Oxidacion Bacteriana de Sulfato Ferroso

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
OXIDACIN BACTERIANA DE SULFATO FERROSO
CON Acidithiobacillus ferrooxidans
GABRIEL EDUARDO MERUANE NARANJO
2002
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
OXIDACIN BACTERIANA DE SULFATO FERROSO
CON Acidithiobacillus ferrooxidans
GABRIEL EDUARDO MERUANE NARANJO
PROFESOR TUTOR : DR. TOMS VARGAS V.
PROFESORES DE COMISIN : DRA. BARBARA ANDREWS
DR. EDGARDO DONATI
DR. LEANDRO HERRERA
DR. DAVID HOLMES
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
DE LA INGENIERA, MENCIN QUMICA
SANTIAGO DE CHILE
JUNIO 2002
ii
A MI ESPOSA YENNY
Y A MIS HIJOS GABRIELA Y TEODORO
iii
AGRADECIMIENTOS
Al finalizar este trabajo debo reconocer a todos aquellos que colaboraron en mi
formacin, y a aquellos que en forma directa e indirecta colaboraron en el desarrollo
de esta tesis. En especial quisiera agradecer a las siguientes personas e
instituciones:
A mis padres, Teodoro Meruane y Bibiana Naranjo, quienes me inspiraron a
realizar estudios de post-grado.
A Conicyt, que contribuyo a financiar mis estudios y permiti la realizacin de esta
tesis.
A los profesores del departamento de Ingeniera Qumica, que contribuyeron en
mi formacin y me entregaron herramientas para el desarrollo de este trabajo.
Al Dr. Roberto Acevedo y al Dr. Jacques Wiertz, quienes desinteresadamente me
ayudaron en la revisin de los manuscritos originales.
A los profesores de la comisin Dra. Barbara Andrews, Dr. Edgardo Donati, Dr.
Leandro Herrera y Dr. David Holmes, quienes colaboraron al enriquecimiento
conceptual y mejoramiento de esta tesis.
Al Dr. Toms Vargas, mi profesor tutor, inspirador en parte y cmplice en general
del desarrollo de este trabajo.
A mis colegas del centro de estudios avanzados en Hidrometalurgia /
Electrometalurgia, prof. Blanca Escobar y Dr. Jess Casas, por sus sabios y
siempre oportunos consejos.
A mis compaeros y amigos del centro, Angel Sanhueza, Ral Cordoba, Ins
Godoy, Hector Jordan y Juan Jos Segura, soporte fsico, intelectual y sicolgico
de mi trabajo.
Finalmente, y en forma muy especial debo agradecer a Yenny, ya que sin su
compaa y apoyo constante este trabajo no hubiese sido posible.
iv
TABLA DE CONTENIDOS
PORTADA i
DEDICATORIA ii
AGRADECIMIENTOS iii
TABLE DE CONTENIDOS iv
NDICE DE FIGURAS viii
INDICE DE TABLAS xi
RESUMEN xii
PRIMERA PARTE:
INTRODUCCIN Y ANTECEDENTES
1
1 INTRODUCCIN 1
2 ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS 3
2.1 Caractersticas generales de Acidithiobacillus ferrooxidans 3
2.2 Metabolismo y bioenergtica en la oxidacin de ion ferroso 4
2.2.1 Metabolismo 4
2.2.2 Mecanismo de transporte directo de electrones 7
2.2.3 Mecanismo de transporte reverso de electrones 13
2.2.4 Reduccin de ion frrico 16
2.2.5 Discusin 18
2.3 Oxidacin bacteriana de ion ferroso 23
2.3.1 Cintica de oxidacin 23
2.3.2 Efecto del pH 27
2.3.3 Efecto de la temperatura 32
2.3.4 Efecto de los aniones 35
2.3.5 Efecto de los cationes 36
2.3.6 Formacin y efecto de precipitados 37
2.3.7 Efecto del ion frrico 39
2.3.8 Efecto del potencial redox de la solucin y estudios de la actividad
de Acidithiobacillus ferrooxidans en celdas electroqumicas
43
2.3.9 Discusin y enfoque la tesis 44
3 OBJETIVOS 46
v
SEGUNDA PARTE:
EFECTO DEL Eh EN LA CINTICA DE OXIDACIN DE ION
FERROSO CON Acidithiobacillus ferrooxidans
47
1 INTRODUCCIN 47
2 MATERIALES Y MTODOS 48
2.1 Cultivo de bacterias 48
2.2 Celda electroqumica 49
2.3 Procedimiento 50
3 RESULTADOS Y DISCUSIN 52
3.1 Calibracin de Electrodos 52
3.2 Resultados experimentales 54
4 EL MODELO 57
4.1 Descripcin del modelo 57
4.2 Estimacin de parmetros 63
4.3 Aplicacin del modelo a otra informacin experimental 67
4.4 Implicaciones mecansticas del modelo cintico derivado 68
5 CONCLUSIONES 71
TERCERA PARTE:
EFECTO DEL pH EN LA CINTICA DE OXIDACIN DE ION
73
1 INTRODUCCIN 73
2.1 Medicin del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana.
Caso I: Rango de pH 1,3 2,5
75
2.1.1 Cultivo de bacterias 75
2.1.2 Montaje experimental 76
2.1.3 Preparacin de soluciones 77
2.1.4 Procedimiento 77
Caso II: Rango de pH 2,5 7,0
78
2.2.2 Montaje experimental 79
vi
Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano
80
2.3.2 Bioreactor y montaje 82
3.1 Caso I: Rango de pH 1,3 2,5 85
3.2 Caso II: Rango de pH 2,5 7,0 92
3.2.1 Metodologa de clculo 92
3.2.2 Velocidad de oxidacin de ion ferroso 96
3.3 Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento
bacteriano entre pH 2,0 y 4,0
104
3.3.1 Evaluacin del rendimiento 104
3.3.2 Discusin 109
4 EFECTO DEL pH, EL MODELO 110
5 CONCLUSIONES 118
CUARTA PARTE:
BIOOXIDACIN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO EN
UNA CELDA ELECTROQUMICA
120
1 INTRODUCCIN 120
2.0.2 Celda electroqumica 121
2.1 Experiencias con cambio de anolito 122
2.2 Experiencias con recirculacin de anolito 123
3.1 Experiencias con cambio de anolito 124
3.2 Experiencias con recirculacin de anolito 126
4 CONCLUSIONES 128
vii
REFERENCIAS 129
ANEXOS
ANEXO A. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DE OXGENO EN
LAS MEDICIONES DE Eh
140
ANEXO B. CALIBRACIN DE ELECTRODOS DE Eh 148
ANEXO C. PRUEBAS A POTENCIAL CONTROLADO 153
ANEXO D. DESARROLLO ALGEBRAICO DEL MODELO, SECCIN 4
SEGUNDA PARTE
154
ANEXO E. RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIN DE ION
FERROSO EN EL RANGO pH 1,3 2,5
159
ANEXO F. DETERMINACIN DE ESTEQUIMETRAS DE FORMACIN
DE PRECIPITADOS FRRICOS
164
ANEXO G. RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIN DE ION
FERROSO EN EL RANGO pH 2,5 7,0
170
ANEXO H. MEDICIN DEL COEFICIENTE DE RENDIMIENTO
BACTERIANO EN EL RANGO DE pH 2,0 4,0
177
ANEXO I. BIOOXIDACIN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO 182
ANEXO J. PUBLICACIONES INTERNACIONALES GENERADAS CON
LOS RESULTADOS DE ESTE TRABAJO DE TESIS
183
viii
NDICE DE FIGURAS
PRIMERA PARTE
Figura 2.1 Esquema del ciclo de Calvin resumido. 5
Figura 2.2 Representacin de las relaciones redox y metablicas en
Acidithiobacillus ferrooxidans.
6
Figura 2.3 Cadena de transporte directo de electrones propuesta por
Ingledew y colaboradores.
8
Blake II y colaboradores.
9
Yamanaka y colaboradores.
10
Elbehti y colaboradores.
11
Figura 2.7 Cadena de transporte directo de electrones propuesta en este
trabajo. En color rojo se resalta el transporte de electrones y en
color azul el flujo de protones.
13
Figura 2.8 Cadena de transporte directo y reverso de electrones
propuesto por Elbehti y colaboradores. En color rojo se resalta
el transporte de electrones y en color azul y verde el flujo de
protones para cada caso.
15
Figura 2.9 Transporte de electrones en la oxidacin de ion ferroso. En
color rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul
el flujo de protones.
21
Figura 2.10 Transporte de electrones en la oxidacin de azufre. En color
rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul el
flujo de protones.
21
Figura 2.11 Transporte de electrones en la oxidacin anaerbica de azufre.
En color rojo se resalta el transporte de electrones y en color
azul el flujo de protones.
22
Figura 2.12 Efecto del pH sobre la actividad oxidativa de Fe
2+
por
Acidithiobacillus ferrooxidans (Figura extrada de Pesic, 1993).
28
Figura 2.13 Poblacin de Acidithiobacillus ferrooxidans en funcin del pH
en muestras de relaves. (Figura extrada de Nordstrom y
Southam 1997).
31
Figura 2.14 Efecto de la temperatura sobre la actividad oxidativa de ion
ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans y su relacin con el
pH del medio. Figura tomada de MacDonald y Clark (1970).
33
ix
SEGUNDA PARTE
Figura 2.1 Celda electroqumica para medicin de actividad oxidativa
bacteriana a potencial controlado.
50
Figura 3.1 Curva de calibracin de electrodo de Eh como funcin de la
razn frrico / ferroso. Caso 1 g/l de hierro total a 30C con
medio basal.
54
Figura 3.2 Velocidad especfica de oxidacin en funcin de la
concentracin de ion ferroso.
55
Figura 3.3 Velocidad especfica de oxidacin de ion ferroso en funcin del
Eh de la solucin que se establece para cada corriente.
57
Figura 4.1 Correlacin entre valores calculados y experimentales de v
Fe
2+
.
Valores calculados usando expresin (17).
64
Figura 4.2 Dependencia de la velocidad de oxidacin bacteriana de ion
ferroso con el Eh (o la razn frrico/ferroso) y la concentracin
de ion ferroso en solucin, calculada utilizando las expresiones
(17) y (22).
65
Figura 4.3 Valores publicados por Harvey y Crundwell (1996) y ajuste al
modelo cintico presentado en este trabajo.
67
Figura 4.4 Diagramas corriente potencial en el mecanismo
electroqumico de la oxidacin bacteriana de ion ferroso con
70
TERCERA PARTE
Figura 2.1 Montaje experimental para medicin del efecto del pH en la
actividad oxidativa bacteriana.
77
Figura 2.2 Montaje experimental utilizado para la estimacin del
rendimiento en el crecimiento bacteriano al oxidar sulfato
ferroso.
82
Figura 3.1 Evolucin del Eh y pH. Poblacin de bacterias 5,5x10
7
cel/ml,
[Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH promedio 1,84.
86
Figura 3.2 Velocidad de oxidacin de ion ferroso. Poblacin de bacterias
5,5x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH promedio 1,84.
87
Figura 3.3 Efecto del pH sobre V
Max
. 89
Figura 3.4 Efecto del pH sobre K
S
. 89
Figura 3.5 K
S
en funcin de la concentracin de protones. Regresin
lineal de los datos en el rango de pH 1,27 2,06.
90
Figura 3.6 Evolucin de Eh y pH. Poblacin inicial de bacterias 2x10
7
cel/ml. Concentracin inicial de ion ferroso 0,5 g/l en medio
basal.
93
Figura 3.7 Velocidad de oxidacin de ion ferroso. [Fe
2+
]
inicial
= 0,5 g/l, no
inoculado, en medio basal.
97
Figura 3.8 Velocidad de oxidacin de ion ferroso. [Fe
2+
]
inicial
= 0,5 g/l,
97
x
Figura 3.9 Velocidad de oxidacin bacteriana de ion ferroso. [Fe
2+
]
inicial
=
0,5 g/l, inoculado, en medio basal.
99
Figura 3.10 Valores de V
max
calculados, en soluciones de medio basal con
2x10
7
cel/ml para diferentes [Fe
2+
]
inicial
.
100
max
calculados, en soluciones libres de nutrientes
con 2x10
7
2+
]
inicial
.
100
Figura 3.12 Masa acumulada de precipitados frricos, [Fe
2+
]
inicial
= 0,1 g/. 101
Figura 3.13 Masa acumulada de precipitados frricos, [Fe
2+
]
inicial
= 1,0 g/l. 101
Figura 3.14 Velocidad de oxidacin mxima. Soluciones de medio basal
con 1,0 g/l de ferroso inicial.
103
Figura 3.15 Razn masa de precipitados / nmero de bacterias, durante
pruebas de oxidacin con 1,0 g/l de ion ferroso inicial en medio
basal.
103
Figura 3.16 Evolucin de la velocidad de consumo de oxgeno y potencial
redox en experiencia con pH = 2,0. [Fe
2+
] inicial = 1,0 g/l.
106
Figura 3.17 Velocidad de consumo de oxgeno en funcin del Eh,
experiencia con pH = 2,0. [Fe
2+
106
Figura 3.18 Evolucin de la velocidad de consumo de oxgeno y dixido de
carbono en experiencia con pH = 2,0
107
Figura 3.19 Razn entre velocidad de consumo de dixido de carbono y
oxgeno en experiencia con pH = 2,0
107
Figura 3.20 Evolucin de la velocidad de consumo de oxgeno y dixido de
108
oxgeno en experiencia con pH = 4,0
108
oxgeno promedio en funcin del pH de cada experiencia.
109
Figura 4.1
Valores de
calc
max
V en funcin del pH.
112
Figura 4.2 V
Max
vs [H
+
]. Serie experimental con 1,0 g/l de ion ferroso inicial
en medio basal y 8x10
7
cel/ml. En color azul, datos
experimentales; en rojo modelo ajustado ec. (38).
114
Figura 4.3
+ 2
Fe
V vs pH calculada segn expresin (39). Se consideran
distintas concentraciones de frrico total y precipitacin de
acuerdo a Figura F.11. Concentracin de ion ferroso 1,0 g/l.
116
Figura 4.4
+ 2
Fe
V vs pH calculada segn expresin (39). Se consideran
distintas concentraciones de ion ferroso y frrico total cero.
117
CUARTA PARTE
Figura 2.1 Esquema del montaje utilizado en biooxidacin indirecta. 122
Figura 3.1 Potenciales redox en las semi-celdas para la operacin celda
bioelectroqumica con recambio de anolito.
125
Figura 3.2 Crecimiento bacteriano, oxidacin indirecta en reactor
bioelectroquimico versus ion ferroso total oxidado en la celda.
127
xi
NDICE DE TABLAS
PRIMERA PARTE
Tabla 2.1 Rango de pH ptimo para la oxidacin de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans. Valores de referencia.
30
Tabla 2.2 Temperatura ptima de oxidacin de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans en cultivos batch y continuos.
Valores de referencia obtenidos por mltiples investigadores.
34
Tabla 2.3 Efecto de aniones sobre la oxidacin de Fe(II) por
Acidithiobacillus ferrooxidans (Ingledew, 1982).
35
Tabla 2.4 efecto inhibitorio de algunos cationes en la oxidacin de ion
ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans
37
SEGUNDA PARTE
Tabla 2.1 Composicin del medio basal. 48
Tabla 3.1 Efecto del potencial aplicado sobre la velocidad de oxidacin y
el potencial redox de la solucin.
55
Tabla 3.2 Efecto de la concentracin de ion ferroso sobre la velocidad de
oxidacin y el potencial redox de la solucin para cada
potencial aplicado.
56
Tabla 4.1 Parmetros ajustados para expresin (17). 63
Tabla 4.2 Parmetros ajustados para expresin (22). 64
Tabla 4.3 Parmetros ajustados para expresin (17) con datos de Harvey
y Crundwell (1996).
67
TERCERA PARTE
Tabla 2.1 Composicin del medio basal. 75
Tabla 3.1 Parmetros ajustados para ecuacin tipo Monod en
experiencias a pH entre 1,27 y 2,60
88
Tabla 4.1 Parmetros ajustados de ecuacin (38) 114
Tabla 4.2 Valor de parmetros para expresin cintica (39). 115
xii
RESUMEN

La disolucin de minerales sulfurados en biolixiviacin, incluye una etapa de
oxidacin bacteriana de ion ferroso utilizando oxgeno disuelto como aceptor de
electrones. El ion frrico producido ataca posteriormente al sulfuro metlico en una
reaccin puramente qumica.

La cintica de oxidacin bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans
ha sido descrita normalmente en trminos de una expresin del tipo Monod. Sin
embargo, la evidencia experimental publicada sugiere un importante efecto del pH y
del Eh de la solucin sobre la velocidad de oxidacin, los cuales no estn
completamente caracterizados. En este trabajo de tesis se profundiza el estudio del
efecto del pH y del Eh sobre la velocidad de oxidacin de sulfato ferroso en
presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans.

El estudio de la influencia del Eh en la velocidad de oxidacin de ion ferroso se
realiz con una celda bioelectroqumica que permite realizar mediciones a potencial
controlado. Los resultados obtenidos permitieron validar un original modelo cintico
desarrollado que incorpora explcitamente el efecto del Eh y considera asimismo el
efecto de las concentraciones de ion ferroso y frrico. La expresin cintica obtenida
permite la descripcin de la cintica de oxidacin de ion ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans en un rango de potencial (0,56 a 0,84 V vs SHE) mucho ms amplio que
los modelos presentados con anterioridad. Los resultados muestran que con Eh <
0,65 V(SHE) la velocidad de oxidacin bacteriana depende slo de la concentracin
de ion ferroso. Cuando el Eh est entre 0,65 y 0,82 V(SHE) la oxidacin bacteriana
de ion ferroso disminuye al crecer la concentracin de ion frrico. Para Eh sobre 0,82
V(SHE) la actividad oxidativa bacteriana disminuye fuertemente por el aumento de
Eh, siendo nula cuando se alcanza Eh mximo de 0,84 V(SHE). El modelo cintico
construido permite relacionar el comportamiento de la velocidad de oxidacin
bacteriana de ion ferroso con las etapas principales de la cadena de transporte de
electrones del microorganismo.

El estudio de la influencia del pH en la zona de pH sobre 2,5 se efectu utilizando
una metodologa desarrollada por el autor que permite evaluar en forma separada la
influencia del pH y de la simultnea formacin de precipitados. Los resultados
muestran que a pH sobre 2,5 la disminucin de la velocidad de oxidacin bacteriana
de ion ferroso esta principalmente controlada por la disminucin en la concentracin
de protones en solucin. Sin embargo, existe una contribucin inhibitoria adicional
debido a la formacin de precipitados frricos en este rango de pH. Se encuentra
adems, que a pH sobre 5,0 la accin bacteriana se vuelve despreciable y
predomina la oxidacin qumica de ion ferroso. Con la informacin obtenida se
demostr que es posible lograr un efectivo aumento de la actividad oxidativa
bacteriana mediante un adecuado control de la concentracin de hierro (y formacin
de precipitados) y la acidez en solucin.

xiii
Se realizaron mediciones de velocidad de oxidacin bacteriana de ion ferroso en el
rango de pH de 1,3 a 2,5. Para ello se midieron velocidades iniciales de oxidacin
utilizando un electrodo de Eh a pH controlado. Se encontr que en este rango de pH
el efecto de la acidez es especialmente fuerte sobre la constante de afinidad con el
sustrato K
S
, aumentndola al disminuir el pH.

Integrando la informacin experimental de velocidades de oxidacin bacteriana de
ion ferroso en el rango de pH de 1,3 a 5,0, se formul una expresin cintica que
permite describir en forma adecuada la influencia de la concentracin de cido y de
la formacin de precipitados sobre la velocidad de oxidacin bacteriana de ion
ferroso en todo el rango de pH analizado.

Finalmente, se evalu el comportamiento de un reactor electroqumico para la
biooxidacin indirecta de ion ferroso en soluciones que inhiben la accin oxidativa de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Utilizando una celda de dos compartimentos se estudi
la oxidacin indirecta de ion ferroso en soluciones cloruradas inadecuadas para el
desarrollo bacteriano. Se encontr que la bacteria es capaz de sostener durante
tiempos prolongados el proceso de oxidacin indirecta y, adems, crecer utilizando
este proceso. El rendimiento obtenido para el crecimiento de los microorganismos en
estas condiciones es Y = 8,34 x 10
4
cel. / g Fe, un valor similar al reportado para la
oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans en medios de cultivo.

1
PRIMERA PARTE:
INTRODUCCIN Y ANTECEDENTES
1 INTRODUCCIN
Acidithiobacillus ferrooxidans
es una bacteria del genero thiobacilli,

quimiolitotrfica, que es capaz de oxidar ion ferroso y compuestos reducidos de
azufre en soluciones de cido sulfrico en presencia de oxigeno. En ambientes
anxicos es capaz de utilizar ion frrico como oxidante para la oxidacin de azufre
(Brock y Gustafson, 1976), sulfuros (Das y Mishra, 1996), hidrgeno (Drobner et
al., 1990) y de algunos compuestos orgnicos (Pronk et al., 1991). La energa
obtenida de los procesos oxidativos se utiliza en la fijacin de dixido de carbono,
mantenimiento celular y crecimiento.
Estos microorganismos se han estudiado ampliamente al comprobarse su
contribucin en la biolixiviacin de una variedad de minerales sulfurados (Brierley
and Brierley, 1999; Hansford and Vargas, 2001). En muchos casos, la
biolixiviacin ofrece ventajas econmicas, tcnicas y genera menor impacto
ambiental que los procesos pirometalrgicos de tratamiento de sulfuros. Plantas
comerciales de biolixiviacin para concentrados refractarios de pirita/arsenopirita
operan en Sudfrica, Gana, Australia y Brasil; y biolixiviacin en pilas de minerales
de cobre se realiza en Chile, Estados Unidos, Australia y Bulgaria (Brierley and
Brierley, 1999).
Para optimizar los parmetros de operacin en una planta de biolixiviacin es
conveniente, conocer el mecanismo y disponer de un modelo cintico para la
biolixiviacin de minerales sulfurados. Aunque existen variadas formas de accin
de los microorganismos (Crundwell, 2001) hay acuerdo en que el mecanismo

El genero Thiobacillus ha sido reclasificado recientemente y la especie Thiobacillus ferrooxidans

ha sido renombrada a Acidithiobacillus ferrooxidans (Kelly and Wood, 2000)
2
principal de catlisis bacteriana en la disolucin de minerales de sulfurados es
aquel identificado como mecanismo indirecto, que est basado en la oxidacin
bacteriana de ion ferroso con oxgeno disuelto de acuerdo con la reaccin:

O H ) SO ( Fe O 2 / 1 H 2 FeSO 2
2 3 4 2
bacteria
2 4
+ + +
+
(1)

El ion frrico producido puede luego atacar qumicamente a los sulfuros segn la
reaccin general:

+ + +
+ + +
2 0 2 3
Fe 2 S M MS Fe 2 (2)

donde M
2+
corresponde a un catin metlico divalente.

Se puede argumentar que, en la biolixiviacin de minerales sulfurados, alcanzar
altas velocidades de disolucin depende principalmente de una adecuada accin
bacteriana indirecta.
Adems de la disolucin de sulfuros metlicos, la habilidad de Acidithiobacillus
ferrooxidans para oxidar ion ferroso ha sido explotada en bioprocesos con relacin
al tratamiento de aguas (drenajes) cidas de mina, en procesos de desulfuracin
de carbn mineral, oxidacin de H
2
S en gas natural y tratamiento de residuos
orgnicos (Nemati et al., 1998). Estas aplicaciones muestran que la oxidacin
biolgica de sulfato ferroso es una operacin unitaria de relevancia industrial.
Dada su importancia creciente la oxidacin bacteriana de sulfato ferroso ha sido
estudiada en las ltimas dcadas. A continuacin se presenta una revisin de los
principales aspectos relativos a su mecanismo de reaccin y a las condiciones de
operacin que la favorecen, utilizando en particular Acidithiobacillus ferrooxidans.
3
2 ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS
2.1 Caractersticas generales de Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus ferrooxidans son bacterias con forma de bastn, gram negativas,
no forman esporulacin y tienen dimensiones de 0,5 m de ancho y 1,0 a 2,0 m
de largo con extremos redondeados (Rossi, 1990). Normalmente se encuentran
aisladas o en pares y solo ocasionalmente forman cadenas cortas. Son mtiles y
poseen un flagelo polar, encontrndose usualmente en aguas cidas de minas de
carbn y fierro. Adems, de acuerdo a su metabolismo poseen las caractersticas
que se indican a continuacin:
Autotrficas: su fuente de carbono para la sntesis celular es el dixido de
carbono. Adems, requiere nitrgeno (como amonio), azufre (como sulfato
o compuestos reducidos) y fsforo (en forma de fosfato) como nutrientes
para el crecimiento celular y sntesis, junto con trazas de metales como: Fe,
K, Mg, Na, Ca y Co.
Quimiolitotrfica: la energa para mantenimiento y crecimiento es obtenida a
partir de la oxidacin de compuestos reducidos de azufre y oxidacin de ion
ferroso. Adems, son capaces de oxidar hidrogeno (Drobner et al., 1990) y
compuestos orgnicos en algunos casos.
Aerbicas: Utilizan oxgeno como aceptor de electrones, sin embargo, se ha
mostrado que es adems anaerbica facultativa (Brock y Gustafson, 1976).
Mesfila: crece en condiciones de temperatura entre 10 y 45 C,
encontrndose el ptimo entre 28 y 33C dependiendo de la concentracin
total de fierro disuelto y el pH.
4
Acidfila: posee un pH ptimo de crecimiento entre 2,0 y 2,5 en la oxidacin
de sulfato ferroso. Cuando oxida compuestos de azufre mantiene altas
actividades oxidativas a pH superior a 4.
2.2 Metabolismo y bioenergtica en la oxidacin de ion ferroso
2.2.1 Metabolismo
Las rutas metablicas de Acidithiobacillus ferrooxidans aparentemente
corresponden a las rutas estndar en microorganismos quimiolitotrofos. Esta
bacteria posee un ciclo de Calvin para la fijacin de CO
2
, y rutas para la fijacin de
nitrgeno y fosfato (Ingledew, 1982). La fijacin de carbono requerida para la
sntesis de material celular y crecimiento, al realizarse a travs del ciclo de Calvin,
requiere de la presencia de ATP (Adenosn Trifosfato) y NADPH (Nicotinamida
Adenina Dinucletido Fosfato) en el citoplasma celular. Un esquema
representativo de este proceso se aprecia en la Figura 2.1. En esta figura 3-PGA
corresponde a 3-fosfoglicerato; G3P es gliceraldehido 3-fosfato; y RuBP es
ribulosa 1,5-bifosfato.
Para la obtencin de las molculas energticas requeridas para impulsar este ciclo
y las otras funciones metablicas del microorganismo, la bacteria obtiene la
energa asociada al proceso de oxidacin de ion ferroso (o compuestos reducidos
de azufre segn sea el caso) con oxigeno.
La transformacin energtica asociada al proceso oxidativo de ion ferroso puede
ser resumida en dos procesos relacionados: El transporte directo de electrones
desde el ion ferroso al oxgeno, que mediante un mecanismo de quimiosmosis
(que ser discutido posteriormente) produce ATP; y un mecanismo reverso de
transporte de electrones que utilizando una parte de la energa disponible en el
transporte directo, transfiere electrones necesarios desde el ion ferroso para la
reduccin de NADP
+
a NADPH.
5
Figura 2.1: Esquema del ciclo de Calvin resumido.
En trminos de una escala de potenciales redox, los procesos de transporte
directo e indirecto de electrones pueden ser esquematizados de acuerdo a la
Figura 2.2, (Ingledew, 1982).
Para la fijacin de cada molcula de dixido de carbono la bacteria utiliza a lo
menos tres molculas de ATP y dos molculas de NADPH (Ver Figura 2.1). La
obtencin de estos compuestos se realiza en el mecanismo asociado a la
oxidacin de ion ferroso (Figura 2.2).
6
La sntesis de ATP utiliza transferencia espontnea de electrones entre el ion
ferroso en solucin y el oxigeno disuelto que ingresa a la clula. Este proceso es
denominado transporte directo de electrones y aparece con una flecha gruesa en
la Figura 2.2. La transferencia de electrones se realiza utilizando una cadena de
reacciones bioqumicas, que en una secuencia de pares redox permite formar una
cadena de transporte de electrones, que se discute mas adelante.
Figura 2.2: Representacin de las relaciones redox y metablicas en
En el caso de la sntesis orgnica, se requiere tambin la reduccin de NADP
+
a
NADPH utilizando como reductor al ion ferroso. Esta reaccin no es espontnea,
ya que la diferencia de potencial de la reaccin es negativa. En consecuencia el
7
transporte de electrones se efecta en un modo reverso, es decir, utiliza una
fuerza electromotriz externa. La energa de este transporte reverso corresponde a
una parte de la obtenida de la oxidacin de ion ferroso con oxigeno. Esto es
posible, dado que el mecanismo de transporte directo de electrones utiliza ms del
90% de los electrones cedidos por el ion ferroso, en cambio el transporte reverso
utiliza un mximo del orden de un 10% de los mismos (Ingledew, 1982).
A continuacin se discuten brevemente los mecanismos de transporte de
electrones en este microorganismo y se proponen los esquemas ms probables
para representar estos procesos.
2.2.2 Mecanismo de transporte directo de electrones
En la variedad de los microorganismos oxidantes de fierro que pueden ser
aislados de aguas cidas de mina o directamente de sulfuros metlicos,
Acidithiobacillus ferrooxidans ha recibido la mayor atencin. Este hecho ha sido,
probablemente influido por la facilidad para su aislamiento y mantencin en
cultivos de laboratorio (Blake et al., 1993). A pesar de ello el mecanismo utilizado
por este microorganismo para la oxidacin de ion ferroso, utilizando oxigeno
disuelto como aceptor de electrones, no ha sido establecido en forma definitiva.
En las ltimas tres dcadas, se han identificado una variedad de componentes
celulares que pueden estar involucrados en el proceso oxidativo. Entre estos
componentes se incluyen: rusticianina, tres o ms citocromos de tipo c, citocromos
de tipo a, protenas con centros de Fe-S y complejos polinucleares de ion frrico y
sulfato en la pared exterior celular. La organizacin de estas especies en la
cadena de transporte de electrones para la oxidacin de ion ferroso no est
definida y su discusin ser llevada a cabo en esta seccin.
Ingledew (1986) propuso que los electrones derivados de la oxidacin de ion
ferroso disuelto son conducidos a travs de un complejo polinuclear de fierro
8
ubicado al interior de la pared celular. Estos equivalentes de reduccin capturados
son luego transferidos al oxigeno mediante una cadena de transporte a travs del
periplasma y la membrana plasmtica. La cadena propuesta se puede observar en
la Figura 2.3.
Ingledew y sus colaboradores (Ingledew and Cobley, 1980; Ingledew, 1982;
Ingledew, 1986; Ingledew and Houston, 1986) demostraron que tanto la
rusticianina como los citocromos c solubles se encuentran en el periplasma,
adems, existe otro citocromo c enlazado a la membrana plasmtica y el
citocromo a se localiza a travs de ella. De igual forma se sugiere que la reduccin
de oxigeno se lleva a cabo en el periplasma celular. El proceso respiratorio puede
as convertir la energa de potencial redox disponible entre los pares de reduccin
y oxidacin en un diferencial electroqumico de protones
. Este diferencial impulsa

el proceso de fosforilacin oxidativa para la obtencin de ATP (Ingledew, 1982).
Figura 2.3. Cadena de transporte de electrones propuesta por Ingledew y
colaboradores.
La rusticianina es una protena soluble con centros de cobre que presenta una
gran abundancia en el periplasma de Acidithiobacillus ferrooxidans (Ingledew,
9
1982; Blake and Shute, 1994). Sin embargo, la reaccin de oxidacin de ion
ferroso y sus complejos solubles en medio sulfato con rusticianina es muy lenta y
en consecuencia esta especie no es probablemente el aceptor primario de
electrones (Blake and Shute, 1987). Otra dificultad encontrada por Blake al
modelo propuesto por Ingledew es el rol asignado a la cubierta polinuclear de ion
frrico de la bacteria. Se argumenta que es difcil diferenciar entre una pelcula de
fierro organizada y de funciones especficas y una cubierta de Fe(III) que se puede
esperar de acuerdo con la polaridad negativa de pared celular relativa a un
ambiente de abundante fierro disuelto (Blake and Shute, 1994).
En acuerdo con esta evidencia Blake y colaboradores (Blake et al, 1993; Blake
and Shute, 1994) propusieron que el aceptor inicial de electrones es un citocromo
c soluble, que luego reduce la rusticianina. El mecanismo de transporte de
electrones en consecuencia se muestra en la Figura 2.4.
Figura 2.4. Cadena de transporte de electrones propuesta por Blake II y
colaboradores.
Tambin, Yamanaka y colaboradores (Yamanaka et al., 1993; Yamanaka and
Fukumori, 1995) aislaron y caracterizaron una serie de enzimas y protenas redox

Se utiliza la palabra protones o H

+
por simplicidad, ya que en soluciones acuosas la especie
10
que participan en la oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans.
Ellas son citocromos c solubles, rusticianina, citocromos c enlazados a la
membrana, un citocromo a incrustado a travs de la membrana plasmtica y una
protena Fe/S que actuara como Fe(II) citocromo c oxidoreductasa. Esta ltima
protena posee una secuencia de aminocidos similar a las protenas fierro
azufre de alto potencial redox encontradas en organismos fotosintticos. Esta
protena reduce rpidamente citocromos c en presencia de ion ferroso, pero no
puede reducir rusticianina en ausencia de citocromo c. Utilizando un razonamiento
energtico, Yamanaka et al. (1993) sugieren adicionalmente que la reduccin de
oxigeno se produce en la cara periplasmtica de la membrana plasmtica. Estos
razonamientos y evidencias le sugirieron plantear un mecanismo alternativo de
transporte de electrones para la oxidacin de ion ferroso que se presenta en la
Figura 2.5.
Figura 2.5. Cadena de transporte de electrones propuesta por Yamanaka y
colaboradores.
Acidithiobacillus ferrooxidans es un microorganismo acidfilo, sin embargo, valores
de pH menores a 1,5 producen una disminucin en su actividad oxidativa de ion
ferroso (Ingledew, 1982; Nemati et al., 1998). Este fenmeno corresponde a un

