PROCESAMIENTO DE IMGENES CIENTFICAS MARCO ANTONIO JIMNEZ SANTOS1 y GABRIEL CAMARENA GUTIERREZ2 Metodologa Cientfica1; Unidad de Morfologa y Funcin2.

FES Iztacala UNAM. Av. de los Barrios 1, Tlalnepantla 54090 Mxico. datura@unam.mx

En el procesamiento de imgenes cientficas y en el anlisis de imgenes, una imagen es algo diferente a una fotografa normal digital de una escena hermosa que dispar durante su ltimas vacaciones. En el contexto de la ciencia, las imgenes digitales son muestras de la informacin, mediante muestreo en los puntos de vrtice de redes n-dimensionales. La percepcin visual humana es muy buena para ciertas tareas, como la correccin de contraste, para detectar diferencias sutiles en los colores brillantes, pero muy mala con otras cosas, como discernir los colores oscuros , o clasificar colores sin una referencia adecuada. Por eso es muy importante tener en cuenta que los valores de pxel son nmeros, no son los colores. Por ejemplo, cuando se graba una imagen usando un microscopio confocal, los valores que podemos encontrar en una coordenada determinada no son los valores de color, sino que se refieren a la cuenta de fotones. Los pixeles no son cuadros pequeos Por qu JPEG no se debe utilizar en imgenes cientficas? JPEG es la abreviatura de Joint Photographic Experts Group, que fueron los creadores de un mtodo para usar la compresin con prdida para imgenes fotogrficas. Este formato se utiliza comnmente en las pginas web y con el apoyo de la inmensa mayora de cmaras fotogrficas digitales y los escneres de imagen, ya que puede almacenar imgenes en archivos relativamente pequeos a expensas de la calidad de la imagen. "La compresin con prdida" significa que en el proceso de reduccin, la cantidad de archivos de cierto tamao de la informacin de la imagen se descarta. En el caso de archivos JPEG, esto podra no ser fcilmente evidentes para un observador, pero ser importante para fines de procesamiento de imgenes. En formato JPEG de compresin con prdida, por lo tanto, la imagen almacenada no es la misma que la original, y no es adecuada para hacer el trabajo de imagen. Mientras que la compresin JPEG tira a la basura informacin que el ojo no puede detectar fcilmente, esto se traduce en artefactos considerables de imagen. Cualquier intento de cuantificar las imgenes, se vern afectados de manera incontrolable por la presencia de los artefactos. Formatos sin prdida son TIFF o PNG disponibles para ImageJ. TIFF mantiene cualquier calibracin aplicada a las imgenes, pero las imgenes no estn comprimidas. Los archivos PNG son ms pequeos pero no almacenan los datos de calibracin. Una vez que una imagen se ha guardado como JPEG comprimido no hay manera de volver a la original. Por lo tanto, un archivo viejo JPEG comprimido que se grabe de nuevo como TIFF o PNG todava contiene todos los elementos originales de compresin JPEG. ImageJ es un programa de procesamiento de imagen digital de dominio pblico programado en Java, desarrollado en el National Institutes of Health. El software permite resolver muchos problemas de procesamiento y anlisis de imgenes, desde imgenes en vivo de las clulas en tres dimensiones, procesamiento de

