistemica Lanafilassi caratterizzata da edema in molti tessuti e crollo della pressione sanguigna a causa della vasodilatazione. Gli allergeni attivano i mastociti in molti tessuti, e i mediatori guadagnano cos accesso al letto vascolare. Il calo del tono vascolare e la fuga di plasma risultano in cun crollo pressorio che porta a shock anafilattico spesso fatale. Gli effetti cardiovascolari sono accompagnati da costrizione delle vie aeree, edema laringeo, ipermotilit intestinale e orticaria. Il trattamento delezione lepinefrina sistemica, che contrasta gli effetto broncocostrittori e vasodilatatori. Asma bronchiale Lasma una patologia infiammatoria causata da ripetute ipersensibilit immediate e tardive nel polmone. Circa il 70% dei casi dovuto allipersensibilit immediata IgE mediata mentre il 30% ha altre cause a volte scatenate da stimoli non immunitari. Gli eventi patofisiologici dellasma sono legati alle citochine prodotte da mastociti ed eosinofili che costringono le vie aeree. La terapia ha al momento due bersagli: linfiammazione e il rilassamento della muscolatura liscia dei bronchi. Allergie alimentari Le manifestazioni cliniche comprendono iper peristalsi, ipersecrezione di fluido intestinale, vomito e diarrea, a volte orticaria e anafilassi sistemica. Le allergie sono associate a molti tipi di cibo, ma tra i pi comuni ci sono arachidi e molluschi. Allergie cutanee Le due manifestazioni evidenti sono orticaria ed eczema. Lorticaria, essenzialmente una reazione pomfoide acuta, pu persistere per ore. In immunologia clinica spesso si prova a limitare linstaurarsi di reazioni allergiche con trattamenti che riducono la quantit di IgE nel soggetto. Un approccio, la desensibilizzazione, prevede la ripetuta esposizione a limitate quantit di antigene per via sottocutanea: il risultato empirico laumento del titolo di IgG e la diminuzione del titolo di IgE. Questo tipo di approccio usato per la prevenzione di reazioni anafilattiche acute (ad esempio veleni) o per poter somministrare farmaci vitali (ad esempio pennicillina).

Capitolo 20. Immunodeficienze congenite ed acquisite

Le immunodeficienze si dividono in due grandi categorie. Le immunodeficienze congenite o primitive sono il risultato di difetti genetici e conferiscono unaumentata sensibilit alle infezioni; queste patologie si manifestano precocemente ma occasionalmente danno manifestazione clinica in et pi avanzata. Le immunodeficienze secondarie o acquisite si sviluppano a seguito di malnutrizione, cancro, uso di farmaci immunosoppressivi o infezioni delle cellule del sistema immunitario (da HIV in primis). Le caratteristiche generali delle immunodeficienze sono: Aumento della sensibilit alle infezioni. Difetti nellimmunit umorale espongono a rischio di infezioni batteriche, mentre difetti in quella cellulo mediata espongono a rischio di infezioni virali o da parte di batteri intracellulari. Aumento del rischio di cancro. Molte delle neoplasie che insorgono in queste condizioni sono dovute a virus oncogeni, ad esempio il virus di Epstein-Barr. Le immunodeficienze possono insorgere sia per difetti nella maturazione/attivazione dei linfociti che per difetti nei meccanismi effettori di immunit innata o adattativa.

