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DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE
AMÉRICA)
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“Todos hacemos uno, todos hacemos
bioquímica, pero somos pocos los que la
practicamos….”
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que
provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
Cromatografía de adsorción, Cromatografía de reparto, Cromatografía iónica,
Cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se hace mención a la
instrumentación que constituye la Cromatografía Liquida de Alta Presión y se
hacen sugerencias para su correcto empleo en otras investigaciones
similares que se realicen en el futuro.
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Palabras clave: Cromatografía Líquida de Alta Presión,
orgánicos, fases inmiscibles, fase fija, fase móvil, cromatografía
líquida, micrones, Cromatografía de adsorción, Cromatografía de
reparto, Cromatografía iónica, Cromatografía de exclusión.
SUMMARY
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his(her,your) correct employment in other similar investigations(researches)
that are realized in the future.
ÍNDICE
♣ Leyenda…………………………………………………………….Pág. 2
♣ Resumen…………………………………………………………Pág 3
♣ Palabras Claves …………………………………………………. Pág 3
♣ Summary………………………………………………………. Pág. 4
♣ Keywords ……………………………………………………. Pág. 4
♣ Introducción ……………………………………………………Págs.6 - 7
♣ Objetivos……………………………………………………..Pág. 8
♣ Marco teórico ……………………………….……………….Págs. 9- 45
♣ Conclusiones …………………………………..………………Pág. 46
♣ Bibliografía………………………………………………… Págs. 47-48
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INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar
los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es
distribuida entre dos fases inmiscibles (sólida, líquida o gas), una estacionaria
y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un
contacto íntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla
es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la
mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las
fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor
parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras
que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda
retenido y su salida es mucho más lenta.
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La cromatografía es un proceso de separación muy común en ingeniería
química y bioquímica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de
distinguir y separar componentes con características físicas y químicas muy
similares. Esta técnica se considera importante tanto a nivel de producción
como de análisis.
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en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan
con la concentración.
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OBJETIVOS
MARCO TEÓRICO
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Cromatografía Liquida de Alta Performance
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Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones
pasan a través de arcilla, rocas, etc. La cromatografía como tal adquiere
importancia cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas,
descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se
depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como el
papel.
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en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue
disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genero la necesidad
de utilizar altas presión es para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera,
nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas. Ver figura 2.
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Ventajas Desventajas
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personal que utiliza estos métodos tenga experiencia para poder obtener
provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser
operador eficiente.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca
la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas
químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es
el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas
mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.
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2) Cromatografía de fase químicamente unida (CFQU)
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y
la alúmina, siendo la primera la preferida.
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Separa solutos según el peso molecular
La fase fija está formada por partículas de sílice que contienen una red
uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño
tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son
eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a
todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce
que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las
grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente.
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5) Cromatografía por intercambio iónico o CII
Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que
existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos,
grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del
soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados
negativamente que atraen cationes del soluto.
INSTRUMENTACIÓN
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• Depósito de disolvente
• Bomba
• Puerto de inyección
• Columna
• Detector
• Sistema de Adquisición de Datos
El depósito que mantiene la fase móvil a menudo no es más que una botella
de vidrio. A menudo, el frasco de reactivos que posee nuestro disolvente HPLC
puede ser utilizado como un depósito. Disolvente se entrega del depósito a la
bomba por medio de tubos de teflón - denominada "línea de entrada" a la
bomba. Algunos sistemas como el HPLC tienen compartimentos especiales
para calibrar uno o más reservorios de fase móvil. Los depósitos en estos
sistemas pueden tener funciones adicionales que permiten la fase móvil a
desgasificar y aislados de contacto con el aire.
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• No cierre la botella demasiado o eliminación de la fase móvil por la
bomba va a crear un vacío. Esto evita que fluya la fase móvil de la
bomba, la creación de un "bloqueo de vapor" en la bomba
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sustitución de válvulas de la bomba focas. Esta parte de la bomba, la bomba
se llama cabeza.
Sección transversal de un
simple diagrama de una sola
bomba de pistones
alternativos
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• que impiden una buena análisis cuantitativo
• dan lugar a principios de la columna fracaso.
Otro enfoque común combina el flujo de salida de dos cabezas que operan
180 grados fuera de fase, de modo que la admisión de una cabeza de entrega
coincide con el trazo de la segunda cabeza. Esto significa que, si bien es un
cilindro de la bomba de llenado del cilindro, el segundo cilindro está
cumpliendo la fase móvil. Entonces, cuando la segunda recarga, proporciona
el primer cilindro. Podemos combinar estas dos corrientes de alimentación de
salida de cada bomba en un té que se conecta con el sistema de CLAR. Ahora,
el flujo combinado de ambos jefes ofrece una apariencia mucho más suave,
menos el flujo pulsante de la LC sistema. La línea de entrada del depósito
también se alimenta a un té que ambas ramas para alimentar a los cilindros
de la bomba. Bomba de pulsaciones se puede reducir aún más especial por
leva formas, variando la velocidad de la bomba de motor, y por el uso de
amortiguadores de pulso.