presente es H
3
O
+
(ion hidronio) u otras especies hidratadas.
11
proceso inhibitorio reversible (Sand, 1989) y en consecuencia se puede
argumentar que el proceso enzimtico de transporte de electrones posee etapas
en las cuales existe transferencia de protones o especies que al estar protonadas
se vuelven inactivas. Appia-Ayme et al. (1999) encontraron que los genes de
Acidithiobacillus ferrooxidans sugieren que la citocromo c oxidasa es del tipo aa
3
.
Esta oxidasa tambin se encuentra en la estructura de las mitocondrias donde es
reconocida la translocacin de protones asociada a la oxidacin de oxigeno (Voet
and Voet, 1995). Un modelo simple que resulta coherente con estos resultados,
indica la translocacin de protones asociada a la entrada de electrones desde la
oxidacin de ion ferroso hacia el oxigeno molecular en el citoplasma (Nemati et al.,
1998; Elbehti et al., 2000). Este esquema corresponde a una presentacin
comnmente aceptada para los procesos de fosforilacin oxidativa utilizando la
teora quimiosmtica (Slater et al., 1985) como se aprecia en la Figura 2.6.
Figura 2.6. Cadena de transporte de electrones propuesta por Elbehti y
colaboradores.
En el esquema de la Figura 2.6 se hace presente otro aspecto relevante del
proceso de oxidacin de ion ferroso que es la definicin de la fuerza motriz
protnica suficiente para producir el proceso de fosforilacin de ADP. El circuito de
H
+
que se define en la membrana plasmtica es clave para la generacin de ATP
12
y el crecimiento bacteriano y en consecuencia la primera pregunta que debemos
responder es Cmo se establece el
H
+ necesario?. Este hecho es relevante
para resolver si el mecanismo es activo (consecuencia de bombeo de protones
asociado a la actividad oxidativa) o pasivo (se genera como consecuencia de la
secuencia de pares redox del sistema y la qumica de la membrana).
Para Acidithiobacillus ferrooxidans se encuentra que durante el proceso oxidativo
el pH citoplasmtico permanece constante, en consecuencia la diferencia de pH a
travs de la membrana plasmtica queda solo definido por el pH del entorno
(Ingledew, 1982). Un hecho similar se encuentra en otros microorganismos como
Thiobacillus acidophilus (Zychlinsky y Matin, 1983). De igual forma, se encuentra
que la diferencia de potencial elctrico () que se establece entre ambas caras
de la membrana citoplasmtica es relativamente constante y suficiente para
mantener la diferencia de pH. Esta condicin se mantiene an en condiciones de
ausencia de oxidacin e insuficiente ATP para producir su hidrlisis que podra
restablecer el equilibrio de protones (Zychlinsky y Matin, 1983).
Estos antecedentes indican que la mantencin de la diferencia de pH en estos
microorganismos acidfilos es un proceso pasivo, es decir, el existente es
suficiente para mantener un pH de 2 o 3 puntos. En consecuencia la fuerza
motriz para la produccin de ATP requiere de un circuito de protones que no est
sustentado en la diferencia de pH entre la solucin y el interior del
microorganismo. Este hecho es claramente sealado por Ingledew (1986) al
expresar que
H
+ se obtiene del proceso respiratorio que convierte la diferencia
de energa potencial entre los pares redox. Esta energa electroqumica es
convertida en energa qumica (ATP) a travs de un mecanismo de quimiosmosis.
En resumen, los antecedentes anteriores muestran que la fuerza motriz protnica
que produce la fosforilacin de ADP para dar ATP, est bsicamente definida por
la diferencia de potencial redox entre el par ferroso / frrico y el par oxigeno /
agua. El proceso oxidativo consume protones en el citoplasma ([H
+
] consumido)
13
y simultneamente realiza la translocacin de protones fuera de la membrana
citoplasmtica ([H
+
] translocado). Adicionalmente el ion frrico producido es
hidrolizado en el exterior, generando una diferencia mayor de acidez ([H
+
]
hidrlisis).
En la Figura 2.7 podemos sintetizar las conclusiones de este anlisis y la siguiente
expresin nos indica la sumatoria de trminos que podran definir la fuerza motriz
protnica para la formacin de ATP.
[H
+
] total = [H
+
] (consumido) + [H
+
] (translocado) + [H
+
] (hidrlisis) (3)
Figura 2.7. Cadena de transporte de electrones propuesta en este trabajo. En
color rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
2.2.3 Mecanismo de transporte reverso de electrones
En adicin al mecanismo de sntesis de ATP en la membrana celular, se desarrolla
simultneamente un proceso de transporte reverso de electrones orientado a la
reduccin de NADPH a partir de NADP
+
. Esta reaccin es imprescindible para la
fijacin de CO
2
y los procesos de sntesis orgnica que ocurren al interior de la
estructura celular. Esta reduccin tambin utiliza la oxidacin de ion ferroso, sin
14
embargo, al ser esta reaccin termodinmicamente desfavorable (diferencia de
energa libre positiva), se requiere una fuerza motriz externa para incentivar la
transferencia de electrones. Este proceso utiliza una parte de la energa disponible
de la oxidacin de ion ferroso por oxgeno (Ingledew, 1982). En esta reaccin la
diferencia de potencial electroqumico de protones slo se encuentra en la forma
de pH. Aprovechando el potencial qumico de la diferencia de actividad de los
protones en ambas caras de la membrana plasmtica, se impulsa el transporte de
electrones asocindolo al ingreso simultaneo de protones a la clula.
El mecanismo de transporte reverso de electrones utiliza una pequea cantidad
del flujo total de electrones a travs de la membrana celular y consecuentemente
la concentracin de sus componentes en la clula es pequea. Los elementos
mencionados han constituido un obstculo en la investigacin de la cadena de
transporte reverso de electrones en Acidithiobacillus ferrooxidans y solo se pueden
mencionar un par de contribuciones que sugieran mecanismos bioqumicos para la
ocurrencia del proceso (Ingledew, 1982; Elbehti et al, 2000).
Ingledew (1982) sugiri la existencia de centros de fierro-azufre, un citocromo c
1
,
una quinona y citocromos b en la cadena de transporte de electrones y de acuerdo
con sus potenciales redox es de esperar que participen en la cadena de transporte
entre el ion ferroso y NADP
+
. Adicionalmente, como la fuerza motriz del proceso
est slo en forma de pH, se debe transportar en forma activa un mnimo de 4
protones para entregar la energa necesaria. Ingledew (1982) sugiri tres
mecanismos para acoplar el transporte de electrones al ingreso de protones,
aunque no encontr evidencia suficiente para completar una hiptesis slida.
Un slido complemento al trabajo de Ingledew lo encontramos en las
publicaciones de Elbehti et. al. (1997; 1999; 2000) y Brugna et. al. (1999). En
estos trabajos se presenta evidencia concluyente de la existencia de enzimas del
tipo complejo citocromo bc
1
en Acidithiobacillus ferrooxidans y se caracteriza en
detalle su estructura y funcionamiento. De acuerdo con Elbehti et al (1997), en la
15
estructura celular se encuentran citocromos c
1
enlazados a la membrana
plasmtica, citocromos b y protenas de tipo Rieske. Estas tres sub-unidades
sugieren la existencia de un complejo enzimtico del tipo bc
1
. Basados en la
evidencia experimental Elbehti et al (2000) propusieron un mecanismo para el
transporte reverso de electrones que resulta coherente con las aseveraciones de
Ingledew y permite explicar la bioenergtica del proceso.
El mecanismo propuesto por Elbehti et al (2000) para el transporte directo y
reverso de electrones se ilustra en la Figura 2.8.
Figura 2.8. Cadena de transporte directo y reverso de electrones propuesto por
Elbehti y colaboradores. En color rojo se resalta el transporte de electrones y en
color azul y verde el flujo de protones para cada caso.
En el mecanismo propuesto (Elbehti et al., 2000) el proceso de transporte directo
de electrones que ocurre en la oxidacin de ion ferroso con oxigeno disuelto
permite la acumulacin de ATP en el citoplasma celular. Se supone que la
16
concentracin de ATP regula la actividad de la citocromo c oxidasa, disminuyendo
su actividad cuando la razn ATP/ADP es alta. Cuando se acumula ATP, la fuerza
motriz de protones disminuye y se activa la hidrlisis de ATP, regenerando la
fuerza motriz a travs de la membrana. Este gradiente electroqumico de protones
es utilizado para el transporte reverso de electrones a travs de los complejos bc
1
y NDH-1 (NADH-ubiquinona oxidoreductasa de tipo 1), permitiendo la formacin
de NADPH requerida para la fijacin de CO
2
. La razn ATP/ADP disminuye en
este proceso y permite la activacin de las oxidasas de citocromo c (transporte
directo) sintetizando nuevamente ATP. En este modelo la razn ATP/ADP controla
el balance de los equivalentes de reduccin del ion ferroso entre la ruta de
transporte directo y transporte reverso en Acidithiobacillus ferrooxidans.
2.2.4 Reduccin de Ion frrico
De acuerdo con Brock y Gustafson (1976) Acidithiobacillus ferrooxidans tiene la
potencialidad de reducir ion frrico mientras realiza la oxidacin de azufre
elemental. La reduccin es medible solamente en condiciones anaerbicas de
acuerdo con estos autores. En contraste, Sand (1989) sugiere que esta bacteria
es capaz de reducir ion frrico en la oxidacin de azufre an en presencia de aire.
En condiciones normales, el ferroso generado en la reduccin es rpidamente
oxidado haciendo imposible su deteccin, pero al aumentar la acidez (pH menor
que 1,2) se produce la inhibicin del proceso oxidativo de ion ferroso,
observndose la reduccin de frrico. Este proceso inhibitorio es reversible siendo
el tiempo de respuesta del cultivo bacteriano relativamente corto (entre uno y dos
das). Es decir, bacterias que al ser expuestas a valores de pH menores que 1,2
han dejado de oxidar ion ferroso, reinician la actividad oxidativa de ion ferroso al
volver a mayores valores de pH (1,8).
Pronk et al. (1992) demostraron que Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de
crecer en el proceso de oxidacin anaerbica de azufre con frrico como aceptor
de electrones. La velocidad de crecimiento es similar a la velocidad obtenida en la
17
oxidacin aerbica de compuestos de azufre con el mismo microorganismo. En
consecuencia se puede postular que la bacteria es anaerbica facultativa. En el
mismo trabajo (Pronk et al., 1992) se demostr que el rendimiento del crecimiento
bacteriano para la oxidacin de azufre utilizando ion frrico como aceptor de
electrones es similar al rendimiento en la oxidacin de ion ferroso utilizando
oxigeno como aceptor de electrones. En contraste, en el proceso de oxidacin de
azufre (o compuestos reducidos de azufre) con oxgeno como aceptor de
electrones el rendimiento es ms que el doble que el anterior. Este resultado es
consistente con la idea de que en la reduccin anaerbica de ion frrico la cadena
de transporte de electrones es similar a la utilizada en la oxidacin aerbica de ion
ferroso.
A pesar de lo anterior, se ha demostrado que la oxidacin bacteriana de
compuestos reducidos de azufre puede ocurrir en ausencia de actividad oxidativa
de ion ferroso. Cabrejos et al. (1999) mostraron que mutando el microorganismo
utilizando cadenas de insercin nativas del tipo IST1 se puede activar o desactivar
la capacidad de Acidithiobacillus ferrooxidans para oxidar ion ferroso, manteniendo
en todos los casos la capacidad de oxidar compuestos reducidos de azufre. En
consecuencia existe a lo menos una parte de la cadena de transporte de
electrones de la oxidacin de ion ferroso que no es requerida para la oxidacin de
azufre. Esta conclusin es tambin presentada por Pronk y Johnson (1993).
Corbett e Ingledew (1987) y Pronk et al. (1991) demostraron que tanto el proceso
de oxidacin de azufre utilizando oxigeno o ion frrico como aceptor de electrones
son inhibidos al adicionar HOQNO (2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide). Este
compuesto es un inhibidor especfico de la transferencia de electrones en los
complejos enzimticos de tipo bc
1
. Estos resultados indican que el complejo bc
1
participa en la cadena de transporte para la oxidacin de compuestos reducidos
de azufre, tanto en la oxidacin aerbica o anaerbica. En consecuencia los
aceptores primarios de electrones del azufre, y parte de su cadena de transporte
18
de electrones en ambos mecanismos de oxidacin deben ser similares (o los
mismos).
Tambin se ha presentado evidencia del crecimiento de Acidithiobacillus
ferrooxidans utilizando sulfuros metlicos como donante de electrones bajo
condiciones anaerbicas (Donati et al., 1997). Sin embargo, de acuerdo con los
modelos de Shippers et al. (1999) se puede esperar que el mecanismo de
oxidacin sea similar al considerado en la oxidacin de azufre.
De los antecedentes sealados se puede concluir que: la oxidacin de azufre
utilizando la reduccin de ion frrico por Acidithiobacillus ferrooxidans, utiliza una
parte de la cadena de transporte de electrones asociada a la oxidacin aerbica
de oxigeno y, adems, una parte de la cadena de transporte de electrones
asociada a la oxidacin aerbica de azufre.
2.2.5 Discusin
Los intentos por elucidar la cadena de transporte de electrones en la oxidacin de
ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans han permitido estudiar una cantidad
importante de enzimas que se encuentran en la estructura de la bacteria, ya sea
en su periplasma, asociadas a la membrana o como estructuras
transmembrnicas. La cadena de transporte no es an comprendida
completamente y se han propuesto distintas alternativas para el mecanismo de
oxidacin. Sin embargo, se ha comprobado el rol crtico que presentan en la
cadena de transporte directo de electrones: la rusticianina, citocromos c solubles y
otros asociados a la membrana plasmtica y un citocromo a que acta como
citocromo c oxidasa, reduciendo oxigeno en el espacio citoplasmtico.
En la cadena de transporte reverso la situacin es aun ms incierta, aunque los
recientes trabajos de Elbehti et al. (1999, 2000) entregan una propuesta bastante
19
razonable respecto del mecanismo de transporte. Un aspecto de gran inters dice
relacin con la resolucin del mecanismo de transporte para la oxidacin de
compuestos reducidos de azufre. La interaccin de este mecanismo con las
cadenas de transporte asociadas a la oxidacin de ion ferroso ha sido propuesta
(Pronk et al., 1992), pero resulta ms probable solo una interaccin a nivel del
complejo bc
1
.
Algunas de las claves de la interaccin de las distintas cadenas de transporte de
electrones de esta bacteria se pueden buscar en los procesos de reduccin
anaerbica de ion frrico utilizando azufre como donante de electrones. La
evidencia contenida en estos trabajos, indica que la reduccin de ion frrico
involucra algunas enzimas asociadas a la oxidacin de ion ferroso. De igual forma
la oxidacin de azufre en las situaciones aerbica y anaerbica sera el resultado
de un mecanismo comn.
Realizando una analoga con la cadena de transporte de electrones normalmente
aceptada para la respiracin en mitocondrias (Voet and Voet, 1995), se proponen
configuraciones de las cadenas de transporte de electrones para: procesos
aerbicos de oxidacin de ion ferroso (Figura 2.9), oxidacin aerbica de azufre
(Figura 2.10), y para la reduccin anaerbica de ion frrico (Figura 2.11) utilizando
azufre como donante de electrones. Para sugerir estos mecanismos de oxidacin
se han tomada en cuenta algunos resultados de la literatura que al ser
considerados conjuntamente se integran en adecuadamente en estas
representaciones. A continuacin se enumeran estos elementos:
1 Es posible desacoplar la oxidacin de ion ferroso del proceso de oxidacin
de azufre. De acuerdo con el mecanismo propuesto (Figura 2.10) en ausencia de
fierro disuelto la oxidacin de azufre puede desarrollarse perfectamente.
2 En condiciones aerbicas la velocidad de oxidacin de ion ferroso es
bastante ms rpida que la velocidad de oxidacin de azufre. Lo anterior se puede
explicar s se supone que en ambos procesos oxidativos la etapa limitante en la
cintica no es la transferencia de electrones al oxgeno sino que se origina en la
20
cadena de transporte periplasmtica en el caso del ion ferroso y en el paso de los
electrones a travs de su aceptor primario el complejo bc
1
para la oxidacin de
azufre.
3 La velocidad de oxidacin de azufre es la misma en condiciones aerbicas
(con oxigeno como aceptor de electrones) o anaerbicas (siendo el ion frrico
aceptor de electrones). En estos mecanismos una parte importante de la cadena
de transporte de electrones es la misma para ambos procesos de oxidacin y es
esta cadena precisamente la que limita el proceso de transporte de electrones.
4 El rendimiento (carbono fijado por mol de electrones transferido) en la
oxidacin de azufre es ms que el doble cuando se respira oxigeno, respecto del
caso donde el aceptor de electrones es el ion frrico. Como se aprecia en las
Figuras 2.10 y 2.11, cuando se utiliza oxgeno la oxidacin de azufre realiza la
translocacin de un nmero mayor de electrones que en la respiracin de ion
frrico. En consecuencia la cantidad de energa electroqumica disponible es
mayor para cada mol de azufre oxidado, y por lo tanto el rendimiento es mayor.
5 El rendimiento en la oxidacin de ion ferroso es similar al rendimiento
obtenido en la oxidacin anaerbica de azufre. Esto se explica porque en ambos
casos el paso de los electrones solo incluye un complejo enzimtico y se podra
esperar que el nmero de protones translocados (y consumidos en el caso
aerbica) sea similar aportando una energa electroqumica aprovechable similar.
Como resumen del anlisis de la literatura y las hiptesis presentadas se
presentan a continuacin esquemas propuestos para la organizacin de las
cadenas de transporte de electrones en el microorganismo.
21
Figura 2.9. Transporte de electrones en la oxidacin de ion ferroso. En color rojo
se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
Figura 2.10. Transporte de electrones en la oxidacin de azufre. En color rojo se
resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
22
Figura 2.11. Transporte de electrones en la oxidacin anaerbica de azufre. En
color rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
Al presentar las interacciones entre las distintas cadenas de transporte de
electrones para la oxidacin de ion ferroso y azufre en las Figuras 2.9, 2.10 y 2.11
resulta evidente que para ambas se considera el mismo conjunto de estructuras
enzimticas, las cuales han sido reportadas en la literatura. Se espera que, de
acuerdo con las condiciones de desarrollo del microorganismo, la concentracin
de las distintas protenas pueda variar de acuerdo a procesos de seleccin natural
y adaptacin. De esta forma se explica la existencia de etapas (retardo) en el
crecimiento cuando se cambia un cultivo de microorganismos desde un sustrato a
otro.
De acuerdo con esta discusin y las hiptesis presentadas se puede esperar que,
en funcin con el sustrato disponible y las condiciones redox de la solucin
circundante, todos los procesos oxidativos pueden ocurrir en forma simultanea, o
bien pueden favorecerse solo algunos de ellos dependiendo de la cantidad de
energa que la bacteria es capaz de utilizar. Es decir, en forma espontnea la
complejidad de la red enzimtica de transporte de electrones es capaz de
23
adaptarse a las condiciones termodinmicas presentes y prepararse para
aprovechar al mximo la energa disponible.
2.3 Oxidacin bacteriana de ion ferroso
2.3.1 Cintica de oxidacin
Se sabe experimentalmente que la velocidad de oxidacin qumica de ion ferroso
con oxgeno (reaccin que termodinmicamente es espontnea) aumenta hasta
seis ordenes de magnitud en sistemas donde existe una poblacin bacteriana de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Este hecho indica que la oxidacin se encuentra
directamente relacionada con la actividad y crecimiento de esta bacteria.
Especficamente se sabe que la bioenergtica del microorganismo se basa en la
oxidacin de ion ferroso (seccin 2.2.1), siendo el aceptor final de electrones el
oxgeno normalmente. Para la oxidacin de ion ferroso podemos expresar la
velocidad de oxidacin es de la forma que se indica:
Y
N
r
dt
Fe d
Fe
] [
2
2
= =
+
+
(4)
donde :
: es la velocidad especifica de crecimiento del cultivo bacteriano. [1 / hr]
dt
dN
N
1
= (5)
N : es el nmero de bacterias / unidad de volumen.
Y : es el coeficiente de rendimiento. [clulas generadas / g hierro oxidado]
En esta expresin cintica y las que siguen se considera que el volumen de
solucin es constante.
Es necesario definir en forma adecuada una expresin para la velocidad
especfica de crecimiento , de acuerdo con la disponibilidad de sustrato. El
24
modelo ms tradicional asume que para el crecimiento de un cultivo de
microorganismos opera una serie de mecanismos enzimticos que se encuentran
limitados por una etapa tambin enzimtica, en funcin de un sustrato limitante S:
P E ES
ES S E
k
k
k
+

+
3
2
1
(6)
Segn este mecanismo se obtiene una expresin cintica del tipo Michaelis
Menten para el caso en que el ion ferroso es el sustrato limitante:
m
Max
K Fe
Fe
+
=
+
+
] [
] [
2
2
(7)
En esta ecuacin
max
es la mxima actividad alcanzable por el microorganismo y
K
m
es la constante de Michaelis Menten que corresponde a la cantidad de
sustrato necesaria para que la actividad sea igual a la mitad de la actividad
mxima. Esta expresin fue propuesta por Monod para el crecimiento bacteriano
con un sustrato limitante y ha recibido amplia atencin (Kovrov-Kovar y Egli,
1998).
El modelo propuesto por Monod permite una adecuada modelacin de la velocidad
de oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin embargo, los
parmetros del modelo presentan una fuerte variacin al aplicar amplias
variaciones en la concentracin de clulas, concentracin de ion ferroso, la
concentracin de ion frrico, concentracin de cationes metlicos, pH, Eh,
temperatura, fuerza inica, etc. Estos elementos indican que se debe modificar el
modelo para obtener una expresin cintica que de cuenta con ms precisin
adems de la concentracin de ion ferroso del efecto de las restantes condiciones
de la solucin.
En particular, se han propuesto dos esquemas generales de inhibicin: Inhibicin
competitiva e inhibicin no competitiva para intentar la comprensin del efecto de
algunos cationes sobre la actividad oxidativa y crecimiento bacteriano, a saber:
25
1 Inhibicin competitiva: En este caso se supone que un ion especfico o
especie (X) utiliza el sitio activo en la membrana celular bloqueando la enzima (E)
(De et al., 1997; Lizama y Suzuki, 1989a; Nagpal, 1997; entre otros autores). De
acuerdo a esta concepcin, en el modelo de la ecuacin (6) se debe agregar la
siguiente reaccin.
EX X E
k
k

+
5
4
(8)
El ion inhibidor (X) bloquea en forma reversible el sitio de reaccin del sustrato
compitiendo por tanto con l. Uno de los casos ms estudiados para esta situacin
es el del ion frrico, que siendo producto de la reaccin, es capaz de inhibirla. Del
mismo modo se ha reportado inhibicin competitiva por plata (De et al., 1997),
arsnico (Harvey y Crundwell, 1997), etc. Incluso se ha sugerido que altas
concentraciones de bacterias provocan su propia inhibicin. Esto puede ser
explicado, al considerar que en la membrana celular se encuentran enzimas que
contiene ion frrico y en consecuencia el contacto con otra clula produce el
bloqueo de los sitios activos (Suzuki et al., 1989; Nemati y Webb, 1997).
Al incorporar en el mecanismo cintico una serie de inhibidores competitivos (X
i
)
que actan de acuerdo a la ecuacin (8) se puede modificar la expresin cintica y
obtener la expresin que sigue (Nagpal, 1997):
)
] [
1 ( ] [
] [
2
2
+ +
=
+
+
i i
i
m
Max
K
X
K Fe
Fe
(9)
2 Inhibicin no competitiva: en este caso se asume que el ion o especie (X)
reacciona con el complejo intermedio enzima sustrato (ES) en forma reversible,
produciendo el bloqueo momentneo del complejo y no permitiendo que se
complete la reaccin (De et al., 1997; Nagpal, 1997; Braddock, 1984; entre otros).
Para representar esta accin inhibitoria al mecanismo (6) de reaccin se debe
agregar la reaccin:
26
ESX X ES
k
k

+
5
4
(10)
De esta forma la especie produce inhibicin del proceso oxidativo en forma no
competitiva con el sustrato. De et al. (1997) describieron la inhibicin no
competitiva por accin de mercurio; Kupka y Kupskov (1999) presentaron
inhibicin no competitiva por nquel y Nemati et al. (1998) indicaron en su revisin
la existencia de inhibicin no competitiva por accin de ion frrico.
Los inhibidores no competitivos en trminos simplificados, actan disminuyendo la
efectividad de los sitios activos en el corto plazo, con lo cual producen una
disminucin aparente del valor de la mxima velocidad de actividad,
Max
. Se
puede esperar que al existir una coleccin de inhibidores competitivos (X
i
) en el
medio, la expresin que representa la velocidad de oxidacin de ion ferroso y
crecimiento bacteriano puede expresarse por la ecuacin:
m
i i
i
Max
K Fe
Fe
K
X
+
+
=
+
+
] [
] [
)
] [
1 (
2
2
(11)
Lizama y Suzuki (1989a), quienes describieron el efecto sinrgico inhibitorio de la
presencia de ion frrico y la concentracin de bacterias, indicaron que la mejor
forma de describir el fenmeno es adicionando a los trminos de inhibicin
competitiva correspondientes a cada uno (frrico y bacterias) un tercer trmino
asociado a la interaccin entre ellos.
La presencia de una alta concentracin de sustrato puede provocar un efecto
inhibitorio sobre la actividad bacteriana. Tan et al. (1996) presentaron una
expresin general basada en la termodinmica estadstica que representa el
efecto de la inhibicin por sustrato en la actividad de acuerdo a la expresin
siguiente,
27
=
=
=
m
i
i
i
n
i
i
i
Max
S
S
0
1
] [ *
] [ *
(12)
que en el caso ms sencillo se simplifica a la expresin:
2
2 1
1
] [ * ] [ * 1
] [ *
S B S B
S A
+ +
= (13)
Se ha encontrado que en el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans es posible
modelar la inhibicin por sustrato con una expresin de la forma (13). Nikolov y
Karamanev (1992) utilizaron una expresin como esta, al igual que Nemati y Webb
(1996). Estos autores encontraron que esta inhibicin por sustrato es amortiguada
por una alta concentracin de clulas en solucin.
2.3.2 Efecto del pH
Al utilizar ion ferroso como fuente de energa, Acidithiobacillus ferrooxidans es
capaz de crecer en distintas condiciones de acidez, habindose reportado
actividad oxidativa en el rango de pH entre 1,0 y 7,0. Recordando que el pH
interno de la bacteria se mantiene en un valor cercano a 6,5 a pesar de las
condiciones del entorno, la bacteria esta equipada con un mecanismo eficiente
que le permita adecuarse a las variaciones de acidez del medio externo. Las
bacterias acidfilas tienen una estructura de su pared celular, o ms
probablemente de su membrana citoplasmtica, capaz de contener el cido
externo y adecuarse a sus variaciones. En este sentido Amaro et al.(1991)
encontraron que un cambio entre pH 1,5 y 3,5 involucra variaciones visibles en la
composicin de protenas de la clula, lo cual indica un mecanismo de adaptacin.
De acuerdo con los antecedentes presentados en la seccin 2.2 resulta claro que
la mantencin de una diferencia mnima de pH a travs de la membrana
plasmtica es resultado de la existencia de una diferencia de potencial () a
travs de ella.
28
En el proceso de oxidacin de ion ferroso el protn se presenta como un sustrato,
es decir, se espera que al disminuir su disponibilidad la bacteria disminuya su
velocidad de oxidacin. Equivalentemente, puede haber circunstancias en que el
protn podra actuar como sustrato limitante. Esta hiptesis es planteada por
Kupka y Kupskov (1999), quienes encontraron que la velocidad de consumo de
oxgeno depende del pH del medio, cuando la concentracin de los otros sustratos
se encuentra en exceso. En particular esta dependencia puede expresarse en
acuerdo con una cintica del tipo Monod con el protn como sustrato limitante y,
adems, inhibicin por sustrato. Un comportamiento muy similar se observa en las
mediciones de Pesic (1993) como se aprecia en la Figura 2.12. En estas
experiencias se estim la velocidad de oxidacin utilizando las variaciones de
potencial redox de solucin medidas con un electrodo de pirita. Adems, en este
caso se considera solo las velocidades iniciales de oxidacin en cultivos batch.
Figura 2.12: Efecto del pH sobre la actividad oxidativa de Fe
2+
por Acidithiobacillus
ferrooxidans (Figura extrada de Pesic, 1993).
29
Schnaitman et al. (1969) demostraron que para cultivos batch donde el pH del
sistema es mantenido constante mediante el uso de soluciones tampn, la
velocidad de oxidacin de ion ferroso de Acidithiobacillus ferrooxidans vara de
acuerdo a una campana similar a la presentada en la Figura 2.12 en el rango de
pH de 1,8 a 4,5.
De acuerdo con el comportamiento descrito se espera que exista un pH ptimo
para la actividad oxidativa de ion ferroso. Este pH no debe ser tan alto como para
inhibir la actividad por falta de sustrato (protones) y ser lo suficientemente alto
como para no comprometer el metabolismo por excesiva acidez (pH bajo 1,2
provoca severa inhibicin de Acidithiobacillus ferrooxidans).
El pH ptimo de crecimiento en cultivos de clulas suspendidas, de acuerdo a los
resultados de distintos investigadores (Tabla 2.1) presenta una gran variabilidad.
Esta puede estar influenciada por la temperatura a la cual se realizan las
mediciones, el tipo de cultivo utilizado, la condicin de entrada de las clulas, la
concentracin de fierro en la solucin, etc. Kupka y Kupskov (1999) encontraron
el ptimo en 2,4, aunque una observacin ms acuciosa de los datos indica una
actividad mxima entre pH 2 y 3, con una disminucin importante fuera de este
rango. Para Pesic (1993) el ptimo est entre pH 1,6 y 1,7 solamente, siendo ms
sensible la cada hacia menor pH y menos pronunciada al aumentarlo. Sampson y
Blake (1999) estudiaron dos cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans encontrando
comportamientos distintos. En una cepa el ptimo est en pH cercano a 1,7 y para
la otra el ptimo est en el rango de 1,8 a 2,5, aunque la variacin en la actividad
para el rango estudiado (de 1,4 a 3,5) no es muy importante. Gmez et al.(1999)
encontraron el ptimo en pH 2,0, aunque la variacin de la actividad oxidativa
entre pH 1,5 y 2,5 no es muy importante. MacDonald y Clark (1970) encontraron
un ptimo de pH entre 2,5 y 3,5 en experiencias batch de largo plazo.
En el caso de cultivos continuos el efecto del pH es menos importante an. Como
se aprecia en la Tabla 2.1 de acuerdo a algunos estudios para un rango
30
importante de pH el efecto obtenido no es notorio. Esto se puede explicar al
considerar la estructura de los biofilms formados en un lecho fijo. De acuerdo con
estudios recientes se establece que el biofilm de bacterias adherido sobre los
slidos estara formado por precipitados de hierro (Nemati et al., 1998), con lo cual
el pH en la capa lmite que rodea el slido estara dado por el equilibrio slido
solucin para la solubilidad de los precipitados. Del mismo modo se podra esperar
la formacin de microclimas en las inmediaciones de las bacterias (capa lmite
difusional), de modo que la bacteria no necesariamente es afectada por cambios
de acidez de la solucin.
Tabla 2.1: Rango de pH ptimo para la oxidacin de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans. Valores de referencia.
Referencia Rango de
pH ptimo
Tipo de cultivo
Schnaitman et al. (1969) 2,8 3,5 Batch con medicin de concentracin
de ferroso en el tiempo y soluciones
buffer.
MacDonald y Clark (1970) 2,5 3,5 Batch con medicin de largo plazo,
utiliza medio 3K detectando formacin
de precipitados.
Ingledew (1982) 2,0 Revisin bibliogrfica
Gmez et al. (1999) 2,0 Batch durante 120 horas con 1,4 g/l de
Fe en solucin
Pesic (1993) 1,6 1,7 Batch de velocidad inicial utilizando
sensor redox para estimar la velocidad
de oxidacin
Sampson y Blake (1999) 1,8 2,5 Batch de velocidad inicial de consumo
de oxgeno utilizando 5,6 g/l de Fe(II).
Kupka y Kupskov (1999) 2,4 Batch de velocidad inicial para
consumo de oxgeno utilizando 0,5 g/l
de Fe(II).
Manzuelos et al. (1997) -- Cultivo continuo con soporte de
esferas de vidrio, estudia rango de pH
de 1,15 a 1,5.
Karamanev y Nikolov
(1988)
-- Cultivo continuo en un reactor de
biofilm de lecho fluidizado, rengo de
pH de 1,3 a 2,2.
Nakamura et al. (1986) 1,5 2,6 Cultivo continuo en un contactador
rotatorio a 20C y 0,1 a 0,15 g/l de
Fe(II)
31
Para completar la discusin respecto del pH ptimo de crecimiento resulta claro
que se deben considerar elementos relativos a la formacin y efecto de
precipitados como ser descrito en el apartado 2.3.6.
Southam y Beveridge (1992) mostraron la presencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans en ambientes de pH neutro en botaderos de Canad. Esta presencia,
si bien es menor que la asociada a pH menores en el mismo botadero, indica que
a estos valores de pH es posible encontrar condiciones de desarrollo bacteriano.
Nordstrom y Southam (1997) presentaron antecedentes respecto a oxidacin de
ion ferroso de especies de Acidithiobacillus ferrooxidans en ambientes de pH
cercano a la neutralidad. La poblacin encontrada en todos los casos dice relacin
con el pH del sistema, aunque se seala que este tipo de microorganismos sera
capaz de transformar ambientes alcalinos (pH 8) en cidos (pH <3) en presencia
de oxgeno. Es decir, participa en la generacin de aguas cidas de mina.
Figura 2.13: Poblacin de
Acidithiobacillus ferrooxidans en
funcin del pH en muestras de relaves.
(Figura extrada de Nordstrom y
Southam 1997).
En la Figura 2.13 se muestra la poblacin encontrada de Acidithiobacillus
ferrooxidans en muestras de aguas de relaves en funcin del pH de la muestra.
De acuerdo con los antecedentes presentados no existe claridad respecto de cual
es la actividad oxidativa esperable a pH superior a 3,5. Sin embargo, la existencia
32
de colonias de microorganismos gestadas en forma natural en minerales y relaves
de pH neutro indican una pequea actividad oxidativa y crecimiento bacteriano.
Nordstrom y Southam (1997) justificaron la presencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans en altos pH por la formacin de microclimas cidos en su entorno.
Esta situacin es inducida por la hidrlisis del ion frrico obtenido de la oxidacin
de pirita o ion ferroso en presencia de oxgeno (ya sea por bacterias o
naturalmente).
Trabajando a valores altos de pH, Rai (1999) utiliz Acidithiobacillus ferrooxidans
para la oxidacin de sulfato ferroso en un proceso para la desulfuracin de gas
natural. Para ello acompleja el ion frrico producido utilizando ETDA (Etilen Diamin
Tetra Actico), obteniendo crecimiento bacteriano a pH 7,5.
La actividad bacteriana de Acidithiobacillus ferrooxidans a valores altos de pH no
puede ser descartada a priori, ya que existen reportes de distintos tipos de
bacterias que realizan oxidacin de sulfato ferroso a pH neutro (Hafelbradl et al.,
1996; Schler y Baeuerlein, 1996; Emerson y Moyer, 1997; Benz et al., 1998). Por
lo tanto se puede esperar que existan mecanismos de oxidacin, quiz utilizando
algn agente quelante que permita la oxidacin bacteriana de ion ferroso a altos
pH. Ingledew (1986) encontr que la rusticianina incrementa notablemente su
capacidad oxidativa en presencia de agentes quelantes y de este modo podra
actuar como primer aceptor electrnico en la cadena respiratoria.
2.3.3 Efecto de la Temperatura
Las cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans corresponden a microorganismos
mesfilos (viven a temperatura ambiente) con una temperatura ptima de
desarrollo entre 28 y 35C. Sin embargo, este ptimo depende del pH del sistema
como lo evidencian MacDonald y Clark (1970), quienes utilizando cultivos batch en
frascos agitados observaron variaciones de la temperatura ptima de desarrollo
desde 30 C a pH 1,5 hasta 35C a pH 2,5 y superiores (Figura 2.14).
33
Figura 2.14: Efecto de la
temperatura sobre la actividad
oxidativa de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans y su
relacin con el pH del medio.
Figura tomada de MacDonald y
Clark (1970).
Un detalle de las temperaturas ptimas de crecimiento reportadas se presenta en
la Tabla 2.2.
De igual forma los valores de temperatura ptima de crecimiento reportados
poseen una interesante variabilidad, lo cual indica que esta temperatura ser
dependiente de las condiciones bajo las cuales se desarrolla el cultivo y en
particular de la cepa bacteriana utilizada. Amaro et al. (1991) indicaron que
cultivos sometidos a shock de temperatura muestran cambios en la composicin
de protenas de la clula, lo cual podra sugerir cambios metablicos para permitir
la adaptacin a las nuevas condiciones. En el mismo sentido Ahonen y Tuovinen
(1989) demostraron que cultivos realizados a temperaturas en el rango de 4 a 37
C exhiben adaptacin a cambios de temperatura, aunque presenten igualmente
mayor actividad a temperatura de 28 C.
Al igual que con el pH, el efecto de la temperatura resulta bastante menor en
cultivos continuos en lechos fijos. En estos casos la temperatura ptima sube
respecto del caso de bacterias suspendidas o cultivos batch y la mayor actividad
se alcanza dentro de un rango de temperaturas y no en un valor especfico.
34
Tabla 2.2: Temperatura ptima de oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus
ferrooxidans en cultivos batch y continuos. Valores de referencia obtenidos por
mltiples investigadores.
Referencia T ptima Tipo de cultivo
C
MacDonald y Clark (1970) 30 a pH 1,5
35 a pH 2,5
Batch con medicin de largo plazo,
utiliza medio 3K detectando formacin
de pp.
Ahonen y Tuovinen (1989) 28 Batch utilizando frascos agitados con 6,0
g/l de Fe(II), pH inicial 1,5
Nordstrom y Southam (1997) 25 33 Revisin bibliogrfica
Hbner (1991) 29 Medicin batch utilizando reduccin de
ion frrico. pH 1,8 y 6,0 g/l Fe(II)
Okereke et al. (1991) 30 Batch midiendo velocidad inicial por
absorbancia pH 2,4
De et al. (1997) 20 30 Batch midiendo velocidad inicial con
sensor redox, pH 1,7 y 0,06 g/l de Fe(II).
Breed et al. (1999c) 40 Continuo con cultivo mixto pH 1,75 y 12
g/l de Fe(II).
Nemati y Webb (1997a) 35 Batch midiendo velocidad inicial con
sensor redox, pH 2,0 y Fe variable.
Nemati y Webb (1997b) 30 Continuo con bacterias inmovilizadas.
pH 1,7 y 10 g/l de Fe(II).
Nikolov y Karamanev (1992) 25 37 Continuo con bacterias resuspendidas y
adheridas pH 1,7 y altas
concentraciones de Fe(II).
Gmez et al. (1999) 30 Batch de largo plazo pH 2,0 y 1 g/l de
Fe(II).
Pesic et al. (1989) 25 30 Batch midiendo velocidad inicial con
indicador redox
Mazuelos et al. (1999) 31 Continuo en lecho fijo pH 1,5 y 3 g/l de
Fe(II).
Karamanev y Nikolov (1988) 20 40 Continuo en reactor air lift pH 2,0 y 0,3
g/l de Fe(II).
Nakamura et al. (1986) 10 40 Continuo en contactador rotatorio pH 2,4
2,6 y Fe(II) 0,04 0,16 g/l
35
2.3.4 Efecto de Aniones
Se ha encontrado que el desarrollo de Acidithiobacillus ferrooxidans requiere de la
presencia de sulfato para la oxidacin de ion ferroso (Lazaroff, 1963). Este hecho
puede ser explicado al plantear que el ion sulfato es capaz de estabilizar el
complejo de Fe(II) hexahidratado que sirve como substrato directo en el sistema
enzimtico de oxidacin (Jensen y Webb, 1995). Esta hiptesis explicara el efecto
inhibitorio de otros aniones, los cuales podran desacomplejar el ion ferroso o
estabilizar otros complejos no especficos para el mecanismo oxidativo. Es
interesante notar que Ingledew (1986) demostr que la capacidad oxidativa de la
rusticianina est fuertemente asociada a la formacin de complejos en solucin y
al tipo de ellos.
Tabla 2.3: Efecto de Aniones sobre la oxidacin de Fe(II) por Acidithiobacillus
ferrooxidans (Ingledew, 1982).
Especie Velocidad relativa % Observaciones
a un cultivo con SO
4
2-
SO
4
2-
100 Control, dipolo fuerte
SeO
4
2-
70 Dipolo fuerte
B
4
O
7
2-
41
TeO
4
2-
60 Dipolo fuerte
AsO
4
3-
62 Dipolo fuerte
PO
4
3-
83 Portador especfico (fuente de
fsforo para la bacteria)
BO
3
3-
120
F
-
0 Inhibidor de Oxidasas
Cl
-
33 Forma protonada gaseosa
Br
-
I
-
NO
3
-
0 Desacoplador
36
Por otro lado la presencia de sulfato desplaza casi -100 mV el potencial estndar
del par ferroso / frrico (respecto al potencial estndar en medio perclorato), lo
cual lo hace ms reductor y ms fcil de oxidar. Otro aspecto importante dice
relacin con la interaccin entre los aniones y la estructura de la membrana. Esta
ltima al tener polaridad positiva tendr interaccin con aquellos aniones de menor
electronegatividad relativa.
2.3.5 Efecto de Cationes
De acuerdo con las condiciones de crecimiento en ambientes naturales, no es
extrao encontrar que Acidithiobacillus ferrooxidans presente una alta resistencia
a los cationes metlicos y una resistencia relativa a metales pesados. Esta
bacteria posee adicionalmente la capacidad de adaptarse en tiempos breves
(algunos das) a concentraciones elevadas de metales como Fe
3+
, Zn
2+
y Cu
2+
(Das et al., 1997). Adems, se ha reportado que Acidithiobacillus ferrooxidans es
capaz de oxidar otros cationes adems de fierro, por ejemplo Cu
+
(en Cu
2
S), Sb
3+
(en Sb
2
S
3
), U
4+
(en pitchblenda) y Sn
2+
(Ingledew, 1982). Probablemente la
oxidacin de estos cationes no sea directa y corresponda a una oxidacin por ion
frrico quien luego es reoxidado por la bacteria.
La resistencia de Acidithiobacillus ferrooxidans a la presencia de cationes
metlicos ha sido estudiada profusamente y se ha encontrado que el efecto que
ellos pueden provocar es de inhibicin competitiva y no competitiva (ver seccin
2.3.1). De igual forma se encuentra que no todos los cationes tienen un efecto
similar sobre la actividad oxidativa bacteriana, sino que existen algunos como
Cu
2+
, Ni
2+
, Co
2+
y Zn
2+
que tienen muy pequeo efecto sobre la actividad oxidativa
(la bacteria es capaz de adaptarse a su presencia); otros como Sn
2+
y Pb
2+
que
inhiben en forma parcial (disminuye la velocidad especfica de crecimiento
mientras este presente el catin) y algunos como Hg
2+
y

Ag
+
que tienen un fuerte
efecto inhibitorio (la actividad oxidativa disminuye casi a cero con pequeas
concentraciones de estos cationes). En la Tabla 2.4 se sealan algunos
37
antecedentes respecto del efecto de diversos cationes sobre Acidithiobacillus
ferrooxidans.
Tabla 2.4: efecto inhibitorio de algunos cationes en la oxidacin de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans
Especie Efecto Inhibitorio Referencia
Ni
2+
Leve, no competitiva Kupka y Kupskov (1999)
Cu
2+
Muy leve Kupka y Kupskov (1999)
Hg
2+
Fuerte, no competitiva De et al. (1997)
As
3+
Competitiva Harvey y Crundwell (1996)
Co
2+
Media Sampson y Blake (1999)
Fe
3+
Leve, competitiva Nemati et al. (1998)
Ag
+
Fuerte, mixta De et al. (1997)
Pb
2+
Media De et al. (1997)
Mn
2+
Leve De et al. (1997)
Sn
2+
Media Ingledew (1982)
Zn
2+
Leve Ingledew (1982)
Cr
3+
Media Ingledew (1982)
2.3.6 Formacin y efecto de precipitados
Cuando se oxida sulfato ferroso bacterialmente se produce un aumento inicial en
el pH de la solucin producto del consumo de protones en la oxidacin de acuerdo
con la ecuacin (1). Este aumento de pH sumado a la presencia de ion frrico
formado induce la hidrlisis del ion frrico, representada en las reacciones
siguientes:
Fe
3+
+ H
2
O FeOH
2+
+ H
+
(14)
Fe
3+
+ 2 H
2
O Fe(OH)
2
+
+ 2 H
+
(15)
Fe
3+
+ 3 H
2
O Fe(OH)
3
+ 3 H
+
(16)
Estas reacciones, al contrario de (1) reducen el pH tendiendo a estabilizarse el
sistema en valores entre 2,0 y 2,5 dependiendo de la concentracin total de hierro
38
(Nemati et al., 1998). De esta forma la hidrlisis del ion frrico es un fenmeno
dependiente del pH, sabiendo adems que el ion frrico se vuelve cada vez ms
insoluble al aumentar el pH sobre 2,5 (Grishin et al., 1988b). Una reaccin
competitiva a la hidrlisis es la formacin de hidroxisulfatos bsicos de hierro
(jarositas) con una frmula general MFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
, donde el catin M
+
es K
+
,
Na
+
, NH
4
+
o H
3
O
+
(o ms generalmente un catin monovalente). La precipitacin
de jarositas es tambin una reaccin generadora de cido.
3 Fe
3+
+ M
+
+ 2 HSO
4
-
+ 6 H
2
O MFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
+ 8 H
+
(17)
Las jarositas pueden ser encontradas en sedimentos de drenajes cidos de mina,
en oportunidades en conjunto con oxi-hidroxidos frricos. La precipitacin de
jarositas depende del pH y de la composicin inica y concentracin de la
solucin.
La formacin de compuestos frricos puede tener un efecto adverso sobre los
procesos biolgicos. Disminuye la disponibilidad de ion frrico en solucin,
produce una barrera difusional a los sitios de reaccin qumica y en el caso de
procesos de lecho fijo altera las condiciones de percolabilidad de la solucin. Lo
anterior indica la necesidad de controlar la formacin de estos compuestos.
La precipitacin de jarositas se produce a pH tan bajos como 1,8 (Karamanev,
1988), lo cual puede ser comprobado utilizando la termodinmica de soluciones
(Nemati et al., 1998). Al estudiar la cintica de formacin de jarositas a pH entre
1,8 y 2,5 se encuentra que su velocidad de formacin es hasta treinta veces ms
lenta que la velocidad de oxidacin bacteriana (Lazaroff, 1982; Toro, 1988), por lo
cual no sera posible que estos precipitados fuesen el producto primario de la
oxidacin. Toro (1988) utilizando balances de masa y las concentraciones en el
tiempo de distintos iones para un cultivo batch, encontr que antes de la formacin
de jarositas se produce la precipitacin de hidrxido frrico, el cual luego es
reformado a jarosita (ms estable termodinmicamente en estas condiciones).
39
Lazaroff et al. (1982) propuso la formacin de intermediarios polimricos que
actan como precursores de la formacin de hidrxidos y jarositas. La cantidad de
estos polmeros depende de la disponibilidad de sulfato y de cationes
monovalentes necesarios en solucin. Grishin et al. (1988b) encontraron que la
disminucin o eliminacin de estos cationes, en especial el K
+
, en los medios de
cultivo empleados con bajo pH, disminuye en forma importante esta indeseable
precipitacin de fierro.
A pesar de lo anterior Curuchet et al.(1992) encontraron que la formacin
extensiva de precipitados de jarositas no presenta un efecto relevante a la
velocidad de oxidacin de ion ferroso o en la cintica de lixiviacin bacteriana.
Karamanev (1988) demostr incluso que la estructura del biofilm formado en un
lecho fijo bacteriano incluye en su esqueleto estructural de jarositas, es decir,
estas seran necesarias para lograr una adecuada adherencia de las bacterias a
los slidos del lecho. Este hecho fue comprobado por Pogliani (1999).
2.3.7 Efecto del ion frrico
La incidencia de los cationes metlicos sobre la actividad oxidativa bacteriana
puede, en general ser explicada por los mecanismos de inhibicin competitiva y no
competitiva descritos anteriormente. El efecto del ion frrico merece una discusin
especial, ya que se ha sugerido que acta de acuerdo a los dos mecanismos
mencionados de inhibicin (Nemati et al., 1998).
El ion frrico, que corresponde al producto de la oxidacin de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans en soluciones cidas aireadas, ha sido reportado
como inhibidor competitivo por diversos autores. Lizama y Suzuki (1989)
estudiaron el consumo de oxgeno en la oxidacin de sulfato ferroso adicionando
distintas cantidades de sulfato frrico y bacterias, encontrando que la accin del
ion frrico se correlaciona adecuadamente a un modelo de inhibicin competitiva.
40
Adicionalmente encontraron que el efecto inhibitorio del ion frrico es sinrgico con
la concentracin de bacterias en solucin, es decir, la inhibicin frrica es ms
importante cuando la concentracin bacteriana es mayor. El efecto del ion frrico y
la concentracin de bacterias ([C]) se expres de acuerdo a:
| | | |
)
`
+ + + +
=
+ +
+
+
I C I C
S
Max
K K
Fe C
K
Fe
K
C
K Fe
Fe
] [ ] [
1 ] [
] [
3 3
2
2
(18)
Harvey y Crundwell (1996 y 1997) midieron la velocidad de oxidacin de sulfato
ferroso usando un aparato electroqumico, el cual mantiene constantes las
cantidades de ion ferroso y frrico en solucin. Para analizar los resultados utilizan
una expresin del tipo Monod con inhibicin por producto para la inhibicin por ion
frrico obteniendo una buena correlacin de los datos al modelo.
] [ ] [
] [
3 2
2
+ +
+
+ +
=
Fe K K Fe
Fe
I S
Max
(19)
Nyavor et al. (1996) midieron la velocidad inicial de oxidacin en frascos agitados
y ajustaron los parmetros para una expresin similar a (19) para un rango de
concentraciones de frrico ms bajo (de 0 a 1 g/l) que el utilizado por Harvey y
Crundwell (1996) (ellos utilizaron de 1 a 9 g/l de frrico).
Liu et al. (1988) comprobaron la expresin (19) utilizando mediciones de actividad
oxidativa en cultivos continuos y ajustando numricamente los resultados para la
oxidacin de ion ferroso de concentracin inicial entre 0,6 y 9 g/l.
Boon et al. (1999b y 1999c) reformularon la expresin de inhibicin competitiva por
ion frrico, considerando una cantidad de ion ferroso necesaria para la
subsistencia de las bacterias, [Fe
2+
]
m
. Postularon, de este modo, la siguiente
expresin cintica:
41
m i
S
m
S
Max
Fe Fe
Fe
K
K
Fe Fe
K
] [ ] [
] [
] [ ] [
1
2 2
3
2 2 + +
+
+ +
+
=

