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DIAGNOSTICO DE

LABORATORIO DE LAS
INFECCIONES POR
PLASMODIUM

13-2-09
Óscar
Introducción
Plasmodiosis = Malaria = Paludismo:

Parasitosis caracterizada por episodios febriles típicos, precedidos por


escalofrío intenso que terminan con diaforesis, hepatoesplenomegalia y
anemia que varia de leve a grave.

Enfermedad causada por parasitos del genero Plasmodium


Phyllum: Apicomplexa (una sola célula)
Clase: Sporozoea (carece de organelos de locomocion)
Subclase: Coccidia
Familia: Plasmodiidae
Género y especies que pueden parasitar al hombre:
Plasmodium vivax
P.malariae
P. falciparum
P. ovale.
Epidemiología
Entre 500-900 millones de individuos sufrirán
ataques clínicos de paludismo el próximo año
Las infecciones más frecuentes son las debidas a
P.vivax y P.falciparum.
El P.falciparum predomina en África Tropical,
sudeste de Asia, Oceanía, la ribera amazonica y la
Republica Dominicana.
P.Vivax es más común en América Central y en la
India.
• El paludismo es una enfermedad endémica
en unos 100 países.

• Enfermedad reemergente tanto en países


endémicos como en países no endémicos.
Este aumento
obedece a:
-Aumento de la
resistencia de los
parásitos
-Aumento de la
resistencia del
vector
-Aumento de los
viajes a zonas
endémicas
• Transmisores del paludismo: hembras de los
mosquitos del genero Anopheles.
Especies de Anopheles mas importantes:
A.quadrimaculatus
A.pseudopunctipennis
A.albimanus.

• Predomina en las regiones tropicales y


subtropicales.
DISTRIBUCIÓN DEL
PALUDISMO
Epidemiología : Otras formas de
transmisión
• Personas que anteceden de transfusión sanguínea
procedente de donadores con paludismo, puede
desarrollar la enfermedad.

• Paludismo congenito: Ha sido descrito con las 4


especies. Al parecer, para que exista este tipo de
transmisión se necesita que la barrera placentaria
haya sido dañada
Manifestaciones clínicas:
Periodo de incubación

Varia según la especie infectante y de


acuerdo con la cepa.
P. vivax y P. ovale tienen un periodo de
incubación de 10 a 7 días
P. falciparum de 8 a 12 y
P. malariae de 27 a 40 días.
Los últimos días del periodo de incubación
pueden caracterizarse por signos y síntomas
como dolores musculares, anorexia, naúseas e
inclusive vómito.
El paroxismo febril casi siempre es precedido
por un escalofrío repentino, que estremece al
enfermo, al principio dura 10 a 15 minutos y se
alarga un poco a medida que el cuadro clínico
se repite.
La etapa febril sigue a la de escalofrío y se
acompaña de cefalea y dolores de tronco y
miembros.
Esta etapa dura de 2 a 6 horas y es seguida
por una etapa de sudoración intensa, en la cual
el paciente suele sentirse débil y agotado,
quedando casi siempre dormido.
En el paludismo causado por P. vivax y P. ovale
el periodo de la crisis es de 48 horas.
En P. falciparum es casi de 48 horas.
Y en P. malariae de aproximadamente de 72
horas.
Los cuadros clínicos menos graves son
causados por P. ovale y P. vivax
Los moderadamente graves por
P.malariae y
los graves e incluso frecuentemente
mortales por P. falciparum.
Manifestaciones clínicas:
Síntomas
Escalofríos intenso
Fiebre 40-41 º C
Sudoración.
Cefalea
Nauseas
Taquicardia
Tratamiento

Para destruir las formas eritrocitarias


(tratamiento supresivo) se puede
emplear principalmente:

Amodiaquina
Cloroquina
• Debido al aumento
de las resistencia a
estos fármacos se
están diseñando
nuevos fármacos
• Estos tienen el
inconveniente de
ser unas 10 veces
más caros
Ciclo biológico
2. Exporozoitos pasan del
torrente sanguíneo al
hepatocito