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Otro enfoque para la reducción de la bomba de pulsaciones de
mantenimiento de la bomba, mientras que el diseño es bastante simple pistón
bomba Tándem. Un gran y un pequeño pistón / cilindro unidad se combinan
para proporcionar el flujo continuo de fase móvil de la bomba. Si bien el gran
pistón llena, el pequeño pistón ofrece. Cuando se llena el pequeño pistón, el
gran pistón ofrece suficiente fase móvil a la vez llenar el pequeño pistón y
proporcionar un flujo neto de la fase móvil a la LC sistema. Observe que
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completamente lleno. Hay dos tipos de inyectores de la disposición. La
ventaja de llenado parcial es la posibilidad de utilizar pequeñas cantidades de
muestra, cuando hay escasez de la muestra. La precisión de la inyección es
de 1% de RSD y de compensación de remanentes <1%.
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5. Tubos y Accesorios
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con "microbore" columnas; tubos más grandes sólo deben utilizarse con
preparativa columnas
Al volver a una instalación existente (al cambiar las columnas, por ejemplo),
la tuerca debe apretarse el dedo apretado y, a continuación, snugged
ligeramente con una llave para evitar fugas.
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Nota la diferencia en la distancia desde la parte inferior de la virola hasta el
final del tubo en estos tres extremos del tubo montado con los accesorios de
diferentes fabricantes.
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Si se desconecta la columna final del montaje, podemos ver las fritas en la
parte superior de la columna. Este fritas pueden ser removidos y
reemplazados con un nuevo fritas si se convierte en la antigua fritas
conectado. Sin embargo, si hacemos esto, tenemos que ser muy cuidadoso.
Si la columna de embalaje en la entrada se ve perturbado, podría arruinar la
columna permanente.
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¿Cómo funciona el Detector de trabajo? En la mayoría de los casos
que vamos a utilizar un detector fotométrico, comúnmente llamado detector
de UV. En su forma más simple, se trata de una fuente de luz, una celda de
flujo (o "muestra de células"), y un sensor de luz, como se muestra en la
derecha
Los De longitud de onda variable detectores son menos costosos, son el tipo
de detector de nivel de análisis cuantitativos y ensayos de rutina. Los de
Fotodiodo gama son más versátiles, porque permiten la adquisición
simultánea de ambos y de cromatografía de información espectral, que se
utilizan habitualmente en el método de desarrollo.
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puede resultar en disminución de tamaño de pico, o incluso no en todos los
picos
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como "Unidades de Absorbancia escala completa" (AUFS). La figura de la
derecha ilustra el efecto de un cambio en la atenuación. Como el ajuste es el
aumento de la atenuación (AUFS se reduce), se convierte en el detector más
sensible, y todos los picos de aumento de tamaño
En muchos sistemas, el rango o la atenuación se puede establecer ya sea en
el detector o en el propio sistema de datos. Si la atenuación o la gama se
encuentra en el sistema de datos, por lo general afecta sólo a la pantalla. No
cambia la forma de cuantificación se lleva a cabo porque no cambia la
información presentada en el sistema de datos. Si la atenuación o la gama se
sitúa en el propio detector sin embargo, es posible que el gran tamaño de los
picos puede superar las capacidades de los datos del sistema
Otro ajuste es el detector de Base Cero (a veces llamado el "Cero offset").
Mover este ajuste (que se muestra a la derecha) se limita a desplazar la
totalidad del cromatograma arriba o hacia abajo en la pantalla. Al igual que
con la atenuación de configuración, si se ajusta el cero en el sistema de datos,
que sólo afecta a la pantalla; cuantificación se mantiene sin cambios. Si la
línea de base cero se cambia en el detector en sí, la integración puede verse
comprometido si la base de referencia se compensa suficientemente bajo para
enviar una señal de voltaje negativo a los datos del sistema (la mayoría de los
sistemas de datos sólo puede tratar con señales de voltaje positivo).
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HPLC, Detector RI UV / VIS Fluor MS
de
Respuesta Universal Selectiva Selectiva Selectiva
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APLICACIONES
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En cromatografía líquida el análisis de compuestos vitamínicos es
posible en corto tiempo.
