CUPRINS 1. Microorganisme patogene transmise prin intermediul alimentelor si principalele boli produse de acestea 2.

Evidentierea indicatorilor utilizati in controlul microbiologic al alimentelor. 1. Microorganisme patogene transmise prin intermediul alimentelor si principalele boli produse de acestea 1.1. Factori care influeneaz creterea i dezvoltarea microorganismelor n produsele alimentare Calitatea i sigurana alimentelor depinde de meninerea standardelor pe tot parcursul lanului alimentar, de la producia agricol i zootehnic, la prelucrare, transport i consum. Din statisticile realizate la nivel global, reiese c 79% dintre bolile cauzate de alimente contaminate se datoreaz restaurantelor i unitilor de servire, 21% sectorului casnic i 3% productorilor de alimente (indicatie). CDC (Center for Disease Control) estimeaz c n fiecare an se nregistreaz n jur de 76 milioane de cazuri, cu un numr de aproximativ 300.000 de spitalizai, iar pentru 1,6% evolutia este fatal. In Romnia, la nivelul Ministerul Sntii se desfoar programe de monitorizare a toxiinfeciilor alimentare (TIA), datele fiind raportate n cadrul programului FWD (Food and Water Diseases) de supraveghere a bolilor de origine alimentara si hidrica initiat de ECDC (Centrului European de Prevenire si Control al Bolilor Transmisibile). Cu toate acestea, cazurile de TIA cu un numr redus de mbolnaviri declarate, n cazul episoadelor familiale, sunt subraportate, la nivel mondial, fapt ce nu reflect incidena real. Creterea i multiplicarea microorganismelor n produsele alimentare este influenat de o serie de factori care depind de caracteristicile esuturilor vegetale i animale (factori intrinseci: valoarea pH, umiditatea relativ, potenialul de oxidoreducere, coninutul n substante nutritive, coninutul de constitueni antimicrobieni, structura biologic), dar i de condiiile de stocare a alimentelor (factori extrinseci). Majoritatea microorganismelor se dezvolt optim la pH neutru, cu valoare de 7.0 (6.6-7.5). Puine specii se dezvolt la pH sub 4.0. Aciditatea natural sau inerent a unor alimente, n special a fructelor, poate proteja esuturile vegetale de distrugerea microorganismelor, i n special, seminele, acest mecanism fiind foarte important pentru evoluia filogenetic a diferitelor specii vegetale.

Una din cele mai vechi metode de conservare a alimentelor este deshidratarea deoarece microorganismele nu se pot multiplica, iar unele nu supravieuiesc n absena umiditii. Microorganismele prezint diferite grade de sensibilitate la potenialul de oxido-reducere al mediului lor de cretere, cele aerobe necesitnd valori ridicate pentru cretere, iar cele anaerobe, valori negative. Acidul ascorbic i zaharurile reduse din fructe i legume, gruprile SH din proteinele animale contribuie la meninerea unui potenial redox redus n alimente. n cursul multiplicrii ntr-un aliment, microorganismele modific att valoarea pH ct i potenialul redox. Microorganismele aerobe pot reduce potenialul redox al unui aliment pn la -300 mV prin producerea metaboliilor secundari, (de exemplu, H2S). Microorgansimele prezente n alimente pot utiliza ca surs de carbon si energie, n procesele de cretere i multiplicare, glucide simple, alcooli, aminoacizi, amidon, celuloz, grsimi. Factorii extrinseci care influeneaz creterea i dezvoltarea microorgansimelor sunt temperatura de depozitare, umiditatea relativ a mediului, prezena i concentraia gazelor n aerul atmosferic, prezena i activitile altor microorganisme. Microorganismele se pot dezvolta la o gam foarte larg de temperaturi, de la -34 C la 100C. Cele mai multe bacterii termofile prezente n alimente aparin genurilor Bacillus i Clostridium. Umiditatea relativ a mediului de conservare este important att pentru meninerea calitii alimentelor, ct i pentru prevenirea multiplicrii microorganismelor. Alimentele cu valori mici ale umiditii, atunci cnd, sunt depozitate n medii cu umiditate relativ nalt, coninutul lor n ap crete pn la p valpare de echilibru. n mod similar, alimentele cu un coninut ridicat de ap, pierd o parte a apei atunci cnd sunt stocate ntr-un mediu cu umiditate relativ sczut. n alegerea mediilor adecvate pentru depozitarea alimentelor trebuie s se in cont de relaia dintre umiditatea relativ i temperatur, ntre aceti factori existnd o strns corelaie. Dioxidul de carbon (CO2) este cel mai important gaz folosit pentru controlul dezvoltrii microorganismelor n alimente. Ozonul (O3) prezint, de asemenea, proprieti antimicrobiene, fiind testat ca agent de conservare n scopul prelungirii termenului de valabilitate a anumitor produse alimentare, ns datorit caracterului

puternic oxidant, nu poate fi utilizat n cazul alimentelor cu un coninut ridicat de lipide, deoarece le altereaz prin oxidare (rncezire). Unele microorganisme contaminante ale alimentelor produc substane cu efect inhibitor sau letal (antibiotice, bacteriocine, peroxid de hidrogen i acizi organici) asupra altor microorganisme. 1.1. Toxiinfeciile alimentare Maladiile de origine alimentar au fost denumite generic toxiinfecii alimentare, acestea cuprinznd: manifestari propriu-zise de toxiinfecie alimentar produse de microorgansime i parazii; intoxicaii de origine microbian determinate de ingerarea alimentelor contaminate cu toxine preformate rezultat al multiplicrii n aliment a tulpinilor bacteriene de C. botulinum, S. aureus, B. cereus sau cu micotoxine produse de fungi; intoxicaii cauzate de toxine prezente la nivelul esuturilor comestibile ale unor vieuitoare marine. Toxiinfeciile alimentare sunt afeciuni diareice acute, care apar sporadic sau n epidemii, ca urmare consumului de alimente contaminate cu diferite microorgansime a cror multiplicare este favorizat de conservare, n condiii necorespunzatoare, i/sau cu toxinele acestora, fiind caracterizate printr-o simptomatologie de gastroenterocolit, cu debut brusc, dramatic, febr i fenomene toxice generale.

Fig. 1. Cile fecal-orale de transmitere a patogenilor intestinali de origine alimentar (Ivana si colab., 2011).

Toxiinfeciile alimentare prezint o etiologie variat, cu manifestri similare, afectnd, de obicei, un numr mare persoane, apariia lor fiind strns legat de alimentaia colectiv sau public. n general TIA se manifest prin sindroame acute intestinale sau neurologice, simptomele debutnd n primele 72 de ore dup ingerarea alimentului contaminat. Manifestrile TIA, n funcie de agentul microbian etiologic, pot fi: stare de ru general i vom, ce apar la 1-6 ore dup ingerarea alimentului contaminat cu tulpini de S. aureus sau B. cereus, datorat toxinei preformate, iar ulterior diaree (77% din cazuri); crampe abdominale i diaree cu debut la 8-16 ore, dup ingerarea alimentului contaminat cu tulpini de C. perfringens i B. cereus, manifestri cauzate de enterotoxine; crampe abdominale, diaree i vom (35-80% din cazuri) ce apar la 16-18 ore dup ingerarea alimentelor contaminate cu tulpini de Salmonella, Shigella, V. parahemolyticus, E. coli invaziv i C. jejuni ca urmare a invaziei celulare; coninutul intestinal este infiltrat cu polimorfonucleare (PMN), iar diareea este deseori hemoragic; crampe abdominale i diaree apoas ce apar la 16-72 de ore dup ingerarea alimentelor contaminate cu tulpini enterotoxigene de E. coli (ETEC), V. parahemolyticus, V. cholerae non-O1, V. cholerae O1 (n zonele endemice); virusuri enterice; febr i crampe abdominale ce apar la 16-48 de ore dup ingerarea alimentului contaminat, produse n general de Y. enterocolitica; din punct de vedere clinic, simptomele sunt asemnatoare cu cele prezente n apendicit; alte simptome: diaree, stare de ru general i vom n puine cazuri. sindrom de diaree hemoragic fr febr, ce apare la 72-120 de ore dup ingerarea alimentului contaminat, produs de E.coli O157:H7 (EHEC), deseori cu sfrit letal. stare de ru general, vom, diaree, pareze, paralizii, ce apar la 18-36 ore dup ingerarea alimentului contaminat, produse de C. botulinum. Morbiditatea asociat TIA este influenat de o serie de factori, dintre care cei mai importani sunt: specia microbian, tipul i virulena tulpinii, numrul de microorganisme sau cantitatea de toxin acumulat n produsul alimentar (doza

infectant), cantitatea de aliment contaminat consumat, particularitile fizice ale alimentului. 1.2. Microorgansime implicate in etiologia TIA Microorgansimele ce determin TIA aparin cel mai adesea urmtoarelor ordine: Pseudomonadales, Eubacteriales, Actinomycetales dintre bacterii i genurilor Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula, Hansenula, Mycoderma, Schizosaccharomyces, Debaromyces, Brettanomyces, Candida, dintre levuri. n general levurile i bacteriile din genurile Lactobacillus produc modificri organoleptice ale preparatelor din carne tocat (crnai, salam), mzg, nverzire i acrire, iar speciile genurilor Streptococcus, Micrococcus i Mycobacterium determin acidifiere (acrire). Fungii filamentoi, contaminani ai produselor alimentare, pot determina modificarea proprietilor organoleptice: miros particular, modificri de culoare i gust. De asemenea, fungii pot determina modificri ale valorii nutritive prin modificri ale coninutului aminoacizilor, n cazul alimentelor bogate n proteine, sau n cazul alimentelor bogate n grsimi, pot determina rncezire ( Aspergillus niger, A. fumigatus, Penicillium stekii etc.). Riscul major asupra sntii este reprezentat de consumul de alimente contaminate cu micotoxine, care determin diferite efecte nocive: hepatotoxice, nefrotoxice, teratogene, anemiante, alergene, hiperestrogenice, leucopenizante etc. Bacterii din alimente tabel 181 manescu Dintre produsele alimentare, carnea este cea mai perisabil, deoarece prin coninutul bogat n substane nutritive, ofer un mediu favorabil pentru dezvoltarea bacteriilor, levurilor i fungilor filamentoi. n carnea consevat la frigider s-au evideniat numeroase genuri de microorganisme: Pseudomonas, Achromobacter, Proteus, Micrococcus, Flavobacterium, Aeromonas, Streptococcus, Alcaligenes Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Thamnidium, ?? Mucor, Rizopus, Cladosporium, Penicillim i Sporotrichum. Ayers (1960) a demonstrat c mirosul crnii alterate poate fi detectat atunci cnd numrul de microorgansime contaminante este cuprins ntre log. 7,0-7,5/cm2, iar modificarea consistenei suprafeei alimentului (mzga) apare atunci cnd numrul microorganismelor este de aprox log. 7,5-8/cm2. n cazul alimentelor cu suprafa

uscat sau a celor tratate cu antibiotice (tetracicline), alterarea se produce ca urmare a dezvoltrii cu preponderen a fungilor filamentoi. n procesul de alterare a crnii, la temperaturi de cca 20C sunt implicate bacterii mezofile i bacterii aerobe sporulate. Carnea de pasre alterat la temperaturi sczute este contaminat cu bacterii aparinnd urmtoarelor genuri: Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, ocazional lactobacili i micrococi; aceste microorganisme determin formarea unei pelicule la suprafa i un micros acid neplcut. Microbiota petelui proaspt este reprezentat predominant, de Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Corynebacterium, Clostridium, n microbiota petelui alterat predomin genurile Pseudomonas i Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, s.a. Legumele pot fi alterate de bacterii din genurile Erwinia, Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Lactobacillus, Bacillus, fungi filamentoi din genurile Botrytis, Geotrichum, Rhizopus. Coninutul ridicat de glucide i pH acid al fructelor favorizeaz dezvoltarea, n general, a levurilor (Sacharomyces i Torulopsis) i a fungilor filamentoi (Penicillium, Aspergillus, Boytrytis, Rhizopus, Alternaria, Cladosporium, Trichotecium). n general, oule sunt alterate de ctre bacterii din genurile Pseudomonas, Achromobacter, Proteus, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes, Salmonella, Micrococcus i fungi filamentoi: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum, Thamnidium, Mucor. Laptele i derivatele din lapte ofer, de asemenea, un mediu nutritiv bogat pentru dezvoltarea microorganismelor. n laptele netratat temic, depozitat la frigider timp de cteva zile, se dezvolt bacterii din genurile Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Mycobacterium, Micrococcus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas etc. Distrugerea bacteriilor saprobionte din lapte se realizeaz prin pasteurizare, proces care nu influeneaz viabilitatea sporilor bacterieni, fungici i nici bacteriile termofile. Brnza de vaci ofer un mediu nutritiv pentru dezvoltarea bacteriilor din genurile Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, dar i a fungilor Torulla, Geotrichum. Coninutul redus de ap al brnzeturilor maturate determin dezvoltarea fungilor filamentoi Penicillium. Mucor, Cladosporium, Geotrichum, Alternaria, Aspergilus i a levurilor Torulla, Rhodotorula, Debaromyces. Uneori au fost izolate i microorganisme anaerobe din genul Clostridium butyricum i C. sporogenes, fapt ce 6

evideniaz influena potenialului oxidoreducator sczut al unor brnzeturi maturate (cacaval, brnza telemea). Depozitarea alimentelor uscate de tipul cerealelor, finurilor i produselor de panificaie la o umiditate relativ crescut favorizeaz dezvoltarea fungilor filamentoi care pot produce micotoxine cu implicaii severe pentru sntatea consumatorilor. Exist de asemenea riscul ca aceste alimente s vehiculeze microorganisme patogene (Salmonella typhi, S. paratyphi, Vibrio cholerae, Shigella etc). 1.1.1. Toxiinfeciile alimentare produse de Staphylococcus aureus Bacteriile din genul Staphylococcus sunt coci Gram pozitivi, grupai n grmezi, aerobi, se dezvolt la 37C. Coloniile sunt rotunde, de dimensiuni mici (1-2 mm), de tip S, pigmentate alb-galben. Stafilococii fermenteaz glucoza fr producere de gaz, fermenteaz manitolul, lactoza, zaharoza etc., cu producere de acizi. Sunt catalazopozitivi, caracter care i difereniaz de streptococi. Laptele, produsele lactate, diferitele creme pentru prjituri, salatele, precum i preparatele din carne, n special carnea tocat, carnaii, pateul, unca, jambonul, carcasele de vit sau pui, conservele de carne sau pete reprezint medii favorabile pentru dezvoltarea stafilococilor. Pasteurizarea distruge stafilococii, dar nu i toxina preformata. Bacteriile se pot multiplica n laptele acidulat natural, laptele prins sau iaurt, iar datorit holotoleranei, se poate gsi i n telemeaua srat. Sursele de contaminare pentru alimente sunt reprezentate de bolnavi cu infecii cutanate, furuncule, panariii, eczeme, leziuni supurative, infecii ale cilor respiratorii i digestive cu stafilococi sau purtatorii sntoi de tulpini de S. aureus. Animalele bolnave sau purttoare de stafilococi pot reprezenta surse de contaminare a alimentelor, dar cu o pondere redus. 1.1.2. TIA produse de Salmonella sp