1. Inoculación de
esporozoito
3. Esquizoogenesis

11. Fusión de los gametocitos y


formación de los huevos

4. Esquizonte hepático
9. Gametocitos

8. Esquizonte hematico

5. Merozoito

10. Gametocitos chupados por el mosquito


7. Trofozoito
6. Merozoito penetra a los hematíes
Diagnostico de laboratorio:
Examen de muestras de sangre
periferica
Método de referencia
Preparación de las muestras:
Gota gruesa (sobre
todo cuando hay menor
presencia de parásitos)
Frotis (extensión en capa
fina)
Tinciones
– Giemsa (tinción de
referencia)
– Field (tinción rapida y
sencilla)
– Otras:
Leishman
Naranja de Acridina
Plasmodium vivax

Los hematíes parasitados suelen tener tamaño


aumentado y contienen gránulos de Schuffner
(microtúbulos degradados de color rosado)
Las formas en anillo son de contorno fino y de tamaño
considerable
Los Gametocitos tienen forma redonda u ovalada
Los Esquizontes contienen numerosos merozoitos
Plasmodium falciparum

Multiples formas en anillo en el interior


de un hematie
Gametocitos en forma de banana
No suelen verse esquizontes
Inclusiones de color parduzco en el
interior de los neutrofilos y monocitos
(pigmento de Maurer = hemozoina)
Plasmodium ovale
Hematies aumentados
Anillos de forma ovalada mas compactos que
en el P.vivax y el P.falciparum
Gametocitos redondeados
Plasmodium malariae
Hematies ligeramente menores que los
normales
Anillos compactos
Gametocitos redondeados
TROFOZOITOS

Plasmodium falciparum:  Los trofozoitos


dentro del eritrocito siempre están en
forma de “anillo”, además de que sólo en
P. falciparum se presentan múltiples
trofozoitos en una célula.

Plasmodium vivax:  Los eritrocitos


infectados por P. vivax son a veces más
grandes que los eritrocitos normales.
Aproximadamente cabría 1.5  eritrocitos
normales en uno infectado..

Plasmodium malariae: La característica


de los trofozoitos de P. malariae
muestran la forma de “anillo” y una ligera
tendencia de que los eritrocitos
normales sean de tamaño normal o más
pequeños.
GAMETOCITOS
GAMETOCITOS

Plasmodium falciparum:  El
gametocito tiene forma de
Platano.

Plasmodium ovale:  El gametocito


es más grande que los eritrocitos
normales.Tienen una apariencia
granular parecidos a los puntos de
Schuffner.
Plasmodium malariae:  Los
gametocitos de P. malariae tienen
una apariencia redonda cercana a la
de los eritrocitos. Tienen a demás
una apariencia granular.
ESQUIZONTES

Plasmodium malariae:  Un esquizonte


tiene de 6 a 12 merozoitos, dándole
una apariencia granular.

Plasmodium vivax: Un esquizonte


muestra numerosos merozoitos (de
16 a 24), y un mayor tamaño en
comparación con los eritrocitos
normales
Características morfológicas de los parásitos
palúdicos en extensiones sanguíneas finas
(según OMS).
P.Vivax P.Ovale P.Malariae P.falciparum

Hematie infectado Aumentado Aumentado, oval Normal o menor Normal


Puntos de Schuffner Puntos de Schuffner Hendiduras de Maurer

Anillo Grande Compacto Compacto Pequeño


Uno o dos puntos de Raro 2 anillos Raro 2 anillos Delicado
cromatina A menudo dos puntos de
Puede haber 2 anillos cromatina y 2 o más
anillos

Trofozoito Grande Pequeño Pequeño Tamaño moderado


Ameboide No ameboide Compacto, a menudo Compacto
Pigmento en bastones Pigmento granuloso en forma de banda Pigmento en gránulos
fino Pigmento granuloso

Esquizonte Grande Mas pequeño que P.vivax Pequeño Raro


Merozoitos grande 6-12 merozoitos 6-12 merozoitos Merozoitos pequeños (8-
(12-24) Pigmento más oscuro grandes 26)
Pigmento coalescente que P.vivax Aspecto tipico de Masa única de pigmento
“Margarita”
Pigmento granulosos

Gametozito Esfericos Parecido a P.vivax pero Parecidos a P.vivax Forma semilunar


Compactos más pequeños pero más pequeños Nucleo único
Nucleo único Menos mumerosos
Pigmento difuso y Sin puntos de
granuloso Schufner
Otras pruebas diagnosticas:
Microscopia de fluorescencia

