ANALISIS DE ALIMENTOS DETERMINACIN DE PROTEINAS Mtodo Kjeldahl

I.

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FUNDAMENTO TERICO

La muestra alimenticia se somete a un tratamiento oxidativo con el cido sulfrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora. El sulfato amnico formado se libera el amoniaco por tratamiento alcalino y ste se transporta con ayuda de una destilacin en corriente de vapor a un recipiente con cido brico y se realiza su titulacin con HCl. El contenido en protena de la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrgeno de la protena en cuestin.
II.

METODOS

a) MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS Estos mtodos son particularmente tiles en la valoracin del contenido de protena real, puesto que se basan en la formacin de complejos coloreados entre algunos aminocidos proteicos el enlace peptdico, con reactivos especficos. Dentro de los mtodos clsicos estn el que emplea el reactivo del biuret, el cual se fundamenta en la formacin de un complejo coordinado entre los iones cpricos del reactivo y el enlace peptdico de la protena, reaccin que transcurre en medio alcalino. Tambin es de uso frecuente el mtodo que emplea la espectrofotometra con base en la reactivo de Folin. En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibracin con una protena patrn, normalmente la albmina de huevo o la albmina bovina estabilizada estndar, y en las mismas condiciones de reaccin se hace el desarrollo de la coloracin para la muestra que se est analizando. b) MTODOS VOLUMTRICOS Dentro de estos mtodos est el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversin del nitrgeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas por volumetra cido base. El mtodo de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestin de la muestra, destilacin con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoracin cido base de este amoniaco. En la primera etapa, el hidrgeno y el oxgeno proteico, son oxidados hasta dixido de carbono y agua, mientras que el nitrgeno es convertido en sulfato de amonio, por la accin de un agente oxidante en medio cido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador el agente oxidante, pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestin es el de convertir el nitrgeno proteico en sulfato de amonio. PAGINA 1 DOCENTE: ELFER ORLANDO OBISPO GAVINO

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En la etapa siguiente, mediante la accin de una base fuerte, generalmente hidrxido de sodio al 40%, se libera el amonaco de la sal de amonio. Cuando la valoracin se va a efectuar por retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen exactamente medido de un cido estndar. Una variante utilizada comnmente, consiste en recibir el amoniaco (hidrxido de amonio) sobre cido brico aproximadamente al 4% de tal manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente. En la etapa final, se hace la valoracin de acuerdo con el proceso empleado para la recoleccin. As por ejemplo, si el hidrxido de amonio, se recibi sobre un volumen exactamente medido de un cido estndar, la titulacin se hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el cido que no reaccion con el hidrxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidrxido de amonio producido. El hidrxido de amonio se recoge sobre cido brico no valorado y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un cido estndar.
III.

REACCIONES DEL METODO KJELDAHL

A. DIGESTION: Oxidacin de la muestra con cido sulfrico y catalizadores durante el cual la materia orgnica se destruye y el nitrgeno se convierte en sulfato acido de amonio Protena(s) + H2SO4(c) Catalizador B. DESTILACION: Descomposicin del sulfato cido de amonio por medio de un exceso de lcali fuerte para liberar el amoniaco, el cual se recoge por destilacin sobre cido brico a) Liberacin del NH3: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) b) Arrastre con vapor: NH3(g) + H2O(g) c) Recoleccin: NH4OH(ac) + H3BO4(ac) C. TITULACION: NH4H2BO4 + H2O NH4OH(ac) NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g) CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac)

La titulacin del borato de amonio formado con solucin patrn de HCL 0.1 N, usando como indicador, una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno o una mezcla de rojo de metilo y verde de bromocresol Indicador de Tashiro NH4H2BO4(ac) + HCI(ac) PAGINA 2 NH4CI(ac) + H3BO4(ac) DOCENTE: ELFER ORLANDO OBISPO GAVINO

ANALISIS DE ALIMENTOS REACTIVOS: a) Acido sulfrico concentrado, p.a. b) Sulfato de potasio o sulfato de sodio, p.a. c) Sulfato cprico, p.a.

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d) Solucin de hidrxido de sodio al 15 % . Disolver 150 g de NaOH y completar a 1 litro. e) Solucin de cido sulfrico 0.1 N. Tomar 2.7 mL de H 2SO4 conc. y completar a 1 litro, luego estandarizar con Na2CO3 anhidro p.a. f) Solucin de hidrxido de sodio al 40 %. Disolver 400 g de NaOH y completar a 1 litro. en 100 mL de etanol (95 %). h) Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N. Tomar 4 g de NaOH y enrasar a 1 litro con agua recientemente hervida y enfriada. Valorar con cido oxlico di hidratado. i) j) Acido brico al 3 % . Disolver 30 g de cido brico y completar a 1 litro. Indicador de Tashiro: rojo de metilo al 0.1 % y azul de metileno al 0.1 % en relacin de 2:1, en alcohol etlico. k) Solucin de cido clorhdrico 0.1 N. Tomar 8.3 mL de HCl conc. y enrasar a 1 litro. Valorar con Na2CO3 anhidro. FUNCIONES H2SO4: Oxida la muestra NaOH : Contribuye a la liberacin de amoniaco. H3BO3: Recepciona el amoniaco, para formar borato de amonio e indicar la presencia de amoniaco. Indicador de Tashiro: Durante la titulacin pasa de violeta a verde pH=5,4 HCl : Es el titulante de la cantidad de nitrgeno presente en la muestra. g) Solucin indicadora de rojo de metilo al 1 % en etanol. Disolver 1 g de rojo de metilo

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ANALISIS DE ALIMENTOS PRACTICA 8: DETERMINACIN DE PROTEINAS Mtodo Kjeldahl I.