Aceste bacterii sunt bacili Gram negativi, variabili ca lungime, majoritatea mobile datorit flagelilor peritrichi (excepie face S. gallinarium-pullorum), fermenteaz glucoza i uneori produc H2S. Sursele majore de infecie sunt animalele, iar omul intr n circuitul epidemiologic prin contaminare n timpul prelucrarii, transportului, stocrii alimentelor, prin consumul crnii i preparatelor din carne (de pasare, porcine, ovine, pete, crustacei, molute), prin consumul oulor i al diverselor preparate cu ou, prin 7

consumul zarzavaturilor contaminate. Purttorul uman de Salmonella typhi i S. paratyphi A, B i C reprezint unica surs de infecie prin contact direct sau pe cale hidric i alimentar. 1.1.3. TIA produse de E. coli i Shigella Aceste bacterii sunt bacili Gram negativi, scuri, nesporulai, fermenteaz glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, reduc nitraii la nitrii, sunt mobile prin flageli peritrichi sau imobile. Sunt prezente pe plante, sol, n intestinul uman sau animal, reprezentnd componenta major a microbiotei umane intestinale. Cresc pe medii uzuale, formeaz colonii rotunde, convexe, netede. Pentru identificare se folosesc o serie de medii politrope: mediu TSI ( Triple Sugar Iron) pe care se evideniaz fermentarea glucozei/lactozei/zaharozei, producerea de acizi din glucoz cu/fr gaz, producerea de H2S, mediul MIU (Mobility Indole Urease) pe care se evideniaz mobilitatea, producerea de indol i ureaz, mediul MILF ( Mobility Indole Lysin-decarboxilase Phenylalanin-desaminase), pe care se evideniaz mobilitatea, producerea de indol, lizin-decarboxilaza, fenilalanindezaminaza. Specia E. coli este indicatorul sanitar cel mai frecvent folosit pentru aprecierea contaminrii fecale a alimentelor. Comitetul American National pentru Criteriile Microbiologice ale Alimentelor consider c specia E. coli este un indicator igienicosanitar principal pentru verificarea contaminrii fecale a carcaselor animalelor de mcelarie i ale psrilor din abatoare. Numeroasele tulpini de E.coli productoare de TIA au fost clasificate n patru grupe principale: Tulpini de E. coli enteropatogene (Enteropathogenic E. coli (EPEC) i EPEClike), care nu produc enterotoxine, cu excepia unor tulpini ce produc o cantitate mic de toxine Shiga-like, nu sunt invazive, ader la microvilozitile intestinale i le distrug. Serotipurile umane sunt O26:B6, O55:B5, O86:B7, O111:B4, O119:B14, O124:B77, O125:B15, O126:B16, O127:B8, O128:B12. Tulpini de E.coli enterotoxigene (Enterotoxigenic E. coli (ETEC) i ETEClike, care ader la nivelul enterocitelor prin intermediul fimbriilor i produc enterotoxine termostabile i/sau termolabile. Serotipurile umane sunt O6:H16, O8:H9, O15:H11, O25:H42, O78:H12, O120:H7, O120:H-.

Tulpini de E. coli enteroinvazive (Enteroinvasive E. coli (EIEC) i EIEC-like), care poseda plasmide de virulen, patrund n celulele epiteliale intestinale unde se si multiplica i sunt pozitive la testul Sereny (inoculare conjunctivala la cobai). Serotipurile umane sunt O28a.c, O112, O124, O136, O143, O144, O173.

Tulpini de E.coli enterohemoragice (Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) i EHEC-like), care produc cantiti mari de toxine Shiga-like, distrug microvilozitile intestinale ca urmare a aderenei bacteriilor la enterocite, posed plasmide de virulen. Serotipurile umane sunt O157:H7, O26:H11, O103:H2, O172:H?. Tulpinile ETEC- like patogene la animale produc diaree la animale nou-nscute

dar nu i la om datorit specificitii de gazd. Infeciile cu tulpinile de ETEC afecteaz n special sugarii i copii de 2-3 ani. Reprezint agentul etiologic cel mai frecvent al diareei cltorului la persoanele din rile dezvoltate, atunci cnd cltoresc i consum alimente n rile emergente cu clima tropical i subtropical. n rile dezvoltate, infeciile cu ETEC se produc dup consumul de ap sau alimente contaminate prin fecalele purttorilor. Mecanismele de patogenitate ale tulpinilor EPEC constau n capacitatea de aderen la microvilozitile intestinale, urmat de distrugerea acestora. Aceste tulpini reprezint una dintre principalele cauze ale diareei infantile n rile emergente, sursele fiind alimentele contaminate, precum i apa potabil contaminat cu fecalele bolnavilor sau purttorilor. Tulpinile de E. coli EIEC au fost izolate din conserve de pete, brnza Brie i Camembert (datorit contaminarii apei folosite la splarea echipamentelor), salata de cartofi (contaminat de un lucrtor). Au fost izolate, n principal, serogrupul O124 i mai rar O164. Tulpinile de EHEC produc un sindrom urologic foarte grav cunoscut n pediatrie sub denumirea de sindrom HUS (sindrom hemolitic i uremic). Numeroasele analize au condus la concluzia c alimentele care produc majoritatea episoadelor de TIA sunt cele de origine animal. Carnea de vit sub form de diverse preparate, netratate termic sau tratate insuficient, laptele crud, brnza proaspat sau iaurtul preparate din lapte nepasteurizat au contribuit la izbucnirea unor

TIA produse de tulpini de E coli O157:H7. Acest serogrup rezist n sucul de mere refrigerat i la pH mai mic de 4. Epidemii majore produse de tulpini de E coli O157:H7 au avut loc n SUA, n 1993, dup consumul de hamburgeri, n 1994, tot n SUA ca urmare a consumului de salam crud de porc. Cea mai recent epidemie de TIA cu tulpini de E coli O157:H7 a avut loc, n anul 2011, n Europa. Sursa de contaminare a alimentelor cu tulpini de Shigella, o constituie omul bolnav sau purttorul cronic. Contaminarea se realizeaza n timpul prelucrrii sau manipulrii. n TIA produse de tulpini de Shigella au fost incriminate alimente de origine vegetal (salat, ceap verde), persoane contaminate, dar i apa contaminat cu reziduuri fecaloid-menajere, folosit la irigarea culturilor sau splarea legumelor naintea comercializrii. Carnea, produsele din carne, oule, laptele pot fi contaminate n timpul manevrelor de procesare sau manipulare. n literatura de specialitate, au fost citate, focare de dizenterie bacilar pe vase de croazier sau transport aerian. 1.1.4. TIA produse de Bacillus cereus Specia Bacillus cereus prezint morfologie de bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari, grupai n lanuri lungi, mobili, cu capete drepte, necapsulai, sporulai (spor ovalar, central, nedeformant). Dei au fost descrise numeroase episoade de TIA i incriminate o serie de alimente contaminate cu tulpini de B. cereus, analizele microbiologice au evideniat c orezul este cel mai frecvent implicat n producerea acestor TIA cu B. cereus. Alte produse alimentare ce pot fi contaminate cu tulpini B. cereus sunt laptele i produsele lactate, carnea tocat, mezelurile. Iminena TIA crete ca urmare a multiplicrii bacteriilor n alimentele preparate la temperaturi mai mici de 100oC i meninerea acestora la temperatura camerei pentru mai mult timp. B. cereus se gsete n stratul superficial al solului i pentru c este sporogen, poate uor contamina apa, plantele (cereale, legume) dar i animalele. 1.1.5. TIA produse de Clostridium Clostridium botulinum este un bacil Gram pozitiv, de dimensiuni mari, sporulat (endosporul este deformant), imobil, anaerob. Se dezvolt saprobiont pe materia organic vegetal i animal n descompunere, n sol i ape. C. botulinum este -hemolitic. Pe mediul Nagler n jurul coloniei formeaz un precipitat datorit descompunerii lecitinei, fermenteaz zaharurile cu producere de gaz, unele tulpini acidific laptele, altele coaguleaz laptele (coagulare dulce) genernd un aspect de 10

cheag alveolar. Reduce nitratul, fermenteaz glucoza, lactoza, manoza, sucroza etc. i lichefiaz gelatina. Lactoza din lapte este fermentat cu coagulare i producere de gaz, dar nu diger cazeina. Se izoleaz uor dintr-un amestec de microorganisme, prin incubare la 45oC (temperatura optim de cretere), avnd un timp scurt de generaie (8 min). Clostridium botulinum produce botulismul, care este considerat ca o infecie alimentar. Etiologia bacterian i natura toxic a acestei maladii s-a elucidat n 1895, cu ocazia unui focar de 50 de cazuri n Belgia, datorat consumului de jambon nepreparat termic (botulus, lb. latin = crnat). Ulterior s-au nregistrat cazuri de botulism provocat de contaminarea rnilor, botulism infantil datorat absorbiei toxinei produse de organisme toxigene care colonizeaz tractul intestinal al unor copii cu vrsta sub 1 an, datorit absenei unei microbiote stabile care n mod normal inhib germinarea sporilor ingerai. O surs de spori de C. botulinum este mierea. Botulismul este o maladie neurologic sever caracterizat prin paralizie flasc, ce afecteaz omul i diferite specii de animale. Se recunosc 3 forme de botulism, ca entiti clinice distincte: - botulismul clasic cauzat de ingestia toxinei preformate n alimente; - botulismul de plag cauzat de creterea bacteriei i toxigeneza n plag; - botulismul infantil cauzat de absorbia toxinei produs de bacteriile toxigene, care colonizeaz tractul digestiv al copiilor mai mici de un an. Botulismul este o toxiinfecie sau o intoxicaie cu repercursiuni neurologice ca urmare a aciunii neurotoxinei asupra sistemului nervos central. Maladia se manifest att la om ct i la alte mamifere. Psrile sunt rezistente. Pericolul principal l reprezint conservele, n special cele preparate n cas, deoarece conservanii utilizai n industria alimentar prezint i activitate antimicrobian. De asemenea, alimentele pot fi contaminate prin ap sau praf ce conin spori. Botulismul sugarilor apare ca urmare a consumului de miere contaminat. Tulpini aparinnd speciei C. perfringens pot fi izolate din toate alimentele n stare crud, dar i din cele preparate i pstrate la temperaturi de 20-57oC. C. perfringens (denumirea veche C. welchii), este component al microbiotei intestinale la om i animale i a tractului genital la 5% dintre femei. Sporii sunt rari i nu apar n culturile crescute pe mediile obinuite. Crete la temperaturi cuprinse ntre 20 i 50 oC, cu un optim la 45oC. Coloniile pe geloz-snge au contur dublu: o zon clar intern datorat toxinei i o zon extern neclar datorat toxinei (testul CAMP pozitiv) (fig.).

11

Fig. . C. perfringens aspectul culturii pe mediul .hemoliz dubl i testul CAMP pozitiv http://www.graphicshunt.com/health/images/ clostridium_perfringens).

C. perfringens produce 4 toxine letale majore (, , , (iota)), pe baza crora tulpinile se grupeaz n cele 5 tipuri toxigene: A, B, C, D, E. Alte 9 toxine minore (antigene solubile) pot avea rol n patogenez: , , k, , , , , eta i neuraminidaza. Enterotoxina poate cauza intoxicaii alimentare. Toxina- este toxina major din punct de vedere cantitativ, cu efecte letale, produs de tulpinile B i C de C. perfringens. Produce leziunile caracteristice enteritei necrotice la pacienii cu un nivel sczut al dietei proteice i al activitii proteazelor digestive, acestea fiind blocate de inhibitori prezeni n cartof, consumat tradiional n cantiti mari mpreun cu carnea de porc, cu rol de surs a agentului infecios, la srbtorile din Noua Guinee. Toxina- produs de tulpinile de tip B i D, este sintetizat ca protoxin (311 aminoacizi) cu toxicitate minim, convertit la forma activ, de peste 1000 de ori mai toxic dup clivarea proteolitic a secvenei N-terminale, sub aciunea proteazelor bacteriene sau a tripsinei. Activarea protoxinei corespunde ruperii legturii peptidice ntre aminoacizii 14-15 de la captul N i eliberarea peptidului de activare de 14 aminoacizi. Toxina lezeaz n primul rnd intestinul, producnd creterea permeabilitii peretelui intestinal, cu creterea nglobrii toxinei, care acioneaz sistemic i exercit efecte letale. Dup intrarea n circulaie produce hiperemie renal, edem pulmonar, exces de lichid pericardic. Tulpinile de C. perfringens pot produce enterotoxemia (consecutiv creterii accentuate a permeabilitii barierei intestinale, consecina fiind tranzitul unei cantiti crescute de toxine, din lumen, n mediul intern la om i animale), dup ingestia unui numr mare de celule vii sau dup ingestia alimentelor contaminate. Se multiplic n intestin, unde enterotoxina atinge repede un nivel suficient de crescut pentru a fi