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20.1

Immunodeficienze congenite

In diverse immunodeficienze lanormalit principale pu trovarsi indiversi componenti del sistema immunitario innato, o a diversi stadi della maturazione dei linfociti, o nelle risposte dei linfociti maturi alla stimolazione antigenica. Le anormalit ereditarie dellimmunit innata affligono di solito i fagociti o il complemento. Le anomalie dello sviluppo linfocitario possono derivare da mutazioni nei geni codificanti alcuni degli enzimi fondamentali. Le anormalit nello sviluppo e nella funzione dei linfociti B sfociano in carente produzione di anticorpi e suscettibilit ai batteri extracellulari. Queste patologie sono identificate tramite (non tutti i criteri valgono per ogni patologia): bassi titoli di Ig nel siero assenza di risposta alla vaccinazione ridotto numero di linfociti B in circolo o nei tessuti linfoidi, assenza di plasmacellule Le anormalit nella maturazione e nella funzione dei linfociti T portano a immunit cellulo-mediata carente e aumento del rischio di infezioni intracellulari. Queste patologie sono identificate tramite: Ridotto numero di linfociti T nel sangue periferico Poca risposta proliferativa ad attivatori policlonali Mancanza di risposte di ipersensibilit di tipo ritardato (IV) a antigeni microbici 20.1.1 Difetti dellimmunit innata

I disordini congeniti dei fagociti e del sistema del complemento sfociano in infezioni ricorrenti, in par ticolare da batteri Neisseriae, e spesso contribuiscono al rischio di patologie autoimmuni, soprattutto lupus eritematoso sistemico. Malattia granulomatosa cronica La malattia granulomatosa cronica una malattia rara [1 : 106 ] della quale i due terzi dei casi presenta uno schema di ereditariet di tipo X-linked recessivo. La patologia causata da mutazioni nei componenti del complesso enzimatico dellossidasi fagocitica. La forma pi comune causata da una mutazione codificante la subunit alfa del citocromo b558 : questa mutazione porta a difetti nella produzione di superossidi, cio i ROS responsabili dellattivit microbicida del fagocita. La mancanza di superossidi rende i fagociti incapaci di uccidere i microbi fagocitati: si hanno infezioni ricorrenti di funghi e batteri a partire dalla prima infanzia. Le infezioni non vengono controllate dai fagociti e quindi stimolano risposte immunitarie cellulomediate croniche

