INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN PROGRAMA DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGA MOLECULAR

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

PRCTICA INHIBIDORES ENZIMTICOS

IBQ. HERNNDEZ MARN, MIGUEL ANGEL

MATERIA: LABORATORIO DE BIOQUMICA AVANZADA

PROFESOR: Dr. CARLOS WONG RAMREZ (LABORATORIO DE ENZIMOLOGA)

FECHA DE ENTREGA: VIERNES 18 DE FEBRERO DEL 2011

PRCTICA
INHIBIDORES ENZIMTICOS Introduccin
Las reacciones bioqumicas, estan facilitadas por enzimas. Estos catalizadores, son individualmente muy especficos de reacciones determinadas; son extremadamente verstiles en el sentido de que las varias millones de enzimas conocidas llevan a cabo reacciones tan diversas como son la hidrlisis, la polimerizacin, tranferencia de grupos funcionales, oxido reduccin, deshidratacin e isomerizacin, por mencionar solamente las clases mas comunes de recciones catalizadas enzimticamente. Las enzimas son mquinas moleculares complejas que operan mediante una gran variedad de mecanismos. Por ejemplo, algunas enzimas actan sobre una nica molcula de sustrato; otros actan sobre dos o ms molculas de sustrato diferentes cuyo orden de fijacin puede ser obligatorio o no serlo. Algunas enzimas forman intermediarios unidos de manera covalente con sus sustrato, mientras que otras no lo forman. Las determinaciones cinticas de reacciones catalizadas enzimticamente se encuentran entre las tecnicas mas poderosas para elucidar los mecanismos catalticos de las enzimas.

Reaccin de la Quimiotripsina. Ctalisis cido base general y covalente. Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.

Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados.

Inhibicin enzimtica

Las sustancias que reducen la actividad de una enzima, se les denomina inhibidores enzimticos. Muchos inhibidores son sustancias que se parecen estructuralmente al sustrato de la enzima, pero o bien no reaccionan o reaccionan muy lentamente en comparacin al sustrato. Este tipo de inhibidores se utilizan en usualmente para conocer la naturaleza qumica y conformacional de un sitio de fijacin de sustrato como parte de un esfuerzo para dilucidar el mecanismo cataltico de la enzima. Adems muchos inhibidores enzimticos son agentes quimioteraputicos efectivos, ya que un anlogo no natural del sustrato puede bloquear la accin de una enzima especfica. Por ejemplo, el metotrexato (tambin llamado ametopterina) se parece qumicamente al dihidrofolato. El metotrexato se fija fuertemente la enzima hidrofolato reductasa, impidiendo de esta forma que lleve a cabo su funcin normal, la reduccin del dihidrofolato a tetrahidrofolato, cofactor esencial en la biosntesis del precursor del DNA el cido timidlico. Los inhibidores enzimticos son molculas que reducen o anulan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la desaparicin del inhibidor restaura la actividad enzimtica) o irreversible (el inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

 Objetivos
Determinar la actividad enzimtica de la Lactato deshidrogenasa (LDH) de hgado de rata. Evaluar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la LDH. Conocer el efecto del inhibidor sobre la actividad de la enzima. Determinar el tipo de inhibicin enzimtica que produce el inhibidor. Conocer el efecto que tiene la velocidad enzimtica con respecto al tiempo de incubacin de la enzima con el inhibidor. Determinar la actividad especfica de la LDH en el extracto de hgado por el mtodo de Bradford.

Desarrollo experimental
Reactivos Regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.4. Piruvato de sodio en concentraciones de 0.19 * 10 04 M, 0.39 * 10 04 M, 0.75 * 10 04 M, 1.56 * 10 04 M, 3.125 * 10 04 M, 6.25 * 10 04 M, 12.5 * 10 04 M, 25 * 10 04 M, en regulador de fosfatos (como concentracin final en la mezcla de reaccin). NADH (5 mg en 0.75 mL de regulador de fosfatos). Extracto enzimtico de LDH, proveniente de hgado.

Determinacin de la actividad de la LDH En una celda colocar: Reactivo Volumen (mL) Regulador de fosfatos 2.75 Piruvato de sodio 0.1 NADH 0.05 Agitar y verificar la absorbancia a 340 nm en el espectrofotmetro (La absorbancia deber estar de 0.5 0.8) Extracto de LDH (Elegir una dilucin en la que se produzca un cambio en la D.O. por minuto 0.1 de 0.05 a 0.08) Seguir el curso de la reaccin por 6 minutos, tomando lecturas cada minuto.