12

absorbit n snge. Enterotoxemia este produs de enterotoxine, -toxin i toxina . Ultima mrete permeabilitatea intestinal, ceea ce permite absorbia rapid a toxinei din lumen. Are afinitate mare pentru esutul nervos i rinichi, unde produce edem i necroz. Enterotoxemia asociat cu intoxicaia alimentar produs de C. perfringens are un caracter particular, deoarece toxina nu se sintetizeaz n timpul creterii vegetative, ci numai n timpul sporulrii. Toxina se acumuleaz n sporangiul celular i se elibereaz numai dup liza celulei vegetative i dup eliberarea sporului matur. Toxina pare a fi o protein structural a nveliului sporal. n cele mai multe cazuri de intoxicaii alimentare, se consider c celulele vii de C. perfringens sunt ingerate odat cu alimentele, ajung n intestin, sporuleaz i se lizeaz elibernd enterotoxina. Argumentul major mpotriva toxinei preformate este c, n produsele alimentare, bacteria sporuleaz puin sau deloc. Tulpinile de C. perfringens care sintetizeaz toxina n cantitate mare sunt asociate cu enterita necrozant. Toxina produce paralizia local a micrilor intestinale, urmat de inflamaie, hemoragie, necroz gangrenoas focal, n special n jejun. Enterotoxina (CPE) este o protein oligomeric de 35 kDa, cu punctul izoelectric la pH 4,3, produs de tulpinile de tip A, C i D. Este un peptid cu 309 amioacizi, cu un grup sulfhidril liber. n anumite condiii CPE formeaz un complex de cca 155 kDa, care ar corespunde unui por ce altereaz permeabilitatea membranei. Activitatea enterotoxinei crete de cteva ori dup tratamentul cu tripsin. Tripsina cliveaz toxina, la dou situsuri, fiecare cu un rest de lizin, rezultnd dou peptide de 15 i respectiv de 10 aminoacizi. Toxina tripsinizat const dintr-o caten de 284 de aminoacizi i cele dou peptide asociate, care nu se separ de catena major dect n prezena SDS. Aminoacizii din regiunea 45116 sunt eseniali pentru activitatea toxinei, mediind interaciunea acesteia cu ocludina, o protein de 65 kDa situat la nvielul jonciunilor intercelulare strnse. Receptorii celulari pentru enterotoxina de C. perfringens sunt necunoscui. Modul de aciune al enterotoxinei de C. perfringens este asemntor cu al enterotoxinei holerice i al enterotoxinei de Staphylococcus sp.: produce creterea permeabilitii capilarelor, vasodilataie i creterea motilitii intestinale. Enterotoxina se leag de receptorii de suprafa ai celulelor epiteliale intestinale. Legarea este urmat de inseria ntregii molecule n membran, fr 13

internalizare. Se produce o schimbare brusc a fluxului ionic, care influeneaz metabolismul i sinteza macromoleculelor, crete nivelul Ca2+ intracelular, iar transportul apei, Na i Cl este inversat, de la absorbie spre secreie. Se pierde lichidul celular, ionii i moleculele de pn la 3,5 kDa. Toxina are activitate maxim n ileum, moderat n jejun i este inactiv n duoden. Identificarea se realizeaz prin inocularea produsului patologic pe mediu chopped meat ??-glucoz cu tioglicolat (pentru anaerobi) i pe geloz-snge. Cultura microbian rezultat se transfer pe mediu cu lapte. Coagularea cu producere intens de gaz n 24 ore este indicatoare pentru tulpinile aparinnd speciei C. perfringens (fig. ).

Fig. . Aspectul culturii de 48 de ore de C. perfringens pe mediu cu glbenu de ou (Nagler). Apariia precipitatului indic activitatea lecitinazic (http://www.websters-onlinedictionary.org/definitions/Clostridium perfringens).

Identificarea final const n evidenierea toxinei i neutralizarea ei n prezena anticorpilor specifici. 1.1.5. TIA produse de L. monocytogenes Sunt bacili Gram pozitivi (cu forme cocoidale, cocobacilare), aerobi, facultativ anaerobi, cu capetele rotunjite, neramificai, care pot fi dispui n lanuri, mobili, nesporulai, necapsulai. Cresc pe medii de cultur obinuite i medii mbogite cu ser, snge, glucoz, la 20-37C. Pe geloz-snge coloniile de tip S au 1-2 mm, sunt translucide, iar culturile au miros caracteristic de lapte acidulat. Listerioza este una dintre cele mai grave infecii de origine alimentar i cu frecven relativ mare. n formele neuro-meningeale, literatura de specialitate, citeaz

14

rate de mortalitate de 50%, n septicemii, de 32%, iar listerioza la femeile gravide determin deseori moartea ftului sau nou nscutului. Izvorul de infecie este mediul nconjurtor. Agentul infecios este transmis de animale i de produsele alimentare: legume proaspete, produse lactate nepasteurizate, pete, carne i produse din carne crud sau netratate corespunztor, oule. Transmiterea de la persoan la persoan este favorizat n comunitile cu deficiene de igien: spitale, centre pentru copii i btrni. 2. Controlul microbiologic al alimentelor S-a considerat c agenii patogeni care produc toxiinfecii alimentare, fiind microorganisme cu localizare intestinal, se propag direct sau indirect prin intermediul alimentelor contaminate n ciclul fecal-oral. Primul indicator de contaminare fecal utilizat a fost E. coli. nc din 1865, T. Smith, a propus un test de potabilitate a apei, fapt ce a marcat nceputul folosirii bacteriilor coliforme drept indicatori ai agenilor patogeni din ap, practic extins i apoi la alimente. 2.1. Recoltarea probelor n vederea analizelor de control microbiologic 2.1.1. Recoltarea probelor de carne Recoltarea probelor de carne se realizeaz n funcie de produsul alimentar: 1. carne n carcase i semicarcase: se recolteaz 2 cuburi de carne i grsime, unul de la suprafa i altul din profunzime, cu latura de aproximativ 8-10 cm i un os lung. 2. organele ntregi sau pri din acestea: minim 200g n pungi sau recipiente sterile. 3. carnea preambalat, carnea de pasre, specialiti de pasre: se recolteaz 1% din numrul pachetelor care alctuiesc lotul, nu mai puin de cinci pachete. 4. carnea de lucru (din ntreprinderile productoare): se recolteaz o prob de 500-1000g din fiecare lot dac acestea sunt uniforme n privinta caracterelor organoleptice. n caz contrar, lotul se mparte n 3 subloturi: cu caractere organoleptice normale, cu uoare modificri organoleptice, cu caractere organoleptice evident modificate, iar din fiecare sublot se recolteaz o prob de 500-1000g. 5. carnea tocat: se recolteaz 200-300 g / ambalaj, aproximativ 1% din numrul acestora (nu mai puin de dou i nu mai mult de cinci ambalaje).

15

6. preparate din carne: batoanele sau calupurile recoltate se secioneaz longitudinal, realizndu-se examenul organoleptic, cele dou jumti constituind proba i contraproba; din prob se recolteaz (de la mijloc i de la extremiti) 300-800g i se trimit la laborator. 2.1.2. Recoltarea probelor de conserve i semiconserve se realizeaz n funcie de mrimea lotului: conserve Mrimea lotului pn la 1000 1.001-5000 5001-10000 10.001-50000 50.001-150000 semiconserve Mrimea lotului pn la 1000 1.001-2000 1001-3000 3001-5000 Numr de recipiente analizate 2 4 6 8 Numr de recipiente analizate 2 5 10 20 30

2.1.3. Recoltarea probelor de lapte i produse din lapte Recoltarea din ferm se va efectua n recipiente sterile, din fiecare sfert in parte eliminand primele jeturi. Pentru depistarea mamitelor streptococice recoltarea se va realiza de la nceputul mulsului, pentru tuberculoz, de la sfritul mulsorii, pentru bruceloz de la mijlocul mulsorii. Lapte ambalat: n cazul recipientelor de peste 1 litru se recolteaz aseptic 250500ml lapte. Recoltarea probelor din lapte praf se face cu o sond steril, ndeprtndu-se stratul superficial (ancime de 5-10 cm), iar n cazul ambalajelor mici se recoltez 1% din lot, iar a celor mari, 10% din lot, realizndu-se o proba medie de 250g.

16

Recoltarea probelor de lapte concentrat se face din 5% din numrul ambalajelor care formeaza lotul; lotul este format din maxim 2000 litri lapte concentrat pentru ambalajele mari (bidoane, butoaie) i maxim 3000 litri pentru cutii. Recipientele se sterilizeaz prin flambare i se deschid cu un perforator steril, se recolteaz 25 g din care se cntresc aseptic 10 g, iar prima diluie se realizeaz cu citrat de sodiu 1,25%.

Recoltarea probelor de smntn: lotul este format din maxim 500 kg (n cazul ambalajelor de desfacere) i maxim 3000 kg la ambalajele de transport; n cazul smntnii ambalate n bidoane se deschid 5% din numrul acestora i se recolteaz 250g; n cazul ambalajelor de transport se recolteaz 1% din unitile de ambalaj.

Recoltarea produselor lactate acide: din ambalajele mici se recolteaz 1%, iar din cele mari 10% (cca 500 ml) n recipieni sterili adecvai. Recoltarea probelor de unt: cu ajutorul unei sonde speciale se recolteaz de la suprafa i din profunzime, cte 200 g din care se face o prob medie. Recoltarea probelor de ngheat se realizeaz pe loturi, lotul reprezentnd o arj de producie din acest sortiment. Recoltarea probelor de brnzeturi se face cu ajutorul unui cuit, cu sonde sau se pot recolta calupuri ntregi: pentru brnza telemea ambalat n butoaie se recolteaz un calup de la suprafa i un calup din profunzime, precum i 200300 ml saramur; brnza proaspt de vaci se recolteaz prin deschiderea a 10% din ambalajele care formeaz lotul; dac ambalajele sunt mari (bidoane, tvi) se preleveaz probe de la suprafa i din profunzime i se formeaz o prob medie din care se recolteaz 200-300 g care se trimit la laborator; dac ambalajele sunt mici (pachete de 300 g) se recolteaz 2% din numrul unitilor de ambalaj.

2.1.4. Recoltarea probelor de peste Se recolteaz de la mijlocul i din partea inferioar a ambalajului, n cazul n care acesta conine cel puin cte doi peti sau dou buci de pete. Dac ambalajele conin peste 1kg pete, se recolteaz o fie transversal de carne (200-500 g), care se ambaleaz n hartie cerat, se eticheteaz i se sigileaz pstrndu-se n loc uscat,

17

ntunecos i rece (maxim 8C). Probele se supun analizei, n cel mult 12 ore de la recoltare. Petele afumat (lot maxim 500 kg) se prelucreaz n acelai mod.

2.2. Condiiile de realizare a analizelor de control microbiologic Un laborator de control microbiologic al alimentelor trebuie s fie dotat corespunztor cu echipamente (hote cu flux de aer laminar, balane, frigidere (conservare esantioane), incubator, autoclav, etuv, omogenizator (pentru prepararea suspensiilor din produse solide), pH-metru, baie de ap sticlarie, reactivi pentru medii de cultur, precum si consumabile corespunzatoare. Dezinfecia suprafeelor din laborator se face nainte de nceperea analizelor i la finalizarea acestora, iar eficiena dezinfeciei se va verifica periodic prin recoltri cu tampoane sterile, de pe suprafeele de lucru i de pe perei. ncrcatura microbian a aerului va fi verificat, folosind metoda de contaminrii mediilor de cultura neselective, repartizate n plci Petri deschise. Proprietile eantionului influeneaz n mod direct rezultatul analizei. Prin urmare, eantioanele trebuie s fie reprezentative pentru produs, s nu fi suferit deteriorri sau modificri n timpul transportului sau depozitrii. Transportul eantionelor la laborator trebuie s se realizeze n condiii corespunztoare i ntr-un timp ct mai scurt. Depozitarea eantioanelor se va face la temperaturi corespunzatoare (conservele la temperatura ambiant, produsele proaspete sau refrigerate ntre 0 i +4C, produsele congelate sau puternic congelate la -18C, produsele pasteurizate i produse similare, ntre 0 i +4C. Pentru evitarea contaminrii eantioanele vor fi prelucrate n condiii de asepsie n hote cu flux laminar sau n vecinatatea flcrii becului de gaz, folosind instrumente sterile.

2.3. Pregtirea probelor in vederea examenului microbiologic al produselor alimentare Eantioanele trebuie depozitate corespunztor, protejate de lumina solar direct sau de alte surse de nclzire, iar analiza acestora trebuie s nceap ct mai curnd posibil dup recepia acestora. n cazul produselor congelate, decongelarea se realizeaz la frigider, dar nu mai mult de 24 ore.

18

Pregtirea eantionelor n vederea examenului microbiologic se va efectua n hota cu flux laminar, cu respectarea condiiilor de asepsie (suprafaa de lucru se cur cu un dezinfectant adecvat att nainte, ct i dup analiz). Dac eantionul de analizat are o consisten solid se cntresc 10 grame din eantion i se omogenizeaz n mojare sterile. Dac materialul de analizat, datorit consistenei, nu se poate omogeniza, se secioneaz n fragmente mici n condiii aseptice folosind foarfeci, pense. Se realizeaz o trirurare ct mai fin a produsului cu ajutorul pistilului i apoi se adaug 90 ml (40 ml) diluant. n acest mod se face omogenizarea diluarea probei n raport de 1/10 (1/5). Se realizeaz diluii seriale zecimale: 10-2, 10-3 s.a.m.d., iar 1 ml (0.5 ml) fiecare diluie se nsamneaz n 9 ml (4.5 ml) mediu de cultur. n cazul eantioanelor lichide (lapte, lapte concentrat, ap) se realizeaz diluii ca mai sus i se nsmneaz n medii de cultur corespunztoare. Eantioanele sub forma de pulbere fin (lapte praf, produse deshidratate din ou) se amestec cu diluantul sub agitare, n recipiente cu perle de sticl. Prima dilutie a produselor greu miscibile cu apa sau cu solutiile apoase (smantana, unt, margarina) cu puncte de topire relativ joase, se face prin topirea produsului cantarit si introdus in baloane cu cantitatea de diluant masurata, pe baie de apa cu temperatura de 40 - 45C, cu agitare, dilutiile urmatoare, realizandu-se de asemenea cu diluanti pre-nclzii la 40 - 45C. Pentru diluarea probelor de alimente se folosesc serul fiziologic peptonat si serul fiziologic. Pentru probele de lapte (crud, concentrat, praf) si de produse lactate, prima dilutie se va face cu solutii de citrat de sodiu 2%. Analizele microbiologice se fac conform procedurilor specifice pentru fiecare analiza. 2.1. Determinarea numarului total de bacterii Acest parametru se refera la cuantificarea numrului de microorganisme care se dezvolta in aerobioza, la 30oC, dupa incubare de 72 h 3 h. Principiul metodei: Se stabileste gradul de contaminare microbiana al probei de analizat prin incorporarea unei cantitati de proba in mediul solid si incubare la 30 oC0,1oC in 19

aerobioza. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la mililitru sau gram de produs in functie de produsul analizat (lichid sau solid). Medii de cultura si diluanti: - ser fiziologic - ser fiziologic peptonat - agar cu triptona- extract de levuri- glucoza (P.C.A.) Diluarea probei Se realizeaza schema de dilutii corespunzatoare produsului analizat Insamantarea: produsele lichide si fiecare dilutie obtinuta se lucreaza in doua replici, folosind doua placi Petri. In fiecare placa se repartizeaz aseptic cate 1 ml proba nediluata sau 1 ml din dilutiile decimale. In fiecare placa se toarna aproximativ 15 ml mediu nutritiv, topit si racit la 450,5oC, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului. Incubarea: la 301o C, 723h. Interpretarea si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor se face cu lupa sau cu ochiul liber, luand in considerare numai placile Petri care contin 15 300 colonii, iar cuantificarea rezultatelor se realizeaza cu ajutorul formulei de mai jos: c N= (n1+0,1n2) d N = numarul de microorganisme / gram sau pe mililitru c = suma coloniilor numarate in toate placile retinute n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii Rezultatul este exprimat sub forma unui numar cuprins intre 1,0 si 9,9 nmulit cu 10x pe mililitru sau gram de produs.