che portano a formazione di granulomi di macrofagi attivati. La patologia spesso fatale anche se vengono adottate forti terapie antibiotiche. Linterferone gamma stimola la trascrizione del gene phox91 e di altri componenti del complesso dellossidasi: se la produzione viene ripristinata ad un valore di circa il 10% del normale si ha gi un grande miglioramento nella resistenza alle infezioni; linterferone gamma la terapia di elezione per questo tipo di patologia. Deficienze nelladesione leucocitaria La sindrome da deficit di adesione leucocitaria di tipo 1 una patologia autosomica recessiva caratterizzata da frequenti infezioni batteriche e fungine e carenza nella guarigione delle ferite. In questi pazienti le funzioni leucocitarie dipendenti dalladesione sono anormali. La base molecolare lassenza o la carente espressione delle integrine 2 , tra le quali LFA-1 e Mac-1; queste proteine partecipano alladesione dei leucociti alle altre cellule, soprattutto cellule endoteliali ed APC. La sindrome da deficit di adesione leucocitaria di tipo 2 clinicamente simile alla precedente ma non si ha difetto nelle integrine. LAD-2 risulta invece dallassenza di SLEX, un ligando necessario per il legame con le selectine E e P dellendotelio. Sindrome di Chdiak-Higashi La sindrome di CH una patologia autosomica recessiva caratterizzata da ricorrenti infezioni di batteri piogeni, parziale albinismo oculocutaneo e infiltrazioni in vari organi di linfociti non neoplastici. Neurtrofili, monociti e linfociti dei pazienti affetti contengono lisosomi giganti. La malattia causata da mutazioni nel gene che codifica la proteina LYST che gestisce il traffico lisosomiale: la fusione fagosoma lisosoma diventa difettosa (da cui le ricorrenti infezioni), non si forma il melanosoma nei melanociti (da cui lalbinismo) e si formano anormalit lisosomiali nelle cellule nervose. I lisosomi giganti si formano durante la maturazione dai precursori mieloidi: queste cellule possono presentare carenze negli enzimi lisosomiali microbicidi ma anche difetti nella chemotassi e nella fagocitosi. Le cellule NK mostrano ridotta funzionalit, probabilmente a causa delle anormalit nei granuli citoplasmatici che contengono gli enzimi per la loro citotossicit. Difetti ereditari nei pathway del TLR e della segnalazione di NF-B Alcune immunodeficienze sono causate da difetti nelle vie di segnalazione a valle dei TLR. Mutazioni nellinibitore della B chinasi , detto anche NEMO, contribuiscono alla condizione X-linked recessiva detta displasia ectodermica anidrotica con immunodeficienza (zumpap zumpap). NEMO fondamentale per lattivazione di NF-B, se viene compromesso la differenziazione delle strutture di derivazione ectodermica anormale e le funzioni immunitarie ne escono danneggiate. Questi pazienti soffrono di infezioni da parte di batteri piogeni capsulati, cos come di patogeni intracellulari. 20.1.2 Immunodeficienze gravi combinate I disordini che colpiscono sia limmunit cellulomediata che quella umorale sono detti immunodeficienze gravi combinate o SCID (Severe Combined ImmunoDeficiencies). Queste patologie sono caratterizzate da carenze di linfociti T e B o solo dei linfociti T: nel secondo caso il danno allimmunit umorale si ha per via dei linfociti T helper malfunzionanti. I bambini malati di SCID normalmente hanno infezioni entro il primo anno di vita e muoiono se non trattati. Difetti nei recettori per le citochine: X-linked Circa il 50% dei casi di SCID X-linked e dovuto a mutazioni nel gene codificante la catena comune condivisa dai recettori per le interleuchine IL-2, IL4, IL-7, IL-9 e IL-15. Queste condizioni sono caratterizzate da problemi alla maturazione dei linfociti T e delle NK senza cali nel numero dei linfociti B: il problema allimmunit umorale dunque legato solamente agli helper. La patologia dovuta allincapacit della citochina IL-7 di stimolare la crescita dei timociti immaturi, e allincapacit della citochina IL-15 di far proliferare le cellule NK. Difetti nei recettori per le citochine: autosomiche Alcuni pazienti con un quadro patologico uguale alle SCID X-linked mostrano ereditariet autosomica recessiva. Le mutazioni si hanno a carico della catena del recettore per IL-7. Difetti nel riciclo delle purine Circa il 50% dei casi di SCID mostra eredit autosomica recessiva, e molti di questi casi sono legati a difetti nellenzima adenosina deaminasi (ADA), che ha ruolo nel riciclo delle purine. Lenzima catalizza la deaminazione delladenosina a 2-deossiadenosina e dellinosina a 2-deossiadenosina. Il difetto porta allaccumulo di deossiadenosina e dei suoi precursori che hanno