(20)
Considerando que en los cultivos normalmente la concentracin de ion ferroso es
mucho mayor que K
S
, Boon et al. (1999a) estimaron que es posible simplificar el
segundo trmino del denominador en la expresin (20) y obtener lo siguiente:
m i
S
Max
Fe Fe
Fe
K
K
] [ ] [
] [
1
2 2
3
+ +
+
+
=

(21)
Si en la expresin (21) se considera que el trmino de mantencin [Fe
2+
]
m
es
pequeo respecto del ferroso total de la solucin, es posible despreciarlo con lo
cual la expresin (21) toma la forma (22). En esta ecuacin la velocidad de
oxidacin depende solo de la razn [Fe
3+
]/[Fe
2+
] en solucin, y en forma indirecta
del potencial redox de la solucin. La relacin esperada entre y la razn
[Fe
3+
]/[Fe
2+
] y el Eh se expresa en las siguientes ecuaciones:
] [
] [
1
2
3
+
+
+
=
Fe
Fe
K
K
i
m
Max
(22)
|
|
.
|
\
|
+ =
+
+
] [
] [
ln
2
3
0
Fe
Fe
nF
RT
E Eh (23)
Recientemente la expresin (22) ha sido utilizada para explicar la velocidad de
oxidacin de sulfato ferroso en medio cido por Acidithiobacillus ferrooxidans
(Boon et al., 1998; Rawlings et al., 1999; Breed y Hansford, 1999a) y por
Leptospirillum ferrooxidans (Rawlings et al., 1999; Breed et al., 1999). Este modelo
cintico puede ser racionalizado de dos formas distintas: la primera es
42
simplemente como una reformulacin de las expresiones de inhibicin por
producto que se han presentado; la segunda es interpretar esta expresin en
trminos electroqumicos. Es decir, se puede asumir que la velocidad de
transferencia de electrones desde el ion ferroso al oxgeno a travs de la bacteria
esta controlada por el potencial redox de la solucin (expresin 23).
La hiptesis de una cintica de oxidacin controlada por la velocidad de
transferencia de electrones fue utilizada por Crundwell (1997), al plantear un
mecanismo cintico basado en la bioenergtica del microorganismo. Crundwell
plante el mecanismo enzimtico expuesto en (6), pero a diferencia del
mecanismo enzimtico tradicional, se plantea que la cintica se encuentra
controlada por la segunda reaccin que posee una cintica del tipo Tafel:
)
`
|
.
|
\
|
T R
F n
v v exp
0
(24)
con lo cual se pudo derivar un modelo cintico para la oxidacin de ion ferroso
expresado como:
5 . 0
2
2
] [
] [
|
|
.
|
\
|
+
=
+
+
Fe
K Fe
Fe
k (25)
El coeficiente 0,5 que aparece como exponente en la expresin corresponde al
coeficiente de intercambio de la reaccin electroqumica.
43
2.3.8 Efecto del potencial redox de la solucin y estudios de la actividad de
Acidithiobacillus ferrooxidans en celdas electroqumicas
Al comprobar que existe una relacin entre la cintica de oxidacin de ion ferroso
de Acidithiobacillus ferrooxidans y el potencial redox de la solucin, es posible
comprender e interpretar las experiencias donde este microorganismo ha sido
utilizado en celdas electroqumicas.
Kinsel y Umbreit (1964) encontraron un aumento en el rendimiento de la oxidacin
bacteriana de sulfato ferroso mediante la reduccin electroqumica del ion frrico
de la solucin. De esta forma se logra mantener reducido el sustrato y la actividad
bacteriana es mayor. Yunker y Radovich (1986), Taya et al. (1991), Blacke II et al.
(1994), Suissa y Shield (1997) y Magnin et al. (1998) realizaron el cultivo
electroqumico de Acidithiobacillus ferrooxidans aplicando una corriente constante
(utilizando un galvanostato) de reduccin de sulfato frrico, obteniendo de esta
forma un importante aumento del rendimiento de los fermentadores y
concentraciones de bacterias que no han sido obtenidos directamente por otros
mtodos. Otra forma de controlar la concentracin de ion frrico en solucin es
aplicando un potencial a la solucin. Operando de esta forma el circuito (en forma
potenciosttica) Hbner (1991), Nakasono et al. (1997), Matsumoto et al. (1999)
reportaron el cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans. Este modo de operacin
presenta algunas ventajas respecto del galvanosttico, ya que utiliza en forma
ms eficiente la corriente (al conocer el potencial aplicado se restringe la
ocurrencia de reacciones parsitas en el electrodo) y permite correlacionar la
corriente aplicada con la actividad bacteriana en solucin.
Denisov et al. (1980), estudiaron la influencia de la composicin de los medios de
cultivo sobre la actividad bacteriana utilizando una celda electroqumica. De igual
forma Aguirre et al. (1989) y Harvey y Crundwell (1996, 1997) reportaron estudios
de la actividad oxidativa de sulfato ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans
44
utilizando reduccin de ion frrico. Incluso Harvey y Crundwell (1996,1997)
estudiaron la inhibicin por producto y por arsnico bajo potenciales controlados.
2.4 Discusin y enfoque de la tesis
Para el estudio de la cintica del proceso de oxidacin bacteriana de sulfato
ferroso se han utilizado normalmente modelos genricos del tipo Monod para el
crecimiento de microorganismos, que no son respaldados necesariamente por un
mecanismo de reaccin especfico a las bacterias de inters. El mecanismo de
reaccin enzimtico que se ha utilizado para explicar la oxidacin bacteriana de
ion ferroso no considera variables del entorno como son: la temperatura, fuerza
inica de la solucin, potencial redox, actividad de protones o concentracin de
impurezas en la solucin. Estas caractersticas fisicoqumicas de las disoluciones
han mostrado tener una influencia importante sobre las velocidades de oxidacin
de los microorganismos.
En algunos modelos se ha incorporado el efecto de algunas impurezas y del pH de
la solucin, sin embargo, las modificaciones en los modelos no se fundamentan en
un conocimiento profundo respecto de los mecanismos de oxidacin y en
consecuencia en la literatura encontramos en general modelos semi-empricos.
Por otro lado, los modelos fenomenolgicos que se han formulado para incorporar
el efecto de las distintas variables en un mecanismo de reaccin aparecen como
de difcil aplicacin. Por ejemplo en el trabajo de Nagpal (1997), el modelo
desarrollado presenta un numero de parmetros excesivamente alto y para su
aplicacin es necesario realizar numerosas simplificaciones. Otro caso son los
modelos de Huberts (1994), basados en el circuito de quimiosmosis propuesto
para la bacteria. Una de las conclusiones del trabajo es que las velocidades de
oxidacin se correlacionan mucho mejor con un modelo de tipo Monod con
inhibicin competitiva con frrico y no con los modelos propuestos. En el caso de
Crundwell (1997), el modelo propuesto resulta innovador y se ajusta bien al
45
conjunto de datos presentado. Sin embargo, para el desarrollo del modelo se
realizan simplificaciones que comprometen su aplicacin general y se contradicen
con el espritu original del enfoque propuesto.
Considerando los mecanismos de oxidacin propuestos en seccin 2.2, se
concluye que las variables con mayor influencia sobre la velocidad de oxidacin
bacteriana de sulfato ferroso son el pH y el potencial redox de las disoluciones. La
evidencia experimental encontrada en la literatura descrita en la seccin 2.3
concuerda con este razonamiento e indica la necesidad de desarrollar modelos
que en forma explcita consideran estos factores.
En este trabajo de tesis se profundiz el estudio del efecto del pH y el Eh de la
disolucin sobre la velocidad de oxidacin de sulfato ferroso en presencia de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Las metodologas utilizadas estarn basadas en el
uso de sensores redox y de pH, como asimismo aparatos experimentales que
permitan controlar las condiciones de operacin (Eh, pH, T y concentraciones de
ion ferroso y frrico) en valores deseados para aislar el efecto de cada una de
estas variables. La informacin obtenida ser combinada con el desarrollo de
modelos que se ajusten fielmente al conocimiento actual de los mecanismos
bioqumicos de la oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans.
En los procesos de lixiviacin donde las disoluciones entran en contacto ntimo
con minerales de composicin diversa y compleja, es inevitable la presencia de
abundantes y variados iones en solucin. En consecuencia resulta difcil controlar
la composicin de la solucin para asegurar altos niveles de actividad bacteriana y
se deben estudiar alternativas tecnolgicas que puedan resolver este problema.
En esta tesis se analiza el comportamiento de un reactor bioelectroqumico para la
biooxidacin indirecta de ion ferroso en soluciones que inhiben la accin oxidativa
bacteriana.
46
3 OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo de tesis es profundizar en el estudio del
mecanismo de oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans,
utilizando un enfoque que integra aspectos tericos y experimentales avanzados.
En particular los objetivos especficos son los siguientes:
1) Caracterizar la influencia del potencial redox de una solucin de sulfato
ferroso sobre la cintica de oxidacin bacteriana de ion ferroso con
2) Caracterizar el mecanismo de inhibicin de la cintica de oxidacin
bacteriana del ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans a pH sobre
2,5.
3) Desarrollar una expresin general que describa la cintica de oxidacin
bacteriana del ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango
de pH 1,3 7,0.
4) Evaluar la factibilidad tcnica y eficiencia de un reactor electroqumico
diseado para utilizar la accin oxidativa de Acidithiobacillus
ferrooxidans sobre el ion ferroso, en forma indirecta, en soluciones de
alta toxicidad.
47
SEGUNDA PARTE:
EFECTO DEL Eh EN LA CINTICA DE OXIDACIN DE ION

1 INTRODUCCIN

La velocidad de oxidacin bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans se representa normalmente mediante ecuaciones del tipo Monod que
consideran solo la influencia de la concentracin de ion ferroso en solucin o bien
modificando esta expresin para dar cuenta de procesos de inhibicin competitiva
o no competitiva.

Al analizar la bioenergtica del microorganismo (seccin 2.2, primera parte),
queda establecido que el potencial termodinmico que produce la reaccin de
oxidacin de ion ferroso est relacionado principalmente con la diferencia de
potencial electroqumico entre la solucin que rodea la bacteria y su citoplasma.
En consecuencia, se puede esperar que el mecanismo cintico de reaccin de
transferencia de electrones desde el ion ferroso a la bacteria presente una cintica
electroqumica relacionada con las condiciones de la membrana celular y la
solucin circundante.

El efecto del Eh de la solucin ha sido considerado al analizar la oxidacin
bacteriana de ion ferroso desde el punto de vista de la teora de la quimioosmosis
(Crundwell, 1997; Huberts, 1994). Sin embargo, una expresin cintica que incluya
explcitamente el efecto del Eh de la solucin no ha sido deducida an.

El objetivo de esta parte de la tesis es caracterizar con mayor detalle la influencia
del potencial redox de la solucin sobre la velocidad de oxidacin de ion ferroso
con Acidithiobacillus ferrooxidans y relacionarla con los modelos fundamentales de
respiracin de este microorganismo (Ingledew, 1982).
48
El trabajo experimental utilizar las ventajas de una celda bioelectroqumica de
dos compartimentos (Aguirre et al., 1989; Harvey y Crundwell, 1996) que permite
estimar la velocidad de oxidacin de ion ferroso a potenciales controlados. Los
resultados sern integrados en una expresin cintica, que incorpora
explcitamente el efecto del potencial redox de la solucin y, adems, considera el
efecto de la concentracin de ion ferroso y la inhibicin por ion frrico.

2 MATERIALES Y MTODOS

2.1 Cultivo de bacterias

Se utiliz una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859). El cultivo
de las bacterias se efectu en matraces Erlenmeyer de 250 ml, utilizando 100 ml
de medio basal de composicin similar a la propuesta por Touvinen and Kelly
(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1:

Tabla 2.1: Composicin del medio basal.
Compuesto Concentracin, g/l
(NH
4
)
2
SO
4
0,400
MgSO
4
7H
2
O 0,400
K
2
HPO
4
3H
2
O 0,056
FeSO
4
7H
2
O 14,9

El pH del medio se ajust en 1,8 utilizando cido sulfrico concentrado. El cultivo
se mantuvo a 30,0C en un agitador orbital.

Para mantener el cultivo bacteriano en su fase exponencial de crecimiento se
realiz diariamente sub-cultivos. Para ello se toma un 20 ml de la solucin ya
oxidada y se agregan 80 ml de medio basal fresco.

49
El inculo, a ser utilizado en la celda electroqumica, se prepar con 80 ml del
cultivo bacteriano. Esta solucin es filtrada utilizando una membrana Millipore
de
0,22m. Los microorganismos separados son lavados tres veces con 20 ml de
solucin de cido sulfrico a pH 1,8 para la remocin de precipitados de fierro
adheridos, y luego son resuspendidos en 20 ml de medio basal libre de sulfato
ferroso. La poblacin de bacterias en el inculo es determinada por conto directo
en una cmara Petroff-Hausser, resultando tpicamente de 2 a 6 x 10
8
clulas por
ml.

2.2 Celda Electroqumica

Un esquema del montaje y funcionamiento de la celda electroqumica se presenta
en la Figura 2.1. La celda electroqumica, est construida en Pyrex
, posee dos
compartimentos separados por una membrana de intercambio catinica Nafion

de 1 cm
2
. En el compartimento catdico se coloca un alambre de platino (dimetro
0,5 mm, largo 2 m), rea total 16 cm
2
que es utilizado como electrodo de trabajo.
Este diseo, con gran rea catdica, permite determinar la actividad bacteriana en
altas razones [Fe
2+
]/[Fe
3+
] (Salhe, 1999). Adems, en este compartimento se ubica
un electrodo de referencia Hg/HgSO
4
Radiometer Analytical Modelo REF601, junto
con 20 ml de medio basal libre de fierro y la poblacin bacteriana que ser
caracterizada. Para la determinacin del potencial redox del catolito en el mismo
compartimento se coloca un electrodo de platino combinado Cole-Palmer 5990-57.
Como contraelectrodo se utiliza una lmina de platino de rea total 3 cm
2
, que es
ubicada en el compartimento andico.

El catolito es agitado con impulsor magntico y burbujeado con aire. La celda
electroqumica completa se ubica en un bao termosttico de agua, manteniendo
la temperatura en 30,0 t 0,1 C. El electrodo de trabajo, la referencia y el
contraelectrodo son conectados a una interfase electroqumica EG&G Princeton
Applied Research, modelo 363. Para las mediciones de corriente se utiliza un
voltmetro digital Solartron Schlumberger modelo 7150.
50

Figura 2.1: Celda electroqumica para medicin de actividad oxidativa bacteriana a
potencial controlado.

2.3 Procedimiento

El compartimento catdico es llenado con 20 ml de medio basal que contienen una
concentracin inicial de ion ferroso entre 50 y 200 mg/l, junto con una poblacin de
bacterias en el rango 2 8 x 10
7
bac/ml. El sulfato ferroso se adiciona a la celda
como alicuotas de una solucin concentrada de 33,3 g/l de ion ferroso y la bacteria
se adiciona como alicuota del inculo preparado de acuerdo al procedimiento
descrito con anterioridad.

Se aplica un potencial constante en el electrodo de trabajo generando corrientes
catdicas relacionadas con la reduccin de ion frrico. Los valores de potencial
aplicado se fijan entre 0,2 y 0,7 V (versus electrodo estndar de hidrgeno, SHE).
La corriente obtenida, que inicialmente es despreciable, aumenta en el tiempo en
la medida que aumenta la concentracin de ion frrico como consecuencia de la
oxidacin bacteriana de sulfato ferroso. Un valor estacionario de corriente se
obtiene en el sistema despus de un tiempo que vara entre 20 y 60 minutos,
MEMBRANA
ELECTRODO
DE TRABAJO
CONTRA
ELECTRODO
ELECTRODO
DE Eh
WE
ELECTRODO DE
REFERENCIA
CE
e
-
H
+

O
2
+H
+
H
2
O
H
2
O
O
2
+H
+

A.f.
Fe
2+
Fe
3+
Potenciostato
O
2

51
dependiendo de la poblacin bacteriana y la concentracin total de fierro en la
celda. Este estado estacionario corresponde a la relacin ferroso/frrico para la
cual la velocidad de generacin de ion ferroso (debida a la reduccin
electroqumica de ion frrico) es igual a la velocidad de oxidacin de sulfato
ferroso de la poblacin bacteriana en la solucin. Se agregan cantidades
sucesivas de ion ferroso en el compartimento catdico, generando en cada caso
aumentos progresivos en la corriente estacionaria que se obtiene al aumentar la
velocidad de oxidacin bacteriana.

Cuando se ha establecido un valor estacionario de corriente, se registran los
valores de corriente y potencial redox de la solucin. Simultneamente se toman
muestras de la solucin para determinar la poblacin bacteriana presente y la
concentracin de fierro total disuelto. La concentracin de fierro es determinada
por el mtodo de la o-fenantrolina (Herrera et al., 1989). La concentracin de ion
ferroso se determina de la concentracin total de hierro y el Eh determinado.

La relacin entre el potencial redox (Eh) de la disolucin y la razn entre las
actividades de ion frrico (
+ 3
Fe
a ) y ion ferroso (
+ 2
Fe
a ) esta dada por la ecuacin de
Nernst (Pesic et al., 1989; Graindorge et al., 1994; Boon,1996):

,
_
+
+
+
2
3
ln
0
Fe
Fe
a
a
nF
RT
E Eh (1)

El valor del potencial estndar (E
0
) se puede calcular como nF G E
0 0
,
siendo 0,770 V (SHE). Las actividades de los iones (a
i
) se relacionan con su
concentracin (c
i
) utilizando los coeficientes de actividad (
i
),
i i i
c a . Estos
coeficientes son iguales a 1, slo cuando la fuerza ionica ( ( )

i
i i
c z I
2
2 1 ) de
la disolucin es cero. Adems, la formacin de complejos en solucin modifica las
concentraciones libres de los distintos iones como se puede esperar en presencia
de sulfato u otros ligandos. Por lo tanto, al considerar la razn entre [Fe
3+
] y [Fe
2+
]
52
el valor de potencial se establece respecto a un pseudo potencial estndar (E
0
p
)
que debe ser determinado experimentalmente.

Utilizando el valor estacionario de corriente establecido despus de cada adicin
de sulfato ferroso, se determina la velocidad de oxidacin bacteriana de ion
ferroso utilizando la siguiente expresin:

N F z
I
v
Fe

+ 2
(2)

Esta ecuacin corresponde a la aplicacin de la ley de Faraday para las
reacciones de electrodo, comportamiento que es comprobado para la celda
utilizada en experiencias sin microorganismos, registrndose eficiencias de
corriente cercanas al 100%.

En la expresin (2),
+ 2
Fe
v es la velocidad de oxidacin bacteriana y se expresa en
(mol de ferroso /( s x bacteria)), I es la corriente estacionaria que se ha registrado
en (A), z es el nmero de electrones necesarios para la reduccin de un tomo de
ion frrico (z=1), F es la constante de Faraday (96496 C/eq) y N es el nmero de
bacterias que se encuentra en el compartimento catdico.

Cada una de las series experimentales se reprodujo a lo menos dos veces.

3 RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 Calibracin de Electrodos

En estas experiencias se ha realizado la medicin de la velocidad de oxidacin ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en funcin de la cantidad de hierro total y
el Eh de la disolucin.
53
El Eh de una disolucin se encuentra definido por los pares de redox que
interactan sobre el electrodo platino. En el caso de los sistemas utilizados en este
estudio los pares redox de inters son: el par ferroso/frrico y el par
oxgeno(disuelto)/agua. Sin embargo, como se muestra en el Anexo A, en
presencia de hierro en solucin el efecto del oxgeno no es considerable y para
efectos prcticos ser considerado que el Eh est fundamentalmente definido por
el par ferroso/frrico.

Para relacionar la razn de concentraciones de ion frrico y ion ferroso con el
potencial redox de la solucin (Eh) se determin experimentalmente una expresin
del tipo Nernst que representa el rango de concentraciones de hierro utilizado para
el pH de trabajo. Esta expresin fue obtenida para las mismas condiciones de
aireacin que son utilizadas luego en las experiencias. La expresin obtenida es:

,
_
+
+
+
] [
] [
log 0579 , 0 671 , 0 SHE) vs (V
2
3
Fe
Fe
Eh (3)

Los valores de los parmetros corresponden a una media de los valores obtenidos
para distintas concentraciones de hierro total. De este modo la expresin ser
utilizada para el rango de concentraciones de 0,05 a 1 g/l de hierro total, razn
frrico/ferroso entre 0,01 100 y el medio basal presentado en la tabla 2.1. La
ecuacin (3) muestra que el pseudo potencial estndar de la reaccin esta
desviado 0,1 V respecto del potencial estndar termodinmico, en cambio la
pendiente de la curva se acerca bastante al valor esperado a esta temperatura
(0,06 V a 30C). En la Figura 3.1 se presenta como ejemplo la correlacin obtenida
para el caso de una concentracin de hierro total de 1 g/l. El procedimiento
utilizado para la obtencin de esta expresin y los resultados correspondientes se
encuentran en el Anexo B.

54
y = 0,0588x + 0,6704
R
2
= 0,9983
0,500
0,550
0,600
0,650
0,700
0,750
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
E
h
,

V

v
/
s

S
H
E

Figura 3.1:
Curva de calibracin de electrodo
de Eh como funcin de la razn
frrico / ferroso.
Caso 1 g/l de hierro total a 30C
con medio basal.

3.2 Resultados experimentales

En la Figura 3.2 se presentan las mediciones de la velocidad especfica de
oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans en funcin de la
concentracin de ion ferroso en la disolucin. La concentracin de ion ferroso para
cada punto del grfico corresponde al valor que se estabiliza en el catolito en el
momento que se ha establecido una corriente de reduccin estacionaria. El
parmetro Va corresponde al potencial aplicado en el electrodo de trabajo en cada
serie experimental.

Los resultados expuestos en la Figura 3.2 muestran que la velocidad de oxidacin
bacteriana no depende solo de la concentracin de ion ferroso en la solucin y en
consecuencia estos resultados no pueden ser descritos segn una ecuacin tipo
Monod con ion ferroso como sustrato limitante. En la Figura 3.2 se aprecia que
para una concentracin dada de ion ferroso la velocidad de oxidacin aumenta
con el desplazamiento de los potenciales aplicados hacia potenciales catdicos.
Simultneamente este aumento de potencial aplicado se refleja en un aumento de
los potenciales redox de la disolucin como se ejemplifica en la Tabla 3.1. La
totalidad de los datos experimentales obtenidos se presentan en el Anexo C.

55
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
0 200 400 600 800 1000
[Fe
2+
], mg/l
V
F
e
2
+
,

[
g

F
e
/
(
H
r

c
e
l
)
]
Va = 0.2 V vs SHE
Va = 0.4 V vs SHE
Va = 0.5 V vs SHE
Va = 0.6 V vs SHE

Figura 3.2: Velocidad
especfica de oxidacin en
funcin de la
concentracin de ion
ferroso.

Tabla 3.1: Efecto del potencial aplicado sobre la velocidad de oxidacin y el
potencial redox de la solucin.
Va
(V vs SHE)
Ferroso
mg/l
V
Fe
2+
g Fe / (hr cel)
Eh
(V vs SHE)
0,600 30,10 6,57E-07 0,702
0,400 40,12 8,96E-07 0,664
0,400 40,43 9,23E-07 0,662
0,200 48,79 1,02E-06 0,636
0,700 97,22 3,22E-07 0,756
0,700 99,20 3,70E-07 0,756
0,600 96,91 1,11E-06 0,693
0,400 93,36 1,49E-06 0,648
0,650 270,72 8,11E-07 0,721
0,600 259,89 1,57E-06 0,688
0,400 279,33 2,14E-06 0,625
0,200 266,63 2,52E-06 0,601

Es necesario hacer notar que, para cada valor especfico de potencial aplicado Va,
el potencial redox de la solucin disminuye, con el aumento de la concentracin de
ion ferroso, como se aprecia en la Tabla 3.2.
56
Tabla 3.2: Efecto de la concentracin de ion ferroso sobre la velocidad de
oxidacin y el potencial redox de la solucin para cada potencial aplicado.
Va
(V vs SHE)
Ferroso
mg/l
V
Fe
2+
g Fe / (hr cel)
Eh
(mV vs SHE)
0,200 48,79 1,02E-06 0,636
0,200 113,30 1,77E-06 0,625
0,200 266,63 2,52E-06 0,601
0,200 586,99 3,09E-06 0,585
0,200 999,97 3,26E-06 0,571
0,400 40,12 8,96E-07 0,664
0,400 61,56 1,17E-06 0,658
0,400 93,36 1,49E-06 0,648
0,400 384,27 2,29E-06 0,634
0,400 885,57 2,57E-06 0,629
0,400 909,65 2,63E-06 0,620

Esto ocurre porque la corriente de reduccin de ion frrico en el ctodo est
controlada por transferencia de masa. Al disponer de gran rea catdica, cuando
se aumenta la concentracin de ion ferroso disponible, slo un pequeo aumento
de concentracin de ion frrico es requerido en el ctodo para balancear el
aumento en la velocidad de oxidacin bacteriana.

En la Figura 3.3 se presenta ahora la velocidad especfica de oxidacin de ion
ferroso en funcin del potencial redox (Eh) de la solucin que se establece en
cada medicin. De esta figura resulta evidente que la velocidad de oxidacin
bacteriana de ion ferroso, a pesar de depender de la concentracin de ion ferroso,
se encuentra ms fuertemente influida por el Eh de la solucin, el cual es
determinado principalmente por la razn frrico/ferroso que se establece en la
solucin cuando se ha alcanzado una corriente catdica estacionaria.
57
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Eh, V vs SHE
V
F
e
2
+

,

[
g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)
]

Figura 3.3: Velocidad
especfica de oxidacin
de ion ferroso en funcin
del Eh de la solucin que
se establece para cada
corriente.

Los resultados experimentales comprueban que la cintica de oxidacin de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans no puede ser descrita simplemente en
funcin de una expresin tipo Monod con ion ferroso como sustrato limitante. Los
resultados obtenidos indican, adems, una importante influencia del Eh de la
solucin sobre la velocidad de oxidacin. Los modelos cinticos disponibles no
permiten describir en forma adecuada este comportamiento, en consecuencia se
estima necesario desarrollar un modelo cintico que incorpore en forma explcita el
efecto del Eh de la solucin, para interpretar los resultados. Las mediciones de
actividad oxidativa bacteriana en un amplio rango de Eh que son posibles con el
especial diseo utilizado, se mostrarn especialmente tiles para caracterizar el
proceso de oxidacin del microorganismo en funcin de parmetros
electroqumicos.

4 EL MODELO

4.1 Descripcin del modelo

Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de obtener la energa necesaria para su
mantencin y crecimiento de la oxidacin de ion ferroso utilizando oxgeno como
58
aceptor de electrones. La bacteria obtiene la energa con la cadena de transporte
de electrones que se establece entre las siguientes semi-reacciones:

e Fe Fe +
+ + 2 3
(4)

O H e H O
2 2
2 2
2
1
+ +
+
(5)

Los electrones generados en la oxidacin de ion ferroso en el periplasma celular,
son transportados a travs de la cadena de transporte de electrones hasta una
oxidasa terminal (vase seccin 2.2 primera parte), donde reducen oxgeno a
agua en el lado citoplasmtico de la membrana celular. Este proceso es
acompaado por la simultanea disminucin en la concentracin de protones en el
citoplasma celular, estableciendo una diferencia de potencial electroqumico de
protones a travs de la membrana, que es capaz de impulsar el proceso de
fosforilacin para formar ATP (Ingledew, 1982; Elbehti et al., 2000).

El modelo enzimtico de Michaelis-Menten normalmente aceptado para describir
la oxidacin de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans considera el siguiente
esquema (Lacey y Lawson, 1970):

) (
2 2
2
1
E Fe Fe E
k
k
+ +

+ (6)

+ +
+ + e E Fe E Fe
k 3 2
3
) ( (7)

donde E corresponde a la enzima que interviene en el proceso y Fe
2+
(E)
representa el ion ferroso ligado a la enzima. Adicionalmente se considera una
etapa independiente para describir la inhibicin competitiva por ion frrico (Jones y
Kelly, 1983; Lizama y Suzuki, 1989):

59
) (
3 3
5
4
E Fe Fe E
k
k
+ +

+ (8)

donde Fe
3+
(E) corresponde a ion frrico ligado a la enzima. Sin embargo, el efecto
inhibitorio del ion frrico puede ser incluido en la reaccin (7) si es que esta etapa
es descompuesta en dos reacciones reversibles:

+ +
+

e E Fe E Fe
k
k
) ( ) (
3 2
4
3
(9)
+ +
+

3 3
6
5
) ( Fe E E Fe
k
k
(10)

Utilizando el enfoque propuesto, la cintica de oxidacin de ion ferroso, incluyendo
el efecto inhibitorio del ion frrico, puede ser expresada por las reacciones
relacionadas: (6), (9) y (10).

Las reacciones (6) y (10) son reacciones enzimticas, y sus velocidades dependen
solamente de la concentracin de sitios activos y la concentracin de ion ferroso y
ion frrico en la solucin. Sus velocidades netas pueden ser expresadas como
sigue:

( ) ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
2
2
2 3 2
1 6
E Fe k Fe E Fe E Fe E k r
t
+ + + +
(11)
( ) ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
3
5
3 3 2
6 10
t
+ + + +
+ (12)

donde [E
t
] es la concentracin total de enzimas en la superficie de la membrana;
[Fe
+2
], [Fe
+3
] son las concentraciones de ion ferroso y ion frrico en la solucin,
respectivamente; [Fe
+2
(E)], [Fe
+3
(E)] son las concentraciones de ion ferroso y ion
frrico enlazados a enzimas, respectivamente; y k
1
, k
2
, k
5
, k
6
son las constantes
cinticas asociadas.

60
La reaccin (9) involucra transferencia de carga y su velocidad puede ser descrita
de acuerdo con la teora cintica electroqumica. En una primera aproximacin, la
interferencia de la transferencia de masa puede ser despreciada y la velocidad de
la reaccin (9) puede ser expresada en funcin de la ecuacin de Butler Volmer,
como sigue:

( )
,
_
,
_

,
_
RT
F n
RT
F n
nF
i
r exp
1
exp
0
9
(13)

donde i
0
representa la corriente de intercambio, es el coeficiente de simetra de
la reaccin, n es el nmero de equivalentes, R es la constante del gas ideal, T es
la temperatura absoluta y es el sobrepotencial. La velocidad de oxidacin del
complejo enzima-ferroso en la membrana de la bacteria tiene unidades de mol /
(rea x tiempo). Ella se expresa como i/nF, donde i es la densidad de corriente de
electrones removidos desde el complejo enzima-ferroso hacia el circuito redox
interno de la bacteria. El sobrepotencial, , se expresa de acuerdo a los
potenciales establecidos en la membrana celular y se define como:

m
eq
m
E E (14)

m
eq
E es el potencial de membrana para el cual el sistema se encuentra en equilibrio
(i=0), se encuentra determinado por la razn de las concentraciones de los
complejos enzima-frrico y enzima-ferroso en la superficie de la membrana, y puede
ser determinado por la expresin siguiente:

,
_
+
+
+
] ) [(
] ) [(
ln
2
3
0
E Fe
E Fe
F n
T R
E E
m m
eq (15)

61
Cuando la corriente de oxidacin de ion ferroso en la membrana es cero este
potencial debe igualarse al potencial de Nernst asociado a la razn [Fe
3+
]/[Fe
2+
] en la
solucin, el cual se puede representar adecuadamente por el Eh:
,
_
+
+
+
] [
] [
ln
2
3
0
Fe
Fe
F n
T R
Eh Eh (16)
Por otro lado,
m
E es el potencial establecido en la cara periplasmtica de la
membrana cuando el proceso de oxidacin de ion ferroso se desarrolla a una
velocidad finita. Este potencial est inducido por la reduccin de oxgeno en la
zona citoplasmtica, que impulsa la cadena de transporte de electrones que
comienza en la zona periplasmtica con la oxidacin del complejo ferroso-enzima.
Utilizando las hiptesis expuestas en la descripcin del modelo, la siguiente
expresin para la velocidad de oxidacin de ion ferroso fue derivada (ver detalles
en Anexo D):

] [
] [
] [
1
1
] [
] [
2
3
2
2
3
2
2
+
+
+
+
+
+ +

+
Fe
Fe
K
Fe
K
Fe
Fe
K V
v
I S
Max
Fe
(17)

donde los parmetros V
Max
, K
2
, K
S
y K
I
se definen a continuacin:

( )
1
]
1
,
_

0
2
1
5 1
6 2 0
2
1
exp ] [ Eh E
RT
nF
E
k k
k k
nF
k
V
m
t Max
(18)
[ ] ( )
1
]
1

0 0
2
2
1
exp Eh E
RT
nF
E
nF
k
K
m
t
(19)
1
2
k
k
K
S
(20)
62
5 1
6 2
k k
k k
K
I
(21)

La ecuacin (17) es similar a las expresiones del tipo Monod con inhibicin por
frrico utilizadas para representar la oxidacin de ion ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans (ver expresiones (19) y (22), seccin 2.3.7, primera parte). La
diferencia es que en este caso existe un trmino que disminuye el numerador, el
cual resulta del supuesto de reversibilidad en la reaccin de transporte de
electrones (9). Este trmino indica la existencia de una razn frrico/ferroso para
la cual la velocidad neta de oxidacin de ion ferroso es cero. Este aspecto puede
ser observado en forma ms clara al expresar la velocidad de oxidacin de ion
ferroso,
+ 2
Fe
v , en funcin del potencial de membrana (
m
E ) y el Eh de la solucin.
En este caso la siguiente expresin fue obtenida (la deduccin se puede revisar en
Anexo D):

( ) ( )
( )
1
]
1
+ +
'
1
]
1

1
]
1
+
0
3
2
2
0
1
exp
] [
1
exp 1
2
exp
2
Eh Eh
RT
nF
K
Fe
K
Eh E
RT
nF
Eh E
RT
nF
K
v
m m
Fe
(22)

donde: K
1
*
=
2
1
5 1
6 2
,
_
k k
k k
nF
k
; K
2
*
=
1
2
k
k
; K
3
*
=
5 1
6 2
k k
k k

63
4.2 Estimacin de parmetros

Para la estimacin de los parmetros (V
Max
, K
S
, K
I
, K
2
) que mejor ajustan el
modelo a los valores experimentales se utiliza el mtodo de Newton. Para ello se
defini una funcin objetivo como la suma de los cuadrados de las diferencias
entre los valores experimentales y la prediccin del modelo. El proceso se
desarrollo con Solver
de MS Excel
, obtenindose los valores presentados en la

tabla 4.1.

Tabla 4.1: Parmetros ajustados para expresin (17).
Parmetro Valor
V
Max
[g Fe/(hr cel)] 2,817 x 10
-6
K
S
[g/l] 0,073
K
I
[ - ] 0,641

K
2
[g Fe/(hr cel)] 8,833 x 10
-9

La expresin (17) muestra una adecuada descripcin de los datos experimentales
que se demuestra en una alta correlacin (R
2
= 0,95). Esto puede ser visualizado
en la Figura 4.1 que correlaciona los valores experimentales de v
Fe
2+
obtenidos
para distintas concentraciones de ion ferrosos y razones frrico/ferroso con
respecto a aquellos valores calculados utilizando la expresin (17) y los
parmetros de la tabla 4.1.

En forma similar, la informacin experimental fue correlacionada con la expresin
(22), una ecuacin que proviene del mismo modelo cintico, pero que
explcitamente muestra el efecto del Eh sobre la velocidad de oxidacin de ion
ferroso v
Fe
2+
, y el potencial de membrana E
m
.
Los parmetros de la ecuacin (22)
fueron determinados de igual forma al caso anterior, obtenindose los valores
presentados en la tabla 4.2.

64
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
4,0E-06
0,0E+00 1,0E-06 2,0E-06 3,0E-06 4,0E-06
VFe2+ Experimental [g Fe/ (hr cel)]

V
F
e
2
+

C
a
l
c
u
l
a
d
a

[
g

F
e
/

(
h
r

c
e
l
)
]

Figura 4.1: Correlacin entre valores calculados y experimentales de v
Fe
2+
.
Valores calculados usando expresin (17).

Tabla 4.2: Parmetros ajustados para expresin (22).
Parmetro Valor
*
1
K [g Fe/(hr cel)] 1,594 x 10
-7
*
2
K [g/l]
0,073
*
3
K [ - ]
0,641

E
m
[V vs SHE] 0,839

La dependencia de v
Fe
2+
con [Fe
+2
], [Fe
+3
]/[Fe
+2
] y el Eh de la solucin de acuerdo
al modelo cintico desarrollado en este trabajo, se resume en la Figura 4.2. Esta
Figura muestra tres zonas caracterizadas por distinto comportamiento. En la zona
de Eh bajo 0,65 (SHE), v
Fe
2+
depende principalmente de la concentracin de ion
ferroso en solucin. En este rango de potencial la razn frrico/ferroso asociada es
muy pequea, y los trminos K
I
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] y K
2
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] son despreciables,
con lo cual la ecuacin (17) se puede simplificar a una expresin del tipo Monod
estndar (expresin 7, seccin 2.3.1, primera parte). Se ha encontrado que esta
expresin describe en forma adecuada la cintica de oxidacin de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en sistemas con una alta concentracin inicial de ion
65
ferroso (Lacey and Lawson, 1970; MacDonald and Clarke, 1970; Jones and Kelly,
1983; Nakamura et al., 1986; Shrihari and Gandhi, 1990).

Eh, V vs SHE
0,500 0,600 0,700 0,800 0,900
V
F
e
2
+

[
g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)
]
10
-9
10
-8
10
-7
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
[Fe
3+
]/[Fe
2+
]
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
0,1
0,5
1
10
[Fe
+2
], g/l

Figura 4.2: Dependencia de la velocidad de oxidacin bacteriana de ion ferroso
con el Eh (o la razn frrico/ferroso) y la concentracin de ion ferroso en solucin,
calculada utilizando las expresiones (17) y (22).

En el rango de Eh 0,70 0,80 V (SHE), el incremento en la razn [Fe
+3
]/[Fe
+2
]
hace que el trmino K
I
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] predomine sobre K
S
/[Fe
+2
], pero an el trmino
K
2
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] es despreciable con respecto a V
max
. En esta situacin, la
expresin (17) se simplifica a la expresin (22) de la primera parte, es decir, la
velocidad de oxidacin de ion ferroso solo depende de la razn [Fe
+3
]/[Fe
+2
]. Esta
expresin ha sido reportada para experiencias donde se opera a alto Eh con el
uso de poblaciones relativamente altas de Acidithiobacillus ferrooxidans, en donde
las variaciones en las mediciones de Eh son utilizadas para estimar la velocidad
de oxidacin de ion ferroso (Boon et al., 1995; Breed et al., 1999).

66
En el rango de Eh, 0,65 0,72 V (SHE), solo el trmino K
2
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] se cancela
en la ecuacin (17) (es despreciable respecto a V
max
). En ese caso la expresin
(17) se puede reducir a una expresin del tipo Monod con inhibicin por ion frrico
(expresin (19) de la primera parte). Esta ecuacin entrega una buena descripcin
del comportamiento cintico para todos los valores de Eh menores a 0,80 V
(SHE). Esta expresin, corresponde a una de las ecuaciones ms completas
reportadas previamente en la literatura, y fue deducida de un modelo enzimtico
que incluye inhibicin competitiva por ion frrico (Jones and Kelly, 1983; Lizama
and Suzuki, 1989).