2.2. Determinare a numarului de levuri Principiu. Stabilirea gradului de contaminare cu levuri a unei probe de analizat prin insamantarea unei cantitati de produs in mediul gelozat. Se incubeaza mediul

20

insamantat in aerobioza timp de 3 zile, dupa care se numara coloniile vizibile de levuri tipice dupa morfologia macroscopica si se raporteaza la un gram (1 cm2) proba. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica peptonata - mediu Czapek-Dox cu clorhidrat de tetraciclina - mediu cu extract de levur-dextroz- cloramfenicol-agar Diuarea probei Determinarea se face pe proba ca atare si/sau din diluii zecimale ale acesteia. Obinerea dilutiilor A se vedea schema de dilutii specifice pentru fiecare produs n parte. Insamantarea Din proba omogenizata si/sau din fiecare dilutie pentru analiza, se preiau cu pipeta cte 1cm3 si se distribuie n cte doua placi Petri. n fiecare placa Petri se introduc cate 13+2 cm3 din mediul solid, topit si racit la 45+1oC. Continutul placilor Petri se omogenizeaza apoi se lasa n repaus pna la solidificare. Incubarea Dupa solidificare placile Petri cu mediul nsamntat se introduc la termostat cu capacul n jos la 25+1 oC timp de 5 zile. Confirmarea prezentei levurilor Dupa trei, patru si cinci zile de incubare se numara coloniile dezvoltate in fiecare placa Petri. Dupa cinci zile sunt retinute acele placi care contin sub 150 colonii. Daca este necesar, se face o examinare stereomicroscopic, pentru a diferentia, dupa morfologia lor, coloniile de levuri de cele de bacterii sau de fungi filamentoi. Calculul si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor de levuri dezvoltate pe ntreaga suprafata a mediului nsamntat se face cu ochiul liber, lundu-se n considerare numai placile Petri n care s-au dezvoltat ntre 15 si 150 colonii. Numarul de levuri pe gram sau mililitru se calculeaza cu ajutorul formulei de mai jos: C ( n1 +0,1 n2) d in care : C = suma coloniilor numarate in toate placile; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = dilutia cea mai mica.

21

Se rotunjeste rezultatul obtinut la doua cifre semnificative. Rezultaul se exprima ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 nmulit cu 10x. Daca nu exista nici o colonie in placile corespunzatoare suspensiei initiale, in cazul produselor solide, numarul de levuri pe gram de produs trebuie raportat ca fiind mai mic de 10. Daca in placile cu proba nu exista nici o colonie, in cazul produselor lichide, numarul de levuri pe mililitru produs se raporteaza ca fiind mai mic de 1. 2.3. Determinare a numarului de fungi filamentoi Principiu. Stabilirea gradului de contaminare cu fungi filamentoi a unei probe de analizat prin insamantarea unei anumite cantitati din produs intr-un mediu de cultura adecvat. Se incubeaza mediul insamantat in aerobioza timp de 5 zile, dupa care se numara coloniile tipice de fungi filamentoi dupa morfologia macroscopica si se raporteaza la un gram (1 cm2) proba. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica peptonata - mediu Czapek-Dox cu tetraciclina clorhidrica - mediu cu extract de levuri-dextroza-cloramfenicol-agar Diluarea probei Determinarea se face pe proba ca atare si/sau din dilutii zecimale ale acesteia. Insamantarea Din proba analizata omogenizata si/sau din fiecare dilutie se preiau cu pipeta cte 1cm3 si se distribuie n cte doua placi Petri. n fiecare placa Petri se introduc cate 13+2 cm3 din mediul solid, lichefiat si racit la 45+1oC. Continutul placilor Petri se omogenizeaza apoi se lasa n repaus pna la solidificare. Dupa solidificare, placile Petri cu mediul nsamntat se introduc n termostat cu capacul n jos la 25+1oC timp de 5 zile. Confirmarea prezentei fungilor filamentoi Dupa trei, patru si cinci zile de incubare se numara coloniile din fiecare placa Petri. Dupa cinci zile sunt retinute acele placi care contin sub 150 colonii. Daca este necesar, se executa o examinare microscopica, pentru a diferenia, dupa morfologia lor, coloniile de levuri de cele baccteriene sau de fungi filamentoi.

22

Calcularea si exprimarea rezultatelor Numararea coloniilor de fungi filamentoi dezvoltate pe ntreaga suprafata a mediului nsamntat se face cu ochiul liber, lundu-se n considerare numai placile Petri n care s-au dezvoltat ntre 15 si 150 colonii. Numarul de levuri pe gram sau mililitru se calculeaza dup formula de mai jos: C ( n1 +0,1 n2) d in care: C = suma coloniilor numarate in toate placile; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = dilutia cea mai mica. Se rotunjeste rezultatul obtinut la doua cifre semnificative. Rezultaul se exprima ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 inmultit cu 10x. Daca nu exista nici o colonie in placile corespunzatoare suspensiei initiale, in cazul produselor solide, numarul de levuri pe gram de produs trebuie raportat ca fiind mai mic de 10. Daca in placile cu proba nu exista nici o colonie, in cazul produselor lichide, numarul de levuri pe mililitru produs se raporteaza ca fiind mai mic de 1. 2.4. Determinarea numarului de bacteriilor coliforme Principiu. Se toarna in doua placi Petri mediul de cultura selectiv solid, impreuna cu o cantitate specifica din proba de analizat daca produsul initial este lichid, sau cu o cantitate specifica dintr-o suspensie initiala in cazul altor produse. Alte doua replici de placi Petri cu mediu de cultura selectiv solid sunt preparate in aceleasi conditii, folosind dilutii zecimale din proba de analizat sau din suspensia initiala. Placile Petri sunt incubate la 30C sau la 37C timp de 24 h. Coloniile caracteristice sunt numarate iar daca este necesar, numarul de colonii este confirmat prin testul fermentarii lactozei. Numarul de colonii pe mililitru sau pe gram din proba este calculat dupa numararea coloniilor caracteristice dezvoltate in placile Petri folosite (conform ISO 7218 ). Medii de cultura si reactivi - diluanti (ser fiziologic peptonat, apa peptonata tamponata, citrat de sodiu 2%); 23

- agar-cristal violet-rosu neutru-bila-lactoza (VRBL); - bulion-verde briliant-bila-lactoza (BBLV); Modul de lucru Recoltarea probelor si efectuarea dilutiilor se face conform SR EN ISO 6887-4 /AC2005 Inocularea si incubarea Se pregatesc doua placi Petri pentru proba lichida si/sau pentru fiecare dilutie aleasa. Se transfera cu o pipeta sterila 1 ml din produsul lichid sau dilutia adecvata in centrul fiecarei placi. Se foloseste o alta pipeta sterila pentru a inocula fiecare dilutie in placile Petri. Se distribuie aproximativ 15 ml de VRBL incalzit la 44-47 C, in fiecare placa Petri. Perioada de timp intre prepararea dilutiilor si momentul in care mediul este turnat in placile Petri nu trebuie sa depaseasca 15 minute. Inoculul se omogenizeaza cu atentie in mediul turnat si se lasa sa se solidifice, avand grija ca placile Petri sa fie plasate pe o suprafata orizontala rece. De asemenea, se pregateste o placa martor cu 15 ml mediu pentru verificarea sterilitatii mediului. Dupa completa solidificare, se toarna aproximativ 4 ml mediu VRBL, incalzit la 44- 47 C, pe suprafata mediului inoculat. Se lasa sa se solidifice conform descrierii de mai sus. Se intorc placile astfel preparate si se introduc n termostat la o temperatura de 37 C timp de 24 2 h. Nota. In cazul laptelui si al produselor lactate, temperatura de incubare este de 30 C. Numararea coloniilor Dupa perioada specifica de incubare, se selecteaza, daca este posibil, placile Petri care contin intre 10 si 150 de colonii. Se numara coloniile rosii purpurii cu un diametru mai mic de 0.5 mm (uneori acestea sunt inconjurate de o zona rosie de precipitare a bilei). Acestea sunt considerate ca fiind colonii tipice de coliformi si nu necesita o alta confirmare. De asemenea, se numara si se confirma coloniile atipice (de dimensiuni foarte mici ) si toate coloniile provenite de la produsele lactate ce contin glucide, altele decat lactoza, imediat dupa perioada de incubare a placilor Petri. 24

Metabolizarea glucidelor, altele decat lactoza, se evidentiaza prin aparitia coloniilor cu un aspect similar coliformilor tipici. Nota. Aparitia unei zone rosii de precipitat a bilei in jurul coloniilor depinde de tipul coliformilor si de calitatea mediului. Confirmarea coloniilor dezvoltate Se selecteaza, daca este posibil, 5 colonii din fiecare tip de colonie atipica si se insamanteaza in tuburi cu BBLV (bulion-verde briliant- bila- lactoza). Se incubeaza eprubetele la 37oC timp de 242h. Se sconsidera pozitive eprubetele in care se acumuleaza gaz in tuburile Durham. Se retin rezultatele pentru introducerea lor in formula de calcul. Exprimarea rezultatelor Cazul general. Calculul numarului de bacterii coliforme identificate pentru fiecare placa selectata: -se calculeaza, pentru fiecare placa, numarul de bacterii coliforme, conform formulei: bnc a = Cc + --------- x cnc Anc In care: Cc- numarul total de colonii tipice identificate pe placa; Anc numarul de colonii atipice supuse testului; bnc- numarul de colonii atipice confirmate; cnc- numarul total de colonii atipice identificate pe placa; -se rotunjeste rezultatul la un numar intreg (conform ISO 7218). Calculul numarului N de bacterii coliforme prezente in proba Pentru placile care contin maxim 150 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii consecutive, se calculeaza numarul de bacterii coliforme pentru fiecare placa si se calculeaza, ca o medie ponderata din doua dilutii succesive, numarul N de bacterii coliforme identificate, prezente in proba, folosind urmatoarea formula: a N = ------------------------

25

V (n1 + 0.1 n2) d In care: a suma coloniilor de bacterii coliforme identificate pe toate placile selectate; V- volumul de inocul aplicat pe fiecare placa, in ml; n1- numarul de placi selectate la prima dilutie; n2 numarul de placi selectate la a doua dilutie; d factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie selectata (suspensia initiala este o dilutie). Rezultatul calculat se rotunjeste la doua cifre semnificative (conform ISO 7218). Rezultatele se raporteaza ca numar de bacterii coliforme / mililitru (produse lichide) sau /gram (alte produse), exprimat ca un numar cuprins intre 1.0 si 9.9 inmultit cu 10x. 2.5. Determinare a numarului de colonii Escherichia coli glucuronidaz-pozitive Principiu. Proba diluata se inoculeaza pe placi cu mediu TBX incubat la 44 +/- 1oC, timp de 18-24 h, dupa care se examineaza pentru prezenta coloniilor specifice caracteristice E. coli glucuronidaz- pozitive, care se numara si se raporteaza pe gram sau ml de produs. Medii de cultura si reactivi - solutie salina fiziologica pepetonata pentru diluii; - mediu TBX ( mediu cu triptona bila glucuronid). Pregatirea esantionului pentru analiz Pregatirea esantionului pentru analiza se face conform standardului specific al produsului examinat. Daca nu exista standarde internationale specifice, se recomanda ca partile interesate sa se puna de acord asupra acestui punct. Diluarea. Dilutia initiala si dilutiile succesive ale probei de analizat se realizeaza conform ISO 6887 si standardului international specific al produsului respectiv. Inocularea Folosind pipete sterile se distribuie in placa Petri 1 ml din proba de analizat daca este lichida sau 1 ml din dilutia initiala ( 10-1) din proba de analizat daca este solida. Se inoculeaz doua placi pentru fiecare dilutie. Se repeta procedura pentru urmatoarele dilutii daca este necesar, folosind pipete sterile pentru fiecare dilutie. In fiecare placa Petri se distribuie cate 15 ml mediu TBX, racit anterior la 44 -47 C pe baie de apa. Se omogenizeaza cu grija inoculul cu mediul de cultura, dupa care placile se lasa la solidificat pe o suprafata perfect orizontala.

26

Timpul scurs intre adaugarea mediului peste inocul nu trebuie sa depaseasca 15 minute. Incubarea: Dupa solidificarea mediului, placile Petri inoculate se incubeaza la 44 C, timp de 1824 ore. Daca se suspecteaza prezenta celulelor stresate ??, placile se incubeaza initial 4 ore la 37C si apoi se mareste temperatura de incubare la 44 C, timp 18-27 h. Temperatura de incubare nu trebuie sa depaseasca 45 C. Numararea unitatilor formatoare de colonii (UFC) Dupa incubare se iau in considerare pentru citire placile ce contin mai mult de 15 colonii si cel putin 150 colonii tipice sau/ si 300 de colonii totale (tipice sau atipice) de E. coli glucuronidaz-pozitive. Formula de calcul a numarului de UFC de E. coli prezente in proba a N = V (n1+0,1n2)d N = numarul de UFCde E. coli glucuronidaza pozitive pe gram sau pe ml; a = suma UFC numarate pe toate placile retinute din dilutii succesive, din care cel putin o placa contine 15 colonii; n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie; V = volumul de inocul in ml folosit la fiecare placa; n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie; d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii. Se raporteaza numarul intreg de elemente semnificative (colonii caracteristice daca sunt sub 100) sau ca numar intre 1.0 si 9.9 inmultit cu 10x. Estimarea incarcaturii minime a probei Daca cele doua placi Petri ale dilutiei contin mai putin de 15 UFC, numarul de UFC de E. coli glucuronidaza pozitiva se calculeaza dupa formula: c NE = Vnd c= suma coloniilor albastre dezvoltate in cele 2 placi Petri ale dilutiei; V = volumul de inocul in ml pentru fiecare placa; n = numarul placilor retinute per dilutie; d = factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie; Se rotunjesc rezultatele.

