Facultad de Qumica Departamento de Bioqumica

Material de apoyo para los estudiantes del curso Bioqumica experimental (0141)

Elaborado por: Dra. Sobeida Snchez Nieto

Editora: Dra. Nahieli Greaves Fernndez Semestre 2013-1

INTRODUCCIN
El material que aqu se presenta est dirigido a los estudiantes de licenciatura, en especial aquellos que buscan introducirse en la bioqumica y como material de apoyo para los estudiantes del curso Bioqumica experimental (0141) de la Facultad de Qumica. Se presenta de manera sencilla y resumida las tcnicas de mayor uso en la bioqumica y la biologa molecular. Comenzando con las partes del mtodo cientfico y como realizar un reporte, tarea que aunque los alumnos han ido llevando a lo largo de sus cursos en la Facultad de Qumica, es distinta, en el curso de la Bioqumica experimental se les introduce al manejo y presentacin de la informacin que obtendrn de un experimento de manera similar a como se hace en los artculos cientficos. Despus se avanza sobre los conocimientos bsicos de bioqumica, como por ejemplo la introduccin en el uso de la espectroscopa y la curva patrn para determinar biomolculas. Se presenta una gua para realizar la purificacin mediante el seguimiento secuencial de varios pasos de purificacin como la precipitacin por salado, desalado, cromatografa de intercambio inico y de afinidad. Para reconocer si el proceso de purificacin fue ptimo se les introduce sobre los conceptos de pureza y rendimiento, los cules son el resultado del monitoreo del proceso de purificacin el cual proviene de la determinacin de protenas, el corrimiento electrofortico de las diferentes fracciones de la purificacin y la medicin de la actividad enzimtica de ests fracciones. Adicionalmente, los alumnos contaran con la informacin mnima necesaria para determinar los parmetros cinticos de una enzima y la influencia de los inhibidores. Es pues, que en est primera parte se presentan los conceptos sobre la estructura, propiedades y funcin de las protenas.

El contenido en la segunda parte es igualmente rico, se presenta la estructura, propiedades y funcin de los cidos nucleicos. Existe abundante informacin respecto a la secuenciacin de genomas y las posibilidades de obtener protenas recombinantes u organismo genticamente modificados. Es por ello que los alumnos recibirn de manera concisa los fundamentos de las tcnicas ms utilizadas en biologa molecular. En est seccin se les presentan dos formas distintas de transferencia horizontal: la conjugacin y la transformacin. Se describen

las tcnicas de monitoreo fenotpico (resistencia a antibiticos, produccin de protena recombinante), genotipo (obtencin del plsmido y restriccin).

Por ltimo, encontraran que la expresin gentica se modifica por varias circunstancias, en particular se revisa el caso del opern lac.

Si bien existen numerosos y excelentes libros en los que los estudiantes pueden encontrar est informacin, la mayor parte de los libros estn escritos para especialistas en el campo, en este escrito se presentan aquellos aspectos que llevaran al estudiante a comprender como en la prctica se realiza la purificacin de protenas o bien la introduccin de un transgen a un organismo como E. coli.

Sobeida Snchez Nieto

CONTENIDO Seccin I Nombre Introduccin al laboratorio de Bioqumica Parte I: Reporte cientfico Parte II: Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva estndar de protenas Estructura y propiedades de protenas: Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo Parte I. Extraccin y precipitacin por salado. Parte II. Purificacin por cromatografa de intercambio inico y de afinidad Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de concentracin de protenas. Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS Actividad enzimtica Parte I. Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino. Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la concentracin de sustrato y de un inhibidor. Anexo I. Deduccin de la ecuacin de Michaelis-Menten. Estructura, propiedades y funcin de cidos nucleicos Transferencia de material gentico I. Conjugacin Transferencia de material gentico II: Transformacin Aislamiento de plsmidos Ensayos de restriccin de plsmido Induccin de protena recombinante Regulacin del metabolismo Parte I: Regulacin gentica en el opern lac Parte II. Regulacin del metabolismo de carbono

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1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA PARTE I: REPORTE CIENTFICO

Introduccin Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, es importante que expreses tus ideas o argumentos de manera clara y fcil de seguir, tanto en forma oral como escrita. Actualmente, tanto las empresas como las instituciones educativas y de investigacin buscan que su personal tenga habilidades adecuadas de comunicacin. Reflexiona: Cmo utilizas diariamente tus habilidades para comunicarte? Cmo se te facilita ms comunicarte con los dems, de manera oral o escrita? Cules son tus fortalezas en el aspecto de la comunicacin? Cules son tus debilidades? Cmo crees que puedes superarlas? lll En el desarrollo de las ciencias, la comunicacin de las observaciones, resultados y propuestas es fundamental para continuar construyendo el conocimiento. Los cientficos comunican sus resultados y conclusiones de distintas maneras, por ejemplo, conferencias, congresos y, principalmente, utilizando reportes cientficos. El reporte cientfico no slo informa sobre los resultados de una investigacin, sino tambin recopila la informacin previa del campo de investigacin, propone nuevas ideas o modelos basados en los resultados, da cuenta de las limitaciones o problemas en la investigacin, analiza los avances tecnolgicos que pueden ayudar a replantear la direccin de una investigacin o llevar a la resolucin de un problema en particular y tambin plantea nuevas preguntas que surgen a partir de los datos obtenidos. De hecho, uno de los objetivos fundamentales de la ciencia es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observacin, utilizando como base la literatura cercana al tema de estudio, es decir, los conocimientos que otros cientficos han generado sobre el tema (Figura 1.1.). Las hiptesis Uno de los aspectos fundamentales para realizar una investigacin es plantear una hiptesis. Reflexiona: Para qu crees que les sirven las hiptesis a los cientficos? En qu crees que se basan los cientficos para plantear sus hiptesis? Qu crees que ocurre cuando, despus de los experimentos, la hiptesis resulta ser falsa?

Una hiptesis puede construirse en varios niveles. En su nivel ms simple, es la prediccin de lo que se espera que ocurra en un experimento, mientras que en niveles ms complejos, las hiptesis se utilizan para probar ideas o modelos muy sofisticados que involucran muchos experimentos y un gran equipo multidisciplinario. En el caso del laboratorio de Bioqumica, generalmente plantears hiptesis sencillas, es decir, debers predecir el resultado de los experimentos que realices y fundamentar por qu piensas que ocurrirn de esa manera. Para construir las hiptesis debes utilizar frases cortas en las que menciones las variables que se estn manipulando y cmo se relacionan entre ellas, as como las mediciones que se realizarn. Las hiptesis siempre deben plantearse en trminos que puedas medir, para poder decir si se cumplieron o no. Adicionalmente, la hiptesis incluye aquella informacin que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigacin, es decir, el fundamento que utilizamos para poder realizar la prediccin. Para ayudarnos a construir la hiptesis generalmente se utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente ejemplo: Si sentimos que la garganta nos duele, nos planteamos: Si tengo dolor de garganta entonces podra deberse a que tengo una infeccin en la garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el da anterior. Sin embargo, la anterior hiptesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir: Si s que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera enfermo, y adems fui a un juego de ftbol en donde grit mucho, entonces es probable que esto ltimo me causara el dolor de garganta. A pesar de que mejor, la hiptesis no establece como se validar o no la prediccin, es decir, no estamos proponiendo un experimento para medir si nuestra prediccin se cumple. Entonces se podra mejorar diciendo: Si no tengo fiebre o sntomas de una infeccin en la garganta, pero s una inflamacin en la garganta, entonces el cultivo de exudado farngeo y otros estudios clnicos darn negativo para una infeccin bacteriana o viral, por lo que la inflamacin se deber a un uso excesivo de las cuerdas vocales. En resumen, la hiptesis es una parte importante en una investigacin y como se mostr, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se est investigando, el conocimiento previo y el diseo del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hiptesis con los resultados se llega a conclusiones vlidas, que permiten replantear las hiptesis y/o reportar lo encontrado.

