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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I ICS 045

Trabalho realizado pela Acadmica de Medicina Veterinria da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientao dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

A imunofluorescncia permite a deteco e localizao de antgenos em clulas e tecidos utilizando anticorpos especficos, marcados com fluorocromos, de modo que a localizao dos antgenos se torna visvel ao microscpio de fluorescncia.
De acordo com o mesmo princpio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biolgicos usando seu antgeno correspondente.

Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade especfica com o antgeno.

Teste qualitativo/semi-quantitativo.
Mtodo de alta sensibilidade e alta especificidade.

o FLUOROCROMOS:
Nos testes de imunofluorescncia so empregados conjugados constitudos de anticorpos ligados covalentemente a molculas reveladoras denominadas fluorocromos. 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos. Fluorocromos so substncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visvel, ou seja, ficam fluorescentes.

o FLUOROCROMOS:
So utilizados vrios fluorocromos diferentes nos laboratrios clnicos para imunofluorescncia.

Isotionato de fluorescena e compostos da rodamina so os fluorocromos mais usados para conjugao com anticorpos para torn-los fluorescentes sob condies adequadas de iluminao.

o MICROSCPIO DE EPIFLUORESCNCIA:
A reao imunofluorescente que desencadeada no microscpio de epifluorescncia ocorre atravs da emisso de luz de cor quando o fton excitado por luz de curto comprimento de onda (UV). Para deixar passar somente a emisso secundria desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo.

o TIPOS DE REAO:

Deteco de Ag

Deteco de Ag

Deteco de Ac

DIRETA

INDIRETA

Antgeno pesquisado

Conjugado

Y Y Y Y Y

O anticorpo especfico marcado com Fluorocromo (conjugado) adicionado e se fixa ao antgeno, formando um imunocomplexo estvel.

Y
Y

O anticorpo no ligado removido por lavagens.


O preparado observado em microscpio de fluorescncia.

o VANTAGENS
Alta especificidade e sensibilidade Possibilidade de deteco de protenas intracelulares e de sua localizao.

o DESVANTAGENS
Alto custo do microscpio de fluorescncia Necessidade de um conjugado para cada antgeno que se deseja identificar ou localizar Subjetividade da leitura

o APLICAES
Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas tumorais.

Em bacteriologia, um dos poucos mtodos de IFD ainda usados em laboratria clnico a identificao do Streptococcus do grupo A.

PARA A PESQUISA DE ANTGENOS Incuba-se a clula ou tecido em que se quer pesquisar o antgeno com o anticorpo especfico obtido em animal ou um monoclonal, levando formao de um imunocomplexo. Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo no ligante excedente. A preparao incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espcie de animal. O preparado observado em microscpio de fluorescncia.

Antgeno pesquisado

Conjugado Anticorpo Monoclonal

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y

PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS Antgenos padronizados so fixados a lminas de vidro. O soro do paciente diludo, colocado sobre o antgeno e incubado para permitir a formao do complexo antgeno-anticorpo. Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos no ligados. A preparao incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo especfico para o antgeno.

Antgeno padronizado

Conjugado Anticorpo pesquisado

Y Y

Y Y

Y Y

Y Y Y Y

Observa-se o preparado em microscpio de fluorescncia.

o VANTAGENS

Sensibilidade
Especificidade Reprodutibilidade De simples padronizao e execuo O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes Para determinar as classes e subclasses de anticorpos so utilizados conjugados especficos

o DESVANTAGENS
Necessidade de microscpio de fluorescncia

Subjetividade na leitura
No-automao

o APLICAES Medicina humana


Diagnstico sorolgico de vrias doenas infecciosas como a Doena de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenas auto-imunes.

Medicina Veterinria
Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.

As tcnicas de imunofluorescncia ainda so empregadas na rotina laboratorial, mas esto sendo gradativamente substitudas por testes imunoenzimticos, principalmente devido necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automao.