27

Exprimarea rezultatelor Estimarea numarului de UFC de E. coli glucuronidaz-pozitive / ml sau pe gram. NE = Y Daca placile Petri nu contin nici o colonie albastra de E. coli glucuronidazpozitive, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d E. coli, unde d este factorul de dilutie al suspensiei initiale sau prima inoculata sau dilutia retinuta (b= 1 in cazul in care proba direct incoculata este retinuta pentru produsele lichide). Daca numarul total de colonii tipice si atipice E. coli din cele doua placi ale primei dilutii d1 este mai mare de 300, cu UFC albastre vizibile si daca cele doua placi ale dilutiei d2 contin mai putin de 300 de colonii, cu nici o colonie albastra, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d 2 si mai mult de 1/d1 E. coli glucuronidaza pozitiva pe ml sau pe gram, unde d1 si d2 sunt factorii de dilutie care corespund dilutiilor d1 si d2. Daca numarul total de colonii tipice si atipice de E. coli din cele doua placi ale primei dilutii d1 este mai mare de 300, fara UFC albastre vizibile si dac cele doua placi ale dilutiei d2 contin mai putin de 300 de colonii si nici o colonie albastra, rezultatele se exprima astfel: mai putin de 1/d2 UFC de E. coli glucuronidaz-pozitive / ml sau pe gram, unde d2 este factorul de dilutie ce corespunde dilutiei d2. Cazuri speciale Cand numarul de UFC albastre este mai mare de 150 la prima dilutie d 1 si sub 15 la dilutia d2: daca numarul de UFC albastre de pe fiecare placa a primei dilutii este cuprins intre 150 si 167 calculul se face ca pentru cazul general; daca numarul de UFC albastre de pe fiecare placa a primei dilutii este mai mare de 167 pentru rezultat se ia in considerare numai numarul de colonii de la dilutia d2; cnd numarul de UFC albastre de pe fiecare din cele doua placi ale fiecarei dilutii este mai mare de 150, exprimarea rezultatelor se va face astfel: mai mult de 150/d E. coli glucuronidaz-pozitive / ml sau pe gram, unde d este factorul de dilutie de la ultima dilutie inoculata. cnd numai cele doua placi ale celei mai mici dilutii (cea mai mare densitate) contin mai putin de 150 de colonii tipice, calculul numarului de E. coli se face folosind urmatoarea formula : 28

c N= Vnd In care: c= suma de UFC albastre numarate in cele doua placi, din care cel putin una contine minim 15 colonii tipice CFU; V = volumul de inocul in ml pentru fiecare placa; n = numarul placilor retinute (n= 2 in acest caz); d = factorul de dilutie care corespunde dilutiei retinute 2.6. Cuantificarea stafilococilor coagulazo-pozitivi Principi. Insamintarea pe suprafata unui mediu selectiv solid a unei cantitati din proba, urmata de incubarea mediului selectiv la 35 0,5C sau la 37 0,5C, 24 - 48 ore. Calculul numarului de S. aureus /ml sau g se face pornind de la numarul de colonii caracteristice si/sau necaracteristice care se dezvolt in placile alese la nivelurile de dilutii sau din rezultate semnificative si care se confirma prin proba coagulazei. Medii de cultura si reactivi - diluant: ser fiziologic, ser fiziologic peptonat 1%; - mediu gelozat Baird Parker; - bulion de inima creier; - plasma de iepure; Realizarea dilutiilor de lucru Recoltarea probelor si scara de diluii se fac conform metodei descrise pentru fiecare produs. Inocularea Cu o pipet steril se transfer 0.1 ml proba lichid sau 0.1 ml din suspensia initiala (dilutie 10-1) in cazul celorlalte produse, pe fiecare din cele doua placi cu agar BairdParker. Se repeta procedura pentru dilutia 10 -2 si pentru urmatoarele dilutii, daca este cazul. Daca, pentru anumite produse, se doreste stabilirea celui mai mic numr de stafilococi coagulazo-pozitivi, limita de detectare poate fi marita cu un factor de 10 prin inocularea a 1.0 ml de proba lichid sau 1.0 ml din suspensia initiala pentru celelalte produse, fie pe suprafata unei placi mai mari de agar (140 mm), fie pe suprafata a trei

29

placi mici de agar (90 mm). In ambele cazuri, se pregatesc duplicate prin folosirea a doua placi mari sau a sase placi mici. Se distribuie inoculul, cat mai repede posibil, pe suprafata placii de agar, fara a se atinge marginile placii, folosind pulverizatorul sau bagheta de sticla in forma de crosa de hochei. Se lasa placile inchise sa se usuce cca 15 minute la temperatura laboratorului. Incubarea Se intorc placile pregatite cu capacul in jos si se incubeaza timp de 242 ore apoi se reincubeaza din nou 242 h in incubator la 35oC si la 37oC. Selectarea placilor si interpretarea rezultatelor Dupa incubare timp de 242 ore, se marcheaza pe dosul placii pozitia fiecarei colonii tipice prezente (a se vedea nota 1). Se reincubeaza toate placile la 35oC si la 37oC pentru inca 242 h si se marcheaza orice colonie tipica nou aparuta. De asemenea, se marcheaza orice colonie atipica prezenta (a se vedea nota 1). Se considera pentru numarare numai acele placi (a se vedea nota 2) care contin maximum 300 colonii din care 150 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii succesive. Una dintre placile selectate trebuie sa contina cel putin 15 colonii. Se selecteaza pentru confirmare un anumit numar A (in general 5 colonii tipice daca exista numai colonii tipice sau 5 colonii atipice daca exista numai colonii atipice sau 5 colonii tipice si 5 colonii atipice daca ambele tipuri de colonii sunt prezente, de pe fiecare placa). Daca sunt prezente mai putin de 15 colonii tipice si/sau atipice pe placile inoculate cu produs lichid nediluat sau cu cea mai mica dilutie pentru celelalte produse, se poate face o numarare estimativa. Nota 1. Coloniile tipice sunt negre sau gri, stralucitoare si convexe (intre 1 mm si 1.5 mm in diametru dupa incubare timp de 24 ore si intre 1.5 mm si 2.5 mm in diametru dupa incubare de 48 ore) inconjurate de o zona clara, care poate fi partial opaca. Dupa incubare de cel putin 24 ore poate s apar in aceasta zona clara, un inel opalescent, in contact cu coloniile. Coloniile atipice pot prezenta una din urmatoarele caractere morfologice: a) colonii stralucitoare negre cu sau fara margine ingusta alba; zona clara este absenta sau slab vizibila si inelul opalescent este absent sau greu vizibil. b) Colonii gri fara zone clare. 30

Coloniile atipice sunt formate in principal de tulpini de stafilococi coagulazo-pozitivi care contamineaza produsele lactate, crevetii si organele de pasare si mult mai rar, alte produse. Nota 2. Alte bacterii pot forma colonii cu aspect asemntor coloniilor de stafilococi, necesitand examinarea microscopica prin coloratie Gram, inainte de confirmare. Daca 1.0 ml inocul a fost repartizat in trei placi, se trateaza aceste trei placi ca una in toate numararile si procedurile de confirmare ulterioare. Pentru a face o estimare a numarului celui mai mic de stafilococi coagulazo-pozitivi, se retin toate placile care contin colonii tipice si atipice. Se selecteaza toate acele colonii pentru confirmare intre limitele descrise mai sus. Confirmarea (testul coagulazei) De pe suprafata fiecarei colonii selectate se preleveaza inocul cu o ansa sterila si se transfera intr-o eprubeta sau sticla cu mediu infuzie ?? de creier-inima. Se incubeaza la 35oC si la 37oC timp de ( 242 ) h. Se adauga aseptic 0.1 ml din fiecare cultura la 0.3 ml plasma de iepure (daca nu sunt specificate de producator alte cantitati) in eprubete sau sticle de hemoliza sterile si se incubeaza la 35oC si la 37oC. Prin inclinarea eprubetei se examineaza coagularea plasmei dupa incubare de 4 - 6 ore si, daca testul este negativ, se reexamineaza la 24 ore de incubare sau se examineaza la timpii de incubare precizati de producator. Se considera testul coagulazei pozitiv daca volumul de plasam coagulat ocup mai mult de jumatate din volumul initial al lichidului. Controlul negativ. Pentru fiecare lot de plasm, se adaug 0.1 ml infuzie sterila creierinima la cantitatea recomandata de plasma de iepure si se incubeaza fara inoculare. Pentru ca analiza sa fie validata, plasma controlata nu trebuie sa prezinte semne de coagulare. Exprimarea rezultatelor Cazul general: calculul numarului de stafilococi coagulazo-pozitivi identificati pentru fiecare placa selectata. Se calculeaza, pentru fiecare placa, numarul a de stafilococi coagulazopozitivi, conform formulei:

31

bc bnc a = --------- x Cc + --------- x cnc Ac Anc In care: Ac numar de colonii tipice supuse testului coagulazei; Anc numar de colonii atipice supuse testului coagulazei; bc numar de colonii tipice coagulazo-pozitive; bnc- numar de colonii atipice coagulazo-pozitive; cc- numar total de colonii tipice numarate pe placa); cnc- numar total de colonii atipice numarate pe placa. Se rotunjeste valoarea obtinuta la un numar intreg (conform ISO 7218). Calculul numarului N de stafilococi coagulazo-pozitivi prezenti in proba Pentru acele placi care contin maxim 300 colonii tipice si/sau atipice la doua dilutii consecutive, se calculeaza numarul de stafilococi coagulazo-pozitivi pentru fiecare placa si apoi se calculeaza, ca o medie ponderata din doua dilutii succesive, numarul N de stafilococi coagulazo-pozitivi identificati, prezenti in proba, folosind urmatoarea formula: a N = -----------------------V (n1 + 0.1 n2) d In care: a suma coloniilor de stafilococi coagulazo-pozitivi identificate pe toate placile selectate; V- volumul de inocul aplicat pe fiecare placa, in ml; n1- numarul de placi selectate la prima dilutie; n2 numarul de placi selectate la a doua dilutie; d factorul de dilutie care corespunde la prima dilutie selectata (suspensia initiala este considerata o dilutie). Rezultatul calculat se rotunjeste la doua cifre semnificative (conform ISO 7218). Rezultatele se raporteaza ca numar de stafilococi coagulazo-pozitivi pe ml (produse lichide) sau pe gram (alte produse), exprimat ca un numar intre 1.0 si 9.9 nmulit cu 10x. Estimarea dilutiei celei mai mici Daca cele doua placi care corespund probei (produse lichide) sau suspensiei initiale (alte produse) contine fiecare mai putin de 15 colonii identificate, rezultatele se raporteaza dupa cum urmeaza: a) Pentru produse lichide, numarul estimat de stafilococi coagulazo-pozitivi pe ml: a Na = -------------Vx2

32

In care: a suma coloniilor de stafilococi coagulaza-pozitive identificate pe cele doua placi selectate; V volumul aplicat pe fiecare placa. b) Pentru alte produse, numarul estimat de stafilococi coagulazo-pozitivi pe gram: a Ne = --------------Vx2xd In care: a suma coloniilor de stafilococi identificate coagulazo-pozitive (IV.5.1.1.) pe cele doua placi selectate; d factorul de dilutie a suspensiei initiale; V volumul aplicat pe fiecare placa. Daca cele doua placi, care corespund probei (produse lichide) sau suspensiei initiale (alte produse) nu contin nici o colonie de stafilococi coagulazo-pozitivi si daca inocularea a fost efectuata cu 0.1 ml proba, se raporteaza rezultatele dupa cum urmeaza (cazul general de 0.1 ml inocul): mai putin de 10 stafilococi coagulazo-pozitivi pe mililitru (produse lichide); mai putin de 10/d stafilococi coagulazo-pozitivi pe gram (alte produse), unde d este factorul de dilutie a suspensiei initiale. Daca inocularea a fost facuta cu 1 ml de proba, rezultatul se raporteaza dupa cum urmeaza: mai putin de 1 stafilococ coagulazo-pozitivi pe mililitru (produse lichide); mai putin de 1/d stafilococ coagulazo-pozitivi pe gram (alte produse).

2.7. Cuantificarea clostridiilor sulfit-reducatoare Principiul metodei: Punerea in eviden a clostridiilor sulfit-reducatoare din produsele alimentare se bazeaza pe capacitatea lor de a reduce compuii oxidai ai sulfului, cu formarea hidrogenului sulfurat (H2S), care reacioneaz cu ionii de fier (Fe2+) din mediu si formeaza sulfura feroasa (FeS) care coloreaza n negru coloniile si mediul de cultura din jurul lor. Mediile pe care se cuantific aceste bacterii trebuie sa conin compui

33

ai sulfului (cisteina, cistina, sulfit de sodiu) si indicatori pentru decelarea hidrogenului sulfurat, cum sunt sarurile de fier. Medii de cultura -bulion VF cu acid tioglicolic si albastru de metilen; -agar cu sulfit; -agar cu sulfit de sodiu, polimixina B si neomicina (TSN); - agar 2 %. Modul de lucru Proba ca atare si/sau diluiile ei se inoculeaza in cantitate de 1 ml, in cte 3 eprubete pentru fiecare dilutie n profunzimea mediului VF cu acid tioglicolic si albastru de metilen. Not. Pentru condiia gram produs se inoculeaza 1 ml din proba lichida nediluata sau cate 10 ml din dilutia 1/10, pentru probele solide. Inainte de nsmnare, mediul repartizat se regenereaz timp de 10 minute la 100o C. Incubarea. Mediile insamanate se incubeaza la 35 0,5o C, timp de 1-3 zile, in functie de intensitatea cresterii. Interpretarea rezultatelor Cresterea se apreciaza prin gradul turbiditii si prin examen bacterioscopic (prezena bacililor Gram pozitivi). Din fiecare eprubeta n care se observa crestere se fac treceri pe mediul DRCA sau pe agar cu sulfit de sodiu si citrat feric, care se incubeaza la 35 o C timp de 5 zile, examinandu-se zilnic pentru a depista nnegrirea mediului, care indica prezenta clostridiilor sulfit-reducatoare. Mediul se toarna lichefiat si racit la 47 - 50 C, astfel ncat sa ocupe din volumul eprubetei. Se omogenizeaza inoculul in mediu prin 8-10 miscari de rotatie a eprubetelor, intre palme, evitnd formarea bulelor de aer. Eprubetele se introduc imediat in pozitie verticala intr-un vas cu apa rece, pana la solidificarea mediului. Dupa solidificarea mediului, in fiecare eprubeta se toarna deasupra coloanei de mediu nsmnat, agar 2 % in coloana de cca 2 cm. Interpretarea si exprimarea rezultatelor Numarul de clostridii sulfit-reducatoare pe gram produs se stabileste n functie de numarul de eprubete pe fiecare serie de dilutie care au dat reactii pozitive si confirmate pe mediul solid conform tabelului din anexa. 34

2.8.