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INTRODUCCIN El mtodo Kjeldahl se basa en la transformacin del nitrgeno contenido en la muestra en sulfato de amonio mediante la digestin con cido sulfrico en presencia de un catalizador. El ion amonio obtenido se transforma en medio bsico en amonaco que se destila y valora con una solucin de cido patrn.

II.

OBJETIVO a) El estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl. b) El estudiante se familiarizar con los equipos y el procedimiento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl y la recuperacin de amonaco. c) El estudiante aprender a realizar los clculos pertinentes para la determinacin de nitrgeno en protenas. d) Determinar la concentracin de nitrgeno presente en la muestra para luego ser transformado a travs de un factor en protena.

III.

FUNDAMENTO El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el que se destila recibindolo en: a) Acido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico.

A.O.A.C. Official Methods of Analysis 13 th Edition, 1984. 4.2.- FAO Food and Nutrition Paper 14/7 Roma, 1986. IV. MATERIAL Y EQUIPO a) Balanza analtica, sensibilidad 0.1 mg. b) Equipo Kjeldahl c) Manto calefactor PAGINA 4 DOCENTE: ELFER ORLANDO OBISPO GAVINO

ANALISIS DE ALIMENTOS d) pHmetro e) Material usual de laboratorio. V. l) REACTIVOS Acido sulfrico concentrado, p.a.

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m) Sulfato de potasio o sulfato de sodio, p.a. n) Sulfato cprico, p.a. o) Solucin de hidrxido de sodio al 15 % . Disolver 150 g de NaOH y completar a 1 litro. p) Solucin de cido sulfrico 0.1 N. Tomar 2.7 mL de H 2SO4 conc. y completar a 1 litro, luego estandarizar con Na2CO3 anhidro p.a. q) Solucin de hidrxido de sodio al 30 %. Disolver 300 g de NaOH y completar a 1 litro. r) Solucin indicadora de rojo de metilo al 1 % en etanol. Disolver 1 g de rojo de metilo en 100 mL de etanol (95 %). s) Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N. Tomar 4 g de NaOH y enrasar a 1 litro con agua recientemente hervida y enfriada. Valorar con cido succnico. t) Acido brico al 3 % . Disolver 30 g de cido brico y completar a 1 litro. de 2:1, en alcohol etlico. v) Solucin de cido clorhdrico 0.1 N. Tomar 8.3 mL de HCl conc. y enrasar a 1 litro. Valorar con Na2CO3 anhidro. VI. PROCEDIMIENTO a) Realizar la muestra en duplicado. b) Efectuar un ensayo en blanco usando una sustancia orgnica sin nitrgeno (sacarosa) que sea capaz de provocar la reduccin de los derivados ntricos y nitrosos eventualmente presentes en los reactivos. c) Pesar al 0.1 mg. alrededor de 1 g de muestra homogeneizada (m) en un matraz de digestin Kjeldahl. d) Agregar 3 perlas de vidrio, 10 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio, 0.5 g de sulfato cprico y 20 mL de cido sulfrico conc. e) Calentar en manta calefactora y una vez que la solucin est transparente, dejar en ebullicin 15 a 20 min. ms. Si la muestra tiende a formar espuma agregar cido PAGINA 5 DOCENTE: ELFER ORLANDO OBISPO GAVINO u) Indicador de Tashiro: rojo de metilo al 0.1 % y azul de metileno al 0.1 % en relacin

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esterico o gotas de silicona antiespumante y comenzar el calentamiento lentamente. f) Enfriar y agregar 200 mL de agua. 30 % por el embudo, y cerrar la llave. h) Destilar no menos de 150 mL en un matraz que lleve sumergido el extremo del refrigerante o tubo colector en: 50 mL de una solucin de cido sulfrico 0.1 N, 4 a 5 gotas de rojo de metilo y 50 mL de agua destilada. Asegurar un exceso de H 2 SO 4 para que se pueda realizar la retrotitulacin.Titular el exceso de cido con NaOH 0.1 N hasta color amarillo o 50 mL de cido brico al 3 %. Titular con cido clorhdrico 0.1 N hasta pH 4.6 mediante un medidor de pH calibrado con soluciones tampn pH 4 y pH 7, o en presencia del indicador de Tashiro hasta pH 4.6 Cada cierto tiempo es necesario verificar la hermeticidad del equipo de destilacin usando 10 mL de una solucin de sulfato de amonio 0.1 N (6.6077 g/L), 100 mL de agua destilada y 1 a 2 gotas de hidrxido de sodio al 30 % para liberar el amonaco, as como tambin verificar la recuperacin destruyendo la materia orgnica de 0.25 g de L(-) Tirosina. El contenido terico en nitrgeno de este producto es de 7.73 %. Debe recuperarse un 99.7 % VII. CALCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS g) Conectar el matraz al aparato de destilacin, agregar lentamente 100 mL de NaOH al

Donde: V m Factor : 50 mL H2 SO4 0.1 N - gasto NaOH 0.1 N o gasto de HCl 0.1 N : masa de la muestra, en gramos : 6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y protenas en general 5.7 : para cereales y derivados de soya 6.38: leche 5.55: gelatina 5.95: arroz PAGINA 6 DOCENTE: ELFER ORLANDO OBISPO GAVINO

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Repetitividad del mtodo: La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas una despus de otra, por el mismo analista, no debe exceder 0.06 % de Nitrgeno o 0.38 % de protena. En la planilla de resultados se indicar mtodo utilizado, identificacin de la muestra, peso de muestra, gastos de titulacin, factor utilizado y resultados obtenidos de la muestras en duplicado con 2 decimales.

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