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la LDH Variar la concentracin de piruvato desde 0.19 * 10 04 M, hasta 25 * 10 04 M. Efecto del inhibidor sobre la actividad de la LDH Utilizando la concentracin de piruvato con la que se obtiene la velocidad de reaccin mxima, adicionar a la mezcla de reaccin una concentracin de inhibidor de 0, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM en 0.00, 0.02, 0.03, 0.04, 0.06, 0.08, y 0.1 mL, considerando que el volumen final de la reaccin debe ser 3 mL, por lo cual se debe restar del regulador en la mezcla de reaccin. Determinacin del tipo inhibicin producida por el inhibidor Medir la actividad de la LDH, variando la concentracin de piruvato de 0.19 * 10 04 M, hasta 25 * 10 04 M, en ausencia y presencia de dos concentraciones del inhibidor (las que provocan aproximadamente el 25 y 50 % de inhibicin enzimtica). Efecto en el tiempo de incubacin de la enzima con el inhibidor En un matraz Erlenmeyer, mezclar 1.5 mL de dilucin enzimtica adecuada, con 1.5 mL de inhibidor, de la concentracin que inhiba el 25% de la actividad. Inmediatamente despus de mezclar, tomar una alcuota de 0.2 mL y adicionarla a la mezcla de reaccin: Reactivo Volumen (mL) Regulador de fosfatos 2.65 Piruvato de sodio (Concentracin que produce 0.1 la velocidad mxima) NADH 0.05 Seguir el curso de la reaccin por 6 minutos, tomando lecturas cada minuto. Repetir este procedimiento a los 15, 30, 45, 60, 75, 90 y 120 minutos de preparada la mezcla enzima inhibidor (mantener en hielo durante el experimento).

Determinacin de la actividad especfica de la LDH en el extracto de hgado (unidades enzimticas por mg de protena) Mtodo de Bradford Preparar una curva de calibracin de acuerdo a la siguiente tabla: Sol. de albmina bovina (0.25 mg / mL) (mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Agua destilada (mL) 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 Reactivo de Bradford (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Tubo Blanco 1 y 1 2 y 2 3 y 3 4 y 4 5 y 5

Agitar los tubos por inversin, despus de 10 minutos, leer la absorbancia de cada tubo a 595 nm. Para la determinacin de la actividad especfica de la LDH en el extracto enzimtico de hgado, preparar los tubos de acuerdo de a lo indicado para el tubo 1, probando dos diluciones distintas (1:30 y 1:60), ambos tubos por duplicado y leer de la misma manera que la curva de calibracin.

 Resultados experimentales y clculos

Determinacin de la actividad de la LDH Se determin la actividad de a Lactato deshidrogenasa en funcin del cambio de absorbancia en el tiempo a una concentracin de sustrato (piruvato de sodio) de 12.5 * 10 04 M. La dilucin empleada del extracto enzimtico para todos los experimentos fue de 1:75.
Determinacin de la actividad de la LDH Tiempo (min) 0 1 2 3 4 5 6 Absorbancia 340 nm 0.664 0.080 0.584 0.042 0.542 0.072 0.470 0.072 0.398 0.071 0.327 0.078 0.249 v (Absorbancia 340 nm)

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la LDH A partir de las diferentes concentraciones de sustrato y sus respectivas velocidades de reaccin expresadas por cambio en de absorbancia, se construye la grfica de cintica enzimtica de Michaelis Menten.

Efecto de la concentracin de piruvato Concentracin de Piruvato (mM) v (Absorbancia 340 nm / min) 0.019 0.039 0.075 0.156 0.3125 0.625 1.250 2.500 0.0052 0.0120 0.0256 0.0410 0.0633 0.0736 0.0782 0.0531

Se determino grficamente a partir de la mitad del valor de la velocidad mxima ( v MAX / 2) a un valor de 0.039 Absorbancia 340 nm / min, la constante de Michaelis (Km), la cual tuvo un valor aproximado de 0.15 mM. El valor de v MAX es 0.078 Absorbancia 340 nm / min.