Cuantificarea bacteriilor din genul Salmonella

Cuantificarea salmonelelor comporta 4 faze succesive: prembogirea, mbogirea, izolarea si identificarea si confirmarea. Materiale si aparatur -balanta tehnica -microscop cu obiectiv cu imersie 90 x sau 100 x si ocular 10 x -termostat reglabil la 370,5o C -termostat reglabil la 420,5o C -vase Erlenmeyer sterile a 200-300 ml -eprubete 10/100 mm si 16/160 mm, sterile -placi Petri cu diametrul de 10 cm, sterile -lame de sticla degresate -ansa bacteriologica -omogenizator electric sau mojare sterile -pungi de plastic sterile -foarfece, pense, spatule -vata -alcool Medii de cultura si reactivi - apa peptonata tamponata - mediul Rappaport-Vassiliadis cu soia (bulion RVS) - bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocina (bulion MKTTn) - agar xiloza-lizina-dezoxicolat (agar XLD). - agar Istrati-Meitert (agar cu bila) - agar nutritiv - agar cu citrat de fier, trizaharat (agar TSI) - mediul cu uree (Christensen) - mediul cu lizina - agar nutritiv semisolid - reactiv pentru evidentierea galactozidazei, discuri de hartie gata preparate - reactiv Kovacs

35

- reactivi pentru reactia Voges Proskauer - solutie salina fiziologica Antiseruri aglutinante polivalente O si de grupO, antiseruri Vi. Prembogirea in mediul neselectiv lichid nsmnarea probei n apa peptonata tamponata, urmata de incubare la 371o C timp de 18 2 h. Imbogirea n medii selective lichide Se utilizeaza mediu Rappaport-Vassiliadis modificat (bulion RVS) si bulionul MullerKauffmann tetrationat/novobiocina (bulion MKTTn), care se nsmneaza cu cultura de preimbogire. Bulionul RVS se incubeaza la 41,5 1o C timp de 24 3 h, iar bulionul MKTTn la 37 1o C timp de 24 h 3 h. Izolarea si identificarea Presupune inocularea celor dou medii de mbogire pe cte doua medii solide selective din care unul in mod obligatoriu este agar xiloza-lizina-dezoxicolat (agar XLD) . Agarul XLD se incubeaza la 37 1o C timp de 24 3 h. Al doilea agar selectiv se incubeaza conform recomandarilor fabricantului. Dupa incubare de 24 ore la 35 sau la 37o C mediile sunt controlate pentru prezenta coloniilor suspecte de Salmonella, dup caracteristicele prezente. Confirmarea coloniilor: repicarea coloniilor suspectate ca fiind Salmonella care se confirma cu ajutorul testelor biochimice si serologice adecvate.

36

Proba de analizat, 25g +225 ml apa peptonata la temperatura camerei

Incubare timp de 18 2 h la 37 1C

0,1 ml cultura + 10 ml bulion RSV incubare timp de 24 3h la 41,5 1 C

1 ml cultura + 10 ml bulion MKTTn incubare timp de 24 3 h la 37 1 C

Mediu XLD si incubare timp de 24 3 h la 37 1 C Colonii caracteristice: zona central neagr si o zona transparent luminoas de culoare rosiatic

Agar I.M. incubare timp de 24 3 h la 37 1 C Colonii caracteristice verzuialbastrui cu sau fr zon central neagr

De pe fiecare placa se testeaza o colonie caracteristic. Daca rezultatul este negativ, se testeaza alte 4 colonii.

Agar nutritiv Incubare timp de 24 3 h la 37 1 C

Confirmare metabolic

Confirmare serologic

Exprimare rezultate

37

Confirmarea metabolic Agar TSI Suprafata nclinata a agarului se nsmneaza in striuri in zig-zag, iar portiunea dreapta a mediului se nsmneaza prin nepare. Incubare la 37 1 C timp de 24 3 h. Se intrepreteaza schimbarile aparute in mediu, dupa cum urmeaza: a) coloana mediului -galbena - neagra .... ..... glucozo-pozitiva (fermentarea glucozei) formarea H2S - rosie sau neschimbata ... glucozo-negativa (nu fermenteaza glucoza) - bule de gaz sau fisuri n coloana de mediu .... fermentarea glucozei b) suprafata inclinata a mediului - de culoare galben ... fermenteaz lactoza si/sau zaharoza - de culoare neschimbata sau roie .... nu fermenteaza lactoza si nici zaharoza. Mediul TSI nsmnat cu tulpini tipice de Salmonella prezint suprafaa nclinata a mediului alcalina (roie) si coloana acida (galbena) cu formare de gaz si (90% din cazuri) formarea H 2S (innegrirea agarului). Dac tulpina de Salmonella izolat este lactozo-pozitiva, suprafata inclinata a mediului TSI este galben. De aceea, confirmarea preliminara a culturilor de Salmnella nu trebuie sa se bazeze exclusiv pe rezultatele testului pe agar TSI. -Agar uree Suprafata inclinata a medului se nsmneaza n striuri in zig-zag. Se incubeaza la 37 1 C timp de 24 3 h si se examineaza la diferite intervale de timp. Daca reacia este pozitiva, culoarea mediului vireaza la roz inchis si mai tarziu la rosu nchis. Reactia este adesea aparenta dupa 2 - 4 h. - Mediul cu L-lizina Mediul lichid se inoculeaza imediat sub interfata lichid-aer. Incubare la 37 1 C timp de 24 3 h. Dupa incubare, turbiditatea si culoarea purpurie indica 38

o reactie pozitiva. O coloratie galbena indica o reactie negativa. -Evidenierea -galactozidazei Coninutul unei anse din coloniile suspectate ca fiind Salmonella se suspend intr-o eprubeta care contine 0,25 ml solutie salina. n eprubet se adauga o picatura de toluen si se agita. Eprubeta se nclzete pe baie de apa la 37 C, timp de 5 minute. Se adauga 0,25 ml reactiv pentru detectarea -galcatozidazei si se amesteca. Eprubeta se renclzete pe baie de apa la 37 C si se lasa timp de 24 h 3 h, examinand eprubeta la intervale de timp. O culoare galbena indica o reacie pozitiv. Reactia este de obicei vizibila dupa 20 minute. Daca se folosesc discuri de hrtie, se respecta instructiunile productorului. - Mediu pentru reactia Voges-Proskauer Continutul unei anse dintr-o colonie suspectat se suspend intr-o eprubeta care contine 3 ml mediu VP. Incubare la 37 1 C timp de 24 3 h. Dupa incubare, se adauga doua picaturi de solutie de creatina, trei picaturi de solutie etanolica de 1-naftol si apoi doua picaturi de solutie de hidroxid de potasiu. Se agita dupa adaugarea fiecarui reactiv. Apariia unei coloratii roz pn la rosu stralucitor in interval de 15 minute indica o reactie pozitiva. - Mediu pentru reactia indolului O eprubeta care contine 5 ml mediu triptona/triptofan se inoculeaz cu o colonie suspectat ca fiind Salmonella. Se incubeaza la 37 1 C timp de 24 3 h. Dupa incubare se adauga 1ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rosu indica o reacie pozitiv. Un inel galben brun indica o reactie negativa. Tabelul... Interpretarea testelor biochimice pentru tulpinile de Salmonella

39

Test Glucoza, TSI (formare de acid) Glucoza, TSI (formare de gaz) Lactoza ,TSI Zaharoza,TSI Hidrogen sulfurat, TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenierea - galactozidazei Reacia Voges-Proskauer Formarea indolului Confirmare serologica

Reactie pozitiva sau negativa sau negativa + + + + -

Prezena anigenelor O ,Vi, sau H de Salmonella se evideniaz prin reacia de aglutinare pe lama cu serurile adecvate, din colonii pure si dupa eliminarea tulpinilor auto-aglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile: Pe o lama de sticla curata se depune o picatura de solutie salina. Cu ansa, se disperseaza o fractiune din colonia de testat, astfel nct sa se obtina o suspensie omogena. Se nclin lama, timp de 30 s- 60 s. Rezultatul se observ pe fond negru, de preferinta cu ajutorul unei lupe. Daca bacteriile se agrega, tulpina este autoaglutinabila si nu mai trebuie examinat pentru evidenierea antigenelor specifice. Evidentierea antigenelor O O parte a unei colonii ne-autoaglutinabila, se disperseaza ntr-o picatura de ser anti- O, astfel incat sa se obtina o suspensie omogena. Daca se produce aglutinarea, reacia este pozitiv. Se utilizeaza serurile poli- si monovalente, n succesiune, in functie de rezultate. Evidentierea antigenelor Vi Se procedeaza ca la punctul anterior, utilizand o picatura de ser anti-Vi, in locul solutiei saline. Daca se produce aglutinarea, reactia este pozitiva. Evidentierea antigenelor H

40

Agarul nutritiv semisolid se nsmneaz cu o colonie neautoaglutinabila. Incubare la 35 sau la 37 C, timp de 18 - 24 h. Cultura se utilizeaz pentru evidenierea antigenelor H, procedand ca la punctele anterioare: n locul solutiei saline, pe lam se depune o picatura de ser anti H. Daca se produce aglutinarea, reactia este pozitiv. Tabelul. Interpretarea reactiilor biochimice si serologice Reactii metabolice Tipice Autoaglutinare Nu Reactii serologice Antigene O, Vi sauH Tipice Nu pozitive Toate reactiile Tipice Lipsa reactiilor tipice Lipsa reactiilor tipice Confirmarea definitiv Tulpinile confirmate sau suspectate ca fiind Salmonella se trimit la un centru de referinta pentru determinarea definitiva a serotipului (INCDMI Cantacuzino). Exprimarea rezultatelor: In functie de rezultatele interpretarii, se indica prezenta sau absenta Salmonella, n x g sau ml. Nu Da Nu negative Neefectuate Antigene O,Vi sau H pozitive Toate reactiile negative Prezumptie diagnostic: Salmonella Infirmare diagnostic Salmonella. Confirmare diagnostic: Salmonella Interpretare

41

2.9.

Determinarea Bacillus cereus

Principiu. Pe suprafaa unui mediu selectiv solid repartizat n placi Petri, se nsmneaz un volum determinat din esantionul pentru analiz (daca produsul este lichid sau din dilutia initiala a altor produse), precum si din diluii zecimale ale eantionului. Dup incubarea in aerobioz, la 30 1o C timp de 18-48 h se calculeaz numarul de celule de Bacillus cereus / gram sau pe /ml de proba, pornind de la numarul de colonii caracteristice, confirmate prin analize specifice. Materiale si aparatura Balanta tehnica Microscop cu obiectiv de imersie (90 x sau 100 x) si ocular 10 x Termostat reglabil la 30 1o C Eprubete de 18/180 mm si flacoane de cultura, sterile Pipete gradate de diferite capaciti, sterile Placi Petri cu diametrul de 90 mm, 100 mm sau 140 mm, sterile Anse bacteriologice Mojar de portelan, cu diametrul de 10 cm, steril sau omogenizator electric Baghete de sticla sau material plastic, pentru etalare (in forma de L) Trusa de colorat, lame de sticla Foarfece, pense, spatule, sterile Vata, alcool

Reactivi si medii de cultura Soluii de diluare: Soluie fiziologic Solutie fiziologic peptonat Mediul agar-manita-galbenu de ou-polimixina (MYP- dupa Mossel) Mediul agar cu snge

Medii de cultura:

Diluarea probei. Se realizeaza schema de dilutii recomandata pentru produsul respectiv. nsmnarea. Cu o pipeta sterila se repartizeaza cte 0,1 ml esantion pentru analiza, daca acesta este lichid, sau din diluie iniial, pentru alte produse, pe suprafata mediului din doua placi Petri. Se repeta operatia pentru dilutiile decimale urmatoare.

42

Pentru anumite produse cu incarcatura microbiana redusa de B. cereus, limita de detectare poate fi marita cu un factor de 10, prin examinarea a 1 ml din proba lichida si a 1 ml din suspensia initiala pentru produse solide. Se distribuie 1 ml din inocul fie pe suprafata unei placi Petri mari (140 mm), fie pe suprafata a 3 placi Petri mici (90 mm). Cu ajutorul baghetei de etalare, se disperseaza inoculul, cat mai repede posibil, pe suprafata mediului, evitand atingerea marginilor placii. Se utilizeaza cate o bagheta sterila pentru fiecare placa. Se lasa placile acoperite cu capac, timp de 15 min. la temperatura camerei, pentru a permite absorbtia inoculului n agar. Se intorc placile cu capacul n jos si se incubeaza timp de 18-24 ore la temperatura de 30oC. Daca dupa acest interval, coloniile nu sunt vizibile, incubarea se continua inca 24 h. Numararea coloniilor Dupa perioada de incubare se retin placile cu mai putin de 150 colonii, pe cat posibil din doua dilutii succesive. Se numara in fiecare placa, coloniile suspectate ca fiind Bacillus cereus, care sunt mari, de culoare roz (nu fermenteaza manitolul) si aproape totdeauna inconjurate de o zona de precipitare (indicand producerea de lecitinaza). Daca in placile insamantate din produsul lichid sau din dilutia cea mai mica, sunt mai putin de 15 colonii caracteristice, se poate face o estimare. Confirmarea coloniilor Se aleg la intmplare 5 colonii suspecte din fiecare placa selecionat. Daca sunt mai putin de 5 colonii suspectate, se analizeaza toate coloniile dezvoltate. Daca s-au dezvoltat foarte multe colonii si nu este posibila selectarea unor colonii suspectate, bine izolate, se nsamneaza 5 colonii din acestea, prin tehnica epuizarii ansei, pe suprafata unor placi cu mediul MYP. Incubare la 30oC, timp de 18 24 h. Se alege pentru confirmare, din fiecare placa, cel putin o colonie bine izolata, de culoare roz. Confirmarea prin testul hemolizei Se repica cate o colonie selectata si se paseaza pe suprafata unei placi Petri cu agar cu snge de berbec. Incubare la 30o C, 24 2 h si se interpreteaza reactia hemolizei. Tabelul . Interpretarea testelor metabolice de identificare si confirmare

43

TEST MYP agar Reactia hemolizei

CONFIRMARE PREZUMTIV Bacillus cereus Colonii roz inconjurate de precipitat Reactie pozitiva

Interpretarea si exprimarea rezultatelor Dac cel puin 80 % din coloniile selectate sunt confirmate, se consider ca numar de celule de Bacillus cereus, cel obinut prin numrarea facuta conform 6.3. In toate celelalte cazuri, numrul de celule de B. cereus se calculeaza ca procent al celor care au fost confirmate, din numrul de colonii numrate. Calculul numarului in placile au crescut 15-150 colonii Numarul de microorganisme pe ml sau pe gram se calculeaza dup formula: a N = -------------------- , n care: V.(n1 + 0,1 n2)d V= volumul de inocul depus in fiecare placa exprimat n ml; = suma coloniilor caracteristice de B. cereus, numarate pe toate placile retinute; n1 = numarul de placi retinute la prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute la a doua dilutie; d = rata dilutiei celei mai mici. Estimarea numerelor mici Daca la cele doua dilutii alese, corespunzatoare esantionului pentru analiza sau dilutiei initiale, s-au dezvoltat sub 15 colonii, se face media coloniilor din cele doua placi, iar rezultatele se raporteaza sub forma: Numr estimat, NE, de microorganisme pe ml NE = m (produse lichide) Numar estimat, NE, de microorganisme pe gram NE = m/d (alte produse) in care d = rata de dilutie a suspensiei initiale. Daca cele doua dilutii alese, corespunzatoare esantionului sau dilutiei initiale, nu s-a dezvoltat nici o colonie, rezultatul se raporteaza sub forma : mai putin de un microorganism pe mililitru (produse lichide) mai putin de 1/d microorganisme pe gram (alte produse), d fiind rata dilutiei initiale.