Colorantes fluorescentes con afinidad por los ácidos


nucleicos de los parasitos:
Naranja de acridina (NA)
Benzotiocarboxipurina (BCP)
Aumentan la sensibilidad.
Pueden ser útiles en caso de parasitemias muy baja
No permiten la diferenciación de las diferentes
especies de Plasmodium
Otras pruebas diagnosticas:
Sistema QBC
Quantitative Buffy Coat System
Se basa en la concentración por gradiente de
densidad de los eritrocitos parasitados mediante
la centrifugación de un capilar impregnado de
heparina y NA, al que se añade un flotador.
Sistema caro: necesita de centrifuga, capilares
especiales, un acoplador de microscopio con un
sistema de epifluorescencia, lentes especiales,…
No aporta mucho al frotis y a la gota gruesa, ni
permite diferenciar diferentes especies
PRUEBAS RAPIDAS
PARA EL DIAGNOSTICO DEL PALUDISMO (PRDM)

• Utilizan principios de inmunocromatografía incorporados a


formatos de cintas reactivas o de tarjetas de prueba

• Pretenden tipificar a la especie de Plasmodium conforme a la


detección de antígenos específicos producidos por el parásito.

•Las PRDM pretenden ser :


sencillas (manejo a temperatura ambiente sin instrumentos)
rápidas (diagnóstico en sólo 10 a 15 minutos)
PRDM
Detección de HRP-2

• Proteína 2 rica en histidina especifica de P. falciparum


(PfHRP-2)
• Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos
especificos y técnicas de inmunocromatografía
• Tienen falsos negativos y no son cuantitativas
• Tienen falsos positivos: especialmente con el FR
• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en diagnostico
microscopico
PRDM
Kit comerciales de detección conjunta de
HPR-2 y pLDH o Aldolasa de plasmodium
• Los kit comerciales utilizan anticuerpos contra HPR-2
especifica de P.falciparum, y anticuerpos contra
antigenos panmalaricos, o sea, presentes en las cuatro
especies de Plasmodium (Lactato Deshidrogenasa
parasitaria y Aldolasa de Plasmodium).
• Detección mediante la captura antigénica con
anticuerpos especificos y técnicas de
inmunocromatografía
• Metodo barato
• No ofrece mejor sensibilidad que la microscopia, tienen
falsos negativos ,no son cuantitativas y no permite
distinguir entre especies diferentes a P.falciparum.
• Tienen falsos positivos
• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en
diagnostico microscopico
OPTIMAL: Diagnóstico de malaria
con anticuerpos monoclonales contra
la enzima pLDH
Técnicas moleculares
PCR a tiempo real
• Se amplifica el gen de la subunidad 18S del RNA ribosomal
Este gen presenta secuencias de bases comunes y especificas
de cada especie.
• Se utilizan varios pares de primers en un unico tubo (PCR multiplex)
que permite la amplificación simultanea de varios fragmentos de
DNA.
• El producto amplificado se detecta por fluorescencia
• La detección de las intensidades de fluorescencia mientras se
produce la PCR, hace posible la detección y cuantificación del
producto amplificado.
• Permite la detección incluso de 0.7-4 parásitos/uL
• Al ser cuantitativa: sirve para controlar tratamientos
• Altisima sensibilidad y especificidad

• MUY CARA. Solo posible en países desarrollados


- Diagnostico molecular de malaria en sangre de pacientes

ssDNA
Plasmodium

P. vivax (499 pb)


ssrDNA P. falciparum (395 pb)
Humano P. malariae (269 pb)
Serología
• Derección de anticuerpos anti P.falciparum en el
suero
• Baja sensibilidad.
• Solo se utiliza en determinados casos en donde la
microscopia es negativo debido a la medicación
• Existe una técnica de inmunofluorescencia
(Falciparum-spot IF. Bio-Merieux).
• Mas recientementew se ha introducido un
enzimoinmunoensayo (Malaria IgG Celisa. BMD).
CONCLUSIONES
LA OBSERVACIÓN MICROSCOPICA ES EL METODO DE
REFERENCIA
cuantitativo ,diferencia especies y barato

LAS TECNICAS INMUNOCROMATOGRAFICAS SON


FACILES Y BARATAS PERO PEORES
menos sensibilidad y con falsos positivos y falsos
negativos

LA PCR ES LA MAS SENSIBLE PERO LA MAS CARA


detecta parasitemias bajas. Util para control de ttos.