A partir de los inversos de los datos anteriores se construye la grfica de Lineweaver Burk colocando los valores de 1 / v en el eje de las ordenadas y en el eje de las abscisas 1 / Concentracin de piruvato, obteniendo la ecuacin de una lnea recta, de la cual se parte para calcular el inverso negativo de la constante de Michaelis (Km). Nota: No se graficaron la concentracin de 0.019 y 0.039 mM de piruvato (Valores inversos sombrados).

Efecto de la concentracin de piruvato Concentracin de Piruvato -1 (mM -1) 52.63 25.64 13.33 6.41 3.20 1.60 0.80 0.40 v -1 ((Absorbancia 340 nm / min)-1) 192.31 83.33 39.06 24.39 15.80 13.59 12.79 18.83

El inverso negativo de la constante de Michaelis ( 1 / Km), se puede determinar en el grfico construido, haciendo uso de la ecuacin de la lnea recta obtenida por regresin lineal a partir de los datos anteriores, la cual es:

Esta ecuacin tambin se puede expresar como:

De acuerdo a esta expresin se sabe que:

Por lo tanto:

Tomando en cuenta que (1 / Km) se encuentra en el eje de las abscisas cuando la ordenada es igual a cero, se realiza el despeje de la independiente como a continuacin se presenta:

Por lo tanto:

Efecto del inhibidor sobre la actividad de la LDH Partiendo de diferentes concentraciones de inhibidor presente en la reaccin enzimtica y sus respectivas velocidades de reaccin expresadas por cambio en de absorbancia, se puede conocer los porcentajes de inhibicin que este ejerce sobre el catalizador. Se toma como 100% de actividad enzimtica, aquel sistema que no contiene inhibidor.

Efecto del inhibidor sobre la actividad de la LDH Concentracin del inhibidor v % Actividad (mM) (Absorbancia 340 nm / min) enzimtica 0 0.068 100 0.2 0.062 91.18 0.3 0.051 75 0.4 0.0475 69.85 0.6 0.032 47.06 0.8 0.028 41.18 1 0.023 33.82

% Inhibicin enzimtica 0 8.82 25 30.15 52.94 58.82 66.18

Determinacin del tipo inhibicin producida por el inhibidor Se grafico la actividad de la LDH, a diferentes concentraciones de piruvato, en ausencia y presencia de dos concentraciones del inhibidor (0.3 y 0.6 mM) que provocaran aproximadamente el 25 y 50 % de inhibicin enzimtica respectivamente.

Determinacin del tipo inhibicin producida por el inhibidor

Concentracin de Piruvato (mM) 0.019 0.039 0.075 0.156 0.3125 0.625 1.250 v (Absorbancia 340 nm / min) Sin inhibidor 0% de inhibicin 0.0076 0.0164 0.0316 0.0554 0.0846 0.0962 0.0954 Inhibidor (0.3 mM) 25% de inhibicin 0.0030 0.0053 0.0112 0.0196 0.0365 0.0590 0.0700 Inhibidor (0.6 mM) 50% de inhibicin 0.0020 0.0033 0.0066 0.0126 0.0193 0.0390 0.0570

Para conocer el tipo de inhibicin ejercida por la sustancia empleada, se construye la grfica Lineweaver Burk, para las tres cinticas.

Determinacin del tipo inhibicin producida por el inhibidor

Concentracin de Piruvato -1 (mM -1) 52.632 25.641 13.333 6.410 3.200 1.600 0.800 v -1 ((Absorbancia 340 nm / min) -1) Sin inhibidor 0% de inhibicin 131.579 60.976 31.646 18.051 11.820 10.395 10.482 Inhibidor (0.3 mM) 25% de inhibicin 333.333 188.679 89.286 51.020 27.397 16.949 14.286 Inhibidor (0.6 mM) 50% de inhibicin 500.000 303.030 151.515 79.365 51.813 25.641 17.544

La determinacin del inverso de velocidad mxima (1 / v MAX) en la grfica Lineweaver Burk, se realiz de manera visual, ajustando la tendencia de las rectas a un punto en comn en el eje de las ordenadas. Estas tendencias se extrapolaron hasta el eje negativo de las abscisas para obtener los valores de los inversos negativos de las constantes de afinidad para cada cintica (1 / Km).