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molti effetti tossici, tra i quali linibizione della sintesi di DNA. I linfociti in fase di sviluppo sono meno efficienti delle altre cellule nel degradare dATP a 2-deossiadenosina e quindi sono particolarmente sensibili alla carenza di ADA. Una forma pi rara di SCID dovuta alla carenza di un altro enzima, la purina nucleoside fosforilasi (PNP), anchesso coinvolto nel catabolismo delle purine. PNP catalizza la conversione dellinosina in ipoxantina e della guanosina a guanina: il difetto porta ad accumulo di deossiguanosina e deossiguanina con effetti tossici sui linfociti immaturi, soprattutto i T. Difetti nella ricombinazione V(D)J Mutazioni nei geni RAG1, RAG2 o ARTEMIS rappresentano la causa di un gran numero di forme autosomiche recessive di SCID. Mutazioni ipomorfiche in questi geni portano a condizioni di ristretta generazione di linfociti B e T, immunodeficienze e autoimmunit, come nella sindrome di Omenn. Difetti nel checkpoint pre-TCR Rare forme di SCID sono state collegate a mutazioni nei geni codificanti CD45 e le catene o di CD3. Unaltra forma rara causata dalla mutazione del gene Orai1 , componente dei canali CRAC. Lattivazione dei recettori per lantigene, cos come dei recettori preantigenici porta allattivazione dellisoforma della fosfolipasi C (PLC )e al rilascio I P3 dipendente di calcio dal RE e dai mitocondri. Il rilascio di calcio compensato dai canali CRAC che facilitano il flusso di calcio dal pool extracellulare e questo processo cruciale per lattivazione linfocitaria. Difetti nello sviluppo del timo: sindrome di DiGeorge Il difetto congenito si mostra come ipoplasia o agenesi del timo e porta a difetti nella maturazione dei linfociti T, ad assenza delle ghiandole paratiroidi (quindi anormale omeostasi del calcio e tetania) e sviluppo anomalo di volto e grandi vasi. La patologia causata da una delezione nel cromosoma 22q11.2. Limmunodeficienza pu essere spiegata a causa della delezione del gene TBX1 che mappa in quella regione. In questa sindrome i linfociti T nel sangue periferico sono assenti o molto ridotti e le cellule non rispondono agli attivatori policlonali. Limmunodeficienza pu essere corretta con trapianto di timo fetale o di midollo osseo ma normalmente non necessaria perch la funzionalit immunitaria tende a migliorare con gli anni. Le ragioni del miglioramento spontaneo possono essere la presenza di tessuto timico ectopico o lesistenza di una sede extratimica di maturazione linfocitaria ancora non scoperta. 20.1.3 Deficienze an ticorpali: difetti nello sviluppo e nellattivazione dei linfociti B

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Agammaglobulinemia X-linked La patologia caratterizzata dallassenza di gammaglobuline nel sangue ed tra le immunodeficienze congenite pi comuni. Il difetto il fallimento dei linfociti B di maturare oltre lo stadio di cellula pre-B a causa di mutazioni nel gene codificante la tirosin chinasi di Bruton (Btk). Btk coinvolta nella trasduzione del segnale dal pre-BCR, segnale richiesto per la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule pre-B. I pazienti affetti normalmente hanno Ig sieriche basse o assenti, pochi linfociti B nel sangue periferico e nei tessuti linfoidi, mancano di centri germinativi nei linfonodi e di plasmacellule nei tessuti. Le complicazioni infettive dellagammaglobulinemia x-linked sono molto ridotte dalle iniezioni periodiche di preparati di gamma globuline: questi preparati contengono anticorpi preformati contro patogeni comuni e quindi forniscono unefficace immunit passiva. Agammaglobulinemie autosomiche Forme autosomiche recessive di agammaglobulinemia sono state descritte. I geni mutanti comprendono il gene della catena pesante delle IgM, il gene Ig che codifica un componente segnalatorio sia del pre-BCR che del BCR, e il gene BLNK che codifica una proteina adattatrice importante. Deficienze selettive di isotipi di Ig La pi comune la deficienza selettiva di IgA [1 : 700] che inoltre la pi comune immunodeficienza primaria conosciuta. Le caratteristiche cliniche sono variabili. Molti pazienti sono normali, altri hanno infezioni occasionali e diarrea, altri hanno gravi infezioni con danno permanente ad intestino e vie aeree. Il difetto in questi pazienti il blocco nella differenziazione delle cellule B a plasmacellule secernenti IgA. I geni delle catene pesanti alfa e lespressione delle IgA di membrana sono normali. In una piccola porzione di pazienti le mutazioni sono state individuate in TACI, uno dei tre tipi di recettore per le citochine BAFF ed APRIL. Le deficienze selettive delle sottoclassi di IgG sono patologie in cui il titolo delle IgG normale ma le concentrazioni di una o pi sottoclassi sono sotto la norma. La deficienza delle IgG3 la pi

comune negli adulti, delle IgG2 nei bambini. Alcuni individui presentano infezioni batteriche ricorrenti ma la maggior parte non ha problemi clinici. Difetti nella differenziazione: immunodeficienze variabili comuni Le immunodeficienze variabili comuni sono un gruppo eterogeneo di disordini definito dalla riduzione dei livelli di Ig nel siero: la diagnosi viene fatta per esclusione. Linfociti T maturi sono presenti in questi pazienti ma le plasmacellule mancano e questo suggerisce un blocco nella differenziazione. Una piccola porzione di pazienti affetti condivide una delezione del gene ICOS, mentre una causa pi comune la presenza di mutazioni in TACI.