Figura 1.1. Diagrama que representa el mtodo cientfico. Es importante recordar que el llamado mtodo cientfico no es una serie de pasos a seguir, sino una estrategia flexible que no necesariamente debe seguir este orden. Utilizamos este esquema porque es til para entender cmo se puede dar sentido y estructura a una investigacin cuando debemos escribir un reporte cientfico.

Reporte cientfico Como se coment con anterioridad, el principal propsito de escribir un reporte cientfico es el de comunicar la informacin que ha sido compilada como resultado de la investigacin, la experimentacin y el anlisis de los datos. Estos reportes generalmente se publican en revistas cientficas arbitradas, es decir, en revistas en las que los cientficos ms reconocidos en cierto campo revisan todos los trabajos y valoran si deben publicarse o no. Los reportes cientficos cubren una gran variedad de tpicos pero usualmente se enfocan en transmitir la informacin con un propsito claro y para una audiencia especfica. Un buen reporte es un 6

documento preciso, objetivo y completo. Debe tambin estar bien escrito, claramente estructurado y ser ameno, para que el lector mantenga la atencin en l. Generalmente, el valor de una investigacin se evala a travs del reporte, es decir, el reporte escrito es el nico producto tangible de cientos de horas de trabajo. Es por esto que el reporte debe ser de gran calidad.

Reflexiona: A qu crees que se refiere cuando se dice que un reporte cientfico debe ser objetivo? Investiga: Investiga el nombre de tres revistas arbitradas que utilicen los bioqumicos como referencia para su campo de trabajo.

Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introduccin o antecedentes, mtodos, resultados, discusin, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuacin se da una breve descripcin de cada una de las secciones que conforman un reporte cientfico. Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si le interesa leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms relevantes, una frase sobre el objetivo del proyecto, una descripcin corta de los mtodos que se usaron, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo prrafo de 100 a 200 palabras. Introduccin. Contiene la informacin necesaria para que el lector conozca por qu es importante el reporte, as como de qu trata. La informacin que se utiliza en la introduccin se basa en la literatura cientfica publicada con anterioridad y va de lo general a lo especfico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tpico de la investigacin en un rea particular de estudio. Despus, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura especfica) para ayudar a justificar la presente investigacin, es decir, se le comunica al lector qu se sabe y qu no se sabe sobre el tema en cuestin. Esto lleva directamente a una seccin en la que se plantean las preguntas de investigacin del trabajo, es decir, las hiptesis. En algunas publicaciones se requiere que la parte final de la introduccin contenga los objetivos del estudio. Mtodos. El propsito de esta seccin es describir precisamente los materiales y mtodos usados para realizar los experimentos, siempre con suficiente detalle para que alguien ms pueda reproducirlos. Algunas veces se debe justificar por qu se us un mtodo en particular, ya que puede haber una variedad de mtodos alternativos para responder una pregunta o investigar un fenmeno. La seccin de mtodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo. 7

Resultados. En esta seccin se describen pero no se explican los resultados, es decir, slo presenta los hechos que sern analizados posteriormente en el reporte. La seccin de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras, como diagramas, tablas, grficas, cuadros o mapas que pueden ser muy tiles para mostrar o enfatizar la informacin en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta til para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Los investigadores deben disear cuidadosamente sus figuras de manera que presenten la informacin de manera sencilla y clara. Es esencial que las figuras estn integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que se indiquen claramente en el texto (con la numeracin asignada) cuando se mencionen y siempre deben explicarse. Un error comn es mencionar la figura y slo decir que los datos se encuentran en ella. Lo correcto es explicarle al lector cules datos son relevantes en la figura, cmo se relacionan dichos datos con lo descrito en otras figuras o utilizar los datos que en ella se presentan para justificar por qu se realiz el siguiente experimento que se presenta en el reporte. La descripcin de esta seccin al igual que la de mtodos se hace en pasado. Discusin. La seccin de discusin tiene dos objetivos principales: 1) explicar los resultados del estudio con base en la literatura cientfica existente y 2) evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado prctico, biolgico, y/o est relacionado con otro fenmeno. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hiptesis han sido contestadas; c) mostrar cmo los resultados de la investigacin se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadsticamente significativos, o si existi algn defecto en el diseo o en el procedimiento que pudo afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas reas de inters. La descripcin de est seccin se hace en presente. Conclusiones. Esta seccin puede ser incluida como parte de la discusin o bien como una seccin aparte. Establece de manera clara y concisa cul es la relevancia del trabajo y sus implicaciones. Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabtico, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la informacin bibliogrfica. Existen diversas formas de citar la literatura consultada, como la APA, Harvard o Chicago, entre otras. Cada publicacin tiene distintos requisitos para presentar las referencias.

Referencias Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994. Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman, 2000.

PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA Introduccin
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Esto quiere decir que este instrumento nos ayuda a determinar cules sustancias (protenas, lpidos, carbohidratos, cidos nucleicos, entre otras), estn presentes en una disolucin y en qu cantidad. Los espectrofotmetros pueden emitir radiaciones de diferentes longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible. Muchas sustancias absorben radiacin a diferente longitud de onda (puede ser en el espectro visible o en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qu longitud de onda absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qu tipo de molcula se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la sustancia: a mayor cantidad de radiacin absorbida, mayor concentracin de sta. Si la sustancia no absorbe radiacin en el ultravioleta o el visible, puede modificarse qumicamente para producir un compuesto que s absorba en estas longitudes de onda. A este tipo de mediciones se les conoce como indirectas.

Leyes que rigen la espectrofotometra Cuando un haz luminoso de intensidad P 0 pasa a travs de una solucin, parte de ste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al incidente P 0. La relacin entre ambos se denomina transmitancia, T: T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentracin aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la solucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentracin y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuacin general: -log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2) c es la concentracin b es la longitud de la celda o paso ptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad o coeficiente de extincin 9

donde:

La absortividad o coeficiente de extincin mide qu tanto una sustancia absorbe la radiacin a una longitud de onda determinada. Es una caracterstica propia de cada especie qumica y depende de su estructura. El valor de la absortividad para un compuesto vara con la longitud de onda. A la relacin -log P/ P0 se le denomina absorbancia de la solucin (A) y es especfica para una longitud de onda dada ( ). Por tanto, la ecuacin final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A = a bc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3) Es importante mencionar que se le coloca el superndice a la absorbancia A y a la constante de proporcionalidad a porque dependen de la longitud de onda (ec. 3). Si la concentracin se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extincin ( ). Convencionalmente, el paso de la luz en las celdas de laboratorio es de 1 cm, por lo que las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definicin es un ndice. Podemos construir una grfica para observar cmo vara la absorbancia de una especie en solucin a una longitud de onda dada en funcin de su concentracin. A esta grfica se le llama curva de calibracin o curva estndar y para construirla se mide la absorbancia de varias soluciones de concentracin conocida, llamadas disoluciones estndar. Es una lnea recta y de acuerdo con la ecuacin 3 la pendiente es b.

Absorbancia

Pendiente = b

Concentracin (mol/L)
Figura 1.2. Curva estndar.

Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentracin de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Lambert-Beer. La cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin. La ley de Lambert-Beer para cuantificar compuestos se utiliza de manera rutinaria en el laboratorio de bioqumica. Una de sus aplicaciones principales es para determinar la concentracin de protenas en una solucin.

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Determinacin de la concentracin de protenas Dos aplicaciones comunes de la determinacin de la concentracin de protenas son: 1) para reportar la actividad especfica de una enzima (esto es la velocidad a la que una cantidad definida de enzima forma productos o usa el sustrato por unidad de tiempo) y 2) para hacer un cargado homogneo de protena en geles de poliacrilamida-SDS. Existen varios mtodos para medir protenas totales, y la eleccin de cul utilizar depende de su aplicacin. Por ejemplo, para el clculo de la actividad enzimtica, se requiere tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de protena en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisin es ms importante. Recuerda: Cul es la diferencia entre exactitud y precisin? Cuantificacin de protenas por el mtodo colorimtrico de Lowry. Cuando a un pptido o protena en disolucin bsica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinacin entre los nitrgenos del pptido con el ion metlico. En el mtodo de Lowry, el reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato) se aade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reaccin que produce una coloracin azul que se lee a 750 nm. Esta reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptfano de la protena. La determinacin de protenas con el mtodo de Lowry tiene varias ventajas: es un ensayo 10 a 20 veces ms sensible que la medicin de la absorcin ultravioleta de las protenas (280 nm), es varias veces ms sensible que la deteccin con ninhidrina y 100 veces ms sensible que la reaccin de Biuret. Sin embargo, hay algunas desventajas del mtodo como son que el color vara dependiendo de la protena que se determina y que hay varios reactivos usados en la obtencin de protenas que interfieren con la reaccin. Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356. Wang Y, Wade H, Wong E-T, Li YC, Rodewald LW, Wahl GM 2007. Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS 104 (30), 12365-12370.