44

2.10.

Analiza bacteriologic a conservelor alimentare n recipiente

nchise ermetic 2.10.1. Examinarea recipientelor (probe elementare) Se noteaza tipul si formatul recipientelor si, de asemenea, toate datele marcate pe recipiente sau nscrise pe etichetele acestora pentru identificarea produsului. Se scoate eticheta si se noteaz toate defectele de aspect exterior al recipientelor (rugina, deformari, bombarea fizica si biologica), inchidere necorespunzatoare, fisuri, scurgeri de continut etc. Se considera necorespunzatoare din punct de vedere microbiologic si se elimina din lucru, recipientele care prezinta bombaj biologic si inchidere necorespunzatoare, fisuri, scurgeri de continut. Examinarea interioara a recipientelor se efectueaza dupa incubare si dupa recoltarea probei pentru analiza microbiologica. Se verifica si se noteaza toate defectele interioare care pot influena salubritatea si conservabilitatea continutului (corodarea ambalajului, starea vernisului etc.) si de asemenea, aspectul i mirosul coninutului. 2.10.2. Incubarea probelor la termostat Aparatura necesara: termostate reglabile la 35 1; 45 1; 55 1 C. Modul de lucru Recipientele considerate corespunzatoare la examenul exterior, dupa indepartarea etichetei se curata la exterior si se incubeaz la termostat. Pentru incubarea n termostat sunt necesare minimum cinci recipiente: trei recipiente se introduc in termostat la 35 1 C timp de 14 zile, pentru punerea in evidenta a microorganismelor mezofile; doua recipiente se incubeaza n termostat, pentru evidentierea microorganismelor termofile, astfel: la 45 1 C, timp de 7 zile pentru recipientele din sticla cu capac de inchidere Omnia- Twist- off si pentru cele din material plastic (baghete, tuburi etc) ; la 55 1 C, timp de 5 zile pentru recipientele din tabla.

45

Recipientele care prezinta bombaj biologic si/sau scurgere de continut se scot din termostat, considerandu-se necorespunzatoare. La sfritul perioadei de incubare, recipientele se scot din termostat, se racesc la temperatura camerei si se supun examenului microbiologic. 2.10.3. Recoltarea probelor pentru analiza Condiii de lucru Deschiderea recipientelor, recoltarea probei pentru analiza si insamantarea mediilor de cultura se fac in boxe special amenajate, prevazute cu lampi bactericide, pentru evitarea contaminarii probei. Nota. In lipsa boxelor special amenajate, operatiile se fac in ncperi obisnuite de laborator cu ferestre si usi bine inchise, fara curenti de aer. nainte de inceperea lucrului, mesele se vor dezinfecta cu alcool si se vor pune in functiune lampile bactericide, timp de 30 minute. n incaperile destinate analizei microbiologice, accesul altor persoane este interzis. Materiale, instrumente, aparate si medii de cultura alcool vata hidrofila perforator metalic cu 10 20 mm steril dispozitiv de deschis placi, steril, cu decupare circulara pipete negradate, sterile, cu diametrul orificiului de 5 10 mm microscop cu obiectiv de imersie 90 x sau 100 x si ocular 10 x lame lamele ansa bacteriologica bulion nutritiv cu ficat (sau bulion tioglicolat) bulion simplu glucozat agar glucozat inclinat

Pregatirea recipientelor in vederea prelevarii probelor Recipientele care la sfritul perioadei de termostatare nu prezint bombaj biologic si/sau scurgeri de continut se pregatesc pentru operatiunea de deschidere si prelevare a probei pentru analiz, astfel: se curata si se degreseaza suprafata exterioara a recipientului; 46

se dezinfecteaza capacul cu alcool si se flambeaza (pe capacul netanat).

Deschiderea recipientelor Se realizeaza prin perforarea capacului netanat cu perforatorul metalic, care are avantajul de a protejza atat continutul recipientului, cat si pe operator. In timpul deschiderii recipientului, se indreapta flacara unui bec de gaz spre locul de deschidere, pentru sterilizarea aerului care poate patrunde in interiorul acestuia. Modul de recoltare al probei pentru analiza Din recipientul deschis se recolteaza cca 8 10 g de produs, cantitatea necesara pentru inocularea mediilor de cultura si examenului microscopic. Din produsele la care poate sa apara alterarea prin acrire fara bombaj se recolteaza o cantitate suplimentara de proba pentru analiz n vederea efectuarii testului cu purpur de bromcrezol (in cazul conservelor cu pH mai mare de 4,5 ) sau a verificarii valorii pH ( n cazul conservelor cu pH mai mic de 4,5). Testul cu purpur de bromcrezol Intr-o eprubeta curat se introduc cateva picaturi de solutie apoasa de 0,04 % de purpur de bromcrezol, peste care se adauga 56 ml din faza lichida a continutului recipientului. Continutul eprubetei se agita pentru omogenizare. Daca la adaugarea indicatorului culoarea continutului eprubetei vireaza in galben, se considera ca proba analizat prezinta semne de alterare prin acidifiere fara bombare. Insamantarea Din proba de analizat se nsmneaz mediile de cultura adecvate fiecarei grupe de microorganisme, mai nti cele pentru punerea in eviden a microorganismelor anaerobe, apoi cele pentru punerea in eviden a microorganismelor aerobe. Eprubetele cu mediile nsmnate se incubeaza la termostat la 35 1 C, pentru evidentierea bacteriilor mezofile, respectiv la 55 1 C, pentru evidentierea bacteriilor termofile. Examinarea culturilor In timpul perioadei de incubare, culturile microbiene insamantate se examineaza zilnic. Toate culturile microbiene aerobe mezofile se supun examenului microscopic in cazul in care, la acest examen, nu se identifica pe preparat forme sporulate de bacterii, ci doar bacterii nesporulate, se procedeaza astfel:

47

a) din culturile dezvoltate pe bulion glucozat insamantate direct din proba de analizat, se fac insamantari pe agar glucozat inclinat, care se incubeaza la temperatura de 35 1 C, timp de 24 ore, dupa care se face un examen microscopic. b) daca nu se observa prezenta sporilor bacterieni, eprubeta cu agar glucozat se pastreaza la temperatura camerei, timp de 48 ore, dupa care se examineaza microscopic. Dac nici in acest caz nu se observa spori bacterieni, se considera ca proba pentru analiza contine numai bacterii nesporulate. c) Eprubetele cu agar glucozat insamantate direct din probele de analizat, n momentul aparitiei semnelor de dezvoltare microbiana, se scot din termostat si se mentin la temperatura camerei, timp de 48 ore. Dupa aceasta se realizeaza preparate microscopice si se examineaza la microscop. Daca nu se observa spori bacterieni, se considera ca proba de analizat contine doar bacterii nesporulate. d) daca in recipientele cu medii anaerobe se observa crestere microbiana in profunzimea mediilor, dar pe mediile aerobe nu se constata cretere microbiana, se confirma prezenta bacteriilor anaerobe in proba analizata. Culturile termofile aerobe provenite dintr-o proba de analizat cu pH mai mare de 4,5 care au produs virarea culorii mediului de la rosu, la purpuriu la galben, indica prezenta bacteriilor de fermentaie acid fara bombare. Toate culturile termofile aerobe dezvoltate dintr-o proba de analizat cu pH mai mare de 4,5, indica prezenta bacteriilor acidifiere fara bombare. Interpretarea rezultatelor Dac la sfarsitul perioadei de incubare, niciuna din eprubetele cu medii de cultura insamantate nu prezinta semne de dezvoltare microbiana, se considera ca proba de analizat nu contine microorganisme reziduale vii. 2.11. i) Cuantificarea numarului celulelor de Listeria monocytogenes

Principiu. Numararea Listeria monocytogenes necesita sase faze succesive: prepararea suspensiei initiale in una din cele doua solutii de diluare: apa peptonata tamponata sau mediu de baza semi-Fraser;

48

ii) iii)

resuscitarea timp de 1 h, la 20o C; nsmnarea in striuri in zig-zag, pe suprafata mediului selectiv solid din doua placi Petri, a unei cantitati specificate din esantionul pentru analiza, in cazul produselor lichide sau din suspensia initiala, in cazul altor produse, precum si a dilutiilor zecimale;

iv) v) vi)

incubarea placilor la 35o C sau la 37o C si examinarea lor dupa 24 si 48 h; confirmarea coloniilor suspectate ca fiind Listeria monocytogenes; calculul numarului celulelor de Listeria monocytogenes pe baza numarului de colonii confirmate, pe gram sau pe mililitru de proba.

Aparatura si materiale - etuva (aparat pentru sterilizarea uscata) - autoclav (pentru sterilizarea umeda) - etuva pentru uscare sau termostat, meninute ntre 25o 1oC si 50 1oC - termostate pentru mentinerea mediilor inoculate, a placilor si eprubetelor in urmatoarele intervale de temperatura: a) 20 1oC b) 25 1oC c) 37 1oC - baie de apa, mentinuta la 44 47o C - anse bacteriologice, pipete Pasteur sau anse de unica folosinta - dispersoare de material plastic sau de sticla, sterile - pH-metru - eprubete sau flacoane - pipete gradate - placi Petri - microscop - balanta tehnica Medii de cultura si reactivi: apa peptonata tamponata bulion semi-Fraser cu citrat agar Listeria (Ottaviani si Agosti) agar cu snge de berbec bulion cu ramnoza bulion cu xiloza 49

 agar pentru testul de mobilitate Pregatirea dilutiilor de prob Pentru prepararea suspensiei initiale se foloseste bulion TSYEB, apa peptonata tamponata, agar TSYEA sau bulion semi-Fraser. Se lasa suspensia iniial n repaus 1h 5 min. la 20 2oC, n scopul resuscitrii microorganismelor stresate. Daca se foloseste o serie de dilutii, acestea se pregatesc dupa resuscitare. Inocularea si incubarea Se transfera cu ajutorul unei pipete sterile, cate 0,1 ml din suspensia initiala in doua placi cu mediu LISTERIA AGAR (Ottaviani si Agosti). Se repeta procedeul, folosind dilutiile urmatoare, daca este necesar. Inoculul se disperseaz, cat mai repede posibil, pe suprafata agarului din placa, fara a atinge marginile placii cu pipeta. Se foloseste o pipeta sterila pentru fiecare dilutie. Plcile inchise se las aproximativ 15 minute, la temperatura ambianta, pentru ca inoculul sa fie absorbit in agar. Se intorc placile cu capacul in jos si se aseaza n termostat la 35 sau la 37oC. Numararea coloniilor caracteristice Dupa incubare timp de 24 de ore si o incubare suplimentar de 18 ore, daca dezvoltarea este slaba, sau absent, se examineaza plcile pentru prezenta coloniilor suspecte de Listeria spp. Se considera ca fiind L. monocytogenes coloniile verzi-albastrui inconjurate de un halou opac (colonii caracteristice). Daca cresterea este nesemnificativa, sau daca nu se observa nici o colonie, sau daca nici o colonie caracteristica nu este prezenta dupa 24 3 h de incubare, trebuie ca plcile Petri sa fie reincubate pentru nca 24 3 h. Nota 1. Unele tulpini de L. monocytogenes prezinta un halou slab (uneori lipsete) in cazuri de stres, n special stresul generat de un mediu acid. Nota 2. Unele tulpini de L. monocytogenes sunt caracterizate prin activitatea PIPLC redusa (fosfatidul inozitol fosfolipaza C), mai ales cand perioada totala de incubatie este mai mare de 4 zile. Unele dintre aceste tulpini pot fi patogene. Se numara coloniile suspectate ca fiind Listeria spp. din fiecare placa care contine mai putin de 150 colonii caracteristice sau necaracteristice. Selectarea coloniilor pentru confirmarea Listeria spp. a) Dupa perioada de incubare (24 h), se retin placile care contin mai putin de 150 50

colonii suspectate ca fiind Listeria spp, din toate dilutiile si, daca este posibil, la doua dilutii succesive. Se aleg cinci dintre coloniile suspectate din fiecare placa retinuta. Daca sunt mai putin de cinci colonii suspectate pe o placa, se iau pentru confirmare toate coloniile suspectate. b) Se nsmneaza coloniile selectate pe suprafata placilor preuscate cu agar cu extract de levuri, soia, tripton (TSYEA), intr-un mod care sa permita dezvoltarea coloniilor bine izolate. Se aeaz placile intr-un termostat, la 35 sau la 37oC, timp de 18-24 h sau pana cand dezvoltarea este satisfacatoare. Coloniile tipice au diametrul de 1-2 mm, sunt convexe, nepigmentate si opace, cu marginile netede. Daca nu se obtin colonii bine izolate, se repica o colonie de Listeria spp. tipica, pe o alta placa cu TSYEA. Testele urmatoare se executa pe colonii dezvoltate pe agar TSYEA. c) Reactia catalazei Se preleveaza o colonie izolata si se suspenda ntr-o picatura de solutie de peroxid de hidrogen, pe o lama. Formarea imediata a bulelor de gaz indica o reactie pozitiva. d) Coloratia Gram Listeria spp. apare sub forma de bacili scurti, Gram-pozitivi (cu grosimea de 0,4 - 0,5 m si lungimea de 1-2 m). e) Testul mobilitatii (daca este necesar) Se preleveaza o colonie izolata si se suspenda intr-o eprubeta care contine TSYEB. Se incubeaza intr-un termostat la 25oC, timp de 8-24 h pana cand se observa o tulburare a mediului. Se depune o picatura din cultura de mai sus folosind o ansa pe o lama microscopica pentru obtinerea unui preparat proaspat lama/lamela care se examineaza la microscop, observandu-se bacili scurti, subtiri, cu mobilitate prin rostogolire. Culturile dezvoltate la temperaturi mai mari de 25oC pot fi lipsite de mobilitate. Totdeauna testul se realizeaza cu o cultura standard. Ca o alternativa a testului de mobilitate, se inteapa agarul pentru mobilitate, cu o colonie tipica de pe TSYEA folosind un ac de inoculare. Se incubeaza timp de 48 de ore, in termostat, la 25o C. 51