Sindromi iper-IgM La sindrome iper-IgM X-Linked un raro disordine associato con il difetto dello switch verso gli isotipi IgA ed IgG; questi isotipi sono dunque carenti nel sangue e si ha compensazione da parte delle IgM. Il difetto causato da mutazioni nel gene che codifica CD40L: le forme mutate non stimolano i linfociti B a subire lo switch. I pazienti affetti mostrano anche difetti nellimmunit cellulo mediata e unenorme sensibilit alle infezioni da parte del fungo Pneumocystis jiroveci. Rari casi di sindrome iper -IgM mostrano ereditariet autosomica dominante. In questi casi il difetto pu essere in CD40 o in AID, lenzima coinvolto nello switching della catena pesante. 20.1.4 Difetti nellattivazione e nella funzione dei linfociti T Difetti nellesp ressione di MHC II: sindrome del linfocita nudo La sindrome del linfocita nudo un gruppo di patologie autosomiche recessive in cui i pazienti esprimono bassi livelli (o non esprimono affatto) HLA-DP, HLA-DQ o HLA-DR su linfociti B, macrofagi e cellule dendritiche. Lespressione delle molecole di MHC I normale. Nella maggior parte dei casi le sindromi sono dovute a mutazioni nei geni che codificano proteine regolanti la trascrizione dellMHC II. Ad esempio mutazioni nel fattore RFX5 o in CIITA portano a ridotta espressione di MHC II e quindi allimpossibilit di attivare i linfociti C D4+ . La mancata presentazione dellantigene pu portare a problemi nella selezione positiva nel timo o a difetti nellattivazione delle cellule in periferia. La patologia appare entro il primo anno di vita ed tipicamente fatale se non trattata con trapianto di midollo osseo. Difetti nellespressione di MHC I Sono state descritte anche deficienze autosomiche recessive di MHC I associate a riduzione di funzionalit e numero di linfociti T C D8+ . In alcuni casi la patologia dovuta a mtuazioni nei geni codificanti le subunit TAP-1 e TAP2 del complesso TAP responsabile del traffico di peptidi dal citosol al RE. I pazienti privi di TAP mostrano poche molecole MHC I e soffrono soprattutto di infezioni del tratto respiratorio ma non di infezioni virali, dato discordante considerato che la principale funzione dei linfociti citotossici la difesa dai virus. Difetti nella trasduzione del TCR Esempi comprendono la limitata espressione o funzionalit del complesso TCR a causa di mutazioni nei geni CD3 e , oppure la segnalazione difettosa a causa di mutazioni nel gene ZAP-70 o ancora la mancata espressione dei recettori IL-2. I pazienti affetti possono avere deficienze soprattutto nella funzione delle cellule T o avere immunodeficienze miste T e B. Sindrome di Wiskott-Aldrich La sindrome di Wiskott-Aldrich una patologia X-linked caratterizzata da eczema, trombocitopenia e aumentata suscettibilit alle infezioni batteriche. Alcune delle anormalit possono essere ricondotte a difetti nellattivazione dei linfociti T. Nelle fasi iniziali della malattia il numero di linfociti normale e il principale difetto lincapacit di produrre anticorpi verso antigeni T indipendenti. Lavanzare dellet porta a una riduzione del numero di linfociti e ad unimmunodeficienza pi grave. Il gene difettoso codifica la proteina WASP che interagisce con parecchie altre proteine, incluse quelle adattatrici a valle del recettore antigenico. Sindrome linfoproliferativa X-linked La sindrome linfoproliferativa X-linked un disordine legato allincapacit di eliminare il virus di Epstein-Barr e porta a mononucleosi fulminante e a sviluppo di tumori ai linfociti B e ipogammaglobulinemia associata. Nell80% dei casi il problema dovuto ad una mutazione nel gene che codifica la proteina SAP, che lega una famiglia di proteine

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superficiali coinvolta nellattivazione di NK e linfociti B e T (tra le quali la molecola SLAM). SAP collega le proteine SLAM e 2B4 alla kinasi FynT: se manca si ha attenuazione del processo di attivazione. Nel restante 20% dei casi il difetto risiede invece nel gene che codifica XIAP: il risultato un aumento del processo apoptotico dei linfociti T e delle cellule NK-T che porta a una evidente riduzione del numero di queste cellule nel paziente. Sindromi della linfoistiocitosi emofagocitica La famiglia delle sindromi di linfoistiocitosi emofagocit- ica sono caratterizzate da attivazione incontrollata di linfociti citotossici e macrofagi in cui la secrezione granulare da parte dei C D8+ e delle NK difettosa. Una caratteristica tardiva ma sorprendente lingestione dei globuli rossi da parte dei macrofagi attivati (emofagocitosi). Mutazioni nei geni RAB27A e MUNC13-14 sono alla base della compromissione della fusione dei granuli con la membrana plasmatica e contribuiscono a varie forme di queste patologie. 20.1.5 Disordini multisistemici con immunodeficienza: atassia telangectasia Latassia telangectasia una patologia autosomica recessiva caratterizzata da anomalie nella deam- bulazione (atassia), malformazioni vascolari (telangectasie), deficin neurologici, aumentata incidenza tumorale e immunodeficienza. I pi comuni difetti umorali sono carenze di IgA ed IgG2. I difetti nei linfociti T sono associati ad ipoplasia del timo. I pazienti subiscono infezioni batteriche alle vie aeree superiori ed inferiori, fenomeni autoimmuni multipli e neoplasie sempre pi frequenti con lavanzare dellet. Il gene responsabile della malattia si trova sul cromosoma 11 e codifica la proteina ATM che in grado di attivare i checkpoint del ciclo cellulare e lapoptosi in risposta a rotture del doppio filamento del DNA.

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Appendice. Schema delle citochine

A.1 Risposta innata

TNF - Tumor Necrosis Factor Fonti principali: fagociti attivati, NK e mastociti. Struttura e recettore: inizialmente proteina di membrana, poi tagliata per via proteolitica in un peptide che forma omotrimeri riconosciuti dai recettori TNF-RI e TNF-RII. Meccanismo dazione: reclutamento di fattori TRAF che attivano i fattori di trascrizione NF-B e AP-1; occasionalmente attivazione delle caspasi e apoptosi. Attivit biologiche: Stimolazione delle cellule endoteliali a esprimere molecole di adesione Stimolazione delle cellule endoteliali e dei macrofagi a secernere chemochine per la migrazione leucocitaria

 Stimolazione delle attivit microbicide di macrofagi e neutrofili Attivit collaterali: Induzione della febbre per via ipotalamica grazie ad aumento della sintesi delle prostaglandine Aumento della produzione epatica di proteine della fase acuta Distruzione di cellule muscolari e adipose Inibizione della contrattilit miocardica e del tono vascolare Trombosi intravascolare per perdit delle propriet anticoagulanti dellendotelio Profondi disturbi metabolici con crollo della glicemia a livelli letali Shock settico Interleuchina 1 Fonti principali: fagociti attivati, NK e mastociti. Struttura e recettore: due forme, IL-1 e IL-1 , con funzioni identiche ed entrambe secrete come precursori. Il precursore della forma alfa attivo, quello della forma beta lo diventa dopo proteolisi. Meccanismo dazione: reclutamento di MyD88 ai domini TIR del recettore che porta al reclutamento di IRAK1,4 e di TRAF-6 che in vari passaggi attivano NF-B. Attivit biologiche: Stimolazione delle cellule endoteliali a esprimere molecole di adesione Attivit collaterali: Induzione della febbre Aumento della produzione epatica di proteine della fase acuta Produzione di neutrofili e piastrine nel midollo direttamente o attraverso lo stimolo alla produzione di IL-6 Chemochine Fonti principali: leucociti, cellule endoteliali, epiteliali e fibroblasti. Stimolo da TNF e IL-1. Struttura e recettore: le due famiglie pi importanti sono le chemochine CC (residui di cisteina consecutivi) e le chemochine CXC (residui di cisteina con un residuo interposto). I recet- tori sono di tipo accoppiato a preoteina G: esistono dieci diversi recettori per le CC (CCR1-10) e sei per le CXC (CXCR1-6). Meccanismo dazione: attivazione di vari enzimi cellulari che mediano le configurazioni del citoscheletro e laffinit delle integrine. Attivit biologiche: Reclutamento delle cellule immunitarie ai siti di infezione Regolazione del traffico linfocitario e leucocitario attraverso gli organi linfoidi periferici Promozione di angiogenesi e della guarigione delle ferite (soprattutto CXC) Sviluppo di vari organi non linfatici

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Interleuchina 12 Fonti principali: cellule dendritiche attivate e macrofagi Struttura e recettore: recettori di tipo I. Eterodimero delle subunit p35 e p40, recettore della famiglia dei

Meccanismo dazione: Il recettore segnala attraverso la via Jak-STAT, cio le chinasi Jak si portano ad attivare i fattori di trascrizione STAT. Attivit biologiche: Stimolazione della produzione di IFN- da parte delle cellule NK e dei linfociti T Promozione della differenziazione dei C D4+ helper al sottogruppo TH 1 che produce lIFN-

 Miglioramento delle funzioni citotossiche delle NK attive e dei linfociti C D8+ Nota: IL-12 prodotta da cellule dellimmunit innata ma attiva anche cellule dellimmunit adattativa, quindi svolge ruolo di ponte tra i due sistemi. Interferoni di tipo I Fonti principali: cellule dendritiche e fagociti. Stimolo da acidi nucleici virali. Struttura e recettore: gli IFN-I includono IFN-, IFN- , IFN-, IFN- e IFN- , tutti codificati da geni sul cromosoma 9. Tutti gli IFN-I si legano ad un recettore della famiglia dei recettori di tipo II composto da due subunit: IFNAR1 e IFNAR2. Meccanismo dazione: gli IFN-I stimolano la via Jak-STAT per indurre la trascrizione di vari geni. Lo stesso recettore stimola anche la via delle MAP kinasi e delle PI-3 kinasi. Attivit biologiche: Inibizione della replicazione virale (effetto paracrino, con induzione dello stato antivirale nelle cellule vicine) Aumento dellesp ressione di molecole MHC I Stimolo allo sviluppo di cellule TH 1 Sequestro dei linfociti nei linfonodi Inibizione generica della proliferazione di molti tipi di cellula Interleuchina 10 Fonti principali: macrofagi attivati e linfociti T regolatori Struttura e recettore: citochina dimerica che lega recettori di tipo II associati alle kinasi Jak1 e Jak2. Meccanismo dazione: Attivazione della via Jak-STAT. Attivit biologiche: Inibizione della produzione di IL-12 da parte di macrofagi attivati e cellule dendritiche Inibizione dellespressione di costimolatori e di molecole MHC II su macrofagi e cellule dendritiche Nota: citochina inibitoria, in coppia con il TGF. Altre citochine dellimmunit innata IL-6, prodotta da fagociti, cellule endoteliali e fibroblasti, stimola la sintesi delle proteine di fase acuta e la produzione di neutrofili. Ha ruolo anche nellimmunit adattativa poich stimola la crescita dei linfociti B. IL-15, prodotta soprattutto dai fagociti, un importante fattore di crescita e sopravvivenza per linfociti T e cellule NK. IL-18, strutturalmente legata a IL-1, stimola la produzione di IFN- da parte dei linfociti promuovendone il differenziamento a TH 1. IL-23 e IL-27 fanno da ponte tra le due immunit.