imgenes radiolgicas, comparaciones de datos mltiples de imgenes, hasta sistemas automticos de hematologa. El cdigo fuente de ImageJ est disponible gratuitamente. Presentamos un mtodo practico para la medicin de superficies irregulares haciendo uso de un escaner de escritorio, una computadora y el software ImageJ para el procesamiento de imgenes digitales. El software ImageJ se puede descargar en su versin para Windows, para Mac o Linux desde la siguiente liga en internet http://rsbweb.nih.gov/ij/ y para obtener tutoriales en las reas de medicina donde se requiere el procesamiento de imgenes se puede iniciar en la siguiente direccin de internet http://imagejdocu.tudor.lu/ Utilizando el software imageJ en este artculo presentamos el uso ms simple y poderoso para el anlisis del rea irregular de hojas de una planta. El estudio del rea de las hojas es importante para conocer las caractersticas de la nutricin de las plantas, o en los estudios de herbivora por los insectos, o en los estudios de fitopatologa dirigidos a identificar infecciones por bacterias, hongos o virus. El estudio de la fisiologa ecolgica de las plantas se puede dirigir a estudios de comunidades vegetales o en cultivos bajo condiciones experimentales. La cantidad de tejido funcional presente en una planta o una poblacin es la biomasa, que en los ecosistemas se define como productividad primaria. Adems de la biomasa se toma en cuenta el tamao del aparato fotosinttico, es decir se mide el rea foliar. Para la medicin del rea foliar existe una variedad de mtodos para este tipo de anlisis pero tienen la desventaja de requerir equipo costoso y poco accesible; en cambio los mtodos computacionales tienen como ventaja la eficiencia, la reduccin del tiempo y son economicamente accesibles. Una alternativa para la medicin del rea foliar es el manejo de ImageJ. Una vez instalado el software ImageJ podr observar la interfase para el anlisis de imgenes Figura 1. La interface es muy sencilla, pero muy poderosa con 352 comados. Para familiarizarse con el software, puede seleccionar las opciones con que cuenta y seleccionar los mens y submens de la barra de herramientas, como se observa en la Figura 1. Adems cuenta con una serie de herramientas grficas (cuadros con figuras en el centro), con las que es posible la manipulacin de las imgenes digitale. Por ejemplo,cuando tenemos una imagen que vamos a trabajar, la primera opcin de los cuadros de herramienta, permite aplicar formas rectangulares al tamao que uno desee, la segunda opcin permite igualmente seleccionar en la imagen un rea en forma oval, o bien formas irregulares en las siguientes opciones; teniendo seleccionada una imagen es posible colocar puntos y tener una forma seriada o enumerada de los elementos en la imagen, la siguiente opciones llamada barrita mgica permite hacer una seleccin de un rea delimitada por los contrastes de color. Con esta herramienta podemos trabajar una imagen en blanco y negro seleccionando todo el contorno de uno de los dos colores; las siguientes opciones en los cuadros de herramienta permiten manipular y editar la imagen con mayor especializacin, siendo necesario un mayor conocimiento del uso de imagej. Figura 1. Interfaz principal del software ImageJ, as como los principales mens desplegables para la modificacin de imgenes.

Calibracin del software para obtener datos reales Para calibrar nuestras mediciones podemos utilizar un cuadrado de 2 cm de lado de cualquier material, como medida de referencia. Este cuadrado de 2 cm de lado se escanea. El escaner de escritorio se ajusta para tener una resolucin en en pixeles por pulgada, ppp o ppi (esto vara segn el idioma en el que se haya instalado) con un valor entre 100 y 300, ya que se ha observado que entre estos valores se obtiene un escaneo ptimo mnimo y mximo, y se guarda como un archivo TIFF con el titulo de Calibracin (este archivo puede servir en los anlisis posteriores si se emplea el mismo escner, de lo contrario se necesitar una nueva referencia). Usando el mismo valor de resolucin del escaner; a continuacin de obtiene una imagen con diferentes figuras geomtricas (en el ejemplo que mostramos, utilizamos un cuadrado, un tringulo y un hexgono y dos figuras irregulares como se ve en la Figura 2). Para iniciar el anlisis de imgenes digitales, se selecciona File desplegando un men, en el que encontraremos varias opciones como Open y Open next. Open nos permitir seleccionar la imagen que trabajaremos, en nuestro ejemplo seleccionaremos el archivo Calibracin y, si se cuenta con diversas imgenes, tenemos la segunda opcin, que nos abrir de manera automtica esas imgenes que se encuentren en la misma carpeta. Al presionar Open se abre una pantalla donde podremos seleccionar nuestra archivo calibracin. En nuestro ejemplo la imagen se mostrar como la Figura 2. Para obtener datos reales, tenemos que calibrar la imagen con una referencia conocida, ya sea en cm o mm. En la figura 2, sabemos que un lado del cuadrado mide 2 cm; Primero seleccionando la quinta opcin de los cuadros de ayuda (Straight, linea diagonal, el cual nos permite realizar marcas lineales) marcaremos en la figura del cuadrado uno de sus lados. Seleccionada la referencia, se elige la opcin Analyze en la barra de herramientas, se desplegar un men y se selecciona Set Scale, se abrir una ventana, en el cual se registrar el dato de referencia en la segunda opcin know distance, y en la cuarta opcin Unit of length, se escribe la unidad utilizada (Figura 3). Figura 2. Figuras regulares e irregulares obtenidas por escner; un lado del cuadrado tiene 2 cm de longitud.