Se examineaza dezvoltarea culturii in jurul striului de nsmnare. Coloniile de Listeria spp. se dezvolta sub forma de umbrela, imediat sub suprafata agarului. Daca dezvoltarea nu este suficienta, se incubeaza inca cinci zile si se examineaza cultura in cursul acestei perioade. Confirmarea pentru Listeria monocytogenes a) Testul hemolizei a.1. Pe placi cu agar cu sange de berbec. Suprafata agarului cu sange se usuca complet, apoi se marcheaza agarul in patrate. Pentru fiecare cultura se preleveaza o colonie izolata i se nsmneaza n striuri intrun patrat marcat, folosind o ansa bacteriologica. Se folosesc culturi martor pozitive (L. monocytogenes) si negative (L. inocua) Se incubeaza la 35 sau la 37oC, timp de 24 2 h. L. monocytogenes formeaza zone luminoase, clare, inguste de -hemoliza. L. innocua nu prezinta zone clare in jurul striului de insamantare. L. seeligeri prezinta o zona mica de de -hemoliza. L. ivanovii prezinta zone bine delimitate, mari, de -hemoliza. a.2. Reactia hemolitica se poate efectua odata cu testul CAMP sau folosind eritrocite in suspensie, dupa cum urmeaza: se omogenizeaza o colonie in 150 l TSYEB se incubeaza la 35 sau la 37 timp de 2 ore se adauga 150 l suspensie de globule rosii de berbec, se incubeaza la 35 sau se raceste la +3 2oC, timp de 2 h se examineaza pentru prezenta sau absenta -hemolizei daca reactia nu este clara se lasa cultura la +30C 20C timp de 24 h.

la 37oC timp de 15- 60 minute

b) Utilizarea hidratilor de carbon Folosind o ansa bacteriologica se inoculeaza fiecare din mediile pentru utilizarea hidratilor de carbon, cu cultura de pe mediul TSYEB. Se incubeaza la 35 sau la 37oC timp de pana la 5 zile. Reactia pozitiva este indicata de virarea culorii de la purpuriu la galben si are loc dupa 24 h - 48 h de incubare.

52

c) Testul CAMP Se insamanteaza fiecare din culturile de Staphylococcus aureus si Rhodococcus equi in striuri longitudinale paralele, pe suprafata mediului agar cu sange de berbec. Este necesar ca inoculul sa fie uniform si putin dens. Acesta se poate obtine pozitionand ansa bacteriologica in unghi drept fata de agar la prelevarea culturii. In mod asemanator, se insaminteaza tulpina de testat, in unghi drept fata de aceste culturi, astfel incat cultura de testat si culturile de S. aureus si R. equi sa nu se atinga, dar punctele lor cele mai apropiate sa fie la distanta de 1- 2 mm. Pe aceeasi placa pot fi insamantate mai multe tulpini de testat. Simultan, se insamanteaza culturile martor de L. monocytogenes, L. innocua si L. ivanovii. Daca se foloseste agarul cu sange, placile se incubeaza placile la 35 sau la 37oC, timp de 18 h - 24 h. Daca se folosesc placile cu strat dublu, acestea se incubeaza la 35 sau la 37oC, timp de 12 - 18 h. O zona accentuata de -hemoliza la intersectia tulpinii de testat cu culturile de S. aureus si R. equi se considera a fi o reactie pozitiva. Reactia pozitiva cu R. equi apare ca o zona lata de hemoliza (5 - 10 mm), sub forma de cap de sageata. Reactia se considera negativa daca o zona de hemoliza slaba se extinde numai aproximativ la 1 mm de la intersectia tulpinii de testat cu zona culturii de R. equi. O reactie pozitiva cu S. aureus apare ca o zona mica de hemoliza accentuata, care se intinde numai aproximativ 3 - 4 mm de la tulpina de testat si in zona de hemoliza slaba data de dezvoltarea culturii de S. aureus. Zonele mari de hemoliza nu apar in aria apropiata dintre S. aureus si L. monocytogenes. Interpretarea proprietatilor morfologice si fiziologice si a reactiilor biochimice Listeria moncytogenes: -produce hemoliza - produce acid din ramnoza si xiloza - testul CAMP: S. aureus + si R. equi Confirmarea definitiva Tulpinile considerate a fi L. monocytogenes pot fi trimise la un laborator de referinta pentru Listeria, recunoscut pentru posibilitatea tipizarii serologice sau lizogenice sau 53

pentru o metoda de tipizare moleculara acceptata. Trimiterea trebuie insotita de toate informatiile posibile care privesc tulpina(-ile). Exprimarea rezultatelor cantitative a) Se calculeaza pentru fiecare placa numarul de colonii de L. monocytogenes, folosind urmatoarea relatie: b A= xC A b : nr. colonii confirmate A: nr. colonii luate in lucru pentru confirmare C: nr. total de colonii caracteristice numarate in placa. b) Pentru placile care contin mai putin de 150 colonii de L. monocytogenes, din care una contine cel putin 15 colonii de L. monocytogenes, se calculeaza numarul, N, de celule L. monocytogenes prezent in 1 ml sau 1 g de produs: a N= V (n1 + 0,1 n2) d a: suma coloniilor de L. monocytogenes, calculata dupa confirmare, din toate placile retinute la doua dilutii consecutive, din care cel putin una contine minimum 15 colonii identificate. V: volumul inoculului insamantat in fiecare placa, in mililitri; n1: numarul de placi retinute la prima dilutie; n2: numarul de placi retinute la a doua dilutie; d: factorul de dilutie care corespunde primei dilutii retinute. Rezultatul numarului de L. monocytogenes pe ml (produse lichide) sau pe gram (alte produse) este exprimat ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10 x. c) Daca cele doua placi insamantate cu suspensie initiala contin mai putin de 15 colonii de L. monocytogenes, se calculeaza numarul de colonii confirmate din fiecare placa, folosind relatia data mai sus. Se calculeaza media artimetica, y, a coloniilor numarate in doua placi, iar numarul estimat, N E de L. , in care:

54

monocytogenes pe gram sau pe mililitru se exprima cu ajutorul formulei: y NE = , in care: dxV d: factorul de dilutie al suspensiei initiale; V: volumul de inocul din fiecare placa. d) Daca cele doua placi nsamanate cu suspensia initiala nu contin nici o colonie, rezultatul se exprima astfel: mai putin de A 1/d x v L. monocytogenes pe gram sau pe mililitru, in care: d: factorul de dilutie al suspensiei initiale; V: volumul de inocul din fiecare placa 2.12. Determinarea numarului total de enterobacterii Metoda prezentata in continuare pentru determinarea numarului total de enterobacterii din produsele alimentare si de pe suprafetele de lucru sau suprafata carcaselor foloseste ca documente de referinta SR ISO 21528-2 /2007; SR ISO 18593/2007. Principiu. Enterobacterile sunt microorganisme ce formeaza colonii caracteristice pe mediul solid agar VRBG, fermenteaza glucoza si sunt oxidaza negative. Se stabileste numarul de enterobacterii din proba de analizat, prin incorporarea unei cantitati de proba in mediul solid si incubare la 37 sau la 30 o C , timp de 24 2 h. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la 1 ml sau la 1g produs. Se stabileste gradul de contaminare cu enterobacterii a unei suprafete de lucru sau care intra in contact cu alimentele prin stergerea cu ajutorul tampoanelor din bumbac a unei suprafete de 100 cm2, marcata cu un sablon steril dupa care se introduc in 10 ml ser fiziologic peptonat cu 0,1 % agar. Din dilutie se incorporeaza cate 1 ml in medii solide si se incubeaza la 37 0,1o C in aerobioza. Se numara coloniile crescute si se raporteaza la 1 cm2. Aparatura si materiale necesare - termostat reglabil la 37 1o C - baie de apa pentru topirea mediilor - lupa cu putere de marire de 3 ori 55

- pipete de diferite capacitati, sterile - placi Petri cu 10 mm, sterile - balanta tehnica - eprubete de 16 x 160 mm, sterile - vata - alcool sanitar - foarfeci, pense, spatula - pH-metru - omogenizator Medii de cultura si diluanti - ser fiziologic peptonat 0,1% agar (8,5 g NaCl, 1 g triptona-cazeina-peptona, 0,1% agar, 1000 ml apa distilata) - agar glucoza-bila-rosu violet (VRBG) - agar nutritiv - agar glucozat - Reactiv pentru oxidaz Recoltarea probelor de sanitatie Recoltarea cu tamponul Probele trebuie recoltate cu tampoane din bumbac umezite ntr-un 1 ml solutie 0,1% NaCl peptona (8,5 g NaCl, 1 g triptona cazeina peptona, 0,1% agar si 1000 ml apa distilata) de pe o suprafata, de preferinta de 100 cm 2, marcata cu sablon steril; pentru tampoane trebuie adaugata o cantitate de 30 g / l Tween 80 si 3 g / l lecitina (sau alte produse cu un efect similar). Pentru zonele umede pot fi suficiente tampoanele din bumbac uscate. Tampoanele trebuie manipulate cu pense sterile sau eprubete cu tampoane prevazute cu tije. Suprafata de pe care se face recoltarea trebuie stearsa de 10 ori vertical, de sus in jos, apoi orizontal si pe diagonala, aplicand o presiune ferma pe suprafata. Tampoanele trebuie sa fie colectate intr-un recipient ce contine 10 ml apa peptonata tamponata cu solutie salina 0,1% agar. Probele recoltate cu tamponul trebuie refrigerate la temperatura de 4o C pana la prelucrarea ulterioara. Recipientul trebuie agitat puternic inainte de insamantarea pe medii de cultura. 56

Prelevarea de probe la carcase Pentru evaluarea bacteriologica a suprafetei carcaselor prin metoda distructiva trebuie obtinute 4 probe de tesut de la carcase, reprezentand un total minim 20 cm2, prelavate dupa toaletare. Aceasta operatiune trebuie efectuata inainte de inceperea procesului de racire. Portiunile de tesut pot fi obtinute de la carcase, folosindu-se un dispozitiv steril (2,5cm) sau prin decuparea unui lambou cu dimensiunea de minim 5 cm 2 si maximum 5 mm grosime. In abator probele trebuie introduse, in conditii asptice, intr-un container pentru probe sau intr-o punga din plastic. Pentru controlul procesarii se vor utiliza de regula urmatoarele locuri de recoltare a probelor: (i) (ii) (iii) (iv) Vit: gt, piept, flanc, coapsa Oaie, capra: flanc, torace lateral si piept Porc: spate, gusa, pulpa si piept Cal: flanc, piept, spate si coapsa Probele recoltate prin metoda distructiva si tampoanele trebuie pastrate la o temperatura de refrigerare de 4o C pana la examinare. Ele trebuie trimise la laborator in maxim 2 ore de la recoltare. Pregatirea probelor pentru analiza, a suspensiei initiale si dilutiilor zecimale se face conform SR EN ISO 6887 4 / 2005 Insamantarea Din produsele lichide si din fiecare dilutie obtinuta se insamanteaza in cate 2 placi Petri cate 1 ml. Se adauga 15 ml mediu solid (VRBG) in fiecare placa. Din lichidul de eprubete cu tampoane si pentru fiecare dilutie obtinuta se insamanteaza cate 1 ml, in paralel in cate doua placi Petri, din fiecare dilutie. In fiecare placa se introduc aseptic cate 15 ml agar glucoza, bila si rosu violet (VRBG) topit si racit la 45 0.5o C, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie alternate cu miscari perpendiculare pe diametrul placii si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului. Daca lambourile sunt mai mari de 20 cm2 in total, se recolteaza aseptic cate 5 cm2 din fiecare lambou, care vor fi transferate intr-un omogenizator sau mojar mare cu 20 ml 57

mediu de dilutie (0,1 % apa petonata tamponata, 0,9 % solutie clorura de sodiu). Pentru lucru se vor efectua dilutii zecimale seriale in diluant 0,1 % peptona + 0,85 % NaCl. 1 ml din omogenizatul de carne reprezinta 1 cm2. Din fiecare dilutie se insamanteaza cate 1 ml in doua placi Petri in paralel. In fiecare placa se introduc aseptic cate 15 ml VRBG, topit si racit la 45 0.5 o C, apoi se omogenizeaza continutul placii Petri prin miscari de rotatie alternate cu miscari perpendiculare pe diametrul placii si se lasa in repaus pana la solidificarea mediului, Incubarea se realizeaza la 37 1o C, 24 h. Numararea si selectarea coloniilor pentru confirmare Coloniiile caracteristice sunt roz spre rosu sau purpurii cu sau fara halou de precipitare. Se selecteaza placile ce contin mai putin de 150 colonii. Se aleg apoi 5 colonii caracteristice pentru testele de confirmare metabolic, care se paseaza pe placile cu agar nutritiv (cate o colonie pe cate o placa) . Se incubeaza la 37 o C, timp de 24 h. Se selecteaza o colonie bine izolata din fiecare dintre cele 5 placi incubate pentru testele de confirmare metabolic. Confirmarea metabolic (biochimic) a) Reactia oxidazei Se preleveaza o portiune din fiecare colonie bine izolata folosind o ansa sau o bagheta de sticla si se depune pe o hartie de filtru imbibata cu reactiv de oxidaza sau pe un disc comercial. Daca culoarea hartiei de filtru nu vireaza in negru in 10 secunde, reactia este negativa. b) Testul fermentarii glucozei Cu ansa, se preleveaza o portiune dintr-o colonie negativa pentru reacia oxidazei. Se insamanteaza in eprubete cu agar glucozat. Se incubeaza la 37o C, timp de 24 h. Dezvoltarea culorii galbene in eprubetele insamantate indica o reactie pozitiva. c) Interpretarea testelor biochimice Coloniile negative pentru testul oxidaza si pozitive pentru fermentarea glucozei sunt confirmate ca enterobacterii. 58

Exprimarea rezultatelor: Numarul de enterobacterii din proba de calculeaza dupa formula: c N= (n1+0,1n2)d N = numarul de microorganisme pe gram sau pe cm2; c = suma coloniilor numarate in toate placile retinute; n1 = numarul de placi retinute din prima dilutie; n2 = numarul de placi retinute din a doua dilutie; d = factorul de dilutie corespunzator primei dilutii. Exprimarea rezultatelor pentru suprafata carcaselor. Media zilnica a valorilor logaritmice a minim 5 carcase (log10 pentru fiecare rezultat individual al testului si apoi se calculeaza media aritmetica a acestor valori logaritmice). , in care:

59