De este grfico se encontraron los siguientes valores cinticos:

Concentracin del inhibidor (mM) 0 0.3 0.6 v MAX -1 ((Absorbancia 340 nm / min) -1) 0.9 0.9 0.9

Km -1 (mM -1) -4.2 -1.3 -0.8

Km (mM) 0.238 0.769 1.250

A partir estos datos, es posible encontrar la constante de inhibicin ( Ki) de la enzima, por el inhibidor empleado en la parte experimental, graficando la relacin de Km / v MAX contra la concentracin de inhibidor.
Concentracin del inhibidor (mM) 0 0.3 0.6 Km / v MAX (mM / (Absorbancia 340 nm / min)) 0.214 0.692 1.125

El valor negativo de la constante de inhibicin (Ki), se puede determinar mediante el grfico construido, haciendo uso de la ecuacin de la lnea recta obtenida por regresin lineal a partir de los datos anteriormente tabulados:

Esta ecuacin tambin se puede expresar como:

Tomando en cuenta que (Ki) se encontrara en el eje de las abscisas cuando la ordenada sea igual a cero, se realiza el despeje de la independiente como a continuacin se presenta:

Por lo tanto:

Efecto en el tiempo de incubacin de la enzima con el inhibidor Se observ en la velocidad de reaccin de la enzima el efecto de incubar a la LDH con el inhibidor a diferentes tiempos.

Efecto en el tiempo de incubacin de la enzima con el inhibidor

Tiempo de incubacin de la LDH (min) 0 15 30 45 60 75 90 120 %v (Absorbancia 340 nm / min) 6.75 7.33 6.68 6.37 6.42 6.96 7.16 6.91

 Discusin de Resultados:
Determinacin de la actividad de la LDH Se eligi una dilucin apropiada del extracto enzimtico en regulador de fosfatos, la cual no diera incrementos bruscos de densidad ptica por minuto de reaccin. La dilucin tomada fue de 1:75 para cada parte experimental. Antes de iniciar cada experimento fue necesario verificar la velocidad de reaccin de la Lactato deshidrogenasa sobre el piruvato, para asegurar la condicin ptima del catalizador. Es importante recordar que las condiciones de temperatura y pH a las cuales fue llevada a cabo la prctica, afectan directamente la actividad de la LDH, por ello fue importante preparar correctamente el regulador de fosfatos con valor de pH igual a 7.4, que es al cual la enzima muestra su mayor actividad. Las condiciones de temperatura fueron controladas al mantener la dilucin del extracto enzimtico y del NADH en bao de hielo, y de tener a temperatura ambiente tanto el regulador de fosfatos como el sustrato. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la LDH Las diferentes concentraciones de piruvato en presencia de LDH, dio como resultado grfico algunos parmetros cinticos de la reaccin. Se muestra a la concentracin de sustrato de 1.25 mM, la velocidad mxima a la cual el catalizador puede efectuar la reaccin de forma ptima, sin llegar a ser inhibido por efecto del sustrato; ello es visible al notar el comportamiento asinttico de la curva al llegar a dicha concentracin y despus de ella. A un medio de la velocidad mxima (v MAX / 2), fue posible determinar grficamente la constante de afinidad de la enzima por el sustrato (Km), la cual tuvo un valor aproximado de 0.15 mM del cetocido. La determinacin de Km mediante la ecuacin lineal del grfico de Lineweaver Burk tuvo como resultado que el valor de esta es de 0.20 mM de piruvato. En la construccin de este ltimo, no se contemplaron las concentraciones de 0.019 y 0.039 mM del sustrato, ya que los inversos de estos valores conducen a obtener errores grficos por la dispersin de datos, lo cual dara un valor equivoco o muy alejado del Km y v MAX reales. La velocidad mxima de la enzima determinada en la grfica hiperblica es de 0.078 Absorbancia 340 nm / min, mientras que la determinada por el grfico de Lineweaver Burk fue de 0.085 Absorbancia 340 nm / min. Es posible notar que el valor de las constantes de afinidad de la LDH por el piruvato solo difiere en 0.05 mM, mientras que la velocidad mxima del catalizador determinada en los dos grficos tienen solo una diferencia de 0.008 unidades de velocidad. Al no existir una diferencia significativa puede decirse que el valor exacto tanto de la constante de Michaelis y la velocidad mxima de la enzima en estudio debe encontrarse cerca de los valores antes determinados y de los reportados. Efecto del inhibidor sobre la actividad de la LDH Se obtuvieron los porcentajes tanto de la actividad enzimtica y de su inhibicin al intervenir en la reaccin diferentes concentraciones del inhibidor. En ellos se puede observar que a medida que aumenta la concentracin de la sustancia inhibidora, la velocidad a la cual acta la enzima es mermada. Con ello se puede inferir que posiblemente el inhibidor compite por el sitio de accin de la LDH con el piruvato.

