PRÁCTICA # 1

“CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDIMETRÍA”

OBJETIVO:

 Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano.

 Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.
 Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.

INTRODUCCIÓN

Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a
su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza.

Para el aislamiento se de organismos utilizan medios sólidos (agar. Ventajas) o líquidos.

· Medios sólidos: siembra (extensión o vertido) en placa. Separación e inmovilización de organismos de forma
individualizada en un medio nutritivo sólido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Método: diluciones
consecutivas de la muestra.
· Medios líquidos: Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Método de la dilución
límite.
· Medios selectivos: Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico. Se emplean cuando el
organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para:
- Enriquecer: medios líquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento más
elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas
- Aislar directamente: medios sólidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impide
el desarrollo de los demás microorganismos.

Los métodos de aislamiento microscópicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiología.

El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:

 Aumento del número de células

 aumento de masa del cultivo

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado o
equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

Cuantificación de microorganismos:

 Recuento de viables: Se utiliza una técnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en
placas (30-300 bacterias/placa).
 Recuento de totales.
 Medida del número de células:
- Directo mediante microscopio (cámaras de recuento de Newbaver).
- Contador electrónico de partículas (contador de Coulter)
 Medida de la masa celular.
- Turbidimetría (densidad óptica). Se utiliza un colorímetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A= ε
bC, o log Ii/It = k*C). Es el método más utilizado.
- Peso seco

℘ Medida de la masa celular

 Métodos Directos: En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1) Determinación del peso húmedo: se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el
sobrenadante; se determina el peso del sedimento.
- Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la
forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la
noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso
húmedo.
- Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg
con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.
4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en
organismos fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman
grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes
naturales.

 Métodos Indirectos:

1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos:
consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg.
Producción de ácidos.
2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de
estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo
bacteriano. Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula
pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a
la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica.

Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la
suspensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa
bacteriana en una muestra problema; La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el
tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes
de onda (λ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.
b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto
respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la
preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

Método nefelométrico: Determinar la concentración de bacterias en UFC/ml, utilizando la Tabla

Solución de BaCl2 al 1,0% ml Solución de H2SO4 al 1,0% ml Escala de McFarland UFC Millones/ml

0,1 9,9 4,0 300

0,2 9,8 3,7 600

0,3 9,7 3,5 900

0,4 9,6 3,4 1 200

0,5 9,5 3,3 1 500

0,6 9,4 3,2 1 800

0,7 9,3 3,15 2 100

0,8 9,2 3,10 2 400

0,9 9,1 3,04 2 700

1,0 9,0 3,00 3 000

2
 Diluir la suspensión bacteriana con solución salina estéril al 0,85%, a la transmitancia o turbiedad elegida,
de acuerdo con la concentración de bacterias establecida.

℘ Medida del número de individuos

 Métodos Directos:

1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y
unas medidas muy concretas: excavación con 0.02 mm de profundidad; área de 1 mm2, dividida en un retículo
de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. O
sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio
durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a
uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

- Ventajas: es un método muy rápido.

- Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10 6 céls./ml). Por debajo de este
valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo
estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo
capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 µm diámetro) pasa una
partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico,
que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la
intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Hay que usar suspensiones absolutamente libres de
partículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden
obturar el orificio del aparato).

 Métodos Indirectos

1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los
directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto
en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando,
colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto
es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio
sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de
incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de
alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.

Precauciones: para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada
dilución; hay que usar pipetas nuevas en cada dilución; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo (y esto es especialmente
cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se refiere no a “células viables
reales” sino a “unidades formadoras de colonia” (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mínimo, a una
bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el número
real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser
sembrados en la placa.

2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de
suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene
las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un
medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se
cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo
pasar por el filtro.

MATERIAL

3
 10 Tubos de 16x150 con tapón de baquelita
 10 Tubos de 16x150 con tapón de baquelita conteniendo 20, 18, 16, 15, 12, 10, 7.5 y 5ml de caldo nutritivo
estéril
 1 pipeta 1ml
 1 pipeta 10ml
 5 pipetas estériles de 5, 10 y 20ml
 Un espectrofotómetro con su celdas
REACTIVOS:

 Solución salina
 Cultivo de Escherichia Coli en caldo nutritivo
 Solución de cloruro de bario al 1%
 Ácido sulfúrico al 1%
 Caldo nutritivo estéril

PROCEDIMIENTO:

1.- Escala de McFarland

o Identifique los tubos con las claves indicadas en la tabla
o Con la bureta de 1ml, agregue a cada uno de los tubos el volumen de bario indicado en la tabla.
o Con la bureta de 10ml, agregue a cada tubo los volúmenes correspondientes de ácido sulfúrico.
o Con el espectrofotómetro determine la turbiedad de las diferentes mezclas. Para ello calibrar el
aparato con un tubo que contenga agua.
o Graficar las lecturas, colocando en la ordenada los valores de densidad óptica registrados y en las
absisa el número aproximado de bacterias representado.