Para potenciales sobre 0,80V (SHE), el trmino K
2
x[Fe
+3
]/[Fe
+2
] es demasiado
grande para ser despreciado, y la velocidad de oxidacin de ion ferroso solo
puede ser descrita por la expresin (17) completa. La naturaleza del mecanismo
controlante en este rango de altos potenciales, puede ser ms claramente
observado si la cintica es expresada en funcin de los potenciales, es decir,
segn la expresin (22). Se puede observar que cuando el Eh se aproxima al valor
del potencial de membrana, E
m
, la ecuacin (22) se reduce a la siguiente
expresin:

[ ] Eh E Eh K v
m
Fe

1
]
1
2
exp
2
(23)

donde K y son constantes reducidas. La expresin (23) muestra que en este
rango de altos potenciales la velocidad de oxidacin de ion ferroso queda
predominantemente determinada por la diferencia de potencial entre el potencial
de membrana (E
m
) y el Eh. Segn la expresin (23), adems, es evidente que
cuando el Eh iguala al potencial de membrana E
m
, no existe oxidacin neta de ion
ferroso. En otras palabras, E
m
es el mximo Eh que puede ser alcanzado en
solucin al oxidar ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.

67
4.3 Aplicacin del modelo a otra informacin experimental

Para confirmar la validez del modelo desarrollado en este trabajo, se aplico la
expresin cintica del modelo a los datos experimentales publicados por Harvey
and Crundwell (1996). En la Figura 4.3 se presenta la correlacin del modelo a los
datos y en la Tabla 4.3 se presentan los parmetros obtenidos al realizar la
regresin de mnimos errores cuadrticos.

0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0 1 2 3 4 5 6 7
[Fe
2+
], g/l
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
o
n
,

[
1
/
h
r
]
g/l.
g/l.
g/l.
g/l.
[Fe
3+
] = 1,0 .
[Fe
3+
] = 2,5 .
[Fe
3+
] = 5,0 .
[Fe
3+
] = 9,0 .
Figura 4.3: Valores
publicados por Harvey and
Crundwell (1996) y ajuste al
modelo cintico presentado
en este trabajo.

En la Figura 4.3 puede observarse que la correlacin de los datos experimentales
publicados por Harvey y Crundwell (1996) al modelo (puntos y lneas continuas,
respectivamente) es excelente.

Tabla 4.3: Parmetros ajustados para expresin (17)
con datos de Harvey y Crundwell (1996).
Parmetro Valor
V
Max
[g Fe/(hr cel)] 3,915 x 10
-6
K
S
[g/l] 0,063
K
I
[ - ] 0,088

K
2
[g Fe/(Hr cel)] 1,750 x 10
-8

68
Al comparar la informacin contenida en las Tablas 4.1 y 4.3 se observa bastante
similitud en los parmetros estimados para cada caso. An ms, en este caso, el
valor de E
m
calculado es de 0,813 V (SHE), es decir, es bastante cercano al valor
obtenido en esta tesis, a pesar de desarrollarse las experiencias con otros
electrodos, medios de cultivo y cepas bacterianas.

Para comprender en forma ms profunda la solidez del modelo presentado, a
continuacin se realiza un anlisis de las implicaciones mecansticas que l
presenta de acuerdo con la teora de la quimioosmosis y la teora cintica
electroqumica.

4.4 Implicaciones mecansticas del modelo cintico derivado

El modelo desarrollado en este trabajo, describe la cintica de oxidacin de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en condiciones de alto Eh, una situacin
que no haba sido cubierta adecuadamente con los modelos reportados
previamente. El comportamiento cintico observado en esta regin entrega una
clara evidencia del desarrollo de un mecanismo de transporte de electrones que
est gobernado por las diferencias de potencial que se establecen a travs de la
membrana citoplasmtica. Es importante analizar las implicancias mecansticas de
estos resultados y, en particular, definir la naturaleza del potencial de membrana
E
m
, que corresponde a un parmetro electroqumico determinante en el mecanismo
de reaccin presentado.

El proceso de transferencia de carga a travs de la membrana citoplasmtica
puede ser representado utilizando la teora cintica electroqumica, que de este
modo se representa en el diagrama I-E de la figura 4.4a. La curva a representa la
cintica de oxidacin del complejo ferroso-enzima en el lado periplasmtico de la
membrana. La curva b representa la cintica electroqumica de la reduccin de
oxgeno a agua en el lado citoplasmtico de la membrana.
+
+
2
3
Fe
Fe
E representa el
potencial de Nernst asociado a oxidacin del complejo ferroso-enzima que
69
corresponde de hecho al Eh de la solucin y
O H
O
E
2
2
es el potencial de Nernst
asociado a la reduccin de oxgeno. E es la suma de las cadas de voltaje en la
cadena de transporte de electrones y en el sistema de sntesis de ATP que cierra
el circuito electroqumico (Crundwell, 1997). Segn este esquema, la presencia de
oxgeno en el citoplasma de la clula induce la polarizacin de la membrana a un
potencial E
m
. De la teora de potencial mixto el potencial E
m
debe ser tal que
ambas, las corrientes asociadas a la reaccin andica (oxidacin de ion ferroso) y
reaccin catdica (reduccin de oxgeno) sean iguales, y la suma de E ms los
sobrepotenciales asociados a las reacciones andica (
a
) y catdica (
C
) sea igual
a la diferencia de potencial total (
+
+
2
3
Fe
Fe
E
O H
O
E
2
2
).

El potencial electroqumico de la reaccin de reduccin de oxgeno a agua est
dado por la siguiente expresin:

O H O
a pH p E
2 2
log 0148 , 0 0591 , 0 log 0148 , 0 23 , 1 + (24)

que en las condiciones del citoplasma (pH 6,5), resulta ser un potencial de 0,850 V
(SHE) (Ingledew, 1982). La validacin del modelo presentado en este trabajo
muestra que el potencial de membrana E
m
es 0,839 V (SHE), un valor que es muy
cercano al calculado por Ingledew (1982) para el potencial de Nernst de la
reduccin de oxgeno en el citoplasma celular. Este es un resultado clave que
sirve para validar el enfoque mecanstico planteado en este trabajo. Esto implica
que la cintica de reduccin de oxgeno en el citoplasma es muy reversible y,
adems, el E asociado a las cadas de potencial en la cadena de transporte de
electrones y el sistema de sntesis de ATP son despreciables. Este comportamiento
se representa esquemticamente en la figura 4.4b donde la cintica de oxidacin del
complejo ferroso-enzima se presenta en varias situaciones. En este caso E
m
es muy
cercano a
O H
O
E
2
2
y su valor prcticamente no cambia con las variaciones de Eh de
70
la solucin o la cintica de oxidacin del complejo ferroso-enzima, que se
representan en las curvas a1, a2, a3.

Figura 4.4: Diagramas corriente potencial en el mecanismo electroqumico de la
oxidacin bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.

El esquema electroqumico de la Figura 4.4b implica que la cintica de reduccin de
oxgeno es, en forma relativa, mucho mayor que la cintica de oxidacin de ion
ferroso. Los sitios activos para la reduccin de oxgeno en la cara citoplasmtica de
la membrana estn asociados a citocromo oxidasas del tipo aa3 (Appia-Ayme et al.,
1999) mientras que los sitios activos para la oxidacin de ion ferroso en el lado
periplasmtico estn relacionados a enzimas que no han sido bien definidas (ver
+
+
2
3
Fe
Fe
E
O H
O
E
2
2
+ +
+ e E Fe E Fe ) ( ) (
3 2 O H e H O
2 2
2 2
2
1
+ +
+
a
E m
E
Corriente a
travs de la
membrana
+
+
2
3
Fe
Fe
E
O H
O
E
2
2
a
m
E
71
seccin 2.2, primera parte). El comportamiento cintico observado implica que la
reactividad especfica y/o la densidad de los sitios activos para la reduccin de
oxgeno es mucho mayor que los valores respectivos de los sitios activos asociados
a la oxidacin de ion ferroso. Sin embargo, an no existe una descripcin detallada
de la cadena respiratoria de Acidithiobacillus ferrooxidans que pueda ayudar a
corroborar esta conclusin.

5 CONCLUSIONES

Se realizaron mediciones experimentales utilizando una celda bioelectroqumica
de potencial controlado que permitieron cuantificar explcitamente el efecto del Eh
en la velocidad de oxidacin de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.

Los resultados experimentales obtenidos con esta celda fueron utilizados en la
validacin de un modelo enzimtico electroqumico que describe la cintica de
oxidacin de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans. La expresin cintica
obtenida permite integrar en forma explcita la influencia del Eh y las
concentraciones de ion ferroso y frrico en la velocidad de oxidacin de ion ferroso
con Acidithiobacillus ferrooxidans. Esta expresin permite la descripcin adecuada
del proceso de oxidacin bacteriano de ion ferroso en un rango de Eh mucho
mayor que los modelos formulados con anterioridad. El modelo desarrollado
mejora la descripcin de la cintica de oxidacin de ion ferroso, sin contradecir a
los modelos anteriores, es decir, los incluye.

La expresin cintica desarrollada fue utilizada para ajustar datos otros datos
experimentales de la literatura (Harvey y Crundwell, 1996). Se observa que el
modelo es absolutamente compatible con la informacin experimental,
encontrndose que los valores de los parmetros son similares a los reportados
en el trabajo de esta tesis, validando de esta forma el modelo.

72
La descripcin del proceso biolgico de oxidacin es compatible con la descripcin
bioqumica de los mecanismos de transporte de electrones discutida en la seccin
2.2 de la primera parte. De esta forma, se encuentra que en un sistema que no
esta limitado por la disponibilidad de oxgeno, la velocidad de oxidacin esta
controlada por la transferencia de electrones desde el aceptor primario al ion
ferroso. Esta hiptesis se comprueba al encontrarse que el potencial andico (E
m
)
que impulsa la oxidacin corresponde al valor fijado por el par oxgeno/agua en el
interior de la clula.

La formulacin de un modelo enzimtico-electroqumico se demostr til en la
descripcin del comportamiento cintico del sistema en estudio. La extensin de
este modelo a los casos donde concentracin de oxgeno disuelto participa en el
control cintico, se muestra necesaria para comprobar la validez de las hiptesis
en sistemas de mayor complejidad.

73
TERCERA PARTE:
EFECTO DEL pH EN LA CINTICA DE OXIDACIN DE ION

1 INTRODUCCIN

De acuerdo a las cadenas de transporte de electrones y procesos bioenergticos
que fueron discutidos en la seccin 2.2 de la primera parte es claro que la
oxidacin de ion ferroso y el crecimiento bacteriano son impulsados
fundamentalmente por dos fuerzas: La diferencia de potencial redox entre los
pares Fe
3+
/Fe
2+
y O
2
/H
2
O por un lado y la diferencia de pH a travs de la
membrana citoplasmtica por otro. El primer proceso que corresponde a un
mecanismo de transporte de electrones, y su cintica fue estudiada en la
segunda parte de esta tesis. Respecto del pH, se ha establecido que su influencia
se presenta en distintas etapas del circuito quimiosmtico y en consecuencia sus
mecanismos de accin merecen especial atencin.

El proceso de oxidacin de ion ferroso utiliza al oxgeno como aceptor final de
electrones y consume protones en esta reaccin. Simultneamente, la cadena de
transporte directo de electrones produce translocacin de protones aumentando la
diferencia de pH. Adicionalmente, y como consecuencia de la oxidacin de ion
ferroso, se producen reacciones de hidrlisis de ion frrico que liberan a la
solucin una cantidad adicional de protones. La diferencia de actividad de
protones generada de esta forma debe ser suficiente para producir la formacin de
ATP por un lado, e impulsar la cadena de transporte reverso de electrones para la
reduccin de NADP
+
por otro.

A pesar su relevancia la influencia del pH no ha recibido suficiente atencin y solo
algunos autores (ver apartado 2.3 de la primera parte) se han atrevido a formular
hiptesis respecto del mecanismo de control.
74

La presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans en ambientes de alto pH (4 7)
indica que ellos deben poseer actividad en estas condiciones, a pesar de lo cual
no existen estudios de medicin de capacidad oxidativa de ion ferroso para la
bacteria a pH superior a 3,5. En estas condiciones de pH es esperable la
formacin gran cantidad de precipitados de ion frrico (seccin 2.3.5), si esta
especie se encuentra disponible en la solucin. En consecuencia resulta de inters
establecer las caractersticas de la actividad oxidativa bacteriana en condiciones
de alto pH y verificar como ella se encuentra afectada por la disponibilidad de
protones en solucin y la formacin de precipitados que se presenta como
consecuencia de la oxidacin.

En este trabajo se estudiar la velocidad de oxidacin de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 7,0. La formacin de
importantes cantidades de precipitados de ion frrico a pH mayor que 2,0 nos han
obligado a separar este estudio en dos partes: la primera se realiza en rango 1,3
2,5 estimando la velocidad de oxidacin de ion ferroso utilizando un mtodo
convencional; y la segunda que estudiar el rango 2,5 7,0 utilizando una
metodologa desarrollada especialmente en este trabajo.

75
2.1 Medicin del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso I:
rango de pH 1,3 2,5.

En estas experiencias se estim la velocidad de oxidacin de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 2,5 utilizando la metodologa
propuesta por Pesic et al. (1989). Este mtodo usa las variaciones del Eh de la
solucin como un indicador de las variaciones de concentracin de ion ferroso y
frrico cuando la concentracin de hierro total es constante. Esta metodologa ha
sido utilizada exitosamente con anterioridad (Graindorge et al., 1994; Boon et al.,
1995; Breed et al., 1999) y ha demostrado ser confiable cuando se mantienen las
condiciones de aireacin, hierro total, fuerza inica, pH de la solucin y correcto
funcionamiento de los electrodos.

2.1.1 Cultivo de bacterias

(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1:

Tabla 2.1: Composicin del medio basal.
Compuesto Concentracin, g/l
(NH
4
)
2
SO
4
0,4
MgSO
4
7H
2
O 0,4
K
2
HPO
4
3H
2
O 0,056
FeSO
4
7H
2
O 14,9


76

Para cada experimento, el inculo se prepar a partir de 80 ml del cultivo
bacteriano, el cual fue filtrado utilizando una membrana Millipore
de 0,22m. Los
microorganismos separados son lavados cuatro veces: dos veces utilizando una
solucin de cido sulfrico en agua destilada a pH 1,6, y luego dos veces con
agua destilada para la remocin de precipitados de fierro adheridos y cido
residual en el pellet. Estas bacterias fueron luego resuspendidas en 10 ml de agua
destilada a pH 6,0. La poblacin de bacterias en el inculo es determinada por
conto directo en una cmara Petroff-Hausser, resultando tpicamente de 8 a 10 x
10
8
bacterias/ml.

2.1.2 Montaje experimental

Un esquema del montaje experimental se presenta en la Figura 2.1. La celda
contiene 100 ml de la solucin de basal con bacterias en la cual se colocan un
electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo combinado de Eh
Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran conectados a un sistema
de adquisicin de datos Opto 22, que registra las variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas seales, solo la referencia del
electrodo de pH se encuentra conectado elctricamente y ambos valores (pH y
Eh) son referidos a ste. La solucin en la celda es agitada con un agitador
magntico y es mantenida a una temperatura constante de 30t1C usando una
chaqueta de calefaccin con agua.

77

Figura 2.1: Montaje experimental para
medicin del efecto del pH en la
actividad oxidativa bacteriana.
(1) Burbujeo de aire o Nitrgeno
(2) Electrodo de pH
(3) Electrodo de Eh
(4) Sistema de adquisicin de
datos.
(5) Circuito de agua termostatizada.
(6) Agitador magntico.

2.1.3 Preparacin de soluciones

La solucin de trabajo es preparada in situ de acuerdo al siguiente procedimiento:
Se colocan en la celda 100 ml de medio basal (pH 1,6) libre de fierro. Se remueve
el oxgeno disuelto mediante el burbujeo contino de nitrgeno de alta pureza
durante 15 minutos. Se adiciona sulfato ferroso de grado analtico en forma de
cristales hasta completar una concentracin de 0,2 g/l, sin dejar de burbujear
nitrgeno. Se ajusta el pH deseado, entre 1,3 y 2,5 dependiendo de la experiencia,
utilizando cido sulfrico concentrado o solucin de hidrxido de sodio 1 N.

2.1.4 Procedimiento

Se agrega una poblacin aproximada de 5x10
7
cel/ml a la solucin acondicionada
previamente y se cambia el burbujeo de nitrgeno por burbujeo de aire. La
concentracin de bacterias es determinada por conto directo utilizando una celda
Petroff-Hausser.

78
En la celda experimental se colocan los electrodos de Eh y pH y se comienza la
adquisicin de datos en funcin del tiempo durante 150 minutos. En todas las
experiencias se encontr que las variaciones de pH son muy pequeas, con lo
cual la aplicacin del mtodo de Pesic et al. (1989) resulta adecuada.

2.2 Medicin del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso II:
rango de pH 2,5 7,0

Es bien conocido que la actividad de Acidithiobacillus ferrooxidans en la oxidacin
de ion ferroso decae rpidamente a pH sobre 2,5. Sin embargo el mecanismo
detrs de esta inhibicin no esta completamente definido. Esta falta de
conocimiento est en parte relacionada con las limitaciones que presentan las
metodologas utilizadas actualmente para estudiar la oxidacin de ion ferroso con
microorganismos (normalmente se utiliza la medicin de la disminucin de la
concentracin de ion ferroso, consumo de oxgeno o medicin de la evolucin del
Eh). Ellas no permiten mediciones precisas a pH sobre 3,0 donde la oxidacin de
ion ferroso es acompaada por rpidas variaciones de pH y hierro total. Para
resolver este problema, se desarroll un mtodo para estimar las velocidades de
oxidacin de ion ferroso a partir del seguimiento de las variaciones de pH y Eh que
ocurren durante el proceso oxidativo.


(1973), y que se present en la Tabla 2.1.


79

Para cada experimento, el inculo se prepar a partir de 80 ml del cultivo
bacteriano, el cual fue filtrado utilizando una membrana Millipore
de 0,22m. Los
microorganismos separados fueron lavados cuatro veces: dos veces utilizando
una solucin de cido sulfrico en agua destilada a pH 1,6, y luego dos veces con
agua destilada para la remocin de precipitados de fierro adheridos y cido
residual en el pellet. Estas bacterias fueron luego resuspendidas en 10 ml de agua
destilada a pH 6,0. La poblacin de bacterias en el inculo es determinada por
conto directo en una cmara Petroff-Hausser, resultando tpicamente de 8 a 10 x
10
8
bacterias/ml.

2.2.2 Montaje experimental

Un esquema del montaje experimental se present en la Figura 2.1. La celda
contiene 100 ml de la solucin de basal con bacterias en la cual se colocan un
electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo combinado de Eh
Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran conectados a un sistema
de adquisicin de datos Opto 22, que registra las variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas seales, solo la referencia del
electrodo de pH se encuentra conectado elctricamente y ambos valores (pH y
Eh) son referidos a ste. La solucin en la celda es agitada con un agitador
magntico y es mantenida a una temperatura constante de 30t1C usando una
chaqueta de calefaccin con agua.


La solucin de trabajo es preparada in situ de acuerdo al siguiente procedimiento:
se colocan en la celda 100 ml de agua destilada o medio basal libre de fierro,
80
siendo desoxigenados mediante el burbujeo contino de nitrgeno de alta pureza.
Luego, se agregan gotas de una solucin 1N de NaOH hasta alcanzar un pH
levemente superior a 7,0. Manteniendo el burbujeo de nitrgeno se adiciona una
cantidad predeterminada de sulfato ferroso (en forma de cristales hidratados de
calidad analtica) suficiente para alcanzar la concentracin deseada de ion ferroso
en solucin (0,1 g/l, 0,5 g/l o 1 g/l). Este procedimiento permite la solubilizacin de
ion ferroso a alto pH previniendo la oxidacin espontnea del reactivo. Si se
requiere, se agrega una cantidad adicional de NaOH necesaria para reajustar el
pH a 7,0. Finalmente, la bacteria resuspendida es agregada para lograr en la
solucin de trabajo la concentracin deseada de microorganismos (8 x 10
6
a 8 x
10
7
cel/ml).

2.2.4 Procedimiento

La oxidacin de fierro se inicia al cambiar desde burbujeo de nitrgeno a burbujeo
de aire en la celda. La velocidad de oxidacin de ion ferroso fue determinada a
partir de las variaciones de Eh y pH de acuerdo con el procedimiento de clculo
que se describe junto a los resultados. Quince condiciones experimentales
distintas fueron utilizadas, correspondientes a tres diferentes concentraciones
iniciales de ion ferroso (0,1 g/l, 0,5 g/l o 1 g/l), en soluciones con bacterias y
condiciones abiticas y cuatro concentraciones iniciales de bacterias (0,8, 2, 5 y 8
x 10
7
cel/ml). Se oper adems en soluciones de medio basal libre de fierro y
soluciones libres de nutrientes, Cada condicin experimental fue desarrollada en
duplicado para asegurar la reproducibilidad del procedimiento.

2.3 Medicin del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso
III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano.

Acidithiobacillus ferrooxidans obtiene la energa para su crecimiento y mantencin
de un origen distinto a su fuente de carbono. Por lo tanto, puede desacoplar los
procesos de oxidacin de ion ferroso y de fijacin de dixido de carbono para la
81
formacin de biomasa. Considerando lo anterior, es necesario comprobar si los
procesos de oxidacin de ion ferroso a distintos pH se encuentran relacionados
con crecimiento celular. Una forma simple de comprobar si estos procesos estn
acoplados es realizar la medicin simultnea del consumo de oxgeno (cuantifica
la velocidad de oxidacin) y el consumo de dixido de carbono (estima la
velocidad de sntesis de biomasa).

Estas experiencias fueron desarrolladas en el Mineral Bioprocessing Laboratory
del Departamento de Ingeniera Qumica de la Universidad de Cape Town,
Sudfrica, con la supervisin del profesor Goeff Hansford.


En este estudio se utiliz una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC
19859). El cultivo de las bacterias se efectu en matraces Erlenmeyer de 300 ml,
utilizando 150 ml del medio basal presentado en la Tabla 2.1.

El pH del medio fue ajustado en 1.6 utilizando cido sulfrico concentrado. El
cultivo fue mantenido a 30,0C en un agitador orbital.


El inculo a ser utilizado en el reactor se prepar con 480 ml del cultivo bacteriano,
correspondiente a cuatro matraces, el cual fue filtrado utilizando una membrana
Millipore
de 0,22m. Las bacterias separadas fueron lavadas tres veces con 20

ml de solucin de cido sulfrico a pH 1,6 para la remocin de precipitados de
fierro adheridos, y es luego resuspendido en 20 ml de medio basal libre de sulfato
ferroso. La poblacin de bacterias en el inculo no se determin, pero se estim
de acuerdo con las experiencias realizadas anteriormente.
82

2.3.2 Bioreactor y Montaje

Las experiencias de oxidacin batch de sulfato ferroso fueron desarrolladas en
bioreactores Applikon
Z61104CT04 de 2 litros confeccionados en borosilicatos,

con un volumen de trabajo de un litro. Una representacin esquemtica del
bioreactor y el montaje utilizado se presenta en la Figura 2.2.

Figura 2.2: Montaje experimental utilizado para la estimacin del rendimiento en el
crecimiento bacteriano al oxidar sulfato ferroso.

El bioreactor fue termostatizado utilizando una camisa de calefaccin con agua. La
disolucin fue agitada por un impulsor de acero inoxidable 316 de seis aspas
ubicado a dos cm del fondo del reactor. El agitador fue rotado a 400 rpm con un
motor Applikon P100 y control digital de velocidad.

La entrada de gas fue entregada por un generador de aire libre de aceite Peak
Scientific OAG2000DA. El aire de salida fue filtrado con un filtro Walker A30X1,
luego secado por un secador de aire comprimido refrigerado Denco SN0.75 y
finalmente vuelto a filtrar usando filtros Walker A30XA y A30AC, para producir un
Anlisis de O2 y CO2 Salida de gases
Secado de
Gases
Calefactor
Control de
Flujo de Gas
Condensador
Entrada de gases
Adquisicin de Datos
83
aire comprimido, seco y libre de aceite. Los flujos de entrada y salida del reactor
fueron medidos utilizando un flujmetro de burbuja Hewllet Packard de 100 ml. El
gas de salida se sec usando un condensador a la salida del reactor, enfriado con
etilenglicol bajo 1C..

En cuanto al anlisis de gases, la determinacin de las concentraciones de dixido
de carbono y oxgeno en los gases de entrada y salida, se realiz utilizando un
fotmetro industrial Hartmann & Braun Uras 4 NDIR y un analizador
paramagntico de oxgeno Magnos &G, respectivamente.

Para la medicin y control del pH se utiliz un electrodo combinado de pH Metler-
Toledo conectado a una biocontrolador Applikon ADI1030. El biocontrolador
estaba conectado a dos bombas peristlticas Masterflex que alimentan soluciones
de cido sulfrico e hidrxido de sodio al bioreactor segn sea necesario para
mantener el pH en un valor constante. Este controlador asimismo informa las
adiciones de cido y base, y el valor de pH del reactor en el tiempo.

El potencial redox de la solucin es monitoreado utilizando un electrodo
combinado de platino y referencia Ag/AgCl Metler-Toledo. El valor del potencial
junto con el anlisis de los gases de entrada y salida son enviados a un sistema
de adquisicin de datos que almacena la informacin.

2.3.3 Procedimiento

Se coloca en el bioreactor 980 ml de medio basal libre de fierro y se comienza la
agitacin, calentamiento y aireacin. Se agrega al reactor cido sulfrico
concentrado hasta lograr el pH deseado. Se agrega al reactor 1 g/l de ion ferroso
como sulfato ferroso hidratado y a continuacin se adiciona el inculo de bacterias
preparado en acuerdo con el procedimiento descrito. Se comienza el control de la
acidez del sistema. La temperatura es mantenida en 30,0 t 0,1 C.
Simultneamente se comienza el anlisis de gases y la adquisicin de datos. Se
84
monitora pH, T , O
2
, CO
2
, Eh y las adiciones de cido o base. Cada una de las
series experimentales tiene una duracin mnima de 24 horas continuas.

Se tom una muestra de solucin al inicio de la experiencia, antes de la
inoculacin, y otra al final de la serie para realizar un anlisis por ion ferroso y
frrico disueltos. La muestra final es filtrada utilizando una membrana Millipore
para eliminar precipitados presentes y separar las bacterias existentes en el
sobrenadante.

El anlisis de la informacin recopilada se realiza utilizando las metodologas
descritas por Boon (1995).

85

3.1 Caso I: Rango de pH 1,3 2,5

En estas experiencias se caracteriz la velocidad de oxidacin de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 2,5 utilizando la metodologa
propuesta por Pesic et al. (1989). Se defini este rango particular, ya que a valores
menores de pH la oxidacin prcticamente se detiene (evidencia de este trabajo y
antecedentes en seccin 2.3 de la primera parte) y por otro lado, cuando al pH es
mayor que 2,5 la formacin de precipitados es abundante. De esta forma se
defini un rango de valores donde la velocidad de oxidacin es importante y la
hidrlisis del ion frrico no es relevante.

En cada una de las experiencias se observ un continuo aumento del Eh de la
solucin, mantenindose los valores de pH relativamente constantes. La variacin
de Eh est ligada a la oxidacin del ion ferroso de acuerdo a la ecuacin siguiente:

Fe
2+
+ O
2
+ H
+
Fe
3+
+ H
2
O (1)

Simultneamente, es posible la acidificacin producto de la hidrlisis parcial del
ion frrico formado. Sin embargo, la variacin de acidez es pequea en este rango
de pH.

La Figura 3.1 muestra la evolucin tpica de estas variables en una experiencia de
pH inicial 1,9 y pH promedio 1,84, con 0,2 g/l de ion ferroso inicial y 5,5x10
7
cel/ml.

Los grficos correspondientes a las restantes pruebas realizadas se encuentran
en el Anexo E.

86
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
p
H
Eh
pH

Figura 3.1. Evolucin del Eh
y pH. Poblacin de bacterias
5,5x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,2 g/l, pH promedio 1,84.

El mtodo utilizado se basa en la estimacin de las velocidades de oxidacin
utilizando las variaciones en la medida del Eh de la solucin durante la
experiencia. En consecuencia es necesario conocer la dependencia de la seal de
Eh con la razn frrico/ferroso en solucin. Para ello se utiliz la siguiente
expresin, obtenida en la seccin 3.1 de la segunda parte de esta tesis:

,
_
+
+
+
] [
] [
log 0579 , 0 671 , 0 SHE) vs (V
2
3
Fe
Fe
x Eh (2)

Utilizando la curva de calibracin para el electrodo de Eh (Expresin 2) y la
concentracin total de fierro, [Fe
tot
], se calculan las concentraciones instantneas
de ion ferroso y frrico:

,
_

+
+
0579 , 0
671 , 0
2
10 1
] [
] [
Eh
tot
Fe
Fe (3)
] [ 10 ] [
2 0579 , 0
671 , 0
3 +
,
_

+
Fe Fe
Eh
(4)

Se calcul la velocidad instantnea de oxidacin de ion ferroso durante la
experiencia, utilizando una derivada discreta:
87
cel
t t t
Fe
N t
Fe Fe
v
1
] [ ] [
) (
2
) (
2
2

+
+
+
+
(5)

donde N
cel
es el nmero de bacterias en solucin (cel/ml).

La Figura 3.2 muestra la velocidad de oxidacin de ion ferroso obtenida en la
experiencia presentada en la Figura 3.1.

Figura 3.2. Velocidad de
oxidacin de ion ferroso.
Poblacin de bacterias
5,5x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
0 50 100 150
Tiempo, min
V
F
e
2
+
,

g

F
e
/

(
h
r

c
e
l
)

Los resultados de la Figura 3.2 muestran una disminucin importante de velocidad
en la medida que transcurre la oxidacin. Esta disminucin est ligada al
progresivo consumo de ion ferroso y por lo tanto los valores experimentales
pueden ser correlacionados a una expresin de tipo Monod con ion ferroso como
sustrato limitante (expresin 7 seccin 2.3.1, primera parte).

Se realiza una regresin no lineal, utilizando como funcin objetivo el cuadrado del
error en cada punto. De esta forma, se obtuvieron valores para V
Max
y K
S
en cada
pH utilizado, los cuales son presentados en la Tabla 3.1. No se consider la
influencia del ion frrico, ya que el ajuste numrico se realiza en la zona donde su
concentracin es baja y en consecuencia su influencia es muy pequea (Eh menor
que 0,670 V vs SHE). No fue considerada la prueba correspondiente a las figuras
88
E.5 y E.6 del anexo E, ya que en esta experiencia las variaciones de velocidad no
permiten un adecuado ajuste de parmetros en el modelo. Esto se debe a la baja
poblacin de microorganismos que result en esta prueba.

Tabla 3.1. Parmetros ajustados para ecuacin tipo Monod
en experiencias a pH entre 1,27 y 2,60
pH K
S
V
Max

g/l g Fe/ (hr cel)
1,27 0,352 3,02E-06
1,31 0,317 2,75E-06
1,55 0,228 2,87E-06
1,66 0,218 2,74E-06
1,71 0,156 3,03E-06
1,84 0,111 2,88E-06
1,87 0,087 2,84E-06
2,03 0,031 2,85E-06
2,07 0,080 2,73E-06
2,25 0,039 2,76E-06
2,28 0,102 2,95E-06
2,55 0,123 2,86E-06
2,60 0,099 2,82E-06

En las pruebas realizadas a mayor pH (sobre 2,0) se observa inicialmente una
etapa de baja velocidad que no concuerda con el comportamiento posterior. Esto
se explica como un retardo inicial en la actividad, producto de l a aparicin de
trazas de precipitados en el sistema. La precipitacin es inducida durante el ajuste
de pH que se realiza con hidrxido de sodio y la importancia de este fenmeno no
fue prevista ni evaluada con anterioridad. Por esta razn estos puntos no fueron
considerados en el ajuste de parmetros realizado en cada caso.

En las Figuras 3.3 y 3.4 se presentan los valores de V
Max
y K
S
en funcin del pH
para la serie experimental realizada.

89
2,0E-06
2,2E-06
2,4E-06
2,6E-06
2,8E-06
3,0E-06
3,2E-06
3,4E-06
3,6E-06
3,8E-06
4,0E-06
1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
pH
V
m
a
x
,

g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)

0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
pH
K
s
,

g
/
l

Figura 3.3. Efecto del pH sobre V
Max
. Figura 3.4. Efecto del pH sobre K
S
.

En la Figura 3.3 no se observa una clara influencia del pH sobre la velocidad
mxima de oxidacin (V
Max
) en el rango de pH utilizado, por lo tanto en el anlisis
se considera que este parmetro es independiente de la acidez para valores de
pH menores a 2,60. Por otro lado, en la Figura 3.4 se aprecia una clara influencia
del pH sobre la constante de afinidad con el sustrato (K
S
), disminuyendo su valor
en forma importante al aumentar el pH entre 1,27 y 2,0.

Para interpretar la influencia del pH sobre la velocidad de oxidacin de ion ferroso
en esta serie experimental se puede considerar un esquema de inhibicin por
protonacin de los sitios activos. En otras palabras, los protones actan como
inhibidores de la oxidacin de ion ferroso (Shuler y Kargi, 1992). Para explicar
este supuesto debemos volver al mecanismo de oxidacin presentado en la Figura
2.9 de la primera parte. En la figura, el proceso de transporte directo de electrones
es acompaado de la translocacin simultanea de protones, es decir localmente la
oxidacin de ion ferroso produce protones. De esta forma al aumentar la
concentracin de protones en solucin, ellos dificultan el proceso de translocacin
al bloquear los sitios activos de liberacin. Es decir, los protones producen
inhibicin por producto del proceso oxidativo. En consecuencia, el parmetro K
S

debe depender de la concentracin de protones en solucin y la velocidad de
oxidacin bacteriana de ion ferroso se puede expresar de acuerdo a la siguiente
expresin (ver seccin 2.3.1, primera parte):
90

] [ ]) [ 1 (
] [
2
1
2
+ +
+
+ +
Fe H K K
Fe V
V
H
max
(6)

donde K
1
y K
H
son constantes de ajuste. En consecuencia se espera que los
valores obtenidos de K
S
dependan linealmente de la concentracin de protones en
solucin en la forma:

]) [ 1 (
1
+
+ H K K K
H S
(7)

En la Figura 3.5 se aprecia la relacin entre el valor de K
S
y la concentracin de
protones en el rango de pH 1,27 a 2,06. La regresin lineal de los datos indica una
adecuada correlacin (R
2
=0,94) entre el modelo propuesto y la informacin
experimental, lo cual confirma las hiptesis presentadas. Este hecho es de
particular trascendencia, ya que de acuerdo a los modelos propuestos para el
mecanismo de oxidacin en este microorganismo (seccin 2.2, primera parte) se
espera que la oxidacin de ion ferroso este asociada a la translocacin de
protones.

y = 6,571x + 0,015
R
2
= 0,935
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060
[H+], M
K
s
,

g
/
l

Figura 3.5.
K
S
en funcin de la
concentracin de protones.
Regresin lineal de los datos en
el rango de pH 1,27 2,06.

91
Finalmente se encuentra que en el rango de pH considerado (1,27 a 2,06) la
velocidad de oxidacin puede ser adecuadamente descrita utilizando la siguiente
expresin:

1
]
1
+ +

+ +
+
+
cel hr
Fe g

] [ ]) [ 1 , 438 1 ( 015 , 0
] [ 10 85 , 2
2
2 6
2

Fe H
Fe
V
Fe
(8)

donde la concentracin de fierro esta en g/l y la concentracin de protones en
mol/l. El valor de V
Max
considerado (2,85x10
-6
gFe/(hr cel)) corresponde al
promedio aritmtico de los valores obtenidos para este parmetro en el rango de
pH utilizado.

Se debe resaltar que el procedimiento utilizado en el anlisis de los datos significa
una importante acumulacin de errores, por lo tanto el valor del ajuste realizado
debe considerarse en trminos cualitativos. Es decir, el resultado ms destacable
de este apartado es la estructura de la expresin cintica encontrada, que
concuerda en forma adecuada con la hiptesis de translocacin de protones en el
proceso oxidativo. Dado que los resultados fueron obtenidos en 14 pruebas
independientes no resulta sencillo, ni confiable realizar un ajuste nico de
parmetros, ya que se incluira una incertidumbre importante.

Para el caso de las pruebas de mayor pH (sobre 2,06) ellas no pueden ser
consideradas en el modelo presentado. Se considera que la formacin de
pequeas cantidades de precipitados tiene un efecto sobre el procedimiento de
clculo, y adems introduce nuevos fenmenos que no pueden ser incluidos en
modelo analizado. Sin embargo, en el prximo apartado se presenta una
metodologa que permite evaluar el efecto de la acidez y la formacin de
precipitados a mayores valores de pH.

92
3.2 Caso II: Rango de pH 2.5 7.0

La formacin de abundantes precipitados y las rpidas variaciones de pH que se
presentan normalmente en la oxidacin bacteriana de sulfato ferroso a pH superior
a 3,0, impiden el seguimiento del proceso oxidativo utilizando mtodos
convencionales (normalmente se utiliza la medicin de la disminucin de la
concentracin de ion ferroso, consumo de oxgeno o medicin de la evolucin del
Eh). Por esta razn se realizaron mediciones de la velocidad de oxidacin de ion
ferroso en el rango de pH 2,5 7,0 utilizando una metodologa que estima las
velocidades de oxidacin a partir de las variaciones de pH y Eh que ocurren
durante el proceso oxidativo. El objetivo de estas mediciones fue evaluar por
separado el efecto de la disminucin de la concentracin de protones y la
presencia de precipitados frricos en la velocidad de oxidacin de ion ferroso de
Acidithiobacillus ferrooxidans a pH sobre 2,5.

3.2.1 Metodologa de clculo

En cada uno de los experimentos de oxidacin de ion ferroso se observ
simultneamente un continuo descenso del pH y un aumento en el Eh de la
solucin. La tendencia tpica se muestra en la Figura 3.6 que corresponde al caso
de una solucin inoculada con concentracin inicial de ion ferroso de 0,5 g/l en
medio basal y 2x10
7
cel/ml.

El movimiento del pH hacia valores ms cidos resulta del balance entre el
consumo de protones en la oxidacin de ion ferroso y la liberacin de protones
asociada a la precipitacin de ion frrico. El aumento en el Eh se encuentra
relacionado a un aumento neto en la razn Fe
+3
/Fe
+2
presente en la solucin.

La oxidacin de ion ferroso puede ser expresada segn la reaccin:

Fe
2+
+ O
2
+ H
+
Fe
3+
+ H
2
O (9)
93

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 200 400 600 800 1000
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
p
H
Eh
pH

Figura 3.6.
Evolucin de Eh y pH. Poblacin
inicial de bacterias 2x10
7
cel/ml.
Concentracin inicial de ion
ferroso 0,5 g/l en medio basal.

Es necesario desarrollar un mtodo de clculo que permita estimar la velocidad de
oxidacin de ion ferroso a partir de la variacin de Eh y pH en la solucin. Para
ello fue necesario determinar previamente la estequiometra asociada a las
reacciones de precipitacin de ion frrico.

Se realizaron experiencias independientes utilizando la metodologa expuesta en
[R.H. Byrne y Yu-Ran Luo, 2000] y se demostr que la reaccin de precipitacin
de ion frrico en soluciones sin nutrientes queda bien descrita por la reaccin:

Fe
3+
+ 3 H
2
O Fe(OH)
3
+ 3 H
+
(10)

Por otro lado, en el sistema que contiene medio basal, se observo que el proceso
de precipitacin es mejor descrito por la estequiometra de la reaccin:

X
+
+ 3 Fe
3+
+ 2 SO
4
2-
+ 6 H
2
O XFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
+ 6 H
+
(11)

donde X corresponde a un catin monovalente. Los dichos anteriores no implican
que las reacciones que ocurren sean precisamente estas, sino ms bien que la
estequiometra global de precipitacin puede ser descrita por medio de estas
reacciones. Los detalles de estas experiencias y sus resultados se presentan en el
Anexo F.
94
Si la velocidad de oxidacin de ion ferroso,
+ 2
Fe
V , se define por:

[ ]
+

+
2
2
Fe
V
dt
Fe d
(12)

y la velocidad de precipitacin de ion frrico,
ppt
V , se define por:

[ ]
ppt
tot
V
dt
Fe d
(13)

el balance de masa para H
+
y Fe
3+
en la solucin para el caso con medio basal es
entregado por las ecuaciones:

Fe
3+
:
[ ]
ppt
Fe
V V
dt
Fe d

+
+
2
3
(14)
H
+
:
[ ]
ppt
Fe
V V
dt
H d
+
+
+
2
2
(15)

Y en el caso de soluciones sin nutrientes los balances se representan por la
ecuacin (14) y la siguiente expresin

H
+
:
[ ]
ppt
Fe
V V
dt
H d
+
+
+
3
2
(16)

Utilizando las ecuaciones (14) y (15),
+ 2
Fe
V y
ppt
V pueden ser expresados para el
caso con medio basal segn las expresiones:

[ ] [ ]
dt
Fe d
dt
H d
V
Fe
+ +
+
+
3
2
2
(17)
[ ] [ ]
dt
Fe d
dt
H d
V
ppt
+ +
+
3
(18)
95

y en el caso de soluciones sin nutrientes utilizando (14) y (16), se obtiene:

[ ] [ ]
2 3
3
2
,
_
+
+ +
+
dt
Fe d
dt
H d
V
Fe
(19)
[ ] [ ]
2
3
,
_
+
+ +
dt
Fe d
dt
H d
V
ppt
(20)

Para evaluar la velocidad de oxidacin de ion ferroso durante las experiencias se
realiz separadamente un procedimiento de calibracin para obtener
explcitamente la concentracin de protones, [H
+
], y la concentracin de ion frrico
en solucin, [Fe
3+
], a partir del pH, el Eh y la determinacin de hierro total en
solucin. Para las expresiones que relacionan el Eh con la concentracin de ion
ferroso y ion frrico, el detalle se encuentra en el anexo B. Para el caso de medio
basal se obtuvo:

,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0579 . 0 471 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh (Ag/AgCl) (21)

y para el caso de soluciones sin nutrientes:

,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0644 . 0 492 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh (Ag/AgCl) (22)

De la calibracin del electrodo de pH se encontr que la seal de potencial del
electrodo (E) y la concentracin de H
+
en solucin estn relacionadas segn la
siguiente expresin:

( ) ] [ log * 056 . 0 4092 . 0
+
+ H E (23)

96
Las concentraciones de ion frrico y ion ferroso son calculadas con el valor de
hierro total y en Eh en cada momento durante la experiencia utilizando las
siguientes expresiones:

,
_

+
+

579 . 0
471 . 0
2
3
10
] [
] [
Eh
Fe
Fe
R (24)
] [
1
] [
3 tot
Fe
R
R
Fe
+
+
(25)
R
Fe
Fe
tot
+
+
1
] [
] [
2
(26)

Finalmente, la velocidad de oxidacin de ion ferroso se evala de acuerdo a la
expresin (17) o (19), al considerar en cada intervalo de tiempo las variaciones de
concentracin ion frrico y protones en solucin.

El ion frrico precipitado (masa) en cada intervalo de tiempo se evala utilizando la
siguiente integral (en forma discreta):

t
ppt T
ppt
dt V V Fe
0
] [ (27)

donde V
T
es el volumen del reactor. Finalmente, la concentracin total de hierro
que ser utilizada en el siguiente escaln de tiempo se corrige descontando el
hierro precipitado de acuerdo a la ecuacin:

T
ppt tot
t
tot
V Fe Fe Fe / ] [ ] [ ] [
0
(28)

3.2.2 Velocidad de oxidacin de ion ferroso

En las Figuras 3.7 y 3.8 se presentan las velocidades de oxidacin de ion ferroso
calculadas para las experiencias en medio basal con 0,5 g/l de ion ferroso inicial
para el caso abitico y para el caso inoculado, respectivamente. Los valores
97
presentados corresponden al valor instantneo de la velocidad de oxidacin como
funcin del pH, el que evoluciona en el tiempo. En el Anexo G se presentan los
resultados de velocidad de oxidacin calculada en todos los casos considerados.
La integracin de la velocidad de precipitacin en el tiempo permite estimar al final
de la experiencia la cantidad de hierro disuelto disponible. Estos valores fueron
comparados con el anlisis qumico de las soluciones finales filtradas,
encontrndose en todos los casos que el error en la estimacin realizada por el
mtodo de clculo es inferior a un 10%.

La Figura 3.7 muestra que existe una importante velocidad de oxidacin qumica
de ion ferroso a pH sobre 5. Inicialmente existe una zona donde la velocidad de
oxidacin es relativamente constante (no muestra una tendencia clara de
variacin), que corresponde a un estado transitorio inicial durante el cual se
alcanza la plena oxigenacin de la solucin (zona 1). Luego la velocidad de
oxidacin qumica decrece rpidamente como resultado del proceso de
acidificacin (zona 2).

-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
)

[
m
g

F
e

/

H
r
]
ZONA 1
ZONA 2
Figura 3.7. Velocidad de oxidacin de
ion ferroso. [Fe
2+
]
inicial
= 0,5 g/l, no
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n

)

[
m
g

F
e

/

H
r
]
ZONA 4
ZONA 3
ZONA2
ZONA 1
Figura 3.8. Velocidad de oxidacin de
ion ferroso. [Fe
2+
]
inicial
= 0,5 g/l,

En la Figura 3.8, correspondiente al caso inoculado, se pueden definir cuatro
zonas: las zonas 1 y 2 poseen un comportamiento similar al observado en el caso
abitico; en la zona 3 el logaritmo de la velocidad de oxidacin crece casi
98
linealmente con la disminucin del pH; en la zona 4 esta tendencia de aumento se
atena.

Los resultados anteriores muestran que la oxidacin de ion ferroso en el rango de
pH entre 4,8 y 7,0 no esta relacionada con actividad bacteriana. Por el contrario,
cuando el pH cae a valores bajo 4,8 la velocidad de oxidacin esta relacionada
principalmente a actividad oxidativa bacteriana y crece en forma estable con la
disminucin de pH. Este comportamiento tambin es observado en las
experiencias con 0,1 y 1 g/l de ion ferroso inicial (El detalle de los resultados
puede ser revisado en Anexo G). De acuerdo a estas observaciones para obtener
la velocidad neta de oxidacin biolgica de ion ferroso es necesario descontar la
componente inicial de oxidacin abitica que predomina entre pH 7,0 y 4,8. Para
ello se supone que la velocidad de oxidacin qumica (no microbiana) depende
slo del pH en cada experiencia. La expresin obtenida en cada caso es
descontada de las experiencias inoculadas. De esta forma se calcula la velocidad
especfica de oxidacin (
+ 2
Fe V ) de la poblacin de microorganismos segn la
siguiente expresin:

cel
Fe
Fe N V V
+
+
2
2
(29)

donde N
cel
es la poblacin de microorganismos en cada tiempo, cuyas variaciones
se calculan considerando la oxidacin microbiana de ion ferroso de acuerdo a la
ecuacin:

+
+
t
t
Fe
cel cel
dt V Y N N
0
2
*
0
(30)

donde t
0
es el tiempo en el cual se alcanza pH 5,0 (predomina la accin
bacteriana) y
0
cel
N es la poblacin bacteriana inicial de la experiencia.

99
Para el caso de una solucin de medio basal y 0,5 g/l de ion ferroso inicial, se
obtuvo la velocidad de oxidacin bacteriana que se presenta en la Figura 3.9.

0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

g

F
e
/

(
h

c
e
l
l
)

Figura 3.9.
Velocidad de oxidacin bacteriana
de ion ferroso.
[Fe
2+
]
inicial
= 0,5 g/l, inoculado, en
medio basal.

La evolucin del pH en cada experimento es acompaada por una disminucin
continua en la concentracin de ion ferroso y un aumento en la concentracin de
ion frrico. Adems existe una cantidad creciente de precipitados de ion frrico
formados. Asumiendo que la velocidad de oxidacin bacteriana sigue una
expresin cintica del tipo Monod con ion ferroso como sustrato limitante e
incluyendo un trmino de inhibicin por ion frrico (ver seccin 2.3, primera parte),
la velocidad de oxidacin puede ser expresada por la siguiente ecuacin:

]) [ 1 ( ] [
] [
3 2
2
2
+ +
+
+ +
+
Fe K K Fe
Fe V
V
I S
Max
Fe (31)

en donde V
max
=
max
/Y, Y es el rendimiento para la oxidacin de ion ferroso.
Usando esta expresin los valores de V
max
pueden obtenidos a partir de la
velocidad de oxidacin (
+ 2
Fe
V ) en cada pH. Los siguientes valores fueron utilizados
en estos clculos (Harvey y Crundwell, 1996): K
S
= 73 ppm, K
I
= 1,29 l/g. Los
valores de [Fe
2+
] y [Fe
3+
] en cada pH fueron obtenidos de los balances de masa
del sistema (ver metodologa de clculo). Los valores V
max
calculados se
100
presentan en las Figuras 3.10 y 3.11 correspondientes a soluciones con medio
basal y medio sin nutrientes, respectivamente.

0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH
V
m
a
x
,

g

F
e
/

(
h
r

c
e
l
)
1,0 g/l
0,5 g/l
0,1 g/l
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH
V
m
a
x
,

g

F
e
/

(
h
r

c
e
l
)
0,1 g/l
0,5 g/l
0,1 g/l

Figura 3.10: Valores de V
max
calculados,
en soluciones de medio basal con 2x10
7

2+
]
inicial
.
max
calculados,
en soluciones libres de nutrientes con
2x10
7
2+
]
inicial
.

La informacin presentada en las Figuras 3.10 y 3.11 muestra que, excepto para
la experiencia en medio sin nutrientes y 1,0 g/l de ion ferrosos inicial, V
Max

aumenta con la disminucin de pH en un importante rango de pH. Esta tendencia
se encuentra dentro de lo esperado de acuerdo al rol asignado a los protones en
la teora de la quimiosmosis. Sin embargo, en el rango de menores pH se observa
un cambio en la tendencia y se produce una disminucin de la V
Max
. Es conocido
que el aumento en la acidez a bajos pH provoca una disminucin en la actividad
bacteriana, pero como fue encontrado en la seccin anterior este efecto solo es
importante en pH inferior a 2,5. Esta baja en V
Max
se puede relacionar con el
aumento en la cantidad de precipitados de ion frrico en el sistema que no han
sido considerados en la ecuacin (31). Esto hecho es explcito en las Figuras 3.12
y 3.13, las cuales muestran que la disminucin del pH est acompaada de un
aumento casi exponencial de la cantidad de precipitados. Se puede observar que
la zona donde se observa una importante disminucin de V
Max
corresponde a la
zona en que hay gran cantidad de precipitados. Por ejemplo para la experiencia
con medio basal y 1,0 g/l de ion ferroso inicial, la cantidad de precipitados a pH 3,0
101
es diez veces mayor que la presente a pH 3,5. De esta forma es muy probable que
el progresivo aumento de los precipitados pueda contrarrestar el efecto positivo de
la disminucin de pH sobre la actividad oxidativa bacteriana.

0,0E+00
1,0E-03
2,0E-03
3,0E-03
4,0E-03
5,0E-03
6,0E-03
7,0E-03
8,0E-03
9,0E-03
1,0E-02
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH
[
F
e
p
p
t
]
,

g
Sin Nutrientes
Medio Basal

0,0E+00
1,0E-03
2,0E-03
3,0E-03
4,0E-03
5,0E-03
6,0E-03
7,0E-03
8,0E-03
9,0E-03
1,0E-02
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH
[
F
e
p
p
t
]
,

g
Sin Nutrientes
Medio Basal

Figura 3.12. Masa acumulada de
precipitados frricos, [Fe
2+
]
inicial
= 0,1 g/.
Figura 3.13. Masa acumulada de
precipitados frricos, [Fe
2+
]
inicial
= 1 g/l.

De acuerdo a las Figuras 3.10 y 3.11 se observa adems que V
Max
en las
soluciones sin nutrientes es bastante menor que la obtenida a igual pH en
soluciones de medio basal. Esta es una evidencia de que la composicin de los
precipitados frricos posee adems una influencia en el efecto inhibitorio que ellos
poseen sobre la actividad oxidativa bacteriana. Como se demostr anteriormente
en este trabajo (Ver anexo F), cuando se utilizan soluciones libres de nutrientes el
ion frrico precipita solamente como hidrxido frrico (ver ecuacin 10), mientras
que en soluciones de medio basal el ion frrico precipita en compuestos del tipo
jarositas (ver ecuacin 11). En este sentido, los resultados muestran que la
formacin de hidrxidos posee una influencia inhibitoria ms fuerte que las
jarositas sobre la actividad bacteriana. Esta conclusin es consistente con
propiedad bloqueadora que se atribuye a precipitados tipo gel, como los hidrxidos
frricos. Contrariamente, las jarositas son asociadas normalmente a estructuras
porosas y precipitados cristalinos.

102
Los comentarios anteriores merecen una discusin ms profunda, al considerar
que en un medio libre de nutrientes el crecimiento disminuye notablemente (o
puede desaparecer). En consecuencia, an cuando la oxidacin de ion ferroso se
encuentre desacoplada del crecimiento, las velocidades de oxidacin deben
necesariamente disminuir en el tiempo como resultado de la acumulacin de ATP.
No es claro que para el caso de estas experiencias sea precisamente la falta de
nutrientes la que limite las velocidades de oxidacin bacteriana. Ms an cuando
en experiencias reproducibles el uso de bajas concentraciones de ion ferroso (0,1
g/l) permite alcanzar altas velocidades durante el breve lapso de duracin de las
experiencias (10 horas).

En la figura 3.14 se presenta el efecto de aumentar la concentracin inicial de
bacterias sobre la velocidad mxima bacteriana de oxidacin de ion ferroso, para
experiencias con 1,0 g/l de ion ferroso inicial en soluciones de medio basal. Se
observa que el aumento en el nmero de bacterias contribuye a aumentar la
velocidad mxima de oxidacin. Este fenmeno puede ser atribuido a la dilucin
de los precipitados en una mayor poblacin bacteriana. Es decir, la cantidad de
precipitados de ion frrico formado por cada bacteria en solucin es menor
mientras mayor sea el nmero de bacterias. Para realizar esta comparacin se
considera la cantidad especfica de precipitados por bacteria ( ] [
ppt
sp
Fe ), que se
calcula como:

cel
ppt ppt
sp
N Fe Fe ] [ ] [ (32)

Los clculos de ] [
ppt
sp
Fe se pueden apreciar explcitamente en la figura 3.15.

103
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
m
a
x
,

g

F
e
/

(
h
r

c
e
l
)
a
c
d
b

Figura 3.14. Velocidad de
oxidacin mxima. Soluciones
de medio basal con 1,0 g/l de
ferroso inicial. Curva a: 8 x 10
7

cel/ml, Curva b: 5 x 10
7
cel/ml,
Curva c: 2 x 10
7
cel/ml, Curva d:
8 x 10
6
cel/ml.

Figura 3.15. Razn masa de
precipitados / nmero de
bacterias, durante pruebas de
oxidacin con 1,0 g/l de ion
ferroso inicial en medio basal.
Curva a: 8 x 10
7
cel/ml, Curva b:
5 x 10
7
cel/ml, Curva c: 2 x 10
7

cel/ml, Curva d: 8 x 10
6
cel/ml.

0,0E+00
1,0E-09
2,0E-09
3,0E-09
4,0E-09
5,0E-09
6,0E-09
3 4 5 6
pH
[
F
e
p
p
t
s
p
]
,

m
g
/
c
e
l
d
c
b
a

Al observar conjuntamente las Figuras 3.14 y 3.15 se observa que en aquellas
series de menor nmero de bacterias la cantidad de precipitados por cada bacteria
es mayor y simultneamente la velocidad especfica mxima de oxidacin
bacteriana de ion ferroso, V
Max
, es inferior. Estas observaciones indican una
directa relacin entre la masa de precipitados formados y la inhibicin producida
en la actividad oxidativa bacteriana en la zona de pH estudiada. Las implicaciones
de este comportamiento en la cintica de oxidacin sern integradas en los
modelos cinticos que se presentan en el apartado correspondiente.

104
3.3. Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano
entre pH 2,0 y 4,0.

En microorganismos autotrficos, como Acidithiobacillus ferrooxidans, es posible
desacoplar los procesos de oxidacin y crecimiento celular. Sin embargo, la
adecuada interpretacin de los resultados presentados en las secciones 3.1 y 3.2
requiere que ambos procesos estn relacionados, ya que de esa forma las
velocidades de oxidacin evaluadas pueden ser atribuidas a procesos
permanentes que desarrolla el microorganismo. En caso contrario, cuando la
oxidacin de ion ferroso no esta ligada a crecimiento celular (fijacin de CO
2
), las
mediciones corresponden a fenmenos transitorios, que no pueden ser sostenidos
en el largo plazo y su explicacin mecanstica se vuelve difusa.

En esta seccin se evala el rendimiento del crecimiento bacteriano en la
oxidacin de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 2,0 a
4,0. Para ello se realizaron mediciones de la razn entre el consumo de oxgeno
del microorganismo y el consumo de dixido de carbono en experiencias batch a
pH controlado.

3.3.1 Evaluacin de rendimiento

Para calcular el consumo de oxgeno en el reactor se consideran los flujos de gas
en la entrada, el flujo de gas en la salida y las concentraciones de oxgeno en
ambos flujos. El flujo de gas a la entrada es medido y controlado en 20 l/hr y el
flujo de gas en la salida es calculado como se explica a continuacin. Suponiendo
que el flujo volumtrico de gas inerte (nitrgeno es constante en ambos flujos) se
establece la siguiente relacin entre los flujos:

out out
in in
in G out G
CO O
CO O
F F
] [ ] [ 1
] [ ] [ 1
2 2
2 2
, ,

(33)

105
donde F
G,out
es el flujo molar de gas a la salida del reactor, F
G,in
es el flujo molar de
gas a la entrada, [O
2
]
out
es la fraccin molar de oxgeno en el gas de salida, [O
2
]
in

es la fraccin molar de oxgeno en el gas de entrada, [CO
2
]
out
es la fraccin molar
de dixido de carbono en la salida y [CO
2
]
in
es la fraccin molar de dixido de
carbono en el gas que ingresa al reactor.

Una vez conocidos los flujos de gas, la velocidad de consumo de oxgeno se
calcula con la siguiente expresin:

( )
out out G in in G
R
O
O F O F
V
r ] [ ] [
1
2 , 2 ,
2
(34)

donde V
R
es el volumen de lquido en el reactor. En forma equivalente se calcula
la velocidad de consumo de dixido de carbono con la siguiente expresin:

( )
out out G in in G
R
CO
CO F CO F
V
r ] [ ] [
1
2 , 2 ,
2
(35)

La Figura 3.16 presentan los resultados obtenidos en una experiencia batch de
oxidacin de sulfato ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans manteniendo el pH
controlado en 2,0 (la informacin completa de los resultados obtenidos en estas
pruebas se encuentra en el Anexo H). Se puede apreciar que el potencial redox
crece en forma progresiva al transcurrir la experiencia en la medida que el ion
ferroso es oxidado. En este grfico se observa adems que inicialmente la
velocidad de consumo de oxgeno aumenta durante las primeras dos horas y
luego tiene un valor casi constante hasta que el Eh alcanza 0,7 V (SHE), para
luego disminuir en forma simultanea al aumento de Eh.

106
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox

Figura 3.16.
Evolucin de la velocidad de
consumo de oxgeno y potencial
redox en experiencia con pH = 2,0.
[Fe
2+

En trminos del modelo de actividad oxidativa presentado en la segunda parte, es
claro que un alto potencial redox tiene un efecto perjudicial en la velocidad de
oxidacin, an cuando existe una cantidad importante de ion ferroso disponible
(ms de 0,1 g/l a las 18 horas). Esto se puede apreciar mejor al presentar los
resultados de la Figura 3.16 en funcin del Eh de la solucin como se aprecia en
la Figura 3.17.

Figura 3.17.
Velocidad de consumo de oxgeno
en funcin del Eh, experiencia con
pH = 2,0.
[Fe
2+

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)

107
En la Figura 3.18 se observa que la velocidad de consumo de dixido de carbono
en esta experiencia se encuentra relacionada directamente con el proceso
oxidativo de ion ferroso y el consumo de oxgeno. En consecuencia el rendimiento
en el crecimiento, que se pude relacionar por la razn entre la fijacin de carbono
y el consumo de oxgeno, se presenta prcticamente constante como se aprecia
en la Figura 3.19.

0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2

Figura 3.18.
consumo de oxgeno y dixido de
Figura 3.19
Razn entre velocidad de consumo
de dixido de carbono y oxgeno en
experiencia con pH = 2,0

En forma similar a los resultados obtenidos con pH 2,0, en los otros casos tambin
se aprecia una correlacin entre la velocidad de consumo de dixido de carbono y
oxgeno en cada serie experimental. En las Figuras 3.20 y 3.21 se presente el
caso de la experiencia realizada a pH 4,0. A pesar de que las velocidades de
oxidacin son mucho menores que las obtenidas a menor pH, la fijacin de CO
2
se
mantiene acoplada con el proceso oxidativo y ms an la razn promedio de las
velocidades de consumo de dixido de carbono y oxgeno es similar a la obtenida
en otros pH.

108
En la figura 3.22 se presenta el valor representativo de los coeficientes de
rendimiento en la fijacin de carbono (moles de carbono fijado / moles de oxgeno
utilizados) en funcin del pH de la experiencia. Este valor corresponde a la razn
entre el consumo total de dixido de carbono,
dt r
CO
2
, y el consumo total de
oxgeno,
dt r
O
2
. En este clculo no se han considerado aquellas zonas de algunas
experiencias donde el consumo de CO
2
no existe, ya que el origen de estas
irregularidades no es claro y merece mayor discusin (ver detalles de los
resultados en Anexo H).

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2

0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
Figura 3.20.
consumo de oxgeno y dixido de
Figura 3.21.
de dixido de carbono y oxgeno en
experiencia con pH = 4,0

Se puede apreciar que no existe una importante variacin de la razn

dt r dt r
O CO
2 2
en las experiencias distinto pH, lo que indica que la fijacin de CO
2

siempre se mantiene acoplada al proceso oxidativo. En consecuencia, se puede
concluir que en este rango de pH, la oxidacin bacteriana de ion ferroso est
directamente ligada a crecimiento bacteriano.

109
Figura 3.22.
de dixido de carbono y oxgeno
promedio en funcin del pH de cada
experiencia.
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
pH
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2

Adicionalmente se observa que el valor promedio del rendimiento observado en
estas experiencias, Y = 0,057 mol C / mol O
2
, es cercano a otros valores
reportados con anterioridad con otras cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans. Por
ejemplo Boon (1996) reporta Y
Max
= 0,051 mol C / mol O
2
.

3.3.2 Discusin

Considerando el esquema presentado en la Figura 2.9 de la primera parte se
puede concluir que la translocacin de protones asociada a la oxidacin de ion
ferroso en la cadena de transporte directo, ser siempre suficiente para soportar el
transporte reverso necesario para la fijacin de CO
2
con independencia del pH que
exista en el entorno en el rango de pH estudiado. Por otro lado la formacin de
abundantes precipitados en la zona de alto pH (sobre 2.5) libera protones
directamente sobre la superficie de la bacteria, esta mayor presencia de cido
puede formar un microclima entre los precipitados y la bacteria permitiendo que
localmente el pH sea siempre menor, con lo cual la bacteria no siente en forma
directa la disminucin de cido disponible en su entorno. En cualquiera de los
casos presentados la evidencia indica crecimiento bacteriano en todo el rango de
pH analizado, manteniendo un rendimiento constante.
110
4 EFECTO DEL pH, EL MODELO.

En la seccin 3.2 se mostr que en el rango de pH 2,5 a 5,0 existe actividad
bacteriana y ella se encuentra influenciada por la concentracin de cido
disponible. Por otro lado en el apartado 3.1 se ha presentado un modelo que
permite describir el efecto en el cambio de pH para el rango entre pH 1,3 y 2,0.
Finalmente en la seccin 3.3 se muestra que la actividad oxidativa en rango de pH
2,0 a 4,0 esta asociada a crecimiento bacteriano y por lo tanto es sostenible en el
tiempo. Es razonable entonces asociar la oxidacin de ion ferroso en este rango
de pH con actividad bacteriana y tiene sentido buscar un modelo cintico que
describa el comportamiento de dicha actividad.

El objetivo de esta seccin ser desarrollar una expresin cintica unificada que
describa adecuadamente el efecto del pH sobre la velocidad de oxidacin
bacteriana de ion ferroso en todo el rango de pH en que Acidithiobacillus
ferrooxidans muestra actividad oxidativa, 1,3 5,0.

De acuerdo a los conceptos presentados en la seccin 2.2 de la primera parte, se
sabe que altos valores de pH pueden afectar el proceso oxidativo de dos formas.
En un caso se limita la velocidad con que ocurre la sntesis de ATP, ya que no se
dispone de una cantidad suficiente de protones; y en el segundo caso es afectado
el transporte reverso de electrones que utiliza la diferencia de pH a travs de la
membrana citoplasmtica como fuerza motriz. En adicin a estos elementos, la
presencia de bajas concentraciones de protones puede producir que el transporte
de protones desde la solucin sea el proceso limitante en la cintica de oxidacin.
Es decir, la oxidacin de ion ferroso puede llegar a ser limitada por la difusin de
protones desde el seno de la solucin hasta la membrana plasmtica.

De acuerdo a la complejidad del escenario, no es posible plantear un modelo
sencillo que describa la cintica del proceso. Por lo tanto, se utilizar un enfoque
111
semi-emprico para obtener una expresin cintica de oxidacin de ion ferroso que
incluya los rangos de altos pH.

La Figuras 3.14 y 3.15 de la seccin 3.2 sugieren claramente que la formacin de
precipitados frricos juega un rol importante en la disminucin de la actividad
oxidativa del microorganismo. Para comprender, a lo menos en parte, la accin de
estos precipitados sobre la cintica de oxidacin a continuacin se propone un
modelo simple que es luego probado. Si se supone que una parte importante de
los precipitados de hierro formados permanecen sobre la superficie de la bacteria
formando una capa compacta, V
max
se puede expresar en trminos de un
mecanismo de control cintico mixto. Este mecanismo incluye una resistencia
asociada a la reaccin qumica y una resistencia relacionada a la difusin de
reactivos hacia la clula (Levenspiel, 1962). La cintica de la reaccin qumica
esta relacionada al proceso de oxidacin de ion ferroso y puede ser expresado
como V
quim
; el proceso difusional puede ser relacionado a la difusin de protones a
travs de la capa de precipitados frricos formados sobre la bacteria. De esta
forma, V
max
puede ser expresado de la siguiente forma:

x k
V
V
quim
max
+
1
(36)

donde x representa el espesor de la capa de precipitados y k es una constante
proporcional a la razn entre las constantes difusionales y cinticas. La validez del
modelo expuesto fue comprobada utilizando las curvas b, c y d de la Figura 3.14,
como funcin de la concentracin especfica de precipitados formados en cada
caso ( ] [
ppt
sp
Fe en Figura 3.15). Los valores de V
max
en la curva a de la Figura 3.14
(la experiencia con menor concentracin especfica de precipitados y mayor
poblacin de bacterias) son utilizados como pseudo-V
chem
(
chem
ps
V ). Usando como
referencia la expresin (36), se calcularon valores de
calc
max
V vs pH utilizando la
siguiente expresin:
112

] [ ' 1
ppt
sp
quim
ps calc
max
Fe k
V
V
+
(37)

Los valores de k son ajustados en cada caso de modo que el valor mximo de
calc
max
V en cada curva sea igual al valor al ms alto valor de V
max
en la Figura 3.14.

Los valores de
calc
max
V calculados con este procedimiento se muestran en la Figura
4.1: las curvas b, c y d corresponden a la modelacin de las curvas b, c y d de la
Figura 3.14; la curva a simplemente reproduce la curva a de la Figura 3.14, y es
incluida como referencia.

0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
m
a
x
c
a
lc
a
d
b
c

Figura 4.1.
Valores de
calc
max
V en funcin del pH.
Curva a: 8 x 10
7
cel/ml, Curva b: 5
x 10
7
cel/ml, Curva c: 2 x 10
7

cel/ml, Curva d: 8 x 10
6
cel/ml.

Los resultados en la Figura 4.1 muestran que las curvas calculadas reproducen
bastante bien las tendencias de las curvas V
max
pH en la Figura 3.14.
Adicionalmente, se observa que los ms altos valores de V
max
en cada curva se
encuentran en valores de pH muy cercanos a los experimentales. Sin embargo,
los valores de k calculados en cada curva son distintos, resultando: 2x10
7
para
curva b, 1,2x10
8
para curva c, y 1,2x10
9
para la curva c. Esta diferencia puede ser
atribuida, en principio, a variaciones en la fraccin de precipitados que
efectivamente se depositan sobre la bacteria, espesores no uniformes en las
pelculas formadas o bien, a variaciones en la permeabilidad de estas pelculas.
113

Los resultados del modelo propuesto muestran que la disminucin en la actividad
oxidativa observada a pH sobre 2,5 esta relacionada con la formacin de pelculas
de precipitados frricos, los cuales disminuyen la velocidad de difusin de
protones hacia la clula. Sin embargo, como tambin fue mostrado claramente de
los resultados de la seccin 3.2, la cintica de oxidacin de ion ferroso a pH sobre
2,5 depende fundamentalmente de la concentracin de cido en solucin.

La oxidacin bacteriana de ion ferroso utiliza como sustrato ion ferroso, oxgeno y
protones. En las experiencias realizadas, para el rango de pH analizado se estima
que el sustrato limitante es el protn. La forma ms simple de modelar le cintica
de oxidacin es una expresin de tipo Monod con protones como sustrato
limitante, como la siguiente:

] [
1
1
0
+
+
H
K
V
V
H
max
max
(38)

donde
0
max
V es el valor de V
max
mximo, es decir, cuando deja de limitar la
concentracin de cido; y K
H1
es la constante de afinidad con los protones.

Para determinar los parmetros de esta ecuacin en nuestras experiencias se
debe descontar previamente el efecto de la formacin de precipitados frricos. En
trminos de la ecuacin (36), es necesario contar con los valores de V
quim
vs pH.
Como no es posible determinar estos valores con la informacin disponible, se
utilizaran nuevamente los valores de
chem
ps
V , es decir, la curva a de la Figura 3.14.
Hacia el final de esta experiencia, para valores de pH menor que 3,0 es evidente
que se manifiesta un efecto de los precipitados, por lo tanto para el ajuste de
parmetros se considera solamente la zona de pH 3,0 5,0.

114
En la Figura 4.2 se presenta el resultado del ajuste de parmetros realizado. Los
puntos en color azul corresponden a los valores de V
max
para esta serie
experimental, y la lnea continua (rojo) representa el modelo de la expresin (38)
con los parmetros ajustados de la tabla 4.1.

0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
0,0E+00 5,0E-04 1,0E-03 1,5E-03 2,0E-03
[H+], M
V
m
a
x
,

g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)

Figura 4.2.
V
Max
vs [H
+
]. Serie experimental
con 1,0 g/l de ion ferroso inicial
en medio basal y 8x10
7
cel/ml.
En color azul, datos
experimentales; en rojo modelo
ajustado ec. (38).

Tabla 4.1: Parmetros ajustados de ecuacin (38)
Parmetro Valor
V
m
0
4,22 x 10
-6
[g Fe/ (hr cel)]
K
H1
3,99 x 10
-4
[mol / l]

En la seccin 3.1 se muestra que para valores de pH menores a 2,5, V
Max

permanece constante. De esta forma los valores de V
Max
obtenidos en la seccin
3.1 y en la seccin 3 de la segunda parte, pueden ser comparados con los
obtenidos de este anlisis. El valor de velocidad mxima (independiente del pH),
V
m
0
obtenida resulta ser similar (un poco mayor) a los valores obtenidos en otras
secciones de este trabajo de tesis utilizando la misma cepa de microorganismos,
lo cual valida estos resultados del ajuste de datos y de cierta forma la metodologa
experimental utilizada.

115
De igual forma considerando la coherencia de la informacin es posible integrar el
modelo de la ecuacin (38) con el modelo de la ecuacin (37) y la expresin (6),
obtenindose una expresin que integra la influencia de la acidez y de la
formacin de precipitados, en el rango de pH 1,3 5,0, sobre la actividad
oxidativa bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans. La expresin
obtenida es:

( )
( )
,
_
+ +
+
,
_
+ +
+
+
+
+
+
+
1
] [
] [
] [
] [ 1
] [
1 ] [ ' 1
2
3
2
1 1
0
2
Fe
Fe
K
Fe
H K K
H
K
Fe k
V
V
I
H H ppt
sp
max
Fe
(39)

Los valores sugeridos de acuerdo a la informacin experimental para los distintos
parmetros de esta expresin cintica se presentan en la Tabla 4.2.

Tabla 4.2. Valor de parmetros para expresin cintica (39).
Parmetro Valor
0
max
V
4,22 * 10
-6
[g Fe/ (hr cel)]
K
1
0,015 [g/l]
K
I
0,641 [ - ]
K
H
438,1 [l / mol]
K
H1
3,99 * 10
-4
[mol / l]

En la expresin (39) se considera el efecto de los precipitados, aunque el valor
que se debe utilizar para el parmetro k depende de la poblacin de bacterias en
solucin. En el ejercicio que se presenta a continuacin se considera un valor bajo
(1x10
7
cel/mg Fe).

Para ilustrar como vara la actividad oxidativa del microorganismo en funcin del
pH se realiz el siguiente calculo. Se considera una concentracin constante de
ion ferroso (1 g/l) y una cantidad inicial de ion frrico (0 g/l, 0,5 g/l, 3,0 g/l) con una
poblacin de 2x10
7
cel/ml.
116
La solubilidad de ion frrico cambia en funcin del pH, en consecuencia en los
clculos se considera la curva de equilibrio presentada en la Figura F.11 del anexo
F. Para cada valor de pH se evala la solubilidad, y se considera que el exceso de
frrico se encuentra precipitado de acuerdo a la curva de pseudo equilibrio. El
resultado de los clculos se presenta en la Figura 4.3.

0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
V
F
e
2
+
,

g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)
[Fe3+] = 0,0 g/l
[Fe3+] = 0,5 g/l
[Fe3+] = 3,0 g/l

Figura 4.3.
+ 2
Fe
V vs pH calculada segn
expresin (39). Se consideran
distintas concentraciones de
frrico total y precipitacin de
acuerdo a Figura F.11.
Concentracin de ion ferroso
1,0 g/l.

En la Figura 4.3 se observa en negro la curva asociada al caso donde no existe
ion frrico presenta. En esta situacin se anulan en la expresin (39) los trminos
asociados a la accin del ion frrico y a los precipitados de hierro. En
consecuencia, esta curva representa una situacin ideal donde la velocidad slo
depende de la concentracin de protones, es decir, la mxima velocidad esperable
en cada valor de pH. Las curvas con presencia de ion frrico muestran valores
menores para cada pH, lo cual muestra como les mediciones de velocidad se
pueden ver afectadas por la presencia de ion frrico y precipitados de hierro. En la
curva azul (3,0 g/l de frrico total y la mayor cantidad de precipitados por bacteria),
se aprecia que entre pH 1,8 y 3,0 la velocidad de oxidacin prcticamente no vara
con la concentracin de cido. Esto se debe a que la accin inhibitoria del ion
frrico a bajos valores de pH, es reemplazada luego por la accin inhibitoria de los
precipitados presentes al aumentar el pH. Esta observacin explica los
comportamientos observados en reactores o sistemas continuos, donde la
formacin de precipitados es siempre importante.
117

Por otro lado se observa, que el pico en las curvas de velocidad de oxidacin se
desplaza hacia la izquierda al aumentar la concentracin de ion frrico presente.
Esto se explica por la formacin de precipitados a menores valores de pH al
aumentar la disponibilidad de ion frrico, lo cual impide que se alcancen mayores
velocidades al aumentar el pH.

Finalmente, utilizando la misma expresin (39) se ha modificado la concentracin
de ion ferroso presente, manteniendo concentracin de ion frrico total igual a
cero. Los resultados se encuentran en la Figura 4.4.

0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
1,0 3,0 5,0 7,0
pH
V
F
e
2
+
,

g

F
e
/
(
h
r

c
e
l
)
[Fe2+] = 0,3 g/l
[Fe2+] = 1,0 g/l
[Fe2+] = 3,0 g/l

Figura 4.4.
+ 2
Fe
V vs pH calculada segn
expresin (39). Se consideran
distintas concentraciones de
ion ferroso y frrico total cero.

En la Figura 4.4 se observa que al disminuir la concentracin de ion ferroso
disponible se produce un desplazamiento del pico de la curva hacia valores ms
bsicos. Encontrndose que el mximo de la curva se alcanza a pH cercano a 3,0
cuando la concentracin de hierro es suficientemente baja (0,01 g/l). Adems de
acuerdo a esta figura se observa que es posible mantener importantes
velocidades de oxidacin de ion ferroso en el rango de pH 2,0 3,0 si la
concentracin de ion frrico presente se mantiene siempre suficientemente baja.
118
5 CONCLUSIONES

Las mediciones de velocidad de oxidacin bacteriana de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 2,5 indican que al aumentar
la concentracin de cido en el sistema se produce una importante disminucin de
la actividad oxidativa. El anlisis de los datos muestra que la oxidacin es descrita
en forma adecuada por una expresin del tipo Monod donde el parmetro K
S

depende de la concentracin de cido en solucin y el parmetro V
Max
es
constante. La constante de afinidad disminuye linealmente con el aumento de
acidez, es decir, la disminucin en las velocidades de oxidacin puede ser
explicada por un mecanismo de inhibicin competitiva por protones.

Se realizaron mediciones de velocidad de oxidacin de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 2,5 7,0. De los resultados se
desprende que la metodologa permite estimar en forma adecuada la actividad
oxidativa bacteria en el rango de pH de 2,5 a 5,0, lo cual no es posible lograr con
otras metodologas convencionales.

Se encontr que a valores de pH sobre 5,0 la oxidacin bacteriana de ion ferroso
es despreciable y predomina el proceso de oxidacin qumica. Adems se pudo
mostrar que la formacin de precipitados de ion frrico tiene un rol importante en
la disminucin de la actividad oxidativa bacteriana a pH sobre 2,5. Sin perjuicio de
lo anterior se encontr que a pH sobre 2,5 la disminucin de las velocidades de
oxidacin esta principalmente controlada por la disminucin en la concentracin de
protones en solucin.

La medicin del rendimiento en el crecimiento para la oxidacin de ion ferroso en
el rango de pH 2,0 a 4,0 demostr que en este rango de pH los valores no
cambian en forma importante. Esto indica que el proceso oxidativo se encuentra
acoplado a la fijacin de CO
2
en el rango de pH analizado, es decir, la oxidacin
de ion ferroso est directamente ligada a sntesis de biomasa.
119
Utilizando la informacin experimental de ambos rangos de pH analizados, se ha
formulado una expresin cintica que permite describir en forma adecuada la
influencia de la concentracin de cido sobre la velocidad de oxidacin bacteriana
de ion ferroso en todo el rango donde la bacteria presenta actividad oxidativa
(hasta pH 5,0). El uso de esta expresin para describir experiencias realizadas con
distinta razn masa de precipitados / nmero de bacterias permiti mostrar como
un adecuado control de la concentracin de hierro (y formacin de precipitados)
resulta en un efectivo mejoramiento de la actividad oxidativa bacteriana de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.

120
CUARTA PARTE:
BIOOXIDACIN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO EN
UNA CELDA ELECTROQUMICA
1 INTRODUCCIN
Los microorganismos presentes en los procesos de biolixiviacin, si bien
presentan resistencias relativamente altas a la mayora de los cationes metlicos
(seccin 2.3.5, primera parte), son sensibles a la presencia de algunos iones y en
particular requieren la presencia de sulfato para realizar sus procesos de oxidacin
y crecimiento. En la lixiviacin de minerales en pilas, botaderos o reactores, de
acuerdo a la composicin del mineral y su ganga, resulta inevitable la aparicin de
especies disueltas especialmente txicas para el desarrollo de las bacterias y
microorganismos oxidantes de fierro y azufre. Es ampliamente reconocido que la
presencia de altas concentraciones de cloruros, arsnico, mercurio y otras
especias no permite el desarrollo de las bacterias de nuestro inters. Como la
disolucin de estas especies es simultanea a los metales de inters, resulta difcil
controlar la composicin de la solucin para asegurar altos niveles de actividad
bacteriana y se deben estudiar alternativas tecnolgicas que puedan resolver este
problema. En esta seccin se analiza el comportamiento de un original diseo de
reactor bioelectroqumico para la biooxidacin indirecta de ion ferroso en
soluciones que inhiben la accin oxidativa bacteriana.
121
En estas experiencias se utiliza una celda electroqumica de dos compartimentos
separados por una membrana de intercambio catinica Nafion
. La celda opera
como una celda combustible, es decir se produce una espontnea transferencia
de carga motivada por la diferencia de potencial establecida entre los dos
compartimentos conectados por un circuito elctrico externo. De esta forma es
posible transferir el poder oxidativo de un cultivo bacteriano en adecuadas
condiciones de crecimiento a una solucin que posee una composicin
inadecuada para la actividad oxidativa bacteriana.
Se utiliza la cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 19859 en este estudio.
La bacteria fue crecida en un medio de nutrientes conteniendo 1,5 g/l de ion
ferroso (como sulfato ferroso), 0,4 g/l MgSO
4
H
2
O, 0,4 g/l (NH
4
SO
4
)
2
y 0,056 g/l
K
2
HPO
4
H
2
O en agua destilada. El pH inicial del cultivo es ajustado en 1,6
utilizando cido sulfrico.
2.0.2 Celda electroqumica
La celda electroqumica, cuyo montaje se presenta en la Figura 2.1, esta
construida en Pyrex
y posee dos compartimentos separados por una membrana

de intercambio inico catinica Nafion
117 de 1 cm
2
. En cada compartimento se
coloca un disco de platino de rea 95 mm
2
utilizados como electrodos (F y G).
Estos electrodos son cortocircuitados externamente a travs de una cable de
cobre (H). El compartimento catdico (B) es burbujeado por aire a baja presin y
agitado utilizando una agitador magntico. La celda completa es mantenida a 30
1 C colocndola en un bao termosttico de agua. La composicin y volmenes
de las soluciones utilizadas dependen de los modos de operacin de la celda y se
describe luego.
122
AIR
V
D
D
E
C
B
G
F
A
H H
Figura 2.1: Esquema del montaje utilizado en experiencias de biooxidacin
indirecta.
2.1 Experiencias con cambio de anolito
De acuerdo con el procedimiento descrito en 2.0.1 se preparan tres matraces de
cultivo de bacterias. Se toman 210 ml de la solucin obtenida y se dispone como
catolito. En esta solucin tpicamente se encuentran 10
8
bacterias/ml, con un pH
de 2,2.
Como anolito se utilizan 15 ml de disolucin de cloruro ferroso. Esta disolucin es
preparada disolviendo 1,6 g/l de ion ferroso (como cloruro ferroso) en agua
destilada, el pH de la disolucin se ajusta en 1,5 utilizando cido clorhdrico. Todos
los reactivos utilizados son de grado analtico.
123
2.1.2 Procedimiento
Una vez dispuestas las soluciones en los respectivos compartimentos, se cierra el
circuito al conectar elctricamente ambos electrodos. Al comenzar la transferencia
de carga se registra en forma peridica el Eh medido en ambas soluciones
utilizando un electrodo combinado de platino Cole-Palmer 5990-57. Asimismo se
tomas muestras para analizar la variacin en el nmero de bacterias en el tiempo.
El contenido del compartimento andico es reemplazado despus de un mximo
de 72 horas de operacin, para aumentar la fuerza motriz de la transferencia de
carga.
Las experiencias fueron desarrolladas en duplicado.
2.2 Experiencias con recirculacin de anolito
De acuerdo con el procedimiento descrito en 2.0.1 se preparan tres matraces de
cultivo de bacterias. Se toman 210 ml de la solucin obtenida y se dispone como
catolito. En esta solucin tpicamente se encuentran 10
8
bacterias/ml, con un pH
de 2,2.
Como anolito se utilizan 400 ml de disolucin de cloruro ferroso. Esta disolucin es
preparada disolviendo 1,6 g/l de ion ferroso (como cloruro ferroso) en agua
destilada, el pH de la disolucin se ajusta en 1,5 utilizando cido clorhdrico.
2.2.2 Procedimiento
La solucin de cloruro ferroso es continuamente recirculada entre el
compartimento andico y el estanque (E) utilizando un sistema de bombas
peristlticas (D). De esta forma se mantiene un volumen de anolito muy superior al
124
disponible en el compartimento andico y no es necesario el recambio de la
solucin. Utilizando un sistema de adquisicin de datos se registra en forma
continua el potencial de ambos compartimentos y peridicamente se toman
muestras para recuento de la poblacin bacteriana y anlisis de la composicin de
las soluciones.
Se desarrollaron tres series experimentales en las condiciones y sus resultados se
utilizan para describir el rendimiento en el crecimiento bacteriano para la
biooxidacin indirecta.
3.1 Experiencias con cambio de anolito
La Figura 3.1 muestra la evolucin del Eh en la semi-celda de FeCl
2
y el Eh en la
semi-celda de Fe
2
(SO
4
)
3
con bacterias, en el tiempo. Cada curva de Eh para el
compartimento de FeCl
2
corresponde a recambios de solucin en el
compartimento andico. Se observa que el Eh de este compartimento aumenta
rpidamente, registrndose una variacin desde 0,580 V (SHE) hasta 0,700 V
(SHE) en aproximadamente 60 horas, en cada uno de los recambios. El Eh en el
compartimento catdico con bacterias se mantiene en el rango de los 0,810 V
(SHE), lo cual indica que la capacidad oxidativa bacteriana fue siempre suficiente
para contrarrestar el consumo de Fe
3+
por transferencia de carga al compartimento
andico.
125
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo [Horas]
E
h

V

v
/
s

S
H
E
Eh Solucion Cl- Eh Solucin SO4
Figura 3.1: Potenciales redox en
las semi-celdas para la operacin
celda bioelectroqumica con
recambio de anolito.
Paralelamente se midi la velocidad de oxidacin natural y bacteriana, para una
solucin de cloruro ferroso similar, en frascos agitados a 30C. A esta solucin se
adicionaron nutrientes en el caso bacteriano. Se comprob que en 60 horas la
oxidacin fu sustancialmente menor que en el caso del reactor bioelectroqumico,
lograndose un aumento hasta 0,604 V (SHE) en al caso de oxidacin natural con
aire y hasta 0,611 V (SHE) en el caso bacteriano.
Los resultados de esta experiencia indican que en este reactor el ion ferroso esta
siendo efectivamante oxidado por accin indirecta de las bacterias activas en el
compartimento catdico. Sin embargo dada la pequea cantidad de solucin de
cloruro ferroso que es oxidada cada vez, no se detectan variaciones medible en el
nmero de bacterias presentes en el compartimento catdico.
Para comprobar si el proceso oxidativo indirecto es capaz de sustentar crecimiento
bacteriano, debemos operar la celda con un aumento importante en la
disponibilidad de cloruro ferroso. Esto se puede lograr al recircular el anolito desde
la celda a un estanque como se muestra en la siguiente experiencia.
126
3.2 Experiencias con recirculacin de anolito
Se midio la variacin de la concentracin de ion ferroso en el compartimento
andico y el aumento de la poblacin bacteriana en el compartimento catdico, en
el tiempo.
Para obtener la masa neta de ion ferroso oxidado por las bacterias es necesario
considerar las variaciones concentracin de ion ferroso en el compatimiento
catdico y la transferencia de carga hacia el compartimento andico, que se
origina en el desbalance de potenciales electroqumicos en ambos
compartimientos. Considerando los balance de masa para el ion ferroso en ambos
compartimientos se obtienen las siguientes expresiones:
Compartimento Catdico
a C de cia Transferen Bacteriana Oxidacion
c
V V
t
Fe
arg _ _ _
2
=
+
(1)
Compartimento Andico
a C de ia Transferec
a
V
t
Fe
arg _ _
2
=
+
(2)
Combinando ambas expresiones de puede despejar la velocidad de oxidacin
bacteriana neta, como se refleja en la ecuacin:
Bacteriana Oxidacion
a c
V
t
Fe
t
Fe
_
2 2
=
+ +
(3)
En forma integral la ecuacin (3) indica que el ion ferroso oxidado bacterialmente
es igual a la suma de las variacin de concentracin por el volumen en cada
seccin. La Figura 3.2 muestra el aumento en la poblacin bacteriana obtenida
como funcin del ion ferroso total oxidado para tres experimentos a distinta
poblacin inicial de bacterias, el detalle de los resultados tabulados se puede
encontrar en el Anexo I.
127
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E-02 1,0E-01
Ion Ferroso Total Oxidado, g
C
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

d
e

B
a
c
t
e
r
i
a
s
,

c
e
l
/
m
l
Figura 3.2: Crecimiento
bacteriano, de acuerdo a
oxidacin indirecta en reactor
bioelectroquimico versus ion
ferroso total oxidado en la celda.
De esta forma queda claramente establecido que las bacterias en el
compartimento catdico crecen ligadas a la oxidacin de ion ferroso en el
compartimento andico. El rendimiento de biomasa promedio de estos
experimentos es Y = 8,34 x 10
4
cel/g de Fe
2+
( 4,66 x 10
9
cel/mmol de Fe
2+
), que
es similar a los valores obtenidos por Harvey y Crundwell (1997) de 8,4 x 10
4
cel/g de Fe
2+
, Taya et al. (1991) de 2,5 x 10
4
cel/g de Fe
2+
o los valores
mencionados por Pronk y Johnson (1993) del orden de 5,4 x 10
4
cel/g de Fe
2+
.
El diseo de celda presentado en este trabajo es especialmente interesante, ya
que presenta una alternativa para la biooxidacin indirecta de ion ferroso en
soluciones de composicin inhibitoria para la actividad oxidativa bacteriana. El uso
industrial de esta celda permitira el beneficio de minerales realizando lixiviacin
bacteriana indirecta con agua de mar o bien el trtamiento de minerales con alto
contenido de arsnico o alta fuerza ionica.
Por otro lado el uso de esta celda permitira procesos de lixiviacin a potencial
controlado, ya que se puede controlar en forma simple el traspaso de carga a las
soluciones de lixiviacin desde al cultivo bacteriano. Esta alternativa es atractiva
ya que se ha encontrado que algunos sulfuros metlicos poseen potenciales
ptimos de disolucin (Hiroyoshi et al., 2000) que no siempre son muy altos y
128
resultara rentable controlar la actividad oxidativa bacteriana para no superar estos
valores.
4 CONCLUSIONES
Utilizando una celda electroqumica de dos compartimentos separados por una
membrana de intercambio catinica se ha encontrado que una poblacin de
Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de soportar durante un tiempo prolongado
la oxidacin indirecta de cloruro ferroso, el cual es incapaz de oxidar en forma
directa. De igual forma se comprob que este proceso oxidativo indirecto es capaz
de sustentar el crecimiento de la poblacin de bacterias a un ritmo similar al
encontrado en soluciones de medio basal. El rendimiento en el crecimiento de
estos experimentos es Y = 8,34 x 10
4
cel / g Fe.
129
REFERENCIAS
Aguirre R., J.V. Wiertz and R. Badilla-Ohlbaum (1989), An amperometric method
for measuring iron oxidizing activity of Thiobacillus ferrooxidans, In Bioleaching:
from molecular biology to industrial applications. Eds. R. Badilla-Ohlbaum, T.
Vargas and L. Herrera, pp.107-117.
Ahonen L. and O.H. Touvinen (1989), Microbiological oxidation of ferrous iron at
low temperatures, Applied and Environmental Microbiology 55(2):312-316.
Amaro A.M., D. Chamorro, M. Seeger, R. Arredondo, I. Peirano and C.A. Jerez
(1991), Effect of pH perturbations on in vivo protein synthesis by the acidophilic
bacterium Thiobacillus ferrooxidans, Journal of Bacteriology 173(2):910-915.
Appia-Ayme C., N. Guiliani, J. Ratouchniak and V. Bonnefoy (1999),
Characterization of an operon encoding two c-type cytochromes, and aa
3
-type
cytochrome oxidase, and rusticyanin in Thiobacillus ferrooxidans ATCC 33020,
Applied and Environmental Microbiology 65(11):4781-4787.
Benz M., A. Brune and B. Schinck (1998), Anaerobic and aerobic oxidation of
ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria,
Archives of Microbiology 169:159-165.
Blake II R.C. and E.A. Shute (1987), Respiratory enzymes of Thiobacillus
ferrooxidans. A kinetic study of electron transfer between iron and rusticyanin in
sulfate media, The Journal of Biological Chemistry 262(31):14983-14989.
Blake II R., E.A. Shute, J. Waskosky and A.P. Harrison (1993), Respiratory
components in acidophilic bacteria that respire on iron, Geomicrobiology Journal
10:173-192.
Blake II R.C. and E.A. Shute (1994), Respiratory enzymes of Thiobacillus
ferrooxidans. Kinetic properties of an acid-stable iron:rusticyanin oxidoreductase,
Biochemistry 33:9220-9228.
Boon M., G.S. Hansford and J.J. Heijnen (1995), The role of ferrous iron oxidation
in the biooxidation of pyrite. In Biohydrometallurgical Processing, proceedings of
the International Biohydrometallurgy Symposium IBS-95, Via del Mar, Chile. Ed
by T. Vargas, C.A. Jerez, J.V. Wiertz and H. Toledo, Vol. 1 pp. 153-163.
Boon M. (1996), Theoretical and experimental methods in the modelling of bio-
oxidation kinetics of sulphide minerals, Tesis para optar al grado de doctor,
Technische Universiteit Delft.
130
Boon M., J.J. Heijnen and G.S. Hansford (1998), The mechanism and kinetics of
bioleaching sulphide minerals, Mineral Processing and Extractive Metallurgy
Reviews 19:107-115.
Boon M., H.J. Brasser, G.S. Hansford and J.J. Heijnen (1999a), Comparison of the
oxidation kinetics of different pyrites in the presence of Thiobacillus ferrooxidans or
Leptospirillum ferrooxidans, Hydrometallurgy 53:57-72.
Boon M., T.A. Meeder, C. Thone, C. Ras and J.J. Heijnen (1999b), The ferrous
iron oxidation kinetics of Thiobacillus ferrooxidans in continuous cultures, Applied
Microbiology and Biotechnology 51:820-826.
Boon M., C. Ras and J.J. Heijnen (1999c), The ferrous iron oxidation kinetics of
Thiobacillus ferrooxidans in batch cultures, Applied Microbiology and
Biotechnology 51:813-819.
Braddock J.F., H.V. Luong and E.J. Brown (1984), Growth kinetics of Thiobacillus
ferrooxidans isolated from arsenic mine drainage, Applied and Environmental
Microbiology 48(1):48-55.
Breed A.W. and G.S. Hansford (1999a), Studies on the mechanism and kinetics of
bioleaching, Minerals Engineering 12(4):383-392.
Breed A.W. and G.S. Hansford (1999b), Effect of pH on ferrous iron oxidation
kinetics of Leptospirillum ferrooxidans in continuous cultures, Biochemical
Engineering Journal 3:193-201.
Breed A.W., C.J.N. Dempers, G.E. Searby, M.N. Gardner, D.E. Rawlings and G.S.
Hansford (1999), The effect of temperature on the continuous ferrous iron oxidation
kinetics of a predominantly Leptospirillum ferrooxidans culture, Biotechnology and
Bioengineering 65(1):44-53.
Brierley C.L. (1982), Microbiological mining, Scientific American 247(2):42-51.
Brierley J.A. and C.L. Brierley (1999), Present and future commercial applications
of biohydrometallurgy, In Biohydrometallurgy and Environment toward the mining
of the 21
st
century: Proceedings of the International Biohydrometallurgy
Symposium IBS 99, Madrid, Espaa. Ed by R. Amils and A. Ballester, Part A
pp.81-89.
Brock T.D. and J. Gustafson (1976), Ferric iron reduction by sulfur- and iron-
oxidizing bacteria, Applied and Environmental Microbiology 32:567-571.
Brugna M., W. Nitschke, M. Asso, B. Guigliarelli, D. Lemesle-Meunier and C. Schmidt
(1999), Redox components of cytochrome bc-type enzymes in acidophilic
prokaryotes: II. The rieske protein of phylogenetically distant acidophilic organisms,
The Journal of Biological Chemistry 274(24):16766-16772.
131
Byrne R.H. and Yu-Ran Luo (2000), Direct observation of nonintegral hydrous
ferric oxide solubility products K
*
SO
= [Fe
3+
][H
+
]
-2.86
, Geochimica et Cosmochimica
Acta 64(11):1873-1877.
Cabrejos M.E., H.L. Zhao, M. Guacucano, S. Bueno, G. Levican, E. Garcia, E.
Jedlicki and D.S. Holmes (1999), IST1 insertional inactivation of the resB gene:
implications for phenotipic switching in Thiobacillus ferrooxidans, FEMS
Microbiology Letters 175:223-229.
Clarke R.L., R. Lageman, W. Pool and S.R. Clarke (1998), Electrochemically-aided
biodigestion of organic materials, U.S. Patent 5.846.393.
Corbett C.M. and W.J. Ingledew (1987), Is Fe
3+/2+
cycling an intermediate in
sulphur oxidation by Fe
2+
-growth Thiobacillus ferrooxidans, FEMS Microbiology
Letters 41:1-6.
Crundwell F.K. (1997), The kinetics of the chemiosmotic proton circuit of the iron
oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans, Bioelectrochemistry and
Bioenergetics 43:115-122.
Curuchet G., C. Pogliani, E. Donati and P. Tedesco (1992), Effect of Iron(III) and
its hydrolysis products (Jarosites) on Thiobacillus ferrooxidans growth and on
bacterial leaching, Biotechnology Letters 14(4):329-334.
Das A. and A.K. Mishra (1996), Role of Thiobacillus ferrooxidans and
sulphur(sulphide)-dependent ferric-ion-reducing activity in the oxidation of sulphide
minerals, Applied Microbiology and Biotechnology 45:377-382.
Das A., J.M. Modak and K.A. Natarajan (1997), Studies on multi-metal ion
tolerance of Thiobacillus ferrooxidans, Minerals Engineering 10(7):743-749.
De G.C., D.J. Oliver and B.M. Pesic (1997), Effect of heavy metals on the ferrous
iron oxidazing ability of Thiobacillus ferrooxidans, Hydrometallurgy 44:53-63.
Denisov G.V., B.G. Kovrov, N. Trubachev, I.V. Gribovskaya, A.A. Stepen and O.I.
Novoselova (1980), Composition of a growth medium for continuous cultivation of
Thiobacillus ferrooxidans, Mikrobiologiya 49(3):473-478 (In Russian).
Donati E., C. Pogliani and J.L. Boiardi (1997), Anaerobic leaching of covellite by
Thiobacillus ferrooxidans, Applied Microbiology and Biotechnology 47:636-639.
Drobner E., H. Huber and K.O. Stetter (1990), Thiobacillus ferrooxidans, a
facultative hydrogen oxidizer, Applied and Environmental Microbiology 56(9):2922-
2923.
132
Ehrlich H.L. (1997), Microbes and metals, Applied Microbiology and Biotechnology
48:687-692.
Elbehti A., M. Asso, B. Guigliarielli and D. Lemesle-Meunier (1997),
Characterization of the three membrane bound metallo enzymes required to
postulate the existence of a bc type complex in Thiobacillus ferrooxidans, In
Biotechnology Comes of Age: Proceedings of the International Biohydrometallurgy
Symposium IBS 97- Biomine 97. Australian Mineral Foundation, pp. PB2.1-2.9.
Elbehti A., W. Nitschke, P. Tron, C. Michel and D. Lemesle-Meunier (1999), Redox
components of cytochrome bc-type enzymes in acidophilic prokaryotes: I.
Characterization of the cytochrome bc
1
-type complex of the acidophilic ferrous ion-
oxidizing bacterium Thiobacillus ferrooxidans, The Journal of Biological Chemistry
274(24):16760-16765.
Elbehti A., G. Brasseur and D. Lemesle-Meunier (2000), First evidence for existence
of an uphill electron transfer through the bc
1
and NADH-Q oxidoreductase complexes
of the acidophilic obligate chemolithotrophic ferrous ion-oxidizing bacterium
Thiobacillus ferrooxidans, Journal of Bacteriology 182(12):3602-3606.
Emerson D. and C. Moyer (1997), Isolation and characterization of novel iron
oxidizing bacteria that grow at circumneutral pH, Applied and Environmental
Fowler T.A. and F.K. Crundwell (1998), Leaching of zinc sulfide by Thiobacillus
ferrooxidans: Experiments with a controlled redox potential indicate no direct bacterial
mechanism, Applied and Environmental Microbiology 64(10):3570-3575.
Gehrke T., J. Telegdi, D. Thierry and W. Sand (1998), Importance of extracellular
polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching, Applied and
Environmental Microbiology 64(7):2743-2747.
Gmez J.M., I. Caro and D. Cantero (1996), Kinetic equation for growth of
Thiobacillus ferrooxidans in submerged culture over aqueous ferrous sulphate
solutions, Journal of Biotechnology 48:147-152.
Gmez J.M., D. Cantero and B. Johnson (1999), Comparison of the effects of
temperature and pH on iron oxidation and survival of Thiobacillus ferrooxidans
(type strain) and Leptospirillum ferrooxidans like isolate, In Biohydrometallurgy and
the environment toward the mining of the 21
st
century, Proceedings of the
International Biohydrometallurgy Symposium IBS 99, Ed by R. Amils and A.
Ballester. Part A pp.689-697.
Graindorge P., S. Charbonnier, J.P. Magnin, C. Mauvy and A. Cheruy (1994), A
software sensor of biological activity based on a redox probe for the control of
Thiobacillus ferrooxidans cultures, Journal of Biotechnology 35:87-96.
133
Grishin S.I. and O.H. Tuovinen (1988a), Fast kinetics of Fe
2+
oxidation in packed
bed reactors, Applied and Environmental Microbiology 54(12):3092-3100.
Grishin S.I., J.M. Bigham and O.H. Tuovinen (1988b), Characterization of jarosites
formed upon bacterial oxidation of ferrous sulfate in a packed bed reactor, Applied
and Environmental Microbiology 54(12):3101-3106.
Hafenbradl D., M. Keller, R. Dirmeier, R. Rachel, P. Roznabel, S. Burggraf, H.
Huber and K. Stetter (1996), Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., a novel
hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe
2+
at neutral pH under anoxic
conditions, Archives of Microbiology 166:308-314.
Hansford G.S. and T. Vargas (2001), Chemical and electrochemical basis of
bioleaching processes, Hydrometallurgy 59(2-3):135-145.
Harvey P.I. and F.K. Crundwell (1996), The effect of As(III) on the growth of
Thiobacillus ferrooxidans in an electrolytic cell under controlled redox potentials,
Minerals Engineering 9(10):1059-1068.
Harvey P.I. and F.K. Crundwell (1997), Growth of Thiobacillus ferrooxidans: a
novel experimental design for batch growth and bacterial leaching studies, Applied
and Environmental Microbiology 63(7):2586-2592.
Herrera L., P. Ruiz, J.C. Aguillon and A. Fehrmann (1989), A new
spectrophotometric method for the determination of ferrous iron in the presence of
ferric iron, Journal of Chemical Technology and Biotechnology 44:171-181.
Hiroyoshi N., H. Miki, T. Hirajima and M. Tsunekawa (2000), A model of ferrous-
promoted chalcopyrite leaching, Hydrometallurgy 57:31-38.
Hbner K. (1991), Growth of Thiobacillus ferrooxidans under electrochemical
reduction of inorganic energy source used, Acta Biotechnologica 11(4):345-352.
Ingledew W.J. and J.G. Cobley (1980), A potentiometric and kinetic study on the
respiratory chain of ferrous-iron-grown Thiobacillus ferrooxidans, Biochimica et
Biophysica Acta 590:141-158.
Ingledew W.J. (1982), Thiobacillus ferrooxidans: The bioenergetics of an
acidophilic chemolithotroph, Biochimica et Biophysica Acta 683:89-117.
Ingledew W.J. (1986), Ferrous iron oxidation by Thiobacillus ferrooxidans, In
Biotechnology and Bioengineering Symposium N16, pp. 23-33.
Ingledew W.J. and A. Houston (1986), The organization of the respiratory chain of
Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology and Applied Biochemistry 8:242-248.
134
Jensen A.B. and C. Webb (1995), Ferrous sulfate oxidation using Thiobacillus
ferrooxidans: a review, Process Biochemistry 30(3):225-236.
Jones C.A. and D.P. Kelly (1983), A Growth of Thiobacillus ferrooxidans on ferrous
iron in Chemostat culture: Influence of product and substrate inhibition, Journal of
Chemical Technology and Biotechnology 33B:241-261.
Karamanev D.G. and L.N. Nikolov (1988), Influence of some physicochemical
parameters on bacterial activity of biofilm: ferrous iron oxidation by Thiobacillus
ferrooxidans, Biotechnology and Bioengineering 31:295-299.
Kelly D.P. and A.P. Wood (2000), Reclassification of some species of Thiobacillus
to the new genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and
Thermithiobacillus gen. nov., International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology 50:511-516.
Kinsel N.A. and W.W. Umbreit (1964), Method for electrolysis of culture medium to
increase growth of the sulfur-oxidizing iron bacterium Ferrobacillus Sulfooxidans,
Journal of Bacteriology 87:1243-1244.
Kovrov-Kovar K. and T. Egli (1998), Growth kinetics of suspended microbial
cells: from single substrate controlled growth to mixed substrate kinetics,
Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3):646-666.
Kupka D. and I. Kupskov (1999), Iron(II) oxidation kinetics in Thiobacillus
ferrooxidans in the presence of heavy metals, In Biohydrometallurgy and the
environment toward the mining of the 21
st
century. Ed by R. Amils and A. Ballester.
Part A pp.387-396.
Lacey D.T. and F. Lawson (1970), Kinetics of the liquid phase oxidation of ferrous
sulfate by the bacterium Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology and
Bioengineering 12:29-50.
Lazaroff N. (1963), Sulphate requirement for iron oxidation by Thiobacillus
ferrooxidans, Journal of bacteriology 85:78-83.
Lazaroff N., W. Sigal and A. Wasserman (1982), Iron oxidation and precipitation of
ferric hydroxysulfates by resting Thiobacillus ferrooxidans cells, Applied and
Levenspiel O. (1962), Chemical reaction engineering, John Wiley & Sons, pp. 393-
409.
Liu M.S., R.M.R. Branion and D.W. Duncan (1988), The effects of the ferrous iron,
dissolved oxygen, and inert solids concentration on the growth of Thiobacillus
ferrooxidans, The Canadian Journal of Chemical Engineering 66:445-451.
135
Lizama H.M. and I. Suzuki (1989a), Synergistic competitive inhibition of ferrous
iron oxidation by Thiobacillus ferrooxidans by increasing concentrations of ferric
and cells, Applied and Environmental Microbiology 55(10):2588-2591.
Lizama H.M. and I. Suzuki (1989b), Rate equations and the kinetic parameters of
the reactions involved in pyrite oxidation by Thiobacillus ferrooxidans, Applied and
Lpez-Lpez A., E. Exposito, J. Antn, F. Rodrguez-Valera and A. Aldaz (1999),
Use of Thiobacillus ferrooxidans in a coupled microbiological-electrochemical
system for wastewater detoxification, Biotechnology and Bioengineering 63(1):79-
86.
MacDonald D.G. and R.H. Clark (1970), The oxidation of aqueous ferrous sulphate
by Thiobacillus ferrooxidans, The Canadian Journal of Chemical Engineering
48:669-676.
Magnin J.P., F. Baillet, A. Boyer, R. Zlatev, M. Luca, A. Cheruy and P. Ozil (1998),
Augmentation, par rgnration lectrochimique du substrat, de la production
dune biomasse (Thiobacillus ferrooxidans DMS 583) pour un procd biologique
de rcupration de mtaux, The Canadian Journal of Chemical Engineering
76:978-984.
Mandl M., D. Hrbc and H. Docekalov (1996), Inhibition of iron(II) oxidation y
arsenic (III,IV) in Thiobacillus ferrooxidans: effects on arsenopyrite bioleaching,
Biotechnology Letters 18(3):333-338.
Matsumoto N., H. Yoshinaga, N. Ohmura, A. Ando and H. Saiki (1999), Extension
of logarithmic growth of Thiobacillus ferrooxidans using controlled electrochemical
cultivation system, In Biohydrometallurgy and the environment toward the mining of
the 21
st
century. Ed by R. Amils and A. Ballester. Part A pp.757-766.
Mazuelos A., I. Palencia, R. Romero, G. Rodriguez and F. Carranza (1999),
Design variables in high efficiency reactors for the biooxidation of ferrous iron in
solution, In Biohydrometallurgy and the environment toward the mining of the 21
st
Meruane G. and T. Vargas (2002), Indirect biooxidation of ferrous chloride with
Thiobacillus ferrooxidans using a novel bioelectrochemical cell, (en preparacin).
Mustin C. (1992), Approche physico-chimique et modlisation de loxydation
bactrienne de la pyrite par Thiobacillus ferrooxidans: Rle determinant de la
phase minrale, Ph. D. Thesis en Gomicrobiologie, LUniversite de Nancy.
Nagpal S. (1997), A structured model for Thiobacillus ferrooxidans growth on
ferrous iron, Biotechnology and Bioengineering 53(3):310-319.
136
Nakamura K., T. Moike and J. Matsumoto (1986), Effect of operation conditions on
biological Fe
2+
oxidation with rotating biological contactors, Water Resources
20(1):73-77.
Nakasono S., N. Matsumoto and H. Saiki (1997), Electrochemical cultivation of
Thiobacillus ferrooxidans by potential control, Bioelectrochemistry and
Bioenergetics 43:61-66.
Natarajan K.A. (1992a), Effect of applied potentials on the activity and growth of
Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology and Bioengineering 39:907-913.
Natarajan K.A. (1992b), Bioleaching of sulphides under applied potentials,
Hydrometallurgy 29:161-172.
Nemati M. and C. Webb (1996), Effect of ferrous iron concentration on the catalytic
activity of immobilized cells of Thiobacillus ferrooxidans, Applied Microbiology and
Nemati M. and C. Webb (1997a), A kinetic model for biological oxidation of ferrous
iron by Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology and Bioengineering 53(5):478-
486.
Nemati M. and C. Webb (1997b), Does immobilization of Thiobacillus ferrooxidans
really decrease the effect of temperature on its activity?, Biotechnology Letters
19(1):39-43.
Nemati M., S.T.L. Harrison, G.S. Hansford and C. Webb (1998), Biological oxidation
of ferrous sulphate by Thiobacillus ferrooxidans: a review on kinetic aspects,
Biochemical Engineering Journal 1:171-190.
Nemati M. and C. Webb (1999), Combined biological and chemical oxidation of
ferrous sulfate using Thiobacillus ferrooxidans, Journal of Chemical Technology
and Biotechnology 74:562-570.
Nikolov L.N. and D.G. Karamanev (1992), Kinetics of he ferrous iron oxidation by
resuspended cells of Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology Progress 8(3):252-
255.
Nordstrom D.K. and G. Southam (1997), Geomicrobiology of sulfide mineral
oxidation, In Reviews in Mineralogy Vol. 35: Geomicrobiology, interactions
between microbes and minerals, Chapter 11, Eds J.F. Banfield and K.H. Nealson,
Mineralogical Society of America.
Nyavor K., N.O. Egiebor and P.M. Fedorak (1996), The effect of ferric ion on the
rate of ferrous oxidation by Thiobacillus ferrooxidans, Applied Microbiology and
137
Ohmura N., N. Matsumoto, K. Sasaki, T. Nagaoka and H. Saiki (1999), Growth of
Thiobacillus ferrooxidans on hydrogen by the dissimilatory reduction of ferric iron
under anaerobic conditions, In Biohydrometallurgy and the environment toward the
mining of the 21
st
Okereke A. and S.E. Stevens Jr. (1991), Kinetics of iron oxidation by Thiobacillus
ferrooxidans, Applied and Environmental Microbiology 57(4):1052-1056.
Olivares M., A. Olea, and W. Schlein (1999), Nuevo enfoque de pruebas
metalrgicas de lixiviacin de cobre, Minerales 54:39-46.
Pesic B., D.J. Oliver and P. Wichlacz (1989), An electrochemical method to
measuring the rate of ferrous to ferric iron with oxygen in the presence of
Thiobacillus ferrooxidans, Biotechnology and Bioengineering 33:428-439.
Pesic B. (1993), Redox potential technique to study the factors of importance
during reactions of Thiobacillus ferrooxidans with Fe
2+
, In Biohydrometallurgical
technologies, Ed. by A.E. Torma, J.E. Wey and V.L. Lakshmanan, pp.545-560.
Pogliani C. (1999), Inmovilizacin y crecimiento de Thiobacillus ferrooxidans y
Thiobacillus Thiooxidans sobre diferentes soportes. Uso de bio-pelculas en la
biolixiviacin de minerales sulfurados. Tesis para optar al grado de Doctor en
Ingeniera Qumica, Universidad nacional de la Plata.
Pronk J.T., K. Liem, P. Bos and J.G. Kuenen (1991), Energy transduction by
anaerobic respiration in Thiobacillus ferrooxidans, Applied and Environmental
Pronk J.T., J.C. Bruyn, P. Bos and J.G. Kuenen (1992), Anaerobic growth of
Thiobacillus ferrooxidans, Applied and Environmental Microbiology 58(7):2227-
2230.
Pronk J.T. and D.B. Johnson (1993), Oxidation and reduction of iron by acidophilic
bacteria, Geomicrobiology Journal 10:153-171.
Rawlings D.E., H. Tributsch, G.S. Hansford (1999), Reasons why Leptospirillum
like species rather than Thiobacillus ferrooxidans are the dominant iron oxidizing
bacteria in many commercial processes for the biooxidation of pyrites and related
ores, Microbiology 145:5-13.
Rai C. (1999), Biologically assisted process for treating sour gas at high pH, U.S.
Patent 5.989.513.
Ray S.K. and A.K. Dasgupta (1989), A redox battery using Thiobacillus
ferrooxidans, Bulletin of Electrochemistry 5(3):194-195.
Rossi G. (1990), Biohydrometallurgy, McGraw Hill, Hamburg.
138
Salhe M.C. (1999), Evaluacin de la inhibicin bacteriana en soluciones de
lixiviacin industrial usando mtodos bioelectroqumicos. Memoria para optar al
ttulo de Ingeniero civil qumico, Universidad de Chile.
Sampson M.I. and R.C. Blake II (1999), The cell attachment and oxygen
consumption of two strains of Thiobacillus ferrooxidans, Minerals Engineering
12(6):671-686.
Sand W. (1989), Ferric iron reduction by Thiobacillus ferrooxidans at extremely low
pH-values, Biogeochemistry 7:195:201.
Schler D. and E. Baeuerlein (1996), Iron limited growth and kinetics of iron uptake
in Manetospirillum gryphiswaldense, Archives of Microbiology 166:301-307.
Selvi S.Ch., K. Abha and K.A. Natarajan (1997), Electrobioleaching a novel
concept for processing complex sulphide ores, In Biotechnology Comes of Age:
Proceedings of the International Biohydrometallurgy Symposium IBS 97- Biomine
97. Australian Mineral Foundation, pp. PM12.1-12.2.
Shippers A., T. Rohwerder and W. Sand (1999), Intermediary sulfur compounds in
pyrite oxidation: implicatins for bioleaching and biodepyritization of coal, Applied
Microbiology and Biotechnology 52:104-110.
Shrihari R.K. and K.S. Gandhi (1990), Modelling of Fe(II) oxidation by Thiobacillus
ferrooxidans, Applied Microbiology and Biotechnology 33:524-528.
Shler M. and F. Kargi (1992), Bioprocess Engineering, Chapter 3: Enzymes.
Prentice Hall International series in physical and chemical engineering sciences.
Slater E.C., J.A. Berden and M.A. Herweijer (1985), A hypothesis of respiratory-
chain phosphorylation not involving the electrochemical gradient of protons as
obligatory intermediate, Biochimica et Biophysica Acta 811:217-231.
Southam G. and T.J. Beveridge (1992), Enumeration of Thiobacilli within pH-
neutral and acidic mine tailings and their role in the development of secondary
mineral soil, Applied and Environmental Microbiology 58(6):1904-1912.
Suissa J.J. and J.W. Shield (1997), Electrochemically enhanced fermentation to
produce iron-oxidizing bacteria for mining industry, Abstracts of Papers of The
American Chemical Society 213(1):215-biot.
Suzuki I., H. Lizama and P.D. Tackaberry (1989), Competitive inhibition of ferrous
iron oxidation by Thiobacillus ferrooxidans by increasing concentrations of cells,
Applied and Environmental Microbiology 55(5):1117-1121.
Tan Y., Z. Wang and K. Marshall (1996), Modelling substrate inhibition of microbial
growth, Biotechnology and Bioengineering, 52:602-608.
139
Taya M., H. Shiraishi, T. Katsunishi and S. Tone (1991), Enhanced cell density
culture of Thiobacillus ferrooxidans in membrane type bioreactor with electrolytic
reduction unit for ferric ion, Journal of Chemical Engineering of Japan 24(3): 291-
296.
Toro L., B. Paponetti and C. Cantalini (1988), Precipitate formation in the oxidation
of ferrous ions in the presence of Thiobacillus ferrooxidans, Hydrometallurgy 20:1-
9.
Vargas T. (1999), Lixiviacin bacteriana de minerales de cobre en pilas,
Latinomineria Enero 1999, pp.56-59.
Vargas, T (1998). Desarrollo de Procesos para la Utilizacin de la capacidad
Oxidativa Bacteriana en Soluciones Lixiviantes de alta agresividad, Proyecto
Convenio Codelco- Universidad de Chile, Informe final.
Voet D. and J. Voet (1995), Biochemistry, 2 edicin, Ed. John Wiley and Sons.
Yamanaka T., T. Yano, M. Kai, H. Tamenai and Y. Fukumori (1993), The electron
transport system coupled to the oxidation of Fe
2+
in Thiobacillus ferrooxidans, In
Biohydrometallurgical Technologies, Ed. By A.E. Torma, M.L. Apel and C.L.
Brierley, TMS, pp. 453-461.
Yamanaka T. and Y. Fukumori (1995), Molecular aspects of the electron transfer
system wich participates in the oxidation of ferrous ion by Thiobacillus
ferrooxidans, FEMS Microbiology Reviews 17:401-413.
Yunker S.B. and J.M. Radovich (1986), Enhancement of growth and ferrous iron
oxidation of Thiobacillus ferrooxidans by electrochemical reduction of ferric iron,
Biotechnology and Bioengineering 28:1867-1875.
Zychlinsky E. and A. Matin (1983), Effect of starvation on cytoplasmatic pH, proton
motive force, and viability of an acidophilic bacterium, Thiobacillus acidophilus,
Journal of Bacteriology 153(1):371-374.
140
ANEXO A
INFLUENCIA DEL OXGENO EN LAS MEDICIONES DE Eh
Se desarrollaron experiencias para determinar la influencia de la concentracin de
oxgeno disuelto sobre el Eh de una mezcla de soluciones de sulfato frrico y
sulfato ferroso. Estas experiencias tiene por objeto comprobar la validez del
procedimiento utilizado en la estimacin de la velocidad de oxidacin bacteriana
de ion ferroso a pH sobre 2,5. Como se ha destacado con anterioridad el clculo
de las velocidades de oxidacin se realiza considerando las variaciones de Eh y
pH que se producen el sistema, y en consecuencia es importante comprobar que
las variaciones de Eh de la solucin slo estn asociadas a variaciones en la
razn frrico/ferroso para el sistema en estudio. Este punto tiene especial
relevancia para poder comparar experiencias donde la velocidad de oxidacin es
notablemente distinta y en consecuencia se puede esperar diferencias en la
concentracin de oxgeno disuelto disponible en solucin. La situacin descrita se
produce, por ejemplo, cuando se dispone en solucin de nmeros de bacterias
distintos, o bien cuando se cambia en forma importante el pH.
Las pruebas se dividieron en dos partes. En la primera de ellas se evaluar la
variacin en la disponibilidad de oxgeno disuelto al cambiar la poblacin
bacteriana en la oxidacin de sulfato ferroso. En la segunda etapa se verificar la
influencia de la concentracin de oxgeno disuelto en el Eh que es medido en
soluciones que contienen sulfato frrico y sulfato ferroso.
Cultivo de bacterias
(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1 de la segunda parte.
141
El procedimiento de cultivo se describe en detalle en la seccin 2.1 de la segunda
parte de esta tesis.
Procedimiento
Las experiencias se desarrollan en una celda de vidrio pyrex termostatizada con
agua a 30 0,5 C. La celda contiene 100 ml de la solucin de prueba y en ella se
colocan un electrodo combinado de pH Sensorex S201C, un electrodo combinado
de Eh Cole-Palmer 5990-57 y un electrodo de oxgeno. Estos electrodos se
encuentran conectados a un sistema de adquisicin de datos Opto 22, que registra
las variaciones de O
2
disuelto, pH y Eh en el tiempo. Para evitar el cortocircuito de
las distintas seales, solo se conecta elctricamente la referencia del electrodo de
pH y los distintos potenciales (pH y Eh y O
2
disuelto) son referidos a l. La
solucin en la celda es agitada con un agitador magntico.
La solucin de trabajo se prepara con 100 ml de medio de nutrientes a pH 1,8
donde se agregan alicuotas de soluciones concentradas de sulfato frrico y sulfato
ferroso para alcanzar las concentraciones esperadas en cada experiencia.
Etapa 1: [O
2
] versus N de bacterias en solucin.
En estas experiencias se agrega sulfato ferroso a la solucin de trabajo hasta
alcanzar una concentracin de 1 g/l. La solucin resultante es burbujeada con
nitrgeno durante un mnimo de 30 minutos y luego es agregada una alicuota del
inoculo de bacterias para alcanzar una concentracin en solucin de 5 x 10
6
clulas/ml. Superadas estas etapas se cambia manualmente el burbujeo de
nitrgeno a aire para enriquecer en oxgeno la solucin y comenzar el proceso de
oxidacin. Esta condicin se mantiene durante un mnimo de 30 minutos
almacenando las lecturas de [O
2
] disuelto, pH y Eh de la solucin. Posteriormente
se adiciona una nueva cantidad de bacterias a la solucin para alcanzar una
concentracin de 1 x 10
8
bacterias/ml. Se registran las variaciones durante otros
30 minutos y luego se cambia la concentracin de microorganismos hasta 3 x 10
8
bacterias/ml De esta forma se cubre con amplitud el rango de trabajo de las
142
experiencias presentadas en la tercera parte de esta tesis y es posible comprobar
las variaciones en la concentracin de oxgeno disuelto en las condiciones
utilizadas. Las experiencias fueron desarrolladas en duplicado y sus resultados se
presentan en las Figuras A.1 y A.2.
En las Figuras A.1 y A.2 las zonas 1, 2 y 3 corresponden a las distintas
concentraciones de microorganismos utilizadas en las experiencias. De acuerdo a
los resultados obtenidos se puede afirmar que cuando se utiliza una baja
concentracin de microorganismos (5 x10
6
bac/ml) la concentracin de oxgeno
disuelto (7,4 mg/l, 97% de la saturacin) no difiere en forma importante de la
concentracin de saturacin para esta solucin, temperatura y presin de
operacin (7,6 mg/l, valor obtenido en forma independiente). En cambio al
aumentar la concentracin de clulas en solucin se aprecia una disminucin de
[O
2
] disuelto, llegando a 6,7 mg/L (88% de saturacin) con 10
8
bac/mL y hasta 5,5
mg/L (72% de saturacin) con 3 x10
8
bac/mL.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 50 100 150 200 250
Tiempo, minutos
[
O
2
]
,

m
g
/
l
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
E
h
,

V

v
s

S
H
E
O2
Eh
1
2
3
Figura A.1. Oxgeno y Eh en el tiempo. Serie 1.
143
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 50 100 150 200 250
Tiempo, minutos
[
O
2
]
,

m
g
/
l
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
E
h
,

V

v
s

S
H
E
O2
Eh
1 2 3
Figura A.2. Oxgeno y Eh en el tiempo. Serie 2.
Estos resultados indican que en las condiciones de aireacin (y velocidades de
oxidacin) utilizadas la concentracin de oxgeno vara desde un 97% a un 72%
de saturacin. Si bien las variaciones de las concentraciones de O
2
disuelto
encontradas son importantes, an es necesario verificar los cambios que se
producen en el Eh de la solucin producto de estas variaciones. Para verificar
estos cambios se desarrolla una segunda etapa de experiencias.
Etapa 2: Eh versus [O
2
] disuelto.
Para estas experiencias se burbujea nitrgeno durante treinta minutos a 100 ml de
solucin de medio de cultivo. Luego se preparan soluciones con [Fe
3+
]/[Fe
2+
]=1
agregando los reactivos como sulfatos para alcanzar concentraciones totales de
hierro desde 0,1 g/l hasta 1 g/l. Una vez estabilizada las lecturas se cambia el
burbujeo de nitrgeno a aire y se registran las variaciones de Eh y [O
2
] disuelto
durante una hora. Las experiencias fueron realizadas en duplicado y sus
resultados se presentan en las Figuras A.3 a A.8.
144
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
Figura A.3. Eh como funcin de [O
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 1 g/l. Serie 1
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 1 g/l. Serie 2
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 0,2 g/l. Serie 1
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 0,2 g/l. Serie 2
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 0,1 g/l. Serie 1
2
]
disuelto. [Fe
tot
] = 0,1 g/l. Serie 2
145
Los resultados expuestos en estas Figuras, muestran que para las condiciones
utilizadas el efecto de los cambios en la concentracin de oxgeno disuelto no es
significativo. An cuando [O
2
] disuelto cambia desde casi cero hasta la saturacin
el Eh de la solucin se muestra constante y en todos los casos se mantiene entre
0,669 y 0,673 V (SHE). Sin embargo, debe observarse que la ms baja
concentracin de ion frrico utilizada en estas experiencias es de 50 mg/l, valor
que puede considerarse no despreciable. En consecuencia podemos argir que no
est demostrado que sucedera en presencia de concentraciones ms pequeas
de ion frrico. Este punto es relevante, ya que en las experiencias donde el pH es
superior a 3,0 la concentracin de ion frrico disuelto ser inferior a 10 mg/l y an
no es clara la influencia de la concentracin de oxgeno en estas condiciones.
Para responder esta interrogante es posible hacer uso de la Figura A.2 presentada
anteriormente. Para esta experiencia los primeros 50 minutos corresponden a la
desoxigenacin de una solucin de 1 g/l de ion ferroso que incluye 4 3 mg/l de
ion frrico (promedio en tres anlisis) como impureza. En la Figura A.9 se presenta
un acercamiento a esta zona de la experiencia.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 10 20 30 40
Tiempo, minutos
[
O
2
]
,

m
g
/
l
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
E
h
,

V

v
s

S
H
E
O2
Eh
Figura A.9. Variacin en Eh y [O
2
] disuelto durante la desoxigenacin
de medio basal y sulfato ferroso utilizando nitrgeno extra puro.
146
En la Figura A.9 se aprecia que la pequea concentracin de ion frrico presente
junto al ion ferroso es capaz de estabilizar el Eh de la solucin (vara desde 0,521
a 0,519 V vs SHE), an cuando se produce una dramtica disminucin de la
concentracin de oxgeno disuelto en la solucin. Como conclusin es posible
sealar que bajas concentraciones de ion frrico en solucin permiten que sea el
par frrico/ferroso el que determine el Eh de la solucin para el sistema en estudio.
En otras palabras la influencia del oxgeno disuelto no es notable sobre el Eh de la
solucin en presencia de hierro disuelto.
En la Figura A.10 se presenta la variacin de Eh como funcin del oxgeno
disuelto para la desoxigenacin de una solucin de medio basal libre de hierro, es
decir la concentracin de hierro total es menor que 0,1 mg/l al aparecer como
impureza.
0,55
0,56
0,57
0,58
0,59
0,60
0,61
0,62
0,63
0,64
0,65
0 2 4 6 8
[O2], mg/l
E
h
,

V

v
s

S
H
E

Figura A.10. Eh en funcin de oxgeno disuelto en la desoxigenacin
de medio basal libre de hierro con nitrgeno de alta pureza.
De acuerdo a los resultados de la Figura A.10 se aprecia que el Eh de la solucin
depende fuertemente de la concentracin de oxgeno disuelto cuando la presencia
de hierro slo es en forma de trazas. Este resultado sin contradecir los anteriores,
147
indica que la concentracin de oxgeno disuelto es importante en la definicin del
Eh de una solucin, pero en presencia de hierro disuelto ser el par frrico/ferroso
el que tenga una mayor influencia sobre el valor del Eh.
148
ANEXO B
CALIBRACIN DE ELECTRODOS DE Eh
La interpretacin de la seal redox de diferencia de potencial enviada por el
electrodo combinado de Eh se puede realizar utilizando una expresin del tipo
Nernst (Pesic et al., 1989; Graindorge et al., 1994; Boon, 1996) como la siguiente:
+ =
+
+
] [
] [
ln
2
3
0
Fe
Fe
F n
T R
E Eh p (1)
Es decir, el potencial redox es relacionado con la razn frrico/ferroso en solucin.
Para completar este procedimiento es necesario comprobar la validez de esta
expresin en las soluciones de trabajo y determinar el pseudo potencial estndar
de la reaccin. Este potencial es determinado realizando mediciones de Eh en
soluciones que han sido preparadas con distinta razn frrico/ferroso,
manteniendo la temperatura de operacin.
Inicialmente, se preparan dos soluciones de cido sulfrico en agua destilada a pH
2,0. A la primera de ellas se adiciona sulfato ferroso y a la segunda se le agrega
sulfato frrico, obteniendo soluciones cuya composicin se detalla en la Tabla B.1.
Tabla B.1: Composicin de soluciones para calibracin
electrodo de Eh en soluciones sin nutrientes.
Solucin A Solucin B
[Fe
2+
], mg/l 1004,9 11,2
[Fe
3+
], mg/l 19,2 864,7
PH 2,0 2,0
Utilizando las soluciones A y B, se preparan mezclas en distintas proporciones de
ellas, totalizando en cada caso un volumen total de 10 ml y se mide el Eh
resultante en la solucin. Los resultados obtenidos se observan en la Tabla B.2.
149
Tabla B.2: Caractersticas de las mezclas de soluciones preparadas
y Eh medido en soluciones sin nutrientes. Caso 1 g/l Fe total.
Vol. Soln. A 0,1 ml 1,0 ml 5,0 ml 9,0 ml 9,9 ml
Vol. Soln. B 9,9 ml 9,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 0,1 ml
[Fe
2+
], mg/l 21,14 110,57 508,05 905,53 994,9
[Fe
3+
], mg/l 856,3 780,15 441,95 103,75 27,66
[Fe
3+
]

/ [Fe
2+
] 40,51 7,06 0,87 0,115 0,0278
Eh medido
V vs SHE
0,796 0,744 0,688 0,631 0,591
El potencial redox de la solucin (Eh) es graficado versus el logaritmo de la razn
frrico ferroso obtenida en cada caso y mediante una regresin lineal se
obtienen los parmetros de la ecuacin. Este procedimiento se aprecia en la
Figura B.1 para el caso con 1 g/l de Fe total.
y = 0,0644x + 0,6913
R
2
= 0,9998
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
E
h
,

V

v
/
s

S
H
E
Figura B.1: Obtencin de parmetros para ecuacin del
electrodo Eh en ausencia de nutrientes. Caso 1 g/l Fe total.
El procedimiento anterior fue repetido utilizando diluciones de las soluciones A y B
para obtener concentraciones de hierro total de 0,1 g/l, 0,3 g/l y 0,5 g/l. Se
150
obtuvieron los parmetros para la expresin del Eh que se presentan en la Tabla
B.3.
Tabla B.3. Parmetros expresin (1) para distintas concentraciones
de hierro total en agua destilada.
Fe tot Pendiente E
P
R
2
[g/l] [V vs SHE] [V vs SHE] [-]
0,100 0,0640 0,6910 0,9995
0,300 0,0636 0,6919 0,9994
0,500 0,0639 0,6919 0,9997
1,000 0,0644 0,6913 0,9998
Media 0,0640 0,6916
Finalmente en promedio se considera que en el rango de concentraciones de
hierro utilizado en agua destilada el electrodo de Eh puede ser descrito por:
+ =
+
+
] [
] [
log 0640 , 0 692 , 0
2
3
Fe
Fe
Eh (2)
El procedimiento anterior es repetido utilizando ahora una solucin de medio basal
a pH 1,8 (los detalles del medio basal se encuentran la seccin 2, de la segunda
parte) sin fierro. A la primera se le agrega sulfato ferroso y a la segunda sulfato
frrico obtenindose las concentraciones que se detallan en la Tabla B.4.
Solucin C Solucin D
[Fe
2+
], mg/l 1093,5 8,5
[Fe
3+
], mg/l 3,6 988,7
pH 1,8 1,8
Tabla B.4: Composicin de soluciones para calibracin electrodo Eh
en soluciones medio basal.
151
En la Tabla B.5 se presentan las caractersticas esperadas y los resultados con las
mezclas especficas de soluciones C y D. Utilizando esta informacin se construye
la Figura B.2 que permite correlacionar la informacin experimental con una
expresin del tipo Nernst.
Tabla B.5: Caractersticas de las mezclas de soluciones preparadas
y Eh medido en soluciones de medio basal. Caso Fe total 1 g/l.
Vol Soln C 1,0 ml 3,0 ml 5,0 ml 7,0 ml 9,0 ml
Vol Soln D 9,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 3,0 ml 1,0 ml
[Fe
2+
], mg/l 107,28 308,84 510,40 711,96 913,52
[Fe
3+
], mg/l 894,71 696,93 499,15 301,37 103,59
[Fe
3+
]

/ [Fe
2+
] 8,34 2,26 0,978 0,423 0,1134
Eh medido
V vs SHE
0,726 0,691 0,667 0,649 0,616
y = 0,0588x + 0,6704
R
2
= 0,9983
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
E
h
,

V

v
/
s

S
H
E
Figura B.2: Obtencin de parmetros para ecuacin del
electrodo Eh en medio basal. Caso 1 g/l Fe total.
El procedimiento anterior fue repetido utilizando diluciones de las soluciones C y D
para obtener concentraciones de hierro total de 0,1 g/l, 0,3 g/l y 0,5 g/l. Se
152
obtuvieron los parmetros para la expresin del Eh que se presentan en la Tabla
B.6.
Tabla B.6. Parmetros expresin (1) para distintas concentraciones
de hierro total en medio basal.
Fe tot Pendiente E
P
R
2
[g/l] [V vs SHE] [V vs SHE] [-]
0,100 0,0567 0,6718 0,9991
0,300 0,0579 0,6714 0,9958
0,500 0,0580 0,6716 0,9993
1,000 0,0588 0,6704 0,9983
Media 0,0579 0,6713
Finalmente en promedio se considera que en el rango de concentraciones de
hierro utilizado en medio basal el electrodo de Eh puede ser descrito por:
+ =
+
+
] [
] [
log 0579 , 0 671 , 0
2
3
Fe
Fe
Eh (3)
153
ANEXO C
PRUEBAS A POTENCIAL CONTROLADO
Tabla C.1: Velocidad de oxidacin de ion ferroso en celda electroqumica de
potencial controlado.
Fe total
(mg/l)
Eh
(V vs SHE)
Corriente
(A)
Va
(V vs SHE)
[bact]
(cel/ml)
[Fe
3+
]

/ [Fe
2+
]
(--)
[Fe
2+
]
(mg/l)
[Fe
3+
]
(mg/l)

V
Fe
2+
(g/hr/cel)
55,47 0,636 4,90E-04 0,200 5,00E+07 0,1369 48,79 6,68 1,02E-06
123,77 0,625 8,50E-04 0,200 5,00E+07 0,0924 113,30 10,47 1,77E-06
230,11 0,600 8,00E-04 0,200 3,50E+07 0,0379 221,71 8,40 2,38E-06
277,09 0,601 1,09E-03 0,200 4,50E+07 0,0392 266,63 10,46 2,52E-06
496,10 0,580 1,22E-03 0,200 4,50E+07 0,0185 487,07 9,03 2,82E-06
600,00 0,585 1,93E-03 0,200 6,50E+07 0,0222 586,99 13,01 3,09E-06
1013,42 0,571 1,72E-03 0,200 5,50E+07 0,0134 999,97 13,45 3,26E-06
55,04 0,664 4,30E-04 0,400 5,00E+07 0,3720 40,12 14,92 8,96E-07
54,43 0,662 3,10E-04 0,400 3,50E+07 0,3464 40,43 14,00 9,23E-07
80,04 0,658 5,60E-04 0,400 5,00E+07 0,3003 61,56 18,48 1,17E-06
112,98 0,648 5,00E-04 0,400 3,50E+07 0,2101 93,36 19,62 1,49E-06
166,06 0,629 8,40E-04 0,400 5,00E+07 0,1066 150,06 16,00 1,75E-06
305,15 0,625 7,20E-04 0,400 3,50E+07 0,0924 279,33 25,82 2,14E-06
433,26 0,634 1,10E-03 0,400 5,00E+07 0,1275 384,27 48,99 2,29E-06
667,52 0,609 8,30E-04 0,400 3,50E+07 0,0522 634,39 33,13 2,47E-06
980,00 0,629 1,43E-03 0,400 5,80E+07 0,1066 885,57 94,43 2,57E-06
980,00 0,627 2,05E-03 0,400 8,40E+07 0,0993 891,49 88,51 2,54E-06
980,00 0,620 1,16E-03 0,400 4,60E+07 0,0773 909,65 70,35 2,63E-06
1000,00 0,629 1,05E-03 0,450 4,69E+07 0,1066 903,64 96,36 2,33E-06
92,00 0,678 5,10E-04 0,500 5,00E+07 0,6132 57,03 34,97 1,06E-06
207,18 0,669 7,40E-04 0,500 5,10E+07 0,4447 143,41 63,77 1,51E-06
512,36 0,661 1,05E-03 0,500 5,21E+07 0,3342 384,01 128,35 2,10E-06
762,84 0,653 1,14E-03 0,500 5,31E+07 0,2512 609,69 153,15 2,24E-06
778,41 0,651 1,84E-03 0,500 5,42E+07 0,2339 630,86 147,55 3,54E-06
794,29 0,650 1,28E-03 0,500 5,89E+07 0,2257 648,04 146,25 2,26E-06
810,50 0,643 9,70E-04 0,500 6,01E+07 0,1758 689,34 121,17 1,68E-06
1084,14 0,644 1,24E-03 0,500 6,14E+07 0,1822 917,08 167,06 2,11E-06
1106,27 0,659 1,03E-03 0,550 6,26E+07 0,3112 843,71 262,55 1,71E-06
73,58 0,702 2,90E-04 0,600 4,60E+07 1,4444 30,10 43,48 6,57E-07
198,42 0,693 5,00E-04 0,600 4,69E+07 1,0475 96,91 101,51 1,11E-06
487,62 0,688 7,20E-04 0,600 4,79E+07 0,8763 259,89 227,73 1,57E-06
804,25 0,684 8,30E-04 0,600 4,89E+07 0,7597 457,05 347,20 1,77E-06
820,66 0,694 1,27E-03 0,600 4,99E+07 1,0856 393,50 427,17 2,65E-06
837,41 0,689 1,13E-03 0,600 5,42E+07 0,9081 438,87 398,54 2,17E-06
854,50 0,680 8,70E-04 0,600 5,53E+07 0,6586 515,20 339,30 1,64E-06
1154,20 0,681 8,70E-04 0,600 5,64E+07 0,6825 686,00 468,20 1,61E-06
1177,76 0,724 7,20E-04 0,650 5,76E+07 3,1679 282,58 895,18 1,30E-06
1201,79 0,721 5,80E-04 0,650 6,26E+07 2,8462 312,46 889,33 9,65E-07
1226,32 0,742 4,70E-04 0,675 6,39E+07 6,0234 174,60 1051,71 7,67E-07
1251,34 0,756 2,50E-04 0,700 6,94E+07 9,9289 114,50 1136,85 3,75E-07
1276,88 0,756 3,30E-04 0,700 7,09E+07 9,9289 116,84 1160,05 4,85E-07
154
ANEXO D
DESARROLLO ALGEBRAICO DEL MODELO, SECCIN 4 SEGUNDA PARTE
E ) Fe ( Fe E
k
k
+ +

+
2 2
2
1
(1)
+ +
+

e E ) Fe ( E ) Fe (
k
k
3 2
4
3
(2)
+ +
+

3 3
6
5
Fe E E ) Fe (
k
k
(3)
La velocidades asociadas a estas tres etapas reversibles del mecanismo pueden
ser expresadas como sigue:
( ) ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
2
2
2 3 2
1
t A
+ + + +
= (4)
( )
|
|
.
|
\
|
|
.
|
\
|
|
.
|
\
|
RT
F n
RT
F n
F n
i
r
B
exp
1
exp
0
(5)
( ) ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
3
5
3 3 2
6
t C
+ + + +
+ = (6)
donde i
0
, , n, R, T son los parmetros estndar utilizados en cintica electroqumica
(ver seccin nomenclatura. La velocidad de oxidacin del complejo enzima-ferroso
sobre la membrana de la bacteria tiene unidades de mol/(rea x tiempo). Ella se
expresa como i/nF, donde i es la densidad de corriente de electrones removidos del
complejo enzima-ferroso hacia la cadena de transporte de electrones al interior de la
clula. El sobrepotencial, , esta expresado en trminos de los potenciales
establecidos en la membrana bacteriana como:
= E
m
- E
m
eq
(7)
155
E
m
eq
es el potencial de membrana cuando el sistema se encuentra en equilibrio y E
m
es el potencial de membrana cuando la reaccin de oxidacin se desarrolla una
velocidad finita. E
m
eq
esta determinado por la razn entre las concentraciones de los
complejos frrico-enzima y ferroso-enzima en la superficie de la membrana, y puede
ser expresado como:

|
|
.
|
\
|
+ =
+
+
] ) [(
] ) [(
ln
2
3
0
E Fe
E Fe
F n
T R
E E
m m
eq
(8)
Cuando el corriente neta de oxidacin en la membrana es cero este potencial puede
ser igualado al potencial de Nernst asociado a la razn [Fe
3+
]/[Fe
2+
] en solucin, es
decir:
|
|
.
|
\
|
+ =
+
+
] [
] [
ln
2
3
0
Fe
Fe
F n
T R
Eh Eh (9)
y asumiendo que r
B
<< r
A
y r
B
<< r
C
, la cintica del mecanismo queda limitada por
la transferencia de electrones en la reaccin 2. En consecuencia es razonable
suponer que las reacciones 1 y 3 se encuentran en estado pseudo-estacionario.
Equivalentemente r
A
0 y r
C
0, obteninedose expresiones para las
concentraciones de los complejos ferroso-enzima y frrico enzima.
( ) 0 ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
2
2
2 3 2
1
=
+ + + +
E Fe k Fe E Fe E Fe E k
t
(10)
( ) 0 ] ) [( ] [ ] ) [( ] ) [( ] [
3
5
3 3 2
6
= +
+ + + +
E Fe k Fe E Fe E Fe E k
t
(11)
| |
5 2
3
6 2
2
5 1
2
5 1 2
] [ ] [
] [ ] [
) (
k k Fe k k Fe k k
Fe E k k
E Fe
t
+ +

=
+ +
+
+
(12)
| |
5 2
3
6 2
2
5 1
3
6 2 3
] [ ] [
] [ ] [
) (
k k Fe k k Fe k k
Fe E k k
E Fe
t
+ +

=
+ +
+
+
(13)
E
m
eq
se define en condiciones de equilibrio y en ese caso (i=0) el potencial de
membrana se iguala al potencial redox de la solucin por (Eh):
156
Eh E
m
eq
= (14)
La corriente de intercambio para esta reaccin puede ser expresada de acuerdo a
la siguiente expresin:

) 1 ( 2 3
0 0
] ) [( ] ) [(
+ +
= E Fe E Fe k i (15)
combinando las expresiones (12), (13) y (15) la corriente de intercambio queda
expresada como:
) 1 (
5 2
3
6 2
2
5 1
3
6 2
5 2
3
6 2
2
5 1
2
5 1
0 0
] [ ] [
] [ ] [
] [ ] [
] [ ] [

+ +
+
+ +
+
(
+ +

+ +

=
k k Fe k k Fe k k
Fe E k k
k k Fe k k Fe k k
Fe E k k
k i
t t (16)
y reordenando:
5 2
3
6 2
2
5 1
) 1 ( 2 3 ) 1 (
6 2 5 1
0 0
] [ ] [
] [ ] [ ] [ ) ( ) (
k k Fe k k Fe k k
Fe Fe E k k k k
k i
t
+ +

=
+ +
+ +
(17)
utilizando (9) y (14) el sobrepotencial definido en la ecuacin (7) queda expresado
como:
|
|
.
|
\
|
=
+
+
] [
] [
ln
2
3
0
Fe
Fe
nF
RT
Eh E
m
(18)
reemplazando la expresin (18) en (5) la velocidad de transferencia de electrones
queda expresada segn:
( )
( )
( )
( )
(
(
|
|
.
|
\
|
|
.
|
\
|

|
|
.
|
\
|
|
.
|
\
|

=
+
+
+
+

] [
] [
exp
] [
] [ 1
exp
2
3
0
1
2
3
0 0
Fe
Fe
Eh E
RT
nF
Fe
Fe
Eh E
RT
nF
nF
i
r
m m
B
(19)
utilizando = y definiendo la constante k
E
:
157
)) (
2
exp(
0
Eh E
T R
F n
k
m E

= (20)
la ecuacin (19) se simplifica a:

(
|
|
.
|
\
|
|
|
.
|
\
|
=
+
+
+
+
] [
] [ 1
] [
] [
2
3
2 1
2
3
0
Fe
Fe
k
k
Fe
Fe
nF
i
r
E
E
B
(21)
similarmente utilizando = en la expresin (17) la corriente de intercambio se
puede escribir como:
( ) ( )
5 2
3
6 2
2
5 1
2
1
3 2
2
1
6 5 2 1
0 0
] [ ] [
] [ ] [ ] [
k k Fe k k Fe k k
Fe Fe E k k k k
k i
t
+ +

=
+ +
+ +
(22)
reemplazando (22) in (21) y reordenando se obtiene:
] [
] [
] [
1
1
] [
] [ 1
] [
2
3
5 1
6 2
2
1
2
2
3 2
1
5 1
6 2
0
+
+
+
+
+
+ +
|
|
.
|
\
|
|
|
.
|
\
|

|
|
.
|
\
|
=
Fe
Fe
k k
k k
Fe k
k
Fe
Fe
k
k E
k k
k k
F n
k
r
E
E
t
B (23)
Introduciendo la siguiente notacin:
( )
(

|
|
.
|
\
|
=
0
2
1
5 1
6 2 0
2
1
exp ] [ Eh E
RT
nF
E
k k
k k
nF
k
V
m
t Max
(24)
| | ( )
(
=
0 0
2
2
1
exp Eh E
RT
nF
E
nF
k
K
m
t
(25)
1
2
k
k
K
S
= (26)
5 1
6 2
k k
k k
K
I
= (27)
la velocidad r
B
puede ser finalmente expresada como:
158
] [
] [
] [
1
1
] [
] [
2
3
2
2
3
2
+
+
+
+
+
+ +
|
|
.
|
\
|

=
Fe
Fe
K
Fe
K
Fe
Fe
K V
r
I S
Max
B
(28)
La ecuacin (23) se puede modificar para expresar r
B
explcitamente en funcin
del Eh. Si la expresin (9) se escribe como:
( )|
.
|
\
|
=
+
+
0
2
3
exp
] [
] [
Eh Eh
RT
nF
Fe
Fe
(29)
y es reemplazada en (24), reordenando se obtiene:
( )
( )|
.
|
\
|
+ +
|
|
.
|
\
|
|
.
|
\
|

|
|
.
|
\
|
=
+
0
5 1
6 2
2
1
2
0 2
2
1
5 1
6 2
0
exp
] [
1
1
exp ) ( 1 ] [
Eh Eh
RT
nF
k k
k k
Fe k
k
Eh Eh
RT
nF
k k E
k k
k k
F n
k
r
E E
t
B
(30)
Introduciendo la siguiente notacin:
| |
t
E
k k
k k
nF
k
K
2
1
5 1
6 2 0
1
|
|
.
|
\
|
= (31)
1
2
2
k
k
K = (32)
5 1
6 2
3
k k
k k
K = (33)
r
B
puede ser finalmente escrito como:
( ) ( )
( )
(
+ +
)
`

=
+
0
3
2
2
0
1
exp
] [
1
exp 1
2
exp
Eh Eh
RT
nF
K
Fe
K
Eh E
RT
nF
Eh E
RT
nF
K
r
m m
B
(34)
159
ANEXO E
RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIN DE SULFATO FERROSO EN EL
RANGO DE pH 1,3 2,5.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s
S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
Figura E.1 Evolucin del Eh y pH. N bact =
3,2x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,27.
Figura E.2 Velocidad de oxidacin de ion
ferroso. N bact = 3,2x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s
S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
5,5x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,31.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
160
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
1,7x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,33.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150 200 250
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
4,8x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,55.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
6,3x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,66.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
161
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
Figura E.11 Evolucin del Eh y pH. N bact
= 4,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,71.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
F
e
2
+
,

m
g

F
e
/

(
l

m
i
n
)
= 5,5x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,84.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 5,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 1,87.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
162
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 3,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,03.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 3,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,07.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
Figura E.21Evolucin del Eh y pH. N bact =
4,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,25.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
163
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 6,8x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,28.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0.0E+00
5.0E-01
1.0E+00
1.5E+00
2.0E+00
2.5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 7,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,55.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
p
H
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150
Tiempo, min
V
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

O
x
i
d
a
c
i
n
,

m
g

F
e
/

(
L

m
i
n
)
= 3,0x10
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
= 0,2 g/l, pH
promedio 2,60.
7
cel/ml, [Fe
2+
]
inicial
=
164
ANEXO F
DETERMINACIN DE LAS ESTEQUIOMETRAS DE FORMACIN DE
PRECIPITADOS FRRICOS

Para la determinacin de las estequiometras de reaccin en la formacin de
precipitados frricos se utiliza la metodologa descrita por Byrne y Lou (2000). Este
mtodo esta basado en mediciones potenciomtricas de pH y concentracin de
ion frrico en solucin para el rango de pH entre 3,0 y 7,3.
Las ventajas de este mtodo radican en que para su desarrollo no es necesario
tomar muestras del reactor donde se efectan las reacciones, sino que se realizan
los clculos de acuerdo con las mediciones de pH y potencial redox en lnea.

Procedimiento

Figura F.1
Montaje Experimental

1 Burbujeo de Nitrgeno
2 Electrodo combinado de pH
3 Electrodo combinado redox
4 Sistema de adquisicin de datos
5 Bao de agua termostatizada
6 Agitador magntico

En la Figura F.1 se aprecia un esquema del montaje experimental utilizado. Las
experiencias se desarrollan en una celda de vidrio pyrex termostatizada con agua
a 30 t 0,5 C. La celda contiene 150 ml de la solucin de prueba y en ella se
colocan un electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo
combinado de Eh Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran
165
conectados a un sistema de adquisicin de datos Opto 22, que registra las
variaciones de pH y Eh en el tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas seales,
solo uno de los electrodos de referencia se encuentra conectado elctricamente y
ambos valores (pH y Eh) son referidos a l. La solucin en la celda es agitada con
un agitador magntico.

La solucin de trabajo es preparada mezclando 135 ml de solucin de agua cida
(o medio de nutrientes) a pH 1,8 con 7,5 ml de una solucin 0,2 M de sulfato
ferroso y 7,5 ml de una solucin 0,2 M de sulfato frrico. La mezcla se realiza en la
celda bajo continuo burbujeo de Nitrgeno extra puro. Este burbujeo se mantiene
durante el desarrollo completo de la prueba.

Se realiza la adicin de cantidades pre-establecidas de NaOH 0,1 N (establecidas
en una experiencia de prueba) y se espera hasta que las variaciones de pH y Eh
en la celda sean poco significativas. Luego se adiciona una nueva dosis de
hidrxido de sodio. Este procedimiento se repite hasta alcanzar un pH cercano a
7,0. Durante toda la prueba se mantiene un registro minuto a minuto de los valores
de pH y Eh de la solucin. Las pruebas en ambas condiciones (con agua cida y
medio nutriente) son efectuadas en duplicado. En la tabla F.1 se presenta las
condiciones experimentales utilizadas.

Estas pruebas se realizaron en dos condiciones: Caso A, donde la solucin inicial
es agua destilada con cido sulfrico; y Caso B, donde se utiliza medio basal libre
de hierro. Las pruebas se realizaron en duplicado identificndose como prueba 1 y
prueba 2 en cada caso.

En las Figuras F.2 y F.3 se presenta los resultados obtenidos para el caso A y en
las Figuras F.4 y F.5 los resultados del caso B.
166

Tabla F.1. Caractersticas de las soluciones utilizadas.
Caso A Caso B
Soporte H
2
O + H
2
SO
4
MC 1.8
[Fe
2+
], g/l 0,57 0,58
[Fe
3+
], g/l 0,56 0,55
pH 1,8 1,8
Volumen, l 0,15 0,15

0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1
2
3
4
5
6
7
p
H
Eh
pH

0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1
2
3
4
5
6
7
p
H
Eh
pH

Figura F.2. Variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Caso A, prueba 1.
tiempo. Caso A, prueba 2.

0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1
2
3
4
5
6
7
p
H
Eh
pH

0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
E
h
,

V

v
s

S
H
E
1
2
3
4
5
6
7
p
H
Eh
pH

tiempo. Caso B, prueba 1.
tiempo. Caso B, prueba 2.

167
En las condiciones de operacin utilizadas y suponiendo que en la formacin de
precipitados no se arrastra una cantidad importante de ion ferroso, es posible
calcular la concentracin de ion frrico asociada a cada valor de potencial redox.
Para ello se consideran las siguientes expresiones que fueron obtenidas de
acuerdo con los procedimientos del Anexo B.
Caso A:
,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0640 . 0 692 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh
Caso B:
,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0579 . 0 671 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh
Con esta informacin se puede graficar el log [Fe
3+
] versus el pH como se aprecia
en las figuras F.6 a F.9.

-14,0
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]

-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]

Figura F.6. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
A, prueba 1.
Figura F.7. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
A, prueba 2.

168
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]

-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]

Figura F.8. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
B, prueba 1.
Figura F.9. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
B, prueba 2.

En estas Figuras (F.6 a F.9) se aprecia una tendencia lineal entre el log [Fe
3+
]
calculado y el pH. Esta tendencia es la esperada y refleja el exponente que
relaciona la cantidad de cido liberado con la cantidad ion frrico precipitado. Para
observar con mayor claridad este resultado se han graficado solo los puntos
finales que se obtiene despus de cada adicin de hidrxido de sodio, para las
dos pruebas de cada caso. Este ejercicio se aprecia en las Figuras F.10 y F.11.

y = -2,8848x + 7,0201
R
2
= 0,9983
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]
y = -2,2161x + 3,4462
R
2
= 0,9995
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
l
o
g

[
F
e
3
+
]
Figura F.10. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
A, resumen de datos.
Figura F.11. Log [Fe
3+
] versus pH, Caso
B, resumen de datos.

De acuerdo con las pendientes observadas en las Figuras F.10 y F.11 se puede
concluir que: en el caso de las soluciones de agua cida, por cado mol de ion
169
frrico precipitado se liberan poco menos de tres moles de protones; en cambio el
caso de soluciones de medio nutriente, por cada mol de ion frrico precipitados se
liberan a la solucin un poco ms de dos moles de protones. Estas
estequiometras de reaccin pueden ser bien representadas por la formacin de
hidrxido frrico en el caso A y jarositas en el caso B, como se presenta en las
reacciones siguientes:

Caso A: Fe
3+
+ 3 H
2
O Fe(OH)
3
+ 3 H
+

Caso B: X
+
+ 3 Fe
3+
+ 2 SO
4
2-
+ 6 H
2
O XFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
+ 6 H
+

170
ANEXO G
RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIN DE SULFATO FERROSO EN EL
En este apartado se presentan los clculos de las velocidades de oxidacin de ion
ferroso de la seccin 3.2 de la segunda parte de esta tesis. Las velocidades se
presentan como logaritmo (base 10) de la velocidad (mg/(l min)) y se denotan
log(V1). Este anexo se divide en tres partes: pruebas realizadas en soluciones sin
nutrientes; pruebas realizadas en medio basal; y pruebas realizadas cambiando el
nmero inicial de microorganismos. En los casos que corresponde las pruebas A,B
y C corresponden a repeticiones de las mismas condiciones experimentales (n de
bacterias, [Fe
2+
], etc.). En todos los casos, para los clculos se considera la
experiencia que tiene menor disgregacin de datos.
Pruebas en soluciones sin nutrientes.
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
Figura G.1 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ion
ferroso sin bacterias, sin nutrientes.
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
Figura G.3 Log(V) vs pH, 1 g/l de ion
171
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
ferroso con bacterias, sin nutrientes N
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
ferroso con bacterias, sin nutrientes
N bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
ferroso con bacterias, sin nutrientes
N bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
172
Pruebas en soluciones de medio basal
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
ferroso sin bacterias, con nutrientes.
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
173
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
ferroso con bacterias, con nutrientes N
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba C
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
174
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba C
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 2x10
7
cel/ml. Prueba B
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
ferroso con bacterias, con nutrientes. N
bact = 2x10
7
cel/ml Prueba C
175
Pruebas con diferente nmero inicial de microorganismos
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 8x10
6
cel/ml. Prueba A
bact = 8x10
6
cel/ml. Prueba B
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 5x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 8x10
7
cel/ml. Prueba B
176
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g
(
V
1
)
bact = 8x10
7
cel/ml. Prueba A
bact = 8x10
7
cel/ml. Prueba B
177
ANEXO H
MEDICIN DEL COEFICIENTE DE RENDIMIENTO BACTERIANO EN EL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
Figura H.1 Velocidad de consumo de
Oxigeno y potencial redox en
experiencia pH = 2,0. [Fe
2+
]
ini
= 1 g/l.
Oxigeno en funcin del potencial redox
en experiencia pH = 2,0. [Fe
2+
]
ini
= 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
Oxigeno y Dixido de carbono en
2+
]
ini
= 1 g/l.
Figura H.4 Razn velocidad de consumo
de dixido de carbono/oxigeno
2+
]
ini
= 1 g/l.
178
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
2+
]
ini
= 1 g/l.
Figura H.8 Razn velocidad de consumo
de dixido de carbono/oxigeno
2+
]
ini
= 1 g/l.
179
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, mV vs Ag/AgCl
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
2+
]
ini
= 1 g/l.
Figura H.12 Razn velocidad de
consumo de dixido de carbono/oxigeno
2+
]
ini
= 1 g/l.
180
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
181
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-
r
O
2
,

(
m
m
o
l
e
/
(
l
.
h
r
)
)
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
E
h
,

V

v
s

S
H
E
-rO2
redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-
r
O
2

(
m
m
o
l
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-
r
C
O
2

(
m
m
o
l
C
O
2
.
l
-
1
.
h
r
-
1
)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-
r
C
O
2

/

-
r
O
2
2+
]
ini
= 1 g/l.
2+
]
ini
= 1 g/l.
182
ANEXO I
BIOOXIDACIN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO
Solucin Medio Cloruro
Experiencia N Bac Eh Fe Tot Fe 2+ [Fe
2+
]
[cel. / ml] V vs SHE [g/l] [g/l] [g/l]
25-3-99 6,00E+07 0,466 0,169 0,1690 0,000
25-3-99 9,60E+07 0,626 0,169 0,1625 0,065
25-3-99 1,52E+08 0,650 0,169 0,1538 0,152
8-4-99 2,00E+06 0,374 0,160 0,1600 0,000
8-4-99 3,00E+06 0,623 0,160 0,1552 0,048
8-4-99 5,50E+06 0,650 0,160 0,1525 0,075
8-4-99 6,25E+06 0,656 0,160 0,1502 0,098
14-4-99 8,25E+06 0,470 0,1642 0,1642 0,000
14-4-99 1,60E+07 0,615 0,1642 0,1596 0,046
14-4-99 2,40E+07 0,625 0,1642 0,1563 0,079
14-4-99 3,20E+07 0,633 0,1642 0,1535 0,107
14-4-99 2,60E+07 0,641 0,1642 0,1515 0,127
Solucin Medio Sulfato
Experiencia Eh Fe2+ [Fe
2+
] [Fe
2+
] N Bacterias
V vs SHE [g/l] [g/l] [g Fe] [cel / ml]
25-3-99 0,852 0,0040 0,0000 0,0000 0,00E+00
25-3-99 0,822 0,0127 0,0088 0,0242 3,60E+07
25-3-99 0,815 0,0167 0,0127 0,0581 9,20E+07
8-4-99 0,838 0,0068 0,0000 0,0000 0,00E+00
8-4-99 0,796 0,0346 0,0277 0,0134 1,00E+06
8-4-99 0,784 0,0545 0,0476 0,0200 3,50E+06
8-4-99 0,777 0,0708 0,0640 0,0258 4,25E+06
14-4-99 0,813 0,0180 0,0000 0,0000 0,00E+00
14-4-99 0,822 0,0127 -0,0053 0,0195 7,75E+06
14-4-99 0,828 0,0101 -0,0079 0,0333 1,58E+07
14-4-99 0,812 0,0187 0,0007 0,0427 2,38E+07
14-4-99 0,800 0,0297 0,0117 0,0483 1,78E+07
ANEXO J
PUBLICACIONES INTERNACIONALES GENERADAS CON LOS RESULTADOS
DE ESTE TRABAJO DE TESIS

J.1. Trabajo publicado en: Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and
Sustainable Development, Ciminelli, VST & Garcia, O. Jr. (eds.), Process Metallurgy
11A, Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands.

Trabajo presentado por uno de nosotros (G.M.) en International Biohydrometallurgy
Symposium IBS-2001, Ouro Preto, Brazil, Septiembre 16-19, 2001.

Improving the rate of bacterial oxidation of ferrous iron with Acidithiobacillus
ferrooxidans in the pH range 2.5 - 5.0.

Gabriel Meruane and Toms Vargas

Centro de Estudios Avanzados en Hidrometalrgia/Electrometalrgia. Departamentos de
Ingeniera de Minas e Ingeniera Qumica. Universidad de Chile. Tupper 2069 Santiago,
Chile. Email: gmeruane@cec.uchile.cl

In the present work the ferrous ion oxidation activity of Acidithiobacillus ferrooxidans in the
pH range 2.5 - 7.0 was characterized. In order to measure the rate of bacterial oxidation of
ferrous iron with Acidithiobacillus ferrooxidans in this high pH range a novel experimental
methodology was developed. The results of this study showed that the inhibition in the
ferrous iron oxidation activity of Acidithiobacillus ferrooxidans observed when increasing the
pH to values over 3.0 is partially linked to the formation of ferric iron precipitates, which
apparently hinder transport phenomena on the cell surface. In fact, by introducing an accurate
control of the amount of iron precipitates formed during the oxidation of ferrous iron in this
pH range an important enhancement in the bacterial activity could be obtained.

Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; Ferrous iron oxidation; Bioleaching; Bacterial
activity; Iron precipitation.
1. INTRODUCTION

It is well known that the activity of Acidithiobacillus ferrooxidans in the oxidation of
ferrous iron rapidly decays at pH ranges over 2.5. In fact, most of the measurements of
ferrous iron bacterial oxidation report evidence of bacterial activity only up to pH = 3.5
[1,2,3]. According to the chemiosmotic theory [4] a decrease in the ferrous iron oxidation
activity of Acidithiobacillus ferrooxidans is expected when the pH increases. However, the
high inhibition that is observed at pHs over 3.0 cannot be explained only by this factor. It is
well known that bacterial oxidation of ferrous iron in this pH range is accompanied by iron
precipitate formation which usually cover the microorganisms[5]. However, the inhibiting
influence of this phenomenon on the bacterial activity has not been evaluated yet.
In the present work the bacterial oxidation of ferrous iron in the pH range 2.5 7.0 was
investigated. A novel experimental methodology to evaluate bacterial activity in this pH range
was developed. The results permitted to evaluate separately the inhibiting effect of both
proton concentration depletion and ferric iron precipitation linked to pH increase.