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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.

Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo. PARTES I Y II DEL PROTOCOLO. Introduccin Todos los tejidos contienen miles de protenas que difieren en tamao, forma y carga. Algunas tienen actividad enzimtica y otras cumplen otras funciones (por ejemplo, estructurales). Una condicin esencial para el estudio de la estructura y funcin de una protena especfica es su purificacin a partir de los tejidos. Hay varios aspectos que deben considerarse para seleccionar un mtodo para purificar una protena, como por ejemplo, para qu se usar la protena (e.g. si es una enzima, si determinaremos su actividad, o si queremos conocer la secuencia de sus aminocidos o su conformacin en el espacio), cules son sus caractersticas (tamao, carga, solubilidad, hidrofilicidad y funcin biolgica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento nico para la purificacin de protenas, aunque s podemos seguir una gua bsica para realizar la purificacin de forma sistemtica. Dicha gua toma en consideracin lo siguiente: A. B. C. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la protena, puede estar tanto en compartimentos extracelulares o intracelulares. Desarrollar una tcnica de anlisis. Esta tcnica se utilizar para la determinacin rpida de la pureza, actividad o contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separacin de la protena mediante electroforesis, que se detallar ms adelante. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad biolgica de la protena y/o reducir el rendimiento. Remover los posibles contaminantes al inicio del proceso. Un ejemplo son las proteasas, que pueden degradar la protena de inters. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificacin. Se deben seleccionar y usar slo los aditivos necesarios. Usar una tcnica diferente en cada paso. Esto es porque la sucesiva repeticin de un mismo paso no mejora la pureza de la preparacin pero s disminuye el contenido proteico. Para seleccionar la tcnica adecuada en cada paso se deben tomar en cuenta las propiedades fisicoqumicas de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso de purificacin se pierde protena y tiempo. Generalmente se utilizan entre 5 y 8 pasos de purificacin para obtener un enriquecimiento alto de la preparacin proteica.

D. E. F.

G.

H.

Un protocolo tpico de purificacin de una protena intracelular utiliza varias tcnicas (detalladas ms adelante), que pueden incluir: 1 fase: Ruptura de las membranas celulares, centrifugacin diferencial o centrifugacin usando gradiente de densidad (para separar protenas de las partculas subcelulares, o bien, de agregados de diferente peso molecular). 12

2 fase: Puede incluir la precipitacin selectiva de protenas por la adicin de sales o disolventes miscibles en agua. 3 fase: Se remueven las protenas contaminantes utilizando la separacin basada en la carga, tamao y afinidad de la protena. A continuacin se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas tcnicas para purificar una protena. SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA. Las fuentes de la protena pueden ser muy variadas: microorganismos, tejidos, cultivos celulares, clulas transformantes1, entre otras. La eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como el tipo de protena, la facilidad para obtener cantidades suficientes de biomasa, la cantidad de la protena de inters en el tejido o clula, y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida (como su carga, masa o afinidad por ciertos sustratos), que ayudar en su estabilizacin y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, an cuando la cantidad del tejido y de la protena es escaso. La recomendacin para estos casos es realizar un ensayo piloto con una fuente de protena distinta a la requerida, pero que tenga propiedades similares. PRIMERA FASE. El objetivo inicial de la purificacin es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su clarificacin o concentracin. La homogeneizacin es un proceso donde las clulas y los tejidos son lisados o rotos en fragmentos lo suficientemente pequeos para dar lugar a una suspensin uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneizacin son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasnicas pasando por la licuadora. El mtodo a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biolgico para romperse. Igualmente importante al mtodo de homogeneizacin es la seleccin de la solucin de homogeneizacin, puesto que ser el medio al que estar expuesta la protena y en el que se pueden adicionar componentes para ajustar el pH, la fuerza inica, inhibidores de proteasas o algn estabilizador de la protena. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugacin. La centrifugacin utiliza la fuerza de gravedad para separar los diferentes componentes del homogeneizado (como restos de tejido u organelos, por ejemplo), basndose en su tamao, forma y densidad. Despus de la centrifugacin, algunas de las partculas ms pesadas, que normalmente permanecan en suspensin, se sedimentan. Es importante conocer la fuerza centrfuga a la que someteremos la muestra, ya que de sta depende el tamao (o la densidad) de los componentes que se sedimentarn y los que quedarn en suspensin. La fuerza centrfuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuacin:

Clulas a las que se les introdujo un gene que codifica una protena proveniente de otro organismo, a travs del uso de tcnicas de biologa molecular. Ver seccin 4 del manual.

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Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con un radio r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin intermedia del tubo. La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la gravedad) o tan grande como 300,000 Xg. En el primer caso se sedimentan fragmentos de tejido, clulas intactas y ncleos, entre otros. Si la fuerza aplicada es intermedia (13,000 Xg), podemos separar los organelos celulares y, cuando la fuerza es muy grande (100,000 Xg), la mayor parte de las molculas solubles que componen el citosol permanecen en solucin y las molculas aglomeradas en las membranas sedimentan (denominada fraccin microsomal). Como puedes ver, dependiendo de la fuerza aplicada, la sedimentacin vara. Esto implica que podemos realizar un proceso llamado centrifugacin diferencial, en el que el homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones a distintas fuerzas para ir desechando gradualmente los contaminantes de la muestra y avanzar en la purificacin de la protena de inters. Investiga: Busca el diagrama de una centrfuga de laboratorio y seala cules son sus partes.

SEGUNDA FASE El objetivo principal es remover los contaminantes ms pequeos, de una forma especfica. stos pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para eliminar protenas contaminantes es la precipitacin. Para que una protena precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden interaccionar tanto con las molculas de agua como con los iones que se encuentran en solucin. Existen varias estrategias para precipitar a las protenas tales como cambio de pH, incremento en la temperatura, adicin de disolventes, de molculas cargadas, etc. El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4. Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin de iones, fenmeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentracin de iones, disminuye la solubilidad de las protenas y precipitan (salting out). La mayor parte de las protenas presentan en su superficie una capa de agua (capa de solvatacin) que al incrementar la concentracin de los iones disminuye. El mecanismo de salting-out se basa en la exclusin del cosolvente, es decir la sal establece puentes de hidrgeno con el agua y al hacerlo sustrae el agua de la protena. Por lo anterior, la conformacin de la protena se modifica para evitar la exposicin de sus residuos apolares con el solvente, dando como resultado nuevas interacciones y por lo tanto lleva a la formacin de plegamientos o asociaciones nuevas que pueden llevar a su precipitacin. El mtodo del salting out es uno de los ms utilizados en la purificacin de protenas, ya que permite deshacerse de una gran cantidad de contaminantes de una forma econmica. Es por esto que se han diseado tablas y frmulas en las que se pueden determinar las cantidades de (NH4)2SO4 slido o en solucin, que se deben aadir a una mezcla de protenas para obtener una concentracin dada de sal. La precipitacin de una protena a una concentracin dada de sal depende las propias caractersticas inicas y de contenido de residuos polares, por lo que cada protena precipita a cierta concentracin y tipo de sal. Para establecer est concentracin se deben de realizar pruebas. Adems, se tiene que determinar si la protena permanece activa o pierde su actividad biolgica al ser precipitada. 14

Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante, que es comnmente la sal. Una manera es diluir la solucin para reducir la concentracin del compuesto, otras formas pueden ser la dilisis, la ultrafiltracin o bien, el paso por una columna de exclusin molecular. A continuacin se describen brevemente estas tcnicas. La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo de dilisis, que es una membrana semipermeable de celulosa o celofn con un tamao de poro determinado. Se coloca la muestra dentro del tubo de dilisis y ste se sumerge en una solucin que contiene al menos 30 veces ms volumen que la muestra a dializar. Lo anterior aumenta las probabilidades de que la alta concentracin de sal en el tubo migre hacia la solucin en la que se encuentra baada el tubo y cuando se alcance el equilibrio, la concentracin de sal en la muestra y la solucin de dilisis sea muy baja. Existen dos desventajas de la dilisis: el costo de la membrana de dilisis y que el proceso incluye la agitacin del tubo de dilisis a 4 C durante toda la noche. Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar molculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, y al aadir el amortiguador de elucin, las molculas de menor tamao se meten entre los poros de la matriz de Sefadex y se retienen all, mientras que las grandes no se retienen y salen ms rpidamente de la columna. Posteriormente eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes. Investiga: Cmo es un equipo para dilisis? Qu es el Sefadex-G25 y cules son sus propiedades? Cmo es una columna de filtracin en gel? Qu es un amortiguador de elucin? Qu significa eluir? Dibuja: Cmo te imaginas que ocurre la filtracin en gel a nivel microscpico? Dibuja la matriz de Sefadex con sus poros, las molculas grandes y las pequeas y cmo salen stas de la columna.

TERCERA FASE El objetivo de esta fase es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes proteicos. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, de intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. A continuacin slo se describen las dos tcnicas que se usarn en el laboratorio. La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las biomolculas de acuerdo con su carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una protena interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. 15

La purificacin de protenas con este tipo de cromatografa se basa en que la carga electrosttica de las protenas depende del pH en el que se encuentran. El pH en el que se iguala el nmero de cargas positivas y las negativas se llama punto isoelctrico o pI y es diferente para cada protena. A valores de pH menores al pI, la carga neta de una protena es positiva, por lo que puede unirse fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catinico. Por el contrario, a un pH mayor al pI, la protena tendr carga negativa y ser capaz de unirse a intercambiadores de tipo aninico que contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Cuando una protena tiene muchas cargas positivas o negativas, la fuerza con que se une a la columna es mayor que si tiene pocas cargas. Para eluir a la protena de inters se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentracin de sales en la resina. Estas sales tambin pueden interactuar con la resina, reemplazando a las protenas que estn adheridas a ella. Debido a que la separacin de las protenas de la matriz utilizando sales ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unin (dependiendo de qu tan cargada est la protena), es comn eluir a las protenas usando un gradiente de concentracin de sales en orden creciente de concentracin.
Reflexiona:

Por qu una protena tiene cargas positivas a pH< pI? Por qu una protena tiene carga negativa a pH> pI? Dibuja lo que crees que ocurre con las protenas en ambas condiciones. Dibuja cmo crees que la sal reemplaza a una protena con muchas cargas positivas y a otra con pocas cargas positivas durante la elucin. Cul sale primero?

Figura 2.1.Separacin por cromatografa de intercambio inico. Los soportes o resinas de cromatografa pueden estar cargados positiva o negativamente. De esta carga depende cules son las molculas que interaccionarn con la resina.

Cromatografa de afinidad. Si la protena a purificar tiene una afinidad especfica por un ligando como un cofactor, un anticuerpo o un ion metlico, esa propiedad puede usarse para purificarla. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es comn usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien un compuesto que presente alguna similitud a ste (Figura 2.2). 16

Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la protena de inters se unir al ligando, mientras que el resto saldr de la columna. Este tipo de separacin, basada en el reconocimiento biolgico, es muy especfica y elimina muchos contaminantes.

Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificacin por cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de remover, barata y varias compaas las tienen disponibles para realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina B) NAD+. Referencias Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.14.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94. Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104 Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato deshidrogenasa de pollo http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html autor: John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant Sitios recomendados para 1. Aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada por el Dr. Rogelio Rodrguez Sotres. 2. Calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra. http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl 3. Calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm 4. Macro-Prep Ion Exchange Supports. Instruction manual (2000). Biorad www.bio-rad.com 5. Aprender sobre cromatografa http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm 6. Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm

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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de la concentracin de protenas

Introduccin Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas es necesario conocer dos parmetros en cada paso del proceso de purificacin: el rendimiento y el grado de pureza. El rendimiento es un parmetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad biolgica de la protena de inters en cada paso de la purificacin. El 100% corresponde a la actividad del extracto inicial. El grado de pureza se refiere al incremento en pureza a lo largo del proceso. Este valor se obtiene de dividir la actividad especfica de cada paso entre la actividad especfica del paso inicial de purificacin. El ndice da el valor de 1 para el extracto inicial. Para obtener el valor de la actividad especfica (que se encuentra generalmente expresado en Unidades/ mg protena) es necesario contar con a) una tcnica que determine la concentracin de protenas totales en la muestra, y b) una tcnica que especficamente detecte o mida la cantidad de la protena blanco o de inters (unidades de actividad). En casos raros, la protena blanco es fcil de detectar, porque es colorida (mioglobina), porque es fluorescente (protena verde fluorescente) o porque tiene propiedades espectroscpicas caractersticas. Cuando la protena es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimtico especfico para determinar si estamos llevando a cabo la purificacin de manera adecuada. Esta actividad se realizar en el curso y se encuentra descrita en la seccin 3 del manual. Para las protenas que no son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biolgica de la protena (si existe interaccin protena-protena pueden determinarse cambios espectroscpicos intrnsecos a las protenas involucradas o bien de molculas unidas covalentemente como fluorforos) o bien en la deteccin de la protena con anticuerpos (si stos estn disponibles). En esta seccin se realizar la determinacin de protenas de cada una de las fracciones obtenidas durante el protocolo de purificacin de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo. Este paso es necesario para determinar la actividad especfica de la protena de inters. Adems debemos conocer la concentracin de protenas porque llevaremos a cabo el corrimiento electrofortico de todas las fracciones obtenidas de la purificacin y debemos colocar cantidades iguales de protena en el gel para llevar a cabo la comparacin. Investiga: Qu es un fluorforo?

A continuacin se da una breve explicacin del fundamento de la determinacin de protenas por absorbancia a 280 nm y por un mtodo colorimtrico como es el mtodo de Bradford. Cuantificacin de protenas por medicin de absorbancia a 280 nm. 18

El uso de la absorbancia en la regin ultravioleta para medir la concentracin de protena es posiblemente el mtodo ms simple y rpido para determinar la concentracin de protenas, aunque puede producir resultados poco exactos, sobre todo cuando se tiene una mezcla de protenas y cidos nucleicos. Sin embargo, las ventajas de emplearlo son: a) la muestra no se destruye durante la determinacin; b) no es necesario producir una curva de calibracin; c) no utiliza reactivos adicionales; y d) no requiere esperar tiempos de incubacin. Se debe contar con un espectrofotmetro que mida en el intervalo de longitud de onda del UV y con celdas de cuarzo o metacrilato grado UV o poliestireno grado ptico. La cuantificacin de protena por la medida de la absorcin a 280 nm depende de la presencia de los aminocidos aromticos tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). Un alto orden de estructuracin o plegamiento de la protena puede modificar la contribucin de estos aminocidos en la absorbitividad molar del pptido o protena y, en consecuencia, la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza inica del medio. El uso ms comn del ensayo de absorbancia es el monitoreo de las fracciones provenientes de las cromatografas, o cuando se requiere una estimacin rpida de la concentracin de protenas an cuando no sea exacta. Para calcular la concentracin de protenas de la muestra se usar la ecuacin de Lambert y Beer y el coeficiente de extincin molar de la albmina de suero bovino (BSA). Dependiendo en qu unidades se desee expresar la concentracin se emplear un valor diferente de coeficiente de extincin, por ejemplo, para darlo en molaridad se emplea 43 824 M-1 cm-1; cuando se desea reportar en g/L se usa el coeficiente de extincin dado en porcentaje ( en la ecuacin 4), que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL) y se emplea la frmula 4 para determinar la concentracin de la muestra.

(4) Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico. La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rpida, barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibracin para determinar la concentracin de las muestras. El mtodo se basa en la unin especfica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las protenas. El CBBG se une a los residuos de las protenas produciendo una absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia mxima a 470 nm. A diferencia del mtodo de Lowry (otra tcnica colorimtrica para determinar protenas) que es muy sensible a la composicin de la solucin que acompaa a las protenas, el mtodo de Bradford slo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas de este mtodo es que el colorante CBBG se une fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se recomienda usar celdas de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de polipropileno se facilita su limpieza con un poco de alcohol.
Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. Pgina web para consultar mtodos para determinar protenas: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html

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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS
Introduccin La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida es una herramienta analtica indispensable y rutinaria en un laboratorio de Bioqumica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar una mezcla compleja de protenas, evaluar la pureza de una protena durante el proceso de aislamiento y permite conocer algunos valores aproximados de las caractersticas fisicoqumicas de las protenas como la composicin de subunidades, punto isoelctrico, tamao y carga. Reflexiona: Por qu en un pH cercano a 9.0 las protenas tienen mayoritariamente carga negativa? Investiga: Qu es el SDS? Por qu se uniforman las cargas de las protenas cuando se emplea? En la electroforesis, la migracin de las partculas o molculas cargadas ocurre cuando se establece un campo elctrico. La velocidad de la migracin depende de la fuerza del campo elctrico aplicado y de la carga neta de las molculas a separar. La muestra se encuentra disuelta en una disolucin llamada amortiguador de corrida; cuando ste se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las protenas se encontrarn cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo elctrico migrarn al nodo. En condiciones normales, la migracin diferencial de las protenas depender tanto de la carga como del tamao y estructura de la protena, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de las protenas y se uniforman sus cargas, por lo que la migracin slo depende de su peso molecular. Existe una gran variedad en la composicin de los geles, que responde a las necesidades de separacin de diferentes mezclas de protenas. En este caso se utilizar la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificacin de una protena. El gel de poliacrilamida se prepara a partir de las reacciones entre los radicales libres de los monmeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N metilen bisacrilamida para formar una red. La tetrametilndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerizacin y el ion persulfato (S2O8-) realiza la funcin de catalizador favoreciendo la formacin de radicales libres. En un gel de poliacrilamida-SDS, las protenas pequeas viajan ms rpido que las de mayor tamao, porque el tamao del poro del gel entorpece el paso de las protenas de mayor peso molecular. Referencias
Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104 Problemas resueltos de purificacin de protenas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html

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3. ACTIVIDAD ENZIMTICA PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO.
Introduccin Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se consumen o modifican durante sta. Sin su presencia muchas de las reacciones bioqumicas celulares no podran proceder a la velocidad requerida o incluso no se llevaran a cabo. La velocidad de reaccin en presencia de las enzimas se incrementa de 106 a 1012 veces con respecto a la reaccin en ausencia de stas. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad, es decir, solamente catalizan la reaccin en la que participa un sustrato determinado (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y geomtricas comunes (especificidad de grupo). La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de la enzima que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro cataltico o sitio activo. Muchas enzimas catalizan las reacciones utilizando nicamente los residuos de aminocidos de su sitio activo, pero para otras es indispensable que se unan a un cofactor, que es un ion metlico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+ para llevar a cabo la catlisis Otras enzimas necesitan una coenzima, es decir una molcula orgnica con caractersticas no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato, ya que se une transitoriamente al sitio activo de la enzima y se libera al medio durante cada ciclo cataltico. ste es el caso de las deshidrogenasas, como la que purificaste anteriormente y con la que trabajars en esta prctica, cuya coenzima es el NAD+. Algunas coenzimas no se liberan durante el sitio cataltico y se unen fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, en este caso se les da el nombre de grupo prosttico. Diseo de un ensayo enzimtico Durante el aislamiento y purificacin de una enzima es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la misma, as como evaluar sus caractersticas cinticas, es decir la velocidad con la que se lleva a cabo la reaccin en distintas condiciones. Para el diseo de un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: a) cules son las especies que se requieren (sustrato, coenzimas, cofactores, entre otros); b) la estequiometra de la reaccin completa; y c) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica sobre la actividad de la enzima. Adicionalmente, se debe contar con un mtodo para identificar y monitorear el progreso de la reaccin. Esto se puede llevar a cabo monitoreando los cambios fsicos, qumicos o biolgicos que ocurren durante la conversin del sustrato a producto. Para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto se pueden utilizar distintas tcnicas, como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo. La eleccin de la tcnica de deteccin depende esencialmente de las caractersticas estructurales del sustrato y/o producto, as como de la qumica de la reaccin (modificacin del pH por efecto de la actividad de la enzima, reversibilidad de la reaccin, la influencia del o los productos de la reaccin, entre otros).

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La cintica qumica es el estudio de la velocidad a la cual una reaccin ocurre y de los factores que la alteran. En la cintica enzimtica la velocidad, habitualmente denominada actividad enzimtica, involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto que usa o forma, respectivamente la enzima durante un intervalo de tiempo. Este ensayo de actividad se denomina ensayo cintico (Figura 3.1). Tambin es factible realizar la determinacin de la actividad de una enzima a un nico tiempo determinado, midiendo la concentracin del sustrato o producto despus de incubar a la enzima en un medio de reaccin por el tiempo que nosotros decidimos, ste se denomina ensayo a tiempo fijo. Cuando se realizan ensayos temporales o cinticos se obtienen grficos que presentan por lo general tres fases (Figura 3.1). La primera fase ocurre generalmente durante el primer segundo. En esta fase, denominada transitoria, suelen ocurrir las reacciones de formacin del o los intermediarios de vida corta, y se puede evaluar incluso lo que ocurre en el primer ciclo cataltico de la enzima. Como esta fase es tan corta, su anlisis requiere la utilizacin de tcnicas especiales de mezclado y deteccin rpida de sustratos o productos como son la espectroscopia de flujo detenido (stopped-flow), la qumica de apagamiento en flujo (chemical quench-flow) y la fotolisis ptica.

Figura 3.1 Curva temporal de formacin de producto en una reaccin enzimtica. La acumulacin de producto generalmente presenta tres fases. La fase 1 no dura ms de 1 segundo, la fase 2 corresponde a la fase de velocidad inicial y la fase 3 en la que ya se empieza a acumular el producto y/o a acabar el sustrato. En la segunda fase, denominada fase de velocidad inicial, la concentracin de producto se incrementa linealmente conforme el tiempo transcurre (Figura 3.1). La velocidad inicial de una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin; una relacin lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la concentracin inicial. Esta fase es en la que se enfoca la mayor parte de los estudios cinticos y es la que seguiremos en el experimento de curvas temporales de actividad de la lactato deshidrogenasa. Por ltimo, la fase 3 se produce generalmente debido al decremento en la concentracin de sustrato, aunque tambin puede ocurrir la desnaturalizacin de la enzima o su inhibicin causada por la alta concentracin de producto de la reaccin. En esta fase la concentracin de producto no cambia con respecto al tiempo. 22

Lactato deshidrogenasa La lactato deshidrogenasa o LDH es una L-lactato: NAD+ oxidoreductasa, y su clasificacin es EC 1.1.1.27. Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura 3.2). Cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, la enzima cataliza la reaccin reversa, es decir, el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversin de NADH a NAD+. La regeneracin del NAD+ permite que el flujo de la va glucoltica contine. Cuando la demanda de energa cesa o cuando se acumula una gran cantidad de lactato, la actividad de la enzima, que cataliza la reaccin de piruvato a lactato, disminuye. Investiga A qu se refiere la cita EC 1.1.1.27?

Figura 3.2. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima. La LDH es un tetrmero cuyas subunidades tienen un peso molecular de 35 kDa cada una. Existen varios tipos de LDH, dependiendo del tipo de subunidades que las conformen. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el msculo y el hgado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con estequiometras distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todas estas tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reaccin pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas.

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
Introduccin El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros. Se evala la influencia de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en una reaccin y el papel que juegan en la reaccin enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de reaccin. Es esencial entender estos 23

mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la actividad enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cmo las diferencias en actividad estn relacionadas con la funcin y/o la fisiologa del organismo del que proceden.

Efecto de la concentracin de sustrato en la actividad de la enzima En las reacciones no catalizadas por enzimas la formacin de producto depende linealmente de la concentracin de sustrato aadido (Fig. 3.3A). Mientras que en las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente se obtiene una dependencia hiperblica de la velocidad respecto a la concentracin de sustrato, distinguindose 3 partes distintas en la curva (Fig. 3.3B). En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentracin de sustrato, se duplica la velocidad (reaccin de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que en la primera parte con el incremento de la concentracin, iniciando alrededor de la de la Vmax. La ltima parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato (reaccin de orden cero), as la velocidad alcanzada es cercana a la mxima.

A
2

B
3

Figura 3.3 Efecto de la concentracin de enzima en una reaccin no catalizada y una catalizada por enzimas. A) Reaccin no catalizada por enzimas, la formacin de producto depende proporcionalmente de la [S]. B) Curva de saturacin de una enzima. La curva se ajust a la ecuacin michaeliana. Se muestran los parmetros cinticos caractersticos de una enzima, Km y Vmax. A pesar de que la curva del efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de la enzima es compleja, existe una ecuacin matemtica que expresa la relacin que existe entre las variables: la hiprbola cuadrtica o tambin denominada ecuacin de MichaelisMenten (ecuacin 1), llamada as debido al trabajo pionero de Michaelis y Menten y de Bringgs y Haldane. La deduccin de la ecuacin se describe en el ANEXO I.

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(1)

En la ecuacin de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica mxima de la reaccin catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, y se conocen como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena cuya estructura y carga elctrica se modifican cuando los componentes de la solucin cambian. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato. Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta, por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera para obtener los valores de Km y Vmax es la de utilizar alguna de las expresiones matemticas que producen una lnea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la de Lineaweaver-Burk, tambin llamada de dobles recprocos (Fig. 3.4), que es la ms popular y se muestra a continuacin: 1 1 Km 1 * v V max [ S ] V max

y m* x b
Puedes observar en la ecuacin que las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten son expresiones matemticas simples y son tiles para obtener los valores de Km y Vmax. Y son ampliamente usados para evaluar o analizar el efecto de inhibidores sobre la actividad enzimtica.

Figura 3.4 Grfica de dobles recprocos.

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Efecto de inhibidores en la actividad enzimtica Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que disminuyen su velocidad de reaccin, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimticas. Muchos compuestos txicos como antibiticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas responsables de reacciones vitales para la clula. La interaccin de un inhibidor y una enzima vara dependiendo de la naturaleza qumica del inhibidor y de la reaccin qumica que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interaccin entre ambas molculas se determina el efecto del inhibidor en las constantes cinticas de la enzima. Tipos de inhibidores: Inhibidor competitivo. Son molculas que tienen una similitud estructural y qumica con el sustrato de la enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin embargo, debido a que el inhibidor no es idntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertirlo en producto y el inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, porque no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo dentro de ste. Si se adiciona ms sustrato (y el inhibidor no se une de manera irreversible a la enzima) se reduce la inhibicin. En un grfico de dobles recprocos el intercepto en y es el mismo en ausencia y presencia del inhibidor, es decir el inhibidor no afecta la Vmax de la enzima, sin embargo la pendiente de la curva se incrementa. El incremento en la pendiente indica la fuerza de unin del inhibidor. De tal manera que el valor de la Km de la reaccin catalizada por la enzima se incrementa, a este nuevo valor de Km se le llama Km aparente (Figura 3.5).

Figura 3.5. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima. 26

Inhibidor incompetitivo o acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre sino que slo se une al complejo enzima-sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unin del sustrato expone o crea sitios de acceso o unin para el inhibidor, en el sitio activo o fuera de ste. Una vez que el inhibidor se une a la enzima se previene la formacin del producto. El inhibidor incompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima pero no afecta la pendiente, por lo que las curvas de dobles recprocos a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas (Figura 3.5). Los valores nuevos de las constantes cinticas son Km aparente y Vmax aparente. Inhibidor no competitivo. El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato. Un inhibidor no competitivo puro es aquel que modifica tanto la Km de la enzima como la pendiente de la curva de dobles recprocos, as las curvas en ausencia y presencia del inhibidor presentan diferencias en ambos interceptos, 1/Vmax y 1/Km. La mayor parte de los inhibidores no competitivos en realidad son inhibidores mixtos es decir no slo se afecta la unin del sustrato sino tambin la conversin del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km. Sin embargo, la grfica de dobles recprocos muestra que adems de que se afectan ambos interceptos las curvas en ausencia y presencia de inhibidor se intersectan en el segundo cuadrante (Figura 3.5).

Referencias
Bennett NG, Gutfreund H. 1973. The Kinetics of the interconversion of intermediates of the reaction of pig muscle lactate dehydrogenase with oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide and lactate. Biochemistry Journal 135, 81-85.

Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190. Localizacin QP514.2 Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49. Lehninger, A.L. 2005. Principios de Bioqumica. 4 edicin. Editorial Omega. Barcelona. pp. 191-237. Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43 Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de CV., 2002, pP185 Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
Sitios recomendados para 1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que se te hacen. http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm

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ANEXO I: DEDUCCIN DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN Para llegar a la descripcin de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato descrita por Michaelis-Menten se tuvieron que realizar algunas consideraciones, debido a que existen varios pasos intermedios de la reaccin, todos reversibles y a que la velocidad de formacin de cada una de las especies involucradas depende no solo de su concentracin sino tambin de las constantes de velocidad (k1, k-1, k2, k-2, kp, k-p) y que se encuentran en la siguiente reaccin.

Las simplificaciones y suposiciones para obtener la curva matemtica que mejor se ajusta a los datos experimentales fueron las siguientes: 1. Suponer que hay un complejo central (ES), esto es que ES se rompe directamente en E + P.

Simplificndose la reaccin a dos pasos: Paso 1. Formacin de ES que depende de: A) La velocidad de formacin

v1=k1[S] [E] v-1=k-1[ES] vp=kp[ES] v-p=k-p[E] [P]

B) La velocidad de disociacin Paso 2. Formacin de productos que depende de: A) La velocidad de formacin B) La velocidad de disociacin

2. Asumir que la reaccin reversa (PS) es despreciable. La reaccin es termodinmicamente factible y podemos establecer condiciones experimentales que minimicen la reaccin reversa, por ejemplo aadiendo una enzima que convierta P en otra especie como Q y que est no reaccione con nuestra enzima. O bien podemos medir la velocidad de reaccin a tiempos muy cortos en donde la reaccin reversa es insignificante. Lo anterior nos simplifica la reaccin:

De tal forma que la velocidad a tiempos cortos correspondera a la velocidad inicial de reaccin y quedara expresada como sigue: 28

Pero para formar el producto debemos considerar que tan rpido se rompe el complejo ES, quedando descrito en los dos siguientes pasos: Paso 1. En la formacin del complejo ES debemos considerar:

[E]total= [E] + [ES]

entonces

[E]= [E]total-[ES] V formacin ES = k1 [S] [E]

sustituyendo E en la ecuacin de velocidad de formacin de ES resulta:

V formacin ES = k1 [S] ([E] total -[ES])

Paso 2. Ruptura del complejo ES:

Velocidad de ruptura ES = v-1+vp

Sustituyendo las velocidades

Velocidad de ruptura ES = k-1[ES] +kp[ES]

3. Suposicin del estado estacionario de Briggs Haldane.

Figura A.1. Cambios en las concentraciones de las especies involucradas en la catlisis. En el estado estacionario la concentracin del complejo ES se mantiene pequea y constante. 29

En el modelo cintico del estado estacionario, hay un intervalo de tiempo durante la catlisis enzimtica en el que la concentracin del complejo ES es constante (Figura A.1), por lo tanto la velocidad de formacin del complejo ES es igual al de su disociacin:

Despejando [ES]

rearreglando

Si regresamos a la ecuacin de velocidad inicial obtenemos lo siguiente:

y sustituimos ES,

4. Por ltimo si se considera que la [S] >> [E] (Figura A.1) la interaccin de S con E para formar ES no afecta significativamente la [S]. La enzima est saturada de sustrato y

Entonces podemos definir la velocidad mxima de la enzima o Vmax como:

Si sustituimos en la ecuacin de velocidad inicial tendramos que:

Agrupando las constantes:

Sustituyendo Km en la ecuacin de velocidad inicial se obtiene la ecuacin de Michaelis-Menten:

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4. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO I: CONJUGACIN

Introduccin Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, covalentemente cerrados y generalmente, de tamao pequeo que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios para la viabilidad de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a la sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibiticos o a metales, por ejemplo. Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin relajada", esto es, estn presentes en muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin. Una bacteria slo puede adquirir un plsmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por transmisin vertical (es decir, de clula progenitora a clula hija) o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal de material gentico. Estos son: la transformacin, la transduccin y la conjugacin. En la transformacin, el DNA liberado de una clula bacteriana entra a otra clula, generalmente de la misma especie. En la transduccin, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o de un plsmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias. La conjugacin bacteriana es un proceso de transferencia de material gentico en el que la informacin gentica de un plsmido es transferido a otra clula. Este proceso, a diferencia de la transformacin, tiene como condicin esencial el contacto celular. A la clula que aporta el material gentico se le llama donadora y a aqulla que lo recibe, receptora. No todos los plsmidos pueden transmitirse por conjugacin, es decir ser conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro de este grupo de plsmidos se encuentra el factor de fertilidad o plsmido F de E. coli. El plsmido F confiere a la clula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra clula que no lo posea. Este plsmido se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano y tiene la capacidad de integrarse a ste. Cuando se integra suprime su sistema de replicacin y se replica como parte del cromosoma. El plsmido F contiene ms de 40 genes tra, la mayora de los cuales son necesarios para la construccin de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una protena, la pilina, codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las bacterias donadora y receptora y para la formacin de un puente citoplasmtico para la transferencia del material gentico. La transferencia se inicia a partir de un sitio especfico en el plsmido y que forma parte de los genes tra, denominado oriT. Algunos plsmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugacin por s mismos, pero pueden ser transferidos (plsmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plsmidos con genes tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes 31

mob, los cuales incluyen un sitio oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugacin, incluyendo los que codifican para la formacin del pili. En relacin al plsmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: Cepa F-. Clula bacteriana que no posee un plsmido F, y que acta como clula receptora en la conjugacin. Cepa F+. Clula bacteriana que posee un plsmido F independiente del cromosoma bacteriano, acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere al plsmido F a la clula receptora (F-) transformndola en clula F+. Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plsmido F integrado a su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (clula donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinacin. No transfieren el plsmido F, por lo que al trmino de la conjugacin la clula receptora permanece como F-. Cepa F. Clula bacteriana que posee un plsmido F extracromosmico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que se escindi llevando consigo genes bacterianos. Acta como clula donadora en la conjugacin y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la clula receptora en una clula F , la cual ser un diploide parcial o merocigoto. Esto quiere decir que tendr dos copias de los genes bacterianos que estn presentes en el plsmido F . A ese tipo de transferencia se le conoce como sex-duccin. Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una clula F- en un tiempo constante. Se calcula que la transferencia de todo el cromosoma de Escherichia coli de una bacteria a otra tarda aproximadamente 100 minutos. Esta caracterstica ha sido utilizada en el mapeo gentico, ya que permite localizar un determinado marcador gentico (es decir, una caracterstica determinada) en un tiempo dado. En esta prctica se comprobar la conjugacin bacteriana mediante la transferencia de un marcador gentico: la resistencia a la kanamicina. El marcador gentico de seleccin que se utilizar para la cepa receptora ser la resistencia a la estreptomicina.

Investiga: Qu es y para qu se utiliza un marcador gentico de seleccin?

Referencias Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467. Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272. Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002. 32

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN

Introduccin Desde pocas antiguas, el ser humano ha seleccionado animales y plantas con caractersticas fenotpicas deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la produccin de insumos para consumo humano. Por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en promedio 2000 a 3000 litros de leche al ao; actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al ao, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 aos produca en promedio 70 huevos al ao, mientras que en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al ao. Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, produce la mula, que es estril. As, el nmero de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse slo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados. Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, es decir, con la ingeniera gentica. Debido a que el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente igual para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos no relacionados y producir organismos con caractersticas tiles y particulares, que de otra manera sera imposible obtener: los denominados organismos transgnicos. Actualmente se ha identificado y caracterizado un gran nmero de genes. Este conocimiento abre la posibilidad de buscar mtodos para introducir o modificar un gene que proporcione una caracterstica deseable, como por ejemplo, curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes no propios al husped, se pueden ocasionar efectos indeseados, por ejemplo, que la caracterstica introducida lleve a una alteracin en el metabolismo, en la sealizacin y, por tanto, modifique la fisiologa y sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera indiscriminada a otros organismos. Requisitos para construir un vector de clonacin An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un organismo genticamente modificado se debe producir o construir un transgene, que consiste en el gene de inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la funcin del gene en el nuevo husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una regin promotora en el extremo 5 del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor. Recordando que la regin promotora es un segmento de DNA localizada ro arriba de la regin 5 del gen y que acta como un elemento que controla la expresin del gen. Asimismo, 33

se debe aadir una secuencia de poli A en la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda ser traducido. Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en esta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters ( inserto) se denomina molcula vector recombinante.

Figura 4.1. Vector de clonacin pET-24a. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1 ori, origen de replicacin f1 y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lac I. Los vectores usualmente presentan ms de un origen de replicacin, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori es el origen de replicacin usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla. Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido debe poseer al menos tres caractersticas (Figura 4.1): 1) 2) Tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero. Tener un sitio de clonacin mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin deseada. Poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de 34

3)

resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibitico. Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas circunstancias metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresin, denominados promotores fuertes, que tambin pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento. Transformacin Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector, o mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformacin de plantas). En el caso de la transformacin de bacterias, generalmente se introduce el DNA ajeno por microelectroporacin o por choque trmico. Durante el choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre estos se encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga elctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lpidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que disminuye la repulsin de cargas elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la membrana y adems facilita la entrada del plsmido al interior celular. Las clulas que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introduccin de material gentico se denominan clulas competentes. Una vez que se introduce el material gentico a las clulas competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al colocar a las clulas en condiciones ptimas de crecimiento se obtienen las clulas transformantes. Referencias Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localizacin QP514.2 Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442. Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. QH345 L43 Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein science. A.4D.1-A.4D.2. Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45. Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Revert, pp.745-773. http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/ http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinacin de eficiencia de la transformacin) 35

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: AISLAMIENTO DE PLSMIDOS

Introduccin Desde finales de la dcada de los aos 70 del siglo pasado, se desarroll un gran nmero de mtodos de aislamiento de plsmidos. La mayora toma en cuenta las diferencias topolgicas (es decir, su acomodo en el espacio) entre los plsmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, as como el tamao de ambos. Cuando los puentes de hidrgeno entre las cadenas complementarias del DNA del plsmido circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento entre las dos cadenas no se perturba grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plsmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rpidamente, ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solucin, la fidelidad de la reasociacin es diferente para ambas macromolculas. La renaturalizacin de los plsmidos circulares es rpida debido a que las cadenas estn prximas, mientras que las molculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensin por centrifugacin. El plsmido permanece en la solucin y puede ser precipitado con alcohol despus de que el DNA cromosomal ha sido removido.

Referencias Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773. Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin, WH Freeman.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: ENSAYOS DE RESTRICCIN DE PLSMIDO.

Introduccin Las endonucleasas de restriccin o tipo II se caracterizan por su habilidad para reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la molcula de DNA. Si bien existen tres tipos de endonucleasas con caractersticas de reconocimiento y de corte del DNA distintas, son las del tipo II son las que se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar directamente la secuencia que reconocen y a que no modifican la secuencia blanco. Las endonucleasas se denominan enzimas de restriccin, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasin por bacterifagos, es decir, restringen la invasin por el DNA viral. Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en 36

posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos romos (Figura 4.2).

EcoRI

HindIII

HaeIII

Figura 4.2. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas que van desde un nucletido hasta cientos de bases, as como en la introduccin de secuencias ajenas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas recombinantes. Existen diferentes factores que afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta concentracin de sales. Los efectos de la contaminacin pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima aadida a la reaccin, arriba de 10 a 20 U / g DNA, incrementando el volumen de reaccin, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duracin de la incubacin. La digestin del DNA genmico por estas enzimas puede facilitarse por la adicin de policationes como espermidina, que acta uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plsmido est superenrollado es necesario aadir ms enzima o bien, desnaturalizarlo. El tratamiento de una molcula de DNA con enzimas de restriccin permite producir fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los nucletidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el electrodo positivo o nodo. Cuando la migracin ocurre en un gel, las molculas de DNA se separan de acuerdo a su tamao, porque las molculas pequeas se mueven ms rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes. Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restriccin. Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin 37

se denomina mapa de restriccin. El anlisis de los mapas de restriccin constituye una importante herramienta para localizar secuencias de bases especficas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados. Existen varias aplicaciones de los mapas de restriccin, como la obtencin de los patrones de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) u tilizados en las pruebas de paternidad, as como tambin en la identificacin de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabello, etc. Referencias Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2 Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-317. Localizacin QH345 L43 Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: INDUCCIN DE PROTENA RECOMBINANTE

Introduccin La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular protenas. Los sistemas bacterianos han sido los ms utilizados para este fin, debido a que son fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos y se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatizacin en proyectos de produccin a gran escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas. A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las protenas de eucariontes o las protenas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (protenas que se unen a las protenas recin sintetizadas), as como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-trasduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin, como los sistemas de clulas de mamfero, de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las protenas eucariontes de manera 38

correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo de estos sistemas es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms complicada. Adicionalmente, la produccin de grandes cantidades de protenas, como algunos productos teraputicos, se puede lograr tanto en plantas como en sistemas animales. Muchas compaas ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresin muy variadas, con o sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin de la protena deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.

Figura 4.3. Mecanismo de accin del IPTG en la expresin de protena mediada por el vector pET.

Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de protenas heterlogas en E. coli. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de expresin fuerte del promotor del bacteriofago T7, quin controla la alta expresin de la RNA polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de la protena de inters, se tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el isopropil -D tiogalactosido (IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del opern de la lactosa (Fig. 4.3). El IPTG se une a la protena represora, ocasionndole a la protena un cambio conformacional que le impide su funcin biolgica de unirse al DNA. La actividad biolgica de la protena represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo en el caso del vector pET la transcripcin del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripcin del transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represin del gen es denominado induccin, por lo que el 39

IPTG es llamado inductor. El gen que codifica para la protena represora se encuentra incluido en el vector, LacI, y su transcripcin ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9). As a pocas horas de induccin, la formacin del producto, es decir, de la protena deseada, puede llegar a ser ms del 50% de la protena total en la clula.

Como se mencion anteriormente, la produccin de la protena recombinante en un organismo no relacionado puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque no se pleg adecuadamente, provocando su aglomeracin. Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo pueden solubilizarse a travs del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de inclusin. En este caso, aumentan los costos de produccin y/o recuperacin de la protena. Referencias Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442. Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE. LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in Protein Science 5.1.1-5.1.8. Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45. Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.

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5. REGULACIN DEL METABOLISMO PARTE I: REGULACIN GENTICA EN EL OPERN lac

Introduccin La regulacin metablica es el incremento o el decremento de una reaccin enzimtica o de toda una secuencia de reacciones enzimticas de las rutas metablicas. La regulacin surge de la necesidad de la clula de estar en equilibrio. La clula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimticas a travs, principalmente, de la modificacin de la actividad de las enzimas que contiene. Dado que cada clula tiene un gran nmero de enzimas, el control se lleva a cabo a travs de algunos mecanismos globales de regulacin metablica. Uno de estos mecanismos globales de regulacin involucra el aumento o disminucin de la concentracin de enzima por medio de la regulacin de la expresin gentica. El DNA de una clula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. Sin embargo, slo una parte de esta conformacin gentica es requerida por la clula en todo momento (expresin constitutiva).Existen genes con una funcin ms especializada y cuya participacin slo es requerida por la clula bajo ciertas circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de regular la expresin de sus genes. En el caso de las bacterias, la regulacin de la expresin gentica les permite responder metablicamente a los cambios en su ambiente de manera rpida y precisa. Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulacin de la expresin gnica en bacterias fueron propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, junto con Andr Lwoff, compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teora del opern. Un opern se define como un conjunto de genes que pueden regular su propia expresin dependiendo de la presencia o ausencia de un sustrato. El opern de la lactosa se requiere para el transporte y metabolismo del carbohidrato lactosa en Escherichia coli. El opern est formado por tres componentes: un gen regulador, un centro de control (operador y promotor) y los genes estructurales (Fig. 5.1A). El gen regulador (el gen lacI) no se encuentra adyacente al opern, y su producto proteico tiene funcin de represor al unirse al operador, localizado entre el promotor y lacZ. El operador es una secuencia de DNA que de hecho, se encuentra traslapada en la secuencia del promotor (Fig. 5.1B). El promotor es la secuencia que determina el inicio de la transcripcin de la RNA polimerasa. Cuando el represor o protena represora esta unido al operador, la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y por lo tanto no hay transcripcin de los genes estructurales (Fig.5.1C). Los genes estructurales son lacZ, lacY y lacA, que codifican para las enzimas galactosidasa, permeasa y transcetilasa respectivamente. Todos ellos se transcriben en una sola molcula de RNA mensajero (RNA policistrnico, es decir, que contiene la informacin para codificar varias protenas), 41

Figura 5.1. Componentes del opern de lactosa y su funcin. A. Genes que componen el opern de lactosa. B. Secuencia de DNA en la que se encuentran traslapadas las secuencias del promotor con el operador (secuencia sombreada).C. En ausencia de lactosa la protena represora se une al operador impidiendo la unin de la RNA polimerasa por lo que la transcripcin de los genes estructurales no ocurre.

Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas molculas de sta y las convierte en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que ste se pegue al operador. La subsecuente unin de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripcin de los genes estructurales y la posterior traduccin en las enzimas necesarias para la utilizacin de la lactosa como fuente de carbono y energa. Cuando se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador bloqueando la expresin de los genes estructurales. La presencia o ausencia de la lactosa no es el nico factor que influye sobre la expresin del opern de la lactosa. Si la clula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus requerimientos energticos, no necesita metabolizar lactosa an cuando est presente, entonces lleva a cabo un proceso denominado represin catablica, que involucra a una segunda protena reguladora, CAP (protena activadora de catabolito), y un segundo sitio de unin, el sitio CAP, adyacente al promotor. La CAP se une al sitio CAP slo en presencia de AMP cclico (AMPc), un nucletido modificado derivado del ATP por la adenilatociclasa. La cantidad de AMPc en la clula 42

depende de la concentracin de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la adenilato ciclasa. Si los niveles de glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP bajos). Al controlar la cantidad de AMPc en la clula, la glucosa indirectamente regula la unin del complejo CAP-AMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc est unido, se estimula la unin de la RNA polimerasa al promotor (regulacin positiva), lo que ocasiona la transcripcin de los genes estructurales del opern de lactosa. Referencias Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localizacin QP514.2 Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. Localizacin QH581.2 M 65 Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opernlac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002. Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp. 51-71. Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125. Localizacin QH581.2 M 65 Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.

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