Clave BaCl2 1% H2SO4 1% No. Aproximado de bacterias D.O. D.O.

del Tubo MI MI Representadas x 106/ml Teórico Experimental

1 0.1 9.9 300 0.602 0.906

2 0.2 9.8 600 0.568 0.935
3 0.3 9.7 900 0.544 0.928
4 0.4 9.6 1,200 0.532 0.928
5 0.5 9.5 1,500 0.519 0.927
6 0.6 9.4 1,800 0.505 0.917
7 0.7 9.3 2,100 0.498 0.955
8 0.8 9.2 2,400 0.491 0.955
9 0.9 9.1 2,700 0.483 0.958
10 1.0 9.0 3,000 0.477 0.953

4
 Escala de McFarland (TEÓRICA)

1
0.9
0.8
0.7
0.6
D.O.

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

1500

3000
1800
300

600

900

1200

2100

2400

2700
No. de aprox. de bacterias representadas x 100000/m l

Ecala de Mc Farland

2.- Lectura de problemas:

o Identificar los matraces que contienen diferentes volúmenes de medio de cultivo
o En condiciones de asepsia agregar a cada matraz el volumen necesario del cultivo Escherichia
Coli para obtener un volumen total de 20ml, mezclar el contenido.
o Proceder a determinar la turbiedad con el espectrofotómetro. Ajustar el aparato a cero,
empleando caldo nutritivo estéril.

Tubos con A
caldo nutritivo
inoculados (ml)
20  Blanco
18 0.880
16 0.877
15 0.884
12 0.896
10 0.885
7.5 0.892
5 0.892

5
 CURVA DE CALIBRACIÓN

0.8

D.O. 0.6

0.4

0.2

0
300 600 900 1,200 1,500 1,800 2,100 2,400 2,700 3,000
No de Microorganism os

Escala de Mc Farland D.O. experimental

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

 Se realizó la escala de McFarland para la determinación y cuantificación del número de

microorganismos existentes en los caldos preparados, sin embargo, estos valores nos dieron muy altos
posiblemente debido a que el espectrofotómetro se encontraba descalibrado, así que se averiguo cuáles
eran los valores teóricos para esta escala y estos se muestran en la tabla de resultados, junto a los
resultados experimentales, observándose así la gran diferencia que se encontró entre los valores.
Debajo de la tabla se puede observar la curva teórica de Mc farland.
 En la segunda gráfica se observan los resultados obtenidos de las muestras para realizar la escala de
Mc Farland en la misma gráfica que los resultados teóricos y ya que los datos no se podían interpolar,
se realizó una tercera gráfica que se encuentra después de la tabla con los resultados de las
Absorbancias obtenidos de las muestras problema, en la cuál se prolongo la gráfica hacia el cero para
poder interpolar los resultados, además de que se tuvo que hacer una recta para que se extendiera la
gráfica y de esta manera los puntos coincidieran y que de esta manera los resultados nos dieran el
número de bacterias aproximado que se contenía en los tubos de los cuáles los resultados aproximados
para los tubos fueron:

 18ml 480 x106 M.O.

 16ml 420 x106 M.O.
 15ml 600 x106 M.O.
 12ml 930 x106 M.O.
 10ml 840 x106 M.O.
 7.5ml 900 x106 M.O.
 5ml  900 x106 M.O.

 Estos resultados, no pueden ser muy confiables debido a que hubieron varios errores de muestreo como
lo fueron el hecho de que los trasvasados, diluciones, tubos de la escala, lecturas, etc. No se realizaran
por la misma persona, y en el caso de los tubos de Mc Farland no se realizara con las pipetas
volumétricas correspondientes al volumen, y que el espectrofotómetro no se encontrara calibrado, lo que
causó que los resultados fueran poco confiables y que los resultados de la curva de calibración diera tan
altos y poco certeros.

CONCLUSIONES

6
 Con esta práctica se puede concluir que para lograr un método adecuado de cuantificación por el método
de Mc Farland, hay que tener en cuenta varias variables para realizar adecuadamente el método y
prevenir errores, ya que este se basa principalmente en la medición de la cantidad de luz dispersada o
transmitida a través de un cultivo bacteriano, y si este no es realizado correctamente, entonces los resultados
pueden variar desproporcionalemente, además de que lo más adecuado para esta técnica en especial es la
utilización de un nefelómetro ya que este posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro, sin embargo, no
se contaba con uno para la realización de la práctica.

REFERENCIAS:

http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/Docencia/archivos/02.pdf
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934317
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html