Determinacin del tipo inhibicin producida por el inhibidor A partir de las concentraciones de inhibidor de 0.0, 0.3 y 0.6 mM que disminuyeron la actividad enzimtica total en un 0, 25 y 50 % respectivamente, lo cual notable en las graficas hiperblicas de la cintica enzimtica, se realiz la determinacin del tipo de inhibicin producida por esta sustancia. Los inversos de la velocidad y de concentracin de sustrato se emplearon para construir el grfico de Lineweaver Burk, para cada concentracin de inhibidor, en donde existe en la tendencia de las rectas con respecto a la ordenada al origen un punto en comn. El ajuste de la tendencia de cada lnea se realiza de manera visual, ya que la dispersin de los datos en las concentraciones menores de piruvato lleva a tener mayor error. Al saber que la cintica de los tres experimentos tiene en comn un valor de inverso de la velocidad mxima de 0.9 (Absorbancia 340 nm / min) -1, se concluye que el tipo de inhibicin producida por esta sustancia es de tipo competitiva. Las rectas son extrapoladas hasta el eje de las abscisas para conocer el inverso negativo de la constante de afinidad por el sustrato para cada una de las tres cinticas. Fue posible determinar la constante de inhibicin del inhibidor sobre la LDH al construir el grfico de Km / v MAX vs Concentracin del inhibidor, al extrapolar la pendiente hasta el eje negativo de las abscisas, y encontrar el valor negativo de Ki. Se tiene que a una concentracin 0.15 mM de este inhibidor la actividad enzimtica de la LDH ser afectada por el. Efecto en el tiempo de incubacin de la enzima con el inhibidor En esta parte del desarrollo experimental, se logr ver que el inhibidor es de tipo irreversible, ya que a medida que el tiempo de incubacin fue incrementndose, el % de velocidad de reaccin no tuvo una modificacin importante. Esto puede sugerir que el inhibidor se logra unir a la enzima de forma covalente, de tal manera que la afectacin en el catalizador por el inhibidor no pueda revertirse. Los inhibidores enzimticos tienen aplicaciones en medicamentos, por lo que su descubrimiento y mejora es un campo de investigacin activo en la bioqumica y la farmacologa. La validez de un inhibidor enzimtico medicinal suele venir determinada por su especificidad (su carencia de unirse a otras protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual indica la concentracin necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y por tanto una baja toxicidad. Los inhibidores enzimticos tambin son usados en la naturaleza y estn implicados en la regulacin del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas en una ruta metablica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. Este tipo de retroalimentacin negativa retarda el flujo a travs de la ruta cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una clula. Otros inhibidores enzimticos celulares son protenas que se unen especficamente e inhiben una diana enzimtica. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dainas para la clula, como las proteasas o nucleasas. Un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones protena protena ms fuertes conocidas. Como inhibidores enzimticos naturales tambin cabe destacar los venenos, que son usados como defensa contra los depredadores o como forma de matar a una presa.

 Conclusiones:
La constante de afinidad (Km) de la lactato deshidrogenasa sobre le piruvato se encuentra en una concentracin entre 0.15 a 0.20 mM de sustrato. La velocidad mxima de la LDH a 1.25 mM de piruvato es de aproximadamente 0.08 unidades de Absorbancia 340 nm. La constante de inhibicin de inhibidor empleado sobre la lactato deshidrogeneasa de hgado de rata es de 0.15 mM. La inhibicin ejercida por el compuesto inhibidor es de tipo competitiva. Probablemente el inhibidor se une de forma covalente con la lactato deshidrogenasa (inhibicin irreversible). Los inhibidores enzimticos tienen una amplia aplicacin el campo de la medicina y de la farmacologa.

Bibliografa:
Voet, D. y J.G. Voet. 1995. Biochemistry. 2 edicin. John Wiley & Sons. Inc., N.Y., U.S.A. pp. 356 - 373. Nelson, D.L. & Cox, M.M. 2000. Lenhinger Principios de Bioqumica. 3 edicin. Ediciones Omega, Barcelona, Espaa. pp. 243 289. http://es.wikipedia.org/wiki/Inhibidor_enzim%C3%A1tico http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica