EXTRACCIN DE DNA MITOCONDRIAL

EQUIPO 1: Cuenca Prez Emir Moiss Estrada Aguilar Flor Ivonn Flores Pimentel Felipe Antonio Marcelino Ayala Manuel Snchez Arrieta Yesssenia

Las mitocondrias son orgnulos que se encuentran en las clulas eucariotas Contienen las enzimas para la mayora de las reacciones oxidativas que generan energa para las funciones celulares.

 Poseen varias caractersticas importantes que las hace un poco diferentes del resto de los orgnulos de las clulas eucariotas. Por ejemplo, son orgnulos de doble membrana, poseen una envoltura exterior y una envoltura interior. la caracterstica ms sorprendente y diferencial es que poseen su propio ADN (ADNmt).

ADN
Se trata de una molcula circular de ADN, helicoidal, con doble hebra, y supercondensada. En los seres humanos tiene un tamao aproximado de 16569 pares de bases mientras que en levaduras contiene cerca de 80000 pares de bases y en plantas vara entre 100 y 2000 kb.

ADN Mitocondrial

 El ADN MITOCONDRIAL se hereda en todas las personas ,es procedente de la madre. Nos permite ver las relaciones hermanohermano de madre.

 TIPOS DE MUESTRA (Sangre, pelos, saliva, semen, etc...). ESTADO DE LA MUESTRA (Buen estado degradada). CANTIDAD DE MUESTRA (Indicios mnimos, o cantidad suficiente).

Pretratamineto
Limpieza superficial de los RO o dientes, para la eliminacin de los posibles contaminantes (material exgeno y/o bacterias). Se realizan lavados con agua destilada o eliminacin de la capa superficial mediante abrasin mecnica o lijado. Irradiacin de las piezas a analizar con luz ultravioleta. Pulverizacin.

 Descalcificacin del polvo de hueso mediante lavados con EDTA, que es un quelante inico que acta secuestrando las sales inicas contenidas en la muestra, incluyendo el calcio de los huesos.

EXTRACCIN

PROTOCOLO: Extraccin de ADN por fenol:cloroformo

Las muestras son digeridas con proteinasa K y un detergente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas celulares.

El digerido es mezclado con una solucin de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:25:1), paso que es repetido hasta eliminar la coloracin.

 Para eliminar las trazas de fenol, se puede anadir una solucin de cloroformo:alcohol isoamlico .
La fase acuosa, que contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio.

 A partir de este punto, se incluye una fase de precipitacin con acetato amnico y etanol absoluto fro, introduciendo la concentracin en pequeos volmenes ,usando sistemas de filtracin por centrifugacin.

Dicha concentracin se realiza mediante dispositivos de ultrafiltracin 80,81, que permiten la retencin selectiva del ADN extrado.

Protocolo Desmineralizacin-silica
Presenta 2 claves fundamentales: la digestin completa, aumentando la proporcin de tampn de digestin y polvo de hueso; y la eliminacin de inhibidores, mediante la purificacin con resina. Digestin inicial de toda la matriz sea, lo que supone una desmineralizacin total.

 El tampn de desmineralizacin consiste en EDTA (0,5 M), laurilsacnosinato sdico (1%) y proteinasa K. Una vez digerido, el sobrenadante es ltrado en dispositivos de ultraltracin92, y el volumen recuperado Pasa a ser procesado siguiendo las especicaciones de la casa comercial del kit QIAquick.

Silica-sal
Se aade polvo de hueso/diente de una solucin de extraccin, consistente en EDTA y proteinasa K. Dejar incubar toda la noche Al sobrenadante obtenido se le aade una solucin de unin de base de tiocianato de guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sdico (NaCl/Ac), y la suspensin de silica Incubar en obscuridad

 Una vez descartado o almacenado el sobrenadante al precipitado de silica someter a lavados con solucin de lavado de base etanlica (EtOH 50%, NaCl yEDTA) Finalmente se aade la cantidad requerida de tampn TE para eluir el ADN retenido en la silica.

 NOTA: Para muestras que no contienen inhibidores de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes, como el cloruro sdico. Estas sales no caotrpicas son mucho ms baratas y actan igual de bien o incluso mejor en trminos de recuperacin de ADN. Pero, tienden a copurificar inhibidores de la PCR y, por tanto, no deben ser usadas con muestras que probablemente contengan inhibidores.

Bibliografa
Barrio-Caballero PA. Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense. Rev Esp Med Legal. 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.00 2