Figura 3. Ventana despus de seleccionar Analyze-Set Scale. En Known distance se escribe el dato de referencia, y en Unith of lenght, la unidad en la que se desea trabajar, cuenta con la opcin Global, para indicar este valor de referencia para las posteriores imagenes utilizadas en la misma sesin de trabajo, siendo las imagenes obtenidas del mismo escner. Para la obtencin del rea deseada, es necesario tener un color diferenciado del fondo, esto con el fin de que automticamente el programa localice de manera rpida los objeto que se desean analizar. Una imagen a color debe cambiarse a una imagen en blanco y negro, esto se puede lograr dirigiendose a Image en la barra de herramientas, se desplegar un men y se colocar el cursor en Type,

se desplegara un submen con diferentes opciones que pueden cambiar a la imagen en sus tonalidades, el seleccionar 8 bits permitir cambiar laimagen a blanco y negro (figura 4). Nuestra referencia no es una imagen a color por lo que Imagej lo indica determinadamente como imagen de 8 bits Figura 4. Fig 4. Men image, cambio de imagen a 8 bits para obt ener un color en blanco y negro, apto para el anlisis. Ajustada la imagen, se selecciona Image-Adjust-Threshold (Figura 5), el cual nos permitir obtener un color nico del objeto y as ordenar al programa que nos indiqu el rea en la unidad dada. sta opcin cuenta con un par de barras para que ajustando adecuadamente logre ubicar la imagen deseada que posteriormente nos dar una imagen clara diferenciada del fondo; este cuadro debe estar ajustado en Default, Red. Si ya se ajust y se obtuvo una im agen similar a la figura 6, se selecciona Apply y se obtendr una imagen de diferenciada del fondo. Figura 5. Ventana de ajuste de color Threshold, con dos barras de ajuste modificables, con la opcin de dar colores de fondo y principal, los cambios se efectan al seleccionar Apply. Figura 6. Ajuste de color red de la imagen a analizar que posteriormente al seleccionar Apply mostrar una imagen en negro. La imagen diferenciada del fondo puede llevar consigo puntos o manchas, que no son parte de la imagen, siendo la opcin Process-Noise-Despeckle, una herramienta para eliminar estos excesos. Se selecciona la quinta opcin de los cuadros de ayuda (Wand) la cual nos permite seleccionar el objeto deseado con un solo clic y diferenciarlo de los dems objetos; ya seleccionado el objeto, se seleccionara en la barra de herramientas Analyze-Measure, o con el comando Ctrl izquierdo ms la tecla M, y aparecer un cuadro (figura 7) con el rea obtenida en la unidad indicada al inicio, el cual puede guardarse en formato compatible con el programa excel de Office o un procesador de hojas de clculo y posteriormente procesarse los datos. El rea obtenida del cuadrado indica 4.05 cm2, lo cual indica la precisin de este programa, ya que sin este procesamiento, se poda inferir que el cuadrado por ser esta su caracterstica tendra 4 cm2 de rea, sin embargo no se obtuvo este valor por ser una figura realizada manualmente. Figura 7. Ventana de resultados, con la posible opcin de guardado (File) en formato de hoja de calcula. El rea indica 390 mm2. SEGUNDA PARTE. rea foliar Captura de imgenes de las hojas.

Una alternativa es escanear las hojas a archivos digitales y usar estas imgenes para el anlisis. 1. Tomando imgenes digitales colocando las hojas en un fondo muy blanco. se ajusta el escaneo a 100 pp o 100 dpi, dependiendo del modelo de escner. 2. Las imgenes pueden ser JPEG, TIFF u otro formato. 3. Coloque la (s) hoja (s) en torno a una referencia de tamao conocido. Esto le servir como referencia para el clculo de rea. La referencia debe estar intermedia y no sobreponerse en las hojas y/o la referencia (figura 8) Figura 8. hojas tomadas al azar, con referencia en el centro (cuadrado de 2 cm de lado). 5. Tome una imagen de hojas con el mismo tratamiento diferenciando los testigos de los tratamientos. ImageJ 1. Archivo File... abrir el primer archivo de imagen en el grupo consecutivo en el que todos son del mismo experimento. Las indicaciones que siguen son para este primer archivo y todos los archivos posteriores tambin se hacen por el siguiente conjunto de instrucciones. 2. Si la imagen incluye reas problemas, como los bordes de las fotografas, sombras, material no deseados, se puedes seleccionar la imagen dando clic en Crop; utilizando la herramienta rectangular que est en la barra de tareas selecciona el rea deseada, despus selecciona en image > crop. 3. Se ajuste del color de imagen image type 8 bits a. image adjust Threshold b. Arrastrar la barra de desplazamiento inferior para obtener una mnima cantidad de rojo en el fondo y un mximo de gris en las hojas y en las marcas de referencia (figura 9) c. Apply y se obtendr una imagen en blanco y negro (figura 10). Figura 9. Ajuste de imagen con Threshold, se busca con las barras de desplazamiento una imagen que se ubique encima del rea que deseamos conocer. Figura 10. Imagen en negro de las hojas, despus de seleccionar apply en la ventana de Threshold. Opcional Process noise -> Despeckle. Con esto se eliminaran manchas o puntos que no formen parte del objeto. 4. Del men Analyze, vaya a Set Measurements y de clic en Area, Std. Deviation, Display Label y cambie el decimal a 1 (dependiendo la cantidad de nmeros decimales deseados) (figura 11). Figura 11. ventana Set Measurements en el que se indica los parmetros deseados del anlisis.