2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Bacterial culture preparation
A pure strain of Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859) was used in the study. The
bacteria were cultured in 250 ml Erlenmeyer flasks using 100 ml of basal medium with
composition: 0.4 g/l (NH
4
)
2
SO
4
, 0.4 g/l MgSO
4
7H
2
O, 0.056 g/l K
2
HPO
4
3H
2
O, 14.9 g/l
FeSO
4
7H
2
O [6]. The pH of the medium was adjusted to 1.6 using sulfuric acid. The culture
was kept at 30 C in a rotary shaker. The bacteria were maintained in the exponential growth
phase by daily subculturing 20 % of the solution.
The inoculum to be used in each experimental run was prepared from 80 ml of culture
sample, which were filtered using a 0.22m Millipore
membrane. The formed pellet was

washed four times: two times with 20 ml of pH 1.6 sulfuric acid solution for iron removal and
twice with distilled water for residual acid removal. Then it was resuspended in 10 ml of pH
6.0 distilled water or iron-free basal medium. The cell population in this inoculum,
determined by direct counting using a PetroffHausser chamber, was typically in the range: 8-
10 x 10
8
cells per ml.
2.2. Experimental assembly and procedure
The abundant precipitate formation and rapid pH variations which are normally obtained in
the bacterial oxidation of ferrous iron at high pH precludes from monitoring the oxidation
process from direct measurement of variations of ferrous iron concentrations in solution.
Consequently, a novel method was developed to determine the rate of ferrous iron oxidation
from the data of the evolution of Eh and pH during the oxidation process.
The scheme of the experimental set up is shown in Figure 1. The cell contained 25 ml of the
test solution in which a combined pH electrode Sensorex S201C and a combined Eh electrode
Cole-Palmer 5990-57 were immersed. Both electrodes were connected to a data acquisition
system Opto 22 that measured the potential difference in both electrodes and send its data to
an IBM compatible PC, that registers the pH and Eh variations in time. In order to avoid the
short circuit of signals, only one of the reference electrodes was electrically connected and
the values of both the pH and Eh electrodes were referred to it. The solution in the cell was
agitated using a magnetic stirrer. The cell was maintained at constant temperature of 30t1C
using a water heating jacket.

Figure 1: Experimental Assembly

(1) Air or N
2
bubbling
(2) pH electrode
(3) Eh Electrode
(4) Data Acquisition system
(5) Thermostatized water circuit
(6) Magnetic stirrer

The test solution was prepared in situ according to the following procedure: 25 ml of distilled
water or iron-free basal medium were initially added to the cell and deoxygenated by
continuous bubbling of high purity nitrogen. Then, drops of a 1M NaOH solution were added
until obtaining a pH slightly over 7.0. Still under nitrogen bubbling, a predetermined amount
of ferrous sulfate was added to reach the initial desired ferrous iron concentration (100 , 500
or 1000 ppm). This procedure permitted the solubilization of ferrous iron at high pH
preventing completely its spontaneous oxidation. If required, some additional NaOH was
added to adjust the solution to pH = 7.0. Finally, bacteria resuspended in about 1 ml of
distilled water was added in order to fix in the test solution an initial bacterial concentration of
2 x 10
7
cells/ml.
Ferrous iron oxidation was started when switching from nitrogen to air bubbling. Twelve
different experimental conditions were used, corresponding to 3 different initial ferrous iron
concentrations (100, 500 and 1000 ppm), both in iron-free basal medium and nutrients-free
solution, and both in abiotic and inoculated conditions. Each experimental condition was
tested in duplicate. Ferrous iron oxidation rate was determined from the data of the evolution
of Eh and pH according to a calculation procedure described below.

3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Calculation methodology
In every experiment of ferrous iron oxidation a continuous pH decrease and Eh increase was
observed. A typical trend is shown in Figure 2 which corresponds to the case of an inoculated
basal medium solution with an initial ferrous iron concentration of 500 ppm. Shifting of the
pH towards acidic values results from the simultaneous consumption of protons in the
oxidation of ferrous iron and the release of protons related to ferric iron precipitation. Shifting
of the Eh towards more positive values is related to a net increase in the Fe
+3
/Fe
+2
ratio in
solution.
The oxidation of ferrous iron can be expressed by the reaction:

Fe
2+
+ O
2
+ H
+
Fe
3+
+ H
2
O (1)

From initial experimental measurements using the methodology exposed in [7] it was
demonstrated that the precipitation of ferric iron in the system with nutrients-free solution was
well described by the reaction:

Fe
3+
+ 3 H
2
O Fe(OH)
3
+ 3 H
+
(2)

On the other hand, in the system with basal medium, the precipitation process was more
accurately described by the following reaction, where X correspond to a monovalent cation
[8].

X
+
+ 3 Fe
3+
+ 2 SO
4
2-
+ 6 H
2
O XFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
+ 6 H
+
(3)

Figure 2.
Evolution of Eh and pH. Initial
bacterial population: 2x10
7
cells/ml.
Initial ferrous iron concentration: 500
ppm. Basal medium solution.

If the rate of ferrous iron oxidation is defined as:

[ ]
1
2
V
dt
Fe d

+
(4)
and the rate of ferric iron precipitation is defined as:

[ ]
2
V
dt
Fe d
tot
(5)
the mass balance for H
+
and Fe
+3
in solution in the case of basal medium is given by the
equations,

Fe
3+
:
[ ]
2 1
3
V V
dt
Fe d

+
(6)
H
+
:
[ ]
2 1
2 V V
dt
H d
+
+
(7)

and in the case with nutrients-free solution by equation 6 and the equation:

H
+
:
[ ]
2 1
3 V V
dt
H d
+
+
(8)

Therefore, V
1
and V
2
can be expressed in the case with basal medium as:

[ ] [ ]
2
3
1

,
_
+
+ +
dt
Fe d
dt
H d
V (9)
[ ] [ ]
2 2
3
2

,
_
+
+ +
dt
Fe d
dt
H d
V (10)

0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 200 400 600 800 1000
Time, min
E
h
,

V
o
l
t
s

v
s

A
g
/
A
g
C
l
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
p
H
Eh
pH

and in the case with nutrients-free solution as equation 9 and the equation:

[ ] [ ]
2 3
3
2

,
_
+
+ +
dt
Fe d
dt
H d
V (11)

To evaluate the rate of ferrous iron oxidation during the experiment a preliminary calibration
procedure was developed to obtain explicit data of [H
+
] and [Fe
+3
] from the values of Eh and
pH. For this purpose Nernst expressions which relate the solution redox potential with the
ferric/ferrous ratio in solution were obtained, giving:

In basal medium:
,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0579 . 0 471 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh (12)
In nutrients-free solution :
,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0644 . 0 492 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh (13)

From calibration of the pH elecrode the following expression, which relate the potential signal
(V), to H
+
concentration, was obtained:

[ ] ( )
+
+ H V log * 056 . 0 4092 . 0 (14)

The concentration of ferric iron and ferrous iron was calculated from values of Fe tot and Eh
at each time during the experiment. Finally, ferrous iron oxidation rate was evaluated
according to equation 9, by evaluating at each time the instantaneous variation of ferric iron
and protons concentration.
3.2. Ferrous iron oxidation rates.
The results of the calculated ferrous iron oxidation rate for the experiment with 500 ppm
initial ferrous iron concentration for the abiotic case are shown in Figure 3 and for the
inoculated case in Figure 4. Represented data correspond to values of instantaneous oxidation
rates as a function of the pH, which evolves with time.
Figure 3 shows that there is a noticeable rate of abiotic ferrous iron oxidation in this high pH
range. Initially, there is a zone which does not show a clear variation trend in the oxidation
rate, which should corresponds to a transition before full oxygenation of the solution is
reached (zone I). Then the oxidation rate rapidily decays as a result of the acidification
process (zone II). In Figure 4, four areas can be defined: zones I and II are similar to the
behavior observed in the abiotic case; in zone III the logarithm of the oxidation rate grows
almost linearly with the pH decrease; in zone IV this increasing trend is attenuated.
The previous results show that the ferrous iron oxidation at pH values higher than 4.8 5.0 is
not related to bacterial activity. On the contrary, at pH below 4.8 the oxidation rate is mainly
linked to bacterial action and rises steadily with the pH decrease. This behavior was also
observed in experiments at 100 and 1000 ppm. Accordingly, the net rate of biological
oxidation of ferrous iron was obtained in each case after discounting the initial abiotic
oxidation component.

-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
O
x
i
d
a
t
i
o
n

R
a
t
e
)

[
m
g

F
e

/

H
r
]
ZONE I
ZONE II
Figure 3. Ferrous iron oxidation rate.
[Fe
2+
]
initial
= 500 ppm, non inoculated, in
basal medium.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
O
x
i
d
a
t
i
o
n

R
a
t
e
)

[
m
g

F
e

/

H
r
]
ZONE IV
ZONE III
ZONE II
ZONE I

Figure 4. Ferrous iron oxidation rate.
[Fe
2+
]
initial
= 500 ppm, inoculated in basal
medium.

The evolution of pH in each experiment was accompanied by a continuous decrease of the
ferrous iron concentration and increase of ferric iron concentration. Therefore, values of
oxidation rate obtained in different experiments can not be directly compared with each other.
Assuming that the ferrous oxidation kinetics followed a Monod dependence on ferrous iron
and includes a term related to ferric inhibition, the rate of ferrous iron oxidation (v) can be
expressed [9] as:

( ) ] [ * 1 * ] [
] [ *
3 2
2
1
+ +
+
+ +
Fe K K Fe
Fe V
V
I S
Max
(15)

where V
max
=
max
/Y, Y being the yield for ferrous iron oxidation. Using this expression
values of V
max
were obtained from the values of v at each pH. The following values were used
in this calculations[10]: K
S
= 73 ppm, K
I
= 1.29*10
-3
ppm
-1
. Values of [Fe
+2
] and [Fe
+3
] at
each pH were obtained from the mass balance in the system (see section 3.1). Values of V
max

obtained with this normalization procedure are shown in Figures 5 and 6, which compares the
behavior in basal medium and nutrients-free solution for 100 ppm and 1000 ppm respectively.

Figure 5. Calculated values of V
max
,
[Fe
2+
]
initial
= 100 ppm.
Figure 6. Calculated values of V
max
,
[Fe
2+
]
initial
= 1000 ppm.
0.0E+00
5.0E-07
1.0E-06
1.5E-06
2.0E-06
2.5E-06
3.0E-06
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
pH
M
a
x
i
m
u
m

O
x
i
d
a
t
i
o
n

R
a
t
e
,

m
g

F
e
/

(
H
r

c
e
l
l
)
Nutrients-free
Basal Medium
0.0E+00
5.0E-07
1.0E-06
1.5E-06
2.0E-06
2.5E-06
3.0E-06
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
pH
M
a
x
i
m
u
m

O
x
i
d
a
t
i
o
n

R
a
t
e
,

g

F
e
/

(
H
r

c
e
l
l
)
Nutrients-free
Basal Medium

Figure 7. Accumulated mass of Fe
3+

precipitates. [Fe
2+
]
initial
= 100 ppm.
Figure 8. Accumulated mass of Fe
3+

precipitates. [Fe
2+
]
initial
= 1000 ppm.

Results in Figures 5 and 6 show that with the present methodology it is possible to quantify
ferrous iron bacterial oxidation activity in the pH range 3.0-5.0. Normally, works conducted
with standard methodologies has been able to quantify the bacterial ferrous iron oxidation
activity only up to pH = 3.5 [1,2,3]. Bacterial oxidation activity is possible at this high pH
because with the present experimental approach there is an accurate control of the amount of
ferric iron precipitates formation. The amount of ferric iron accumulated as precipitates
during each experiment, which can be also obtained from the mass balance shown in section
3.1, is explicitly shown in Figures 7 and 8 for the cases of 100 and 1000 ppm respectively.
From these figures one can see, for instance, that at pH = 3.5 the amount of precipitated ferric
iron is only 10 ppm in every experimental condition.
Data in Figure 5 and 6 show that, except for the experiment with nutrients-free solution and
1000 ppm, the bacterial oxidation activity increases with the pH decrease in an important
range of pH. This trend is in agreement with what is expected from the role of protons
according to the chemiosmotic theory [4]. However, the bacterial oxidation activity decays in
the lower pH range.This decay reveals, according to our interpretation, the inhibiting
influence of ferric iron precipitate formation. Figures 7 and 8 show that the amount of
precipitates formed in each experiment grows almost exponentially with the pH decrease.
For instance, in the experiment with basal medium containing 1000 ppm the amount of ferric
iron precipitates formed at pH = 3.0 is about 10 times the one obtained at pH = 3.5. It is then
very likely that in the lower pH range the inhibiting effect associated to the presence of such a
high mass of precipitates may counteract the positive influence of pH decrease.
Data in Figures 5 and 6 also show that bacterial activity in nutrients-free solution is much
smaller than in the case of basal medium. This is an evidence that the composition of the
ferric iron precipitate is also influencing its inhibition effect on the bacterial activity. As it
was reported above, when using nutrients-free solutions ferric iron is precipitated solely as
ferric hydroxide (see equation 2), while in the case of basal medium ferric iron is precipitated
as a jarosite-type compound (see equation 3). Therefore, these results show that the formation
of ferric hydroxide has a stronger inhibiting influence than jarosite formation on the bacterial
activity. This conclusion is consistent with the blocking influence which is normally
associated to gel-like precipitates such as ferric hydroxide [11]. On the contrary, jarosites are
normally associated to porous and crystalline precipitates [12].

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
pH
F
e
r
r
i
c

I
r
o
n

p
r
e
c
i
p
i
t
a
t
e
s
,

p
p
m
Nutrients-free
Basal Medium
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
pH
F
e
r
r
i
c

I
r
o
n

p
r
e
c
i
p
i
t
a
t
e
s
,

p
p
m
Nutrients-free
Basal Medium

ACKNOWLEDGMENTS
This work was conducted with the support of Fundacin Andes/Fundacin Antorcha grant
C-13398/6.

REFERENCES

1. B. Pesic, D.J. Oliver and P. Wichlacz, Biotechnology and Bioengineering 33 (1989) 428.
2. D. Kupka and I. Kupskov, In: R. Amils and A. Ballester (Editors), Biohydrometallurgy
and the Environment Towards the Mining of the 21
st
Century, Part A: Proceedings of an
International Biohydrometallurgy Symposium. Elsevier, Amsterdam, (1999) 387.
3. D.G. MacDonald and R.H. Clark, The Canadian Journal of Chemical Engineering
48(1970) 699.
4. W.J. Ingledew, Biochimica et Biophysica Acta 683 (1982) 117.
5. Espejo R., Escobar B., Jedlicki, Uribe P. and Badilla_Ohlbaum R., Applied & Env.
Microb.54(1988) 1694
6. O. H. Touvinen and D.P. Kelly, Archives on Microbiology 68 (1973) 285.
7. R.H. Byrne and Yu-Ran Luo, Geochimica et Cosmochimica Acta 64 (2000) 1873.
8. G. Meruane and T. Vargas, On the mechanism of inhibition of bacterial oxidation of
ferrous iron with Thiobacillus ferrooxidans at low and high pH. In preparation.
9. M.S. Liu, R.M.R. Branion and D.W. Duncan, The Canadian Journal of Chemical
Engineering 66 (1988) 445.
10. P.I. Harvey and F.K. Crundwell, Applied and Environmental Microbiology 63 (1997)
2586.
11. J.W. Mellor, Qumica Inorgnica Moderna, Ed El Ateneo, 1958.
12. N. Lazaroff, W. Sigal and A. Wasserman, Applied and Environmental Microbiology 43
(1982) 924.

J.2. Trabajo enviado a: Hydrometallurgy en Enero 2002.
Actualmente el trabajo se encuentra aceptado y en correccin.

1
Bacterial oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH
range 2.5 - 7.0.

Gabriel Meruane and Toms Vargas

CHEM-CHILE. Centro de Hidrometalrgia/Electrometalrgia. Depto. de Ingeniera de Minas
Depto. de Ingeniera Qumica. Universidad de Chile. Tupper 2069 Santiago, Chile.

Abstract
The oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5 - 7.0 was
characterized. In order to measure the rate of bacterial oxidation of ferrous iron with
Acidithiobacillus ferrooxidans in this high pH range a novel experimental methodology was
developed. The results showed that the inhibition of ferrous iron oxidation activity by
Acidithiobacillus ferrooxidans observed at pH values above 3.0 is partially linked to the
formation of ferric iron precipitates, which apparently hinder transport processes on the cell
surface. By introducing an accurate control on the amount of iron precipitates formed during
the oxidation of ferrous iron in this pH range, enhanced bacterial activity was obtained.

Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; Ferrous iron oxidation; Bioleaching; Bacterial
activity; Iron precipitation.

Correspondence author. Tel.: (562)6784283; Fax: (562) 6991084. E-mail address: tvargas@cec.uchile.cl
2
1. INTRODUCTION

The main mechanism of bacterial catalysis in the dissolution of sulfide minerals is based on
the bacterial oxidation of ferrous iron, with oxygen as electron acceptor, according to the
reaction:

Fe
2+
+ O
2
+ H
+
Fe
3+
+ H
2
O (1)

It is known that ferrous iron oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans rapidly decreases at
pH greater than 2.5 (Nakamura et al., 1986; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupskov, 1999).
In most reports of ferrous iron oxidation by acidophiles, bacterial catalysis is significant only
up to pH ~3.5 (MacDonald and Clark, 1970; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupskov, 1999).
According to the chemiosmotic theory, a decrease in the ferrous iron oxidation activity of
Acidithiobacillus ferrooxidans is expected when the pH increases (Ingledew, 1982). Some
authors have suggested that the formation of ferric iron precipitates can also have an
inhibiting influence in this pH range (Nemati et al., 1998; Espejo et al., 1988), though there is
not clear evidence to support this suggestion. This lack of understanding is related to the
limitations of the current methodologies, which prevent accurate measurements of bacterial
ferrous iron oxidation rate at pH over 3.0. Current measurements are mainly based on the
monitoring of ferrous iron concentration decrease, oxygen consumption or Eh evolution
(MacDonald and Clark, 1970; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupskov, 1999). These
methods are not directly applicable at high pH ranges, where ferrous iron oxidation is
accompanied by rapid variations of pH and total iron concentration.

In the present work the bacterial oxidation of ferrous iron in the pH range 2.5 7.0 was
investigated. A novel experimental methodology was developed to evaluate bacterial activity
over this pH range. This approach permitted the separate evaluation of the inhibiting effects
of both proton concentration depletion and ferric iron precipitation linked to pH increase on
bacterial ferrous iron oxidation.
3
2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Bacterial culture preparation
A pure strain of Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859) was used in the study. The
bacteria were cultured in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium with the
composition: 0.4 g/L (NH
4
)
2
SO
4
, 0.4 g/L MgSO
4
*7H
2
O, 0.056 g/L K
2
HPO
4
*3H
2
O, 14.9 g/L
FeSO
4
*7H
2
O (Touvinen and Kelly, 1973). The pH of the medium was adjusted to 1.6 using
sulfuric acid, and cultures were incubated, shaken, at 30C. The bacteria were maintained in
the exponential growth phase by daily subculturing 20 % of the solution.

The inoculum to be used in each experimental run was prepared from 80 mL of culture
sample, which was filtered through a 0.22m Millipore
membrane. The bacterial pellet was

washed four times: twice times with 20 mL of pH 1.6 sulfuric acid solution for iron removal
and twice with distilled water to remove residual acid. It was then resuspended in 10 mL of
pH 6.0 distilled water or iron-free basal medium. The cell population in this inoculum,
determined by direct counting using a PetroffHausser chamber, was typically in the range: 8-
10 x 10
8
cells per mL.

2.2. Experimental assembly and procedure
The abundant precipitate formation and rapid variations in pH that are associated with the
oxidation of ferrous iron at pH > 2.3, precludes accurate measurements of the bacterial
process by direct measurement of variations of ferrous iron concentrations in solution.
Consequently, a novel method was developed to determine the rate of ferrous iron oxidation
from the data of the evolution of Eh and pH during the oxidation process.

The scheme of the experimental set up is shown in Figure 1. The cell contained 25 mL of the
test solution in which a combined pH electrode (Sensorex S201C) and a combined Eh
electrode (Cole-Palmer 5990-57), which uses Ag/AgCl(sat) as reference electrode, were
immersed. Both electrodes were connected to a data acquisition system Opto 22 that
measured the potential difference in both electrodes and sent the data to an IBM compatible
PC that registers the pH and Eh variations in time. In order to avoid the short circuit of
4
signals, only one of the reference electrodes was electrically connected and the values of both
the pH and Eh electrodes were referred to it. The solution in the cell was agitated using a
magnetic stirrer, and the cell was maintained at constant temperature of 30t1C using a water-
heating jacket.

The test solution was prepared in situ according to the following procedure: 25 mL of iron-
free basal medium were initially added to the cell and deoxygenated by the continuous
bubbling of high purity nitrogen. Next, 1M NaOH solution was added drop wise until a pH
slightly over 7.0 was obtained. Whilst still under nitrogen bubbling, a predetermined amount
of ferrous sulfate was added to reach the initial desired ferrous iron concentration (1 g/L).
This procedure enabled the solubilization of ferrous iron to occur at high pH completely
preventing its spontaneous oxidation. If required, some additional NaOH was added to
readjust the solution to pH = 7.0. Finally, bacteria, resuspended in about 1 mL of distilled
water, were added to give an initial bacterial concentration of 2 x 10
7
cells/mL. Ferrous iron
oxidation was initiated by when switching from nitrogen bubbling to air bubbling. All the
experiments were conducted with 1 g/L initial ferrous iron concentration, and at 4 different
initial bacterial concentrations: 8 x 10
6
, 2 x 10
7
, 5 x10
7
, 8 x 10
7
cells/mL. A blank experiment
in abiotic conditions with the same initial ferrous iron concentration was also conducted.
Every experimental run was conducted in duplicate. Ferrous iron oxidation rates were
determined from the data of the evolution of Eh and pH, according to a calculation procedure
described below.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Calculation methodology
In every experiment a continuous pH decrease and Eh increase was observed, which was
triggered by the oxidation of ferrous iron, either by a chemical or microbiologically mediated
mechanism. A typical trend is shown in Figure 2, which corresponds to the case of an
inoculated basal medium solution containing an initial ferrous iron concentration of 1 g/L.
Shifting of the Eh towards more positive values is directly related to the net increase of the
Fe
+3
/Fe
+2
ratio in solution. Shifting of the pH towards acidic values results from the balance
5
between the simultaneous consumption of protons in the oxidation of ferrous iron and the
release of protons related to ferric iron precipitation. A calculation procedure to determine the
rate of ferrous iron oxidation from the variations of Eh and pH was developed, as described
below.

The oxidation of ferrous iron can be expressed by the reaction described in equation 1. Using
the methodology proposed in Byrne and Luo (2000), it was experimentally shown that the
ferric iron precipitation process in the basal medium could be described by the following
stoichiometry (Meruane, 2002):

X
+
+ 3 Fe
3+
+ 2 SO
4
2-
+ 6 H
2
O XFe
3
(SO
4
)
2
(OH)
6
+ 6 H
+
(2)

where X
+
corresponds to a monovalent cation. This stoichiometry provides the numeric
relation between moles of precipitated iron and moles of released protons to be used in the
calculations.
If the rate of ferrous iron oxidation is defined as:

[ ]
+

+
2
2
Fe
V
dt
Fe d
(3)

and the rate of ferric iron precipitation is defined as:

[ ]
ppt
tot
V
dt
Fe d
(4)

The mass balance for Fe
+3
and H
+
in solution are given by the equations:

Fe
3+
:
[ ]
ppt
Fe
V V
dt
Fe d

+
+
2
3
(5)
H
+
:
[ ]
ppt
Fe
V V
dt
H d
* 2
2
+
+
+
(6)
6

Therefore,
+ 2
Fe
V and
ppt
V can be expressed as:

[ ] [ ]
dt
Fe d
dt
H d
V
Fe
+ +
+
+
3
2
2
(7)
[ ] [ ]
dt
Fe d
dt
H d
V
ppt
+ +
+
3
(8)

A preliminary calibration procedure was developed to obtain explicit data of [H
+
] and [Fe
+3
]
from the values of Eh and pH. For this purpose, the Nernst equation, which relates the
solution redox potential with the ferric/ferrous ratio in solution, were obtained, giving:

,
_
+
+
+
] [
] [
log * 0579 . 0 471 . 0
2
3
Fe
Fe
Eh (9)
(At 30C)
This equation proved to be valid in the pH range 1.4 2.0 and total iron concentration range
0.1 1 g/l.
From calibration of the pH electrode the following expression, which relates the potential
signal ( V ), to H
+
concentration, was obtained:

( ) ] [ log * 056 . 0 4092 . 0
+
+ H V (10)

The concentrations of ferric iron and ferrous iron were calculated from values of [Fe
tot
] and
Eh at each time during the experiment using the following expressions:

,
_

+
+

579 . 0
471 . 0
2
3
10
] [
] [
Eh
Fe
Fe
R (11)
] [
1
] [
3 tot
Fe
R
R
Fe
+
+
(12)
R
Fe
Fe
tot
+
+
1
] [
] [
2
(13)
7

Ferrous iron oxidation rate and ferric iron precipitation rate were evaluated according to
equations (7) and (8), by calculating at each time the instantaneous variation of ferric iron and
protons concentration.
The total ferric iron precipitated at each time was calculated using the following equation:

t
ppt T
ppt
dt V V Fe
0
] [ (14)

Finally, the total iron concentration to be used in the next time step was evaluated using the
expression:

T
ppt tot
t
tot
V Fe Fe Fe / ] [ ] [ ] [
0
(15)

The validity of the proposed calculation methodology was assessed by comparing at the end
of each experiment the final iron concentration calculated according to equation (15) from the
evolution of Eh and pH (see Figure 2), with that determined by atomic absorption in the final
solution. Calculated iron concentrations presented a deviation which was always less than 10
% with respect to the experimental values. This results ensured the reliability of the procedure
proposed for determining ferrous iron oxidation rates.

3.2 Ferrous iron oxidation rates.
Results of the calculated rates of ferrous iron oxidation for the experiment with 1g/L initial
ferrous iron concentration are shown in Figure 3 (abiotic oxidation), and Figure 4
(biologically-enhanced oxidation). Represented data correspond to values of instantaneous
oxidation rates as a function of the pH, which continuously decreased with time from the
initial value of 7.0.

Results in Figure 3 for abiotic conditions shows that, in this high pH range, there is a
significant rate of chemical ferrous iron oxidation. In the pH range 5.5 to 7.0 this rate is
8
practically constant, but at pH below 5.5 the oxidation rate rapidly decays as a result of the
acidification of the solution.

Results in Figure 4 for the inoculated case show that, in the pH range 5.0 to 7.0, the
dependence of ferrous iron oxidation rate on pH in the presence of bacteria was similar to the
one observed in the abiotic case. This implies that, in this pH range, ferrous iron oxidation is
mainly the result of the chemical oxidation of ferrous iron. At pH below 5.0, however, in the
inoculated experiment the rate of ferrous iron oxidation increased with pH decrease, which
indicates that in this range the process is mainly related to bacterial catalysis. From
comparison of data in Figure 4 and those in Figure 3, it can be seen that, e.g. at pH 3.0, the
rate of bacterial oxidation of ferrous iron is about 10
4
times larger than the corresponding rate
of chemical oxidation.

The former results show that it is possible to determine the net rate of bacterial oxidation of
ferrous iron after discounting, at each pH, the component attributable to abiotic ferrous iron
oxidation. Results of bacterial oxidation of ferrous iron obtained with this procedure are
shown in Figure 5 for experiments with an initial ferrous iron concentration of 1 g/L and a
varying concentration of initial inoculated bacteria. Data in Figure 5 were then used to obtain
values of V
max
, which enabled comparison of bacterial activity determined at the 4 different
experimental runs. For this purpose, the rate of ferrous iron oxidation was assumed to follow
a Monod dependence on ferrous iron, but also included a term related to ferric iron inhibition.
Then the specific ferrous iron oxidation rate (
bact
Fe
Fe N V V
+
+
2
2
) was expressed as (Liu et
al., 1988):

( ) ] [ * 1 * ] [
] [ *
3 2
2
2
+ +
+
+ +
+
Fe K K Fe
Fe V
V
I S
Max
Fe (16)

where V
max
=
max
/Y, Y being the yield for ferrous iron oxidation. Using this expression
values of V
max
were obtained from the values of
+ 2
Fe
V at each pH. In this calculation the
following values were used for parameters in equation (16) (Harvey and Crundwell, 1997):
K
S
= 73 mg/L, K
I
= 1.29 x 10
-3
L/mg. Values of V
max
obtained with this procedure are shown
9
in Figure 6, which compares the behavior of experiments with different initial bacterial
populations (between 8 x 10
6
and 8 x10
7
cell/mL) and 1 g/L initial ferrous iron concentration.

3.3. Mechanism of bacterial activity inhibition.
Data in Figure 6 show first that for each experimental run, V
max
starts to increase with pH
decrease at pH below 5.0. This behavior is in agreement with the tendency predicted by the
chemiosmotic theory (Ingledew, 1982). In each run, however, below a certain pH V
max
starts
to decrease with pH decrease. This last trend can not be related to the inhibition of bacterial
activity by acidity, a phenomenon which is only relevant at much lower pH (<pH 2.0) (Pesic
et al., 1989; Nemati et al., 1998; Meruane, 2002). On the other hand, it is interesting to note
that the measured dependence of V
max
on pH was strongly influenced by the population of
bacteria initially added to the experiment.

The possible involvement of the formation of ferric iron precipitates on the peculiar pH
dependence of bacterial activity, indicated by the curvature of the line graphs in Figure 6, was
further investigated. The amounts of ferric iron precipitates that accumulated during the
evolution of pH in each experiment were calculated from the expression:

cell
ppt ppt
sp
N Fe Fe ] [ ] [ (17)

In this expression ] [
ppt
sp
Fe corresponds to the specific amount of ferric iron precipitated per
bacterium. ] [
ppt
Fe was calculated according to equation (14).
cell
N , the population of bacteria
present in the flask at each time during the experiment was calculated from integration of
bacteria grown out of the ferrous iron oxidation, according to the following expression:

+
+
t
t
Fe
cell cell
dt V Y N N
0
2
*
0
(18)

where t
0
is the time at which pH reaches a value about 5.0 and the bacterial oxidation starts
and
0
cell
N is the initial bacterial population.
10

Results of the calculation of ] [
ppt
sp
Fe , shown in Figure 7, demonstrate that the amount of ferric
iron precipitated per bacterium during each experiment is in fact larger in experiments which
show relatively lower bacterial activity. These results clearly suggest that ferric iron precipitates
may be playing an inhibiting role on bacterial iron oxidation. To further clarify the inhibiting
influence of iron precipitates formation on bacterial oxidizing activity, a simple kinetic
mechanism to explain its role was proposed and tested. Assuming that an important fraction of
the formed ferric iron precipitates remains on the cell surface forming a compact layer, V
max
can
be expressed in terms of a mixed control kinetic mechanism involving a chemical resistance and
a diffusional resistance (Levenspiel, 1962). The kinetics of the chemical reaction can be related
to the chemiosmotic mechanism and expressed as
chem
V ; the diffusional process can be
related to diffusion of protons across the ferric iron precipitates layer formed on the bacteria.
Therefore, V
max
can be expressed as:

x k
V
V
chem
max
+
* 1
(19)

where x represents the thickness of the precipitates layer and k is a constant proportional to
the ratio between the diffusional and the kinetics constant. The validity of the proposed model
was tested by modeling curves of V
max
vs pH for runs b, c and d in Figure 6, as a function of the
amount of ferric iron precipitated. Values of V
max
from curve a in Figure 6, the run with slowest
] [
ppt
sp
Fe and larger bacterial population, were used as a pseudo-
chem
V (here denominated
chem
ps
V ).
Consistently with expression (19), curves of
calc
max
V vs pH were calculated using the following
formula:

] [ ' 1
ppt
sp
chem
ps calc
max
Fe k
V
V
+
(20)

Values of k' were adjusted so that the maximum in the calculated curves equaled the maximum
in the experimental curves in Figure 6, for each experimental run.
11

Values of
calc
max
V calculated with this procedure are shown in Figure 8: curves b, c, d correspond to
modeling of experimental curves b, c, d in Figure 6; curve a simply reproduces curve a from
Figure 6, and is included in this figure as a reference. Results in Figure 8 show that the calculated
curves reproduce very well the tendency of V
max
- pH curves in Figure 6. In addition, maximum
V
max
values in each curve are located in pH values very close to the respective experimental
ones. The values of k', however, are different for each calculated curve, being: 2x10
7
for curve b,
1.2 x 10
8
for curve c, and 1.2 x 10
9
for curve d. This may be related to variations of the fraction
of formed ferric iron precipitates that is effectively attached to the bacteria surface and/or to
variations in the permeability of the passivating layer formed.

Results of the former mechanistic analysis show that the decrease in bacterial activity normally
observed at pH values above 2.5 is, in fact, partially related to the formation of a layer of ferric
iron precipitates on the bacteria, which hinders proton diffusion. Previous measurements of
bacterial oxidation activity in this pH range with conventional methodologies have mostly been
conducted using much greater ferrous iron concentrations (1 9 g/L; Nemati et al., 1998). In
such cases, the inhibition observed at high pH may be related to the formation of massive
amounts of ferric iron precipitates. On the other hand, reducing the concentration of ferrous iron
can lead to a dramatic reduction of the amount of precipitates formed. As a consequence, and
according to equation (19), this can lead to a dramatic increase of the bacterial oxidizing activity
of Acidithiobacillus ferrooxidans at pH above 2.5. This behavior could be probed with the use of
the methodology presented in this work, which enables determination of bacterial activity at very
low ferrous iron concentrations.

Maximum rates of bacterial iron oxidation can be obtained when the formation of ferric iron
precipitates is completely avoided. In this hypothetical situation the rate of bacterial oxidation of
ferrous iron will be solely controlled by the chemiosmotic mechanism. The present methodology
has laid a conceptual base, which will facilitate the evaluation of the intrinsic chemiosmotic
kinetics of At. ferrooxidans
12
List of symbols

[Fe
2+
] Ferrous iron concentration (mg/L)
[Fe
3+
] Ferric iron concentration (mg/L)
[Fe
ppt
] Ferric iron precipitates formed (mg)
] [
ppt
sp
Fe Specific amount of ferric iron precipitated per bacteria (mg/cell)
[Fe
tot
] Total iron concentration (mg/L)
[H
+
] Proton concentration (mg/L)
k adjustment parameter in equation (19) (1/m)
k adjustment parameter in equation (29) (cell/mg)
K
S
Michaelis-Menten constant (mg/L)
K
I
Ferric iron inhibition constant (no units)
N
cell
Bacterial concentration in solution (cell/mL)
R Ferric to ferrous concentration ratio (no units)
chem
V Maximum specific ferrous iron oxidation rate non affected by ferric
precipitates (mg/hr cell)
chem
ps
V pseudo values of
chem
V ( mg/hr cell)
+ 2
Fe
V Ferrous iron oxidation rate (mg/hr)
+ 2
Fe V Specific ferrous iron oxidation rate (mg/(hr cell))
V
max
Maximum specific ferrous iron oxidation rate (mg/(hr cell))
calc
max
V Maximum specific ferrous iron oxidation rate calculated using
chem
ps
V and
] [
ppt
sp
Fe (mg/(hr cell))
ppt
V Ferric iron precipitation rate (mg/hr)
V
T
Total volume (0.025 L)
Y Bacterial Growth yield on ferrous iron oxidation (cell/mg Fe)
V Potential difference at the pH electrode (Volt vs Ag/AgCl)
x Ferric iron precipitates thickness at bacterial surface (m)

13
ACKNOWLEDGMENTS
This work was conducted with the support of Fundacin Andes/Fundacin Antorcha grant
C-13398/6. We thank CONICYT for financial support to one of us (G.M.). We are also
grateful to Hctor Jordan for helpful discussion.

REFERENCES

1. Byrne, R.H., Yu-Ran Luo, 2000, Direct observation of nonintegral hydrous ferric oxide
solubility products K
*
SO
= [Fe
3+
][H
+
]
-2.86
, Geochimica et Cosmochimica Acta 64(11), 1873-
1877.
2. Espejo, R., Escobar, B., Jedlicki, E., Uribe, P., Badilla-Ohlbaum, R., 1988, Oxidation of
ferrous iron and elemental sulfur by Thiobacillus ferrooxidans, Applied and Environmental
Microbiology 54, 1694
3. Harvey, P.I., Crundwell, F.K., 1997, Growth of Thiobacillus ferrooxidans: a novel
experimental design for batch growth and bacterial leaching studies, Applied and
Environmental Microbiology 63(7), 2586-2592.
4. Ingledew, W.J., 1982, Thiobacillus ferrooxidans: The bioenergetics of an acidophilic
chemolithotroph, Biochimica et Biophysica Acta 683, 89-117.
5. Kupka, D., Kupskov, I., 1999, Iron(II) oxidation kinetics in Thiobacillus ferrooxidans in
the presence of heavy metals, In Biohydrometallurgy and the environment toward the mining
of the 21
st
century. Ed by Amils, R., Ballester, A. Part A, 387-396.
6. Levenspiel, O., 1962, Chemical reaction engineering, John Willey & Sons, 393-409.
7. Liu, M.S., Branion, R.M.R. Duncan, D.W., 1988, The effects of the ferrous iron, dissolved
oxygen, and inert solids concentration on the growth of Thiobacillus ferrooxidans, The
Canadian Journal of Chemical Engineering 66, 445-451.
8. MacDonald, D.G., Clark, R.H., 1970, The oxidation of aqueous ferrous sulphate by
Thiobacillus ferrooxidans, The Canadian Journal of Chemical Engineering 48, 669-676.
9. Meruane, G., 2002, Oxidacin bacteriana de sulfato ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans, Ph. D. Thesis, Universidad de Chile.
10. Nakamura, K., Noike, T., Matsumoto, J., 1986, Effect of operation conditions on
biological Fe
2+
oxidation with rotating biological contactors, Water Resource, 20(1), 73-77.
14
11. Nemati, M., Harrison, S.T.L., Hansford, G.S., Webb, C., 1998, Biological oxidation of
ferrous sulphate by Thiobacillus ferrooxidans: a review on kinetic aspects, Biochemical
Engineering Journal, 1,171-190.
12. Pesic, B., Oliver, D.J., Wichlacz, P., 1989, An electrochemical method to measuring the
rate of ferrous to ferric iron with oxygen in the presence of Thiobacillus ferrooxidans,
Biotechnology and Bioengineering 33, 428-439.
13. Touvinen, O. H., Kelly, D.P., 1973, Studies on the growth of Thiobacillus ferrooxidans. I.
Use of membrane filters and ferrous iron agar to determine viable number and comparison
with CO
2
fixation and iron oxidation measures of growth, Archives on Microbiology 68, 285.
15
Figures Captions

Figure 1: Experimental assembly. 1. Air/ N
2
bubbling; 2. pH electrode; 3. Eh electrode;
4. Data acquisition system; 5. Thermostatized water circuit; 6.Magnetic stirrer.

Figure 2. Evolution of Eh and pH. Initial bacterial population: 2x10
7
cells/mL. Initial ferrous
iron concentration: 1 g/L.

Figure 3. Ferrous iron oxidation rate in abiotic system. [Fe
2+
]
initial
= 1 g/L.

Figure 4. Ferrous iron oxidation rate in inoculated system. [Fe
2+
]
initial
= 1 g/L. . Initial bacterial
population: 2x10
7
cells/mL.

Figure 5. Net rate of bacterial ferrous iron oxidation for experiments with different initial
bacterial population. Curve a: 8 x 10
7
cell/mL, Curve b: 5 x 10
7
cell/mL, Curve c: 2 x 10
7

cell/mL, Curve d: 8 x 10
6
cell/mL. [Fe
2+
]
initial
= 1 g/L.

Figure 6. Values of V
max
for experiments with different initial bacterial population. Curve a: 8
x 10
7
7
7
6
cell/mL.
[Fe
2+
]
initial
= 1 g/L.

Figure 7. Specific amount of ferric iron precipitates formed per bacteria for experiments with.
different initial bacterial population. Curve a: 8 x 10
7
7
cell/mL,
Curve c: 2 x 10
7
6
cell/mL. [Fe
2+
]
initial
= 1 g/L.

Figure 8. Values of
calc
max
V as function of pH. Curve a: 8 x 10
7
cell/mL (reproduction of V
max
in
Figure 6), Curve b: 5 x 10
7
7
6
cell/mL.

16
Figure 1

17
Figure 2

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 200 400 600 800 1000
Time, min
E
h
,

V
o
l
t
s

v
s

A
g
/
A
g
C
l
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
p
H
pH
Eh

18
Figure 3

-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
V
F
e
2
+

)

[
m
g

F
e

/

H
r
]

19
Figure 4

-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2 3 4 5 6 7
pH
l
o
g

(
V
F
e
2
+

)

[
m
g

F
e

/

H
r
]

20
Figure 5

0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
F
e
2
+
,

g

F
e
/

(
H
r

c
e
l
l
)
a
c
d
b

21
Figure 6

0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
m
a
x
,

g

F
e
/

(
H
r

c
e
l
l
)
a
c
d
b

22
Figure 7

0.0E+00
1.0E-09
2.0E-09
3.0E-09
4.0E-09
5.0E-09
6.0E-09
3 4 5 6
pH
[
F
e
p
p
t
s
p
]
,

m
g
/
c
e
l
l
d
c
b
a

23
Figure 8

0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
V
m
a
x
c
a
l
c
a
c
d
b

J.3. Trabajo enviado a: Biotechnology and Bioengineering en Noviembre 2001.
Aceptado en Abril 2002. En prensa, Production Number: # BB01-786.

Oxidacion Bacteriana de Sulfato Ferroso

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Oxidacion Bacteriana de Sulfato Ferroso

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS

es una bacteria del genero thiobacilli,

El genero Thiobacillus ha sido reclasificado recientemente y la especie Thiobacillus ferrooxidans

. Este diferencial impulsa

Se utiliza la palabra protones o H

, obtenindose los valores presentados en la

de 0,22m. Las bacterias separadas fueron lavadas tres veces con 20

Z61104CT04 de 2 litros confeccionados en borosilicatos,

y posee dos compartimentos separados por una membrana

membrane. The formed pellet was

membrane. The bacterial pellet was

Das könnte Ihnen auch gefallen