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A.2 Risposta adattativa

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Interleuchina 2 Fonti principali: linfociti C D4+ Struttura e recettore: recettore indotto da attivazione in naive ed effettori, sempre presente in linfociti T regolatori. Meccanismo dazione: via Jak-STAT Attivit biologiche: Sopravvivenza e funzionalit delle cellule T regolatrici Stimolo alla sopravvivenza, proliferazione e differenziazione dei linfociti T attivati dallantigene Promozione alla proliferazione e differenziazione delle cellule NK Interleuchina 4 Fonti principali: linfociti T C D4+ attivati e mastociti Meccanismo dazione: via Jak-STAT Attivit biologiche: Stimolo allo switching verso lisotipo IgE Stimolo allo sviluppo di cellule TH 2 a partire da C D4+ naive Fattore di crescita per cellule TH 2 differenziate Inibizione dello sviluppo di cellule TH 1 e TH 17

Interleuchina 5 Fonti principali: cellule TH 2 e mastociti Meccanismo dazione: via Jak-STAT Attivit biologiche: Attivazione degli eosinofili Stimolo alla crescita e alla differenziazione degli eosinofili Interleuchina 13 Fonti principali: soprattutto C D4+ TH 2 ma anche C D8+ e NK-T durante le allergie Meccanismo dazione: via Jak-STAT Attivit biologiche: Promozione della fibrosi nella riparazione tissutale degli stati infiammatori cronici Stimolo alla produzione di muco nel polmone

 Stimolo allo switching a IgE Promozione dellinfiammazione per espressione di molecole di adesione endoteliale e citochine Interferone Fonti principali: cellule NK, linfociti TH 1 e C D8+ . Stimolo di IL-12 o diretto dai microbi. Meccanismo dazione: via Jak-STAT Attivit biologiche: TGF- Fonti principali: linfociti T antigene-stimolati, fagociti LPS-attivati. Attivit biologiche: Inibizione della proliferazione e delle funzioni effettrici dei linfociti T e dellattivazione dei macrofagi. Regolazione della differenziazione verso alcuni sottogruppi di linfociti T e blocco dello sviluppo sia di TH 1 che di TH 2. Stimolazione della produzione di anticorpi IgA tramite switching. Regolazione della riparazione tissutale Altre citochine Linfotossina: praticamente fa le funzioni del TNF. IL-17: promuove il danno tissutale nelle patologie da ipersensibilit. I ruoli fisiologici sono stimolo ai macrofagi a produrre IL-1 e TNF e altre chemochine. IL-21 gli effetti sono di solito sinergistici con altre citochine e non hanno grande ruolo da soli. Attivazione dei macrofagi per luccisione dei microbi fagocitati (insieme a CD40L) Promozione della differenziazione a TH 1 Inibizione della differenziazione a TH 2 Promozione dello switch a certi isotipi IgG Inibizione dello switch a IgE Stimolo dellespressione di molecole MHC I e MHC II

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A.3

Citochine ematopoietiche

Stem Cell Factor Prodotto dalle cellule stromali del midollo, probabilmente serve a rendere le cellule staminali attive nel ricevere altri stimoli: non promuove la formazione di colonie da solo. Interleuchina 7 Secreta dalle cellule stromali di molti tessuti, stimola la sopravvivenza e lespansione dei precursori immaturi delle linee B e T. La mutazione dei geni correlati porta alla patologia dellimmunodeficienza grave combinata X-Linked (SCID X-linked) Interleuchina 3 Secreta dai linfociti C D4+ agisce sui progenitori midollari promuovendone lespansione e la differenziazione in tutti i tipi di cellula.