5. Ir al Analyze Particles (esta opcin es para obtener el rea de diferentes objetos encontrados en la misma imagen digital, siendo diferenciados cada una de las reas) y ajuste el rango apropiado para obtener el rea mnima calculada para las hojas mas pequeas y/o la referencia. 6. Todas las mediciones se van a presentar en el archivo results en una ventana, que puede copiar y pegar en una hoja de clculo de Excel externo (figura 12). a. Se le pedir si desea "Save results (Guardar resultados). Puede, en cuyo caso se tendr que dar nombre al archivo y elegir el lugar donde ser grabador; o puedes decir 'no' y ver los resultados. Figura 12. Ventana de resultados, en el que aparece el rea en cm2, que posteriormente se puede guardar en hoja de clculo. 8. No cierre este primer archivo de imagen. Y sigue las instrucciones para todas las siguientes archivos de imgenes, si es que se cuenta con mas imgenes digitales obtenidas del mismo escner, de lo contrario realizar la calibracin adecuada.

1.-Laboratorios Econatur, Importancia de los analisis foliares, [en Linea], julio 15 del 2009, [Diciembre del 2011], Disponible en la Web: http://www.econatur.net/index.php?sec=19&y=2009&a=491
Los avances de las ciencias biolgicas en aos recientes, y la importancia creciente de la determinacin de relaciones entre la estructura y funcin, han hecho que el manejo de imgenes sea una disciplina importante. El acceso a tecnologa digital ha hecho de las imgenes una parte esencial en muchas reas de investigacin, desde la nanotecnologa hasta la astonoma. Los fabricantes de dispositivos para la adquisicin de imgenes incluyen software de p rocesamiento de las imgenes, pero estos programas generalmente no son muy flexibles y/o no permiten manipulaciones ms complejas. ImageJ tiene una posicin nica debido que no solo es de dominio pblico (lo que significa que su codigo fuente es accesible y tiene una licencia libre para utilizarlo), adems corre en cualquier sistema operativo. Es atractivo debido a que es facil de usar, puede realizar muchas manipulaciones de imgenes y tiene un enorme comunidad de usuarios que la conoce y la que se puede acudir para resolver problemas especficos. Es programa fue creado por Wayne Rasband de Research Services Branch, National Institute of Mental Health, en Bethesda, Md. Se llama ImageJ debido a que est escrito en lenguage Java. De acuerdo al instituto, se ha descargado de su sitio Web decenas de miles de veces. ImageJ puede utilizarse para adquirir imgenes directamente de scanners, camaras y otras fuentes de video, incluyendo camaras que son compatibles TWAIN y FireWire, y otros muchos. El programa soporta manipulaciones de todas

la imgenes comunes, incluyendo lectura y escritura de archivos de imgenes, y operaciones en pixeles individuales, regiones de imgenes, imgenes completas y volmens. Volumenes, llamados stachs en imageJ, son secuencias ordenadas de imgenes que pueden ser operadas como un todo. Pueden realizara operaciones bsicas como deteccin de limites, transformadas de Fourier, histogramas y anlisis de partculas (incluyendo sofisticados procesos estadsticos de grupos de partculas), manipulaciones de edicin y color; y operaciones ms sofisticadas como dilacin, erosin y cierre de estructuras, y conjuntos de operciones matemticas de imgenes, como multiplicaciones, y divisiones. Adems, las operaciones de visualizacin, incluye conversiones de espacios de color, por ejemplo, convirtiendo de RGB a espacios de intensidad de saturacin de color, graficado bi y tridimensional, tambin soporta el anlisis de geles de electroforesis.