INTRODUCCIÓN
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Ácido
Dentro de las principales B Caroteno
funciones de la vitamina A encontramos la
Retinoioo
protección de la piel y su intervención en el proceso de visión de la
retina. También participa en la elaboración de enzimas en el hígado y de
hormonas sexuales y suprarrenales. El déficit de vitamina A produce
ceguera nocturna, sequedad en los ojos y en la piel, y afecciones
diversas de las mucosas.
Mientras que por otro lado el exceso de este puede provocar
alteraciones óseas y hemorragias en diversos tejidos.
DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA A
MATERIALES Y METODOS
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A. EQUIPO
B. CONDICIONES DE OPERACIÓN
Sistema isocrático
Flujo 1,2 mL/min
Volumen de inyección
20ml
Detección UV 242 nm
Temperatura de horno
Ambiente
Tiempo de corrida 7
min
Fase móvil: metanol al
100% grado HPLC.
C. REACTIVOS
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D. PROCEDIMIENTO
E. CÁLCULOS
Donde:
Am (Area del pico de vitamina A en la muestra)
As (Area del pico de vitamina A en el estándar)
Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml)
D (Factor de dilución)
Wm (Peso de la muestra, g)
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F. RESULTADOS
(CV de 3,62%); el CV de
reproducibilidad fue
2,70 % vs. el obtenido
por el método oficial (de
9,72%).
Los resultados de la
precisión del sistema,
basados en la variación
del tiempo de retención,
área y altura; se
muestran en la Tabla 1.
La recuperación
obtenida fue de 97,98%
Vs. la obtenida por el método oficial de la AOAC (de 98,8%).
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La especificidad del método se muestra en la Figura3, donde se
observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada
extracción del analito, y además se muestra la comparación del
espectro del estándar puro vs. el espectro del analito en la muestra.
G. DISCUSIÓN
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por lo que deben almacenarse en frascos ámbar o cubiertos con
papel platino o su equivalente.
La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y
la oxidación, evitándose la luz solar directa y la luz brillante. La
iluminación artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes
dorados ó equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el
procedimiento deberían realizarse en material de vidrio ámbar para
prevenir la degradación.
Dado que el calor también contribuye a la isomerización o a una
posterior alteración de las vitaminas, debería evitarse el calor
innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la
evaporación de los solventes se realice lo más suave posible
utilizando un evaporador
rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento
adecuado de los condensadores y un vacío óptimo. [8]
H. CONCLUSIÓN
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INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
Diclorometano Agua
Cloroformo Acetonitrilo
Acetato de etilo Metanol
Cromatofolio de Fosfato básico de
Silicagel 60 F254 potasio
(Merck) (20 x10) Fosfato dibásico de
sodio anhídrido
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muestra de referencia, y por los datos
publicados.[10]
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
CALIBRACIÓN
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MÉTODO ANALÍTICO
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separaciones se y fueron aplicado
trabajó con una 20ml de cada
columna Ultrasphere muestra. Todas las
ODS (Beckman, separaciones se
150X4.6 mm, 4mm) llevaron a 30ºC. Los
y guarda – columna picos fueron
(ODS). La fase móvil asignados por
consistió de superposición con las
Acetonitrilo(A) y de muestras estándares
un buffer fosfato y por comparación
10nM (B) ajustado a con los tiempos de
p H 7.0, en la retención y espectros
longitud de UV.
detección a 245 nm
RESULTADOS
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inequívoca de éstos
por CCD.
Los cromatogramas
de una muestra de
Uncaria tomentosa
estándar y de una de
las muestra
analizadas (M6). Los
alcaloides pudieron
ser separados con
una resolución no
menor del 90% para
la isopteropodina y
el alcaloide 4, a una
temperatura de 30ºC
en un tiempo de
30min.
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El límite de detección encontrado fue de 0.07 mg/ml para
el compuesto estándar Isopteropodina.
Para la extracción de los alcaloides se ha evitado el uso de
ácido-base, pues está comprobado que produce su
isomerización. La extracción con solución extractante por 5
veces por sonificación cada vez, asegura una extracción
total de los alcaloides
3. DETERMINACION DE TOCOFEROLES POR HPLC EN
ACEITE DE QUINUA (Chenopodiun quinoa) Y KAÑIWA
(Chenopodium pallidicaule)
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y METODOS
A. ESTANDARES
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Tocoferol pureza 99.9% preparada a una
concentración de 40ppm en hexano.
Tocoferol pureza de 99.9 % preparada a una
concentración de 40ppm en hexano.
B. MUESTRA
C. CONDICIONES
Solvente A: Metanol
Solvente B: Acetato de etilo
Velocidad de flujo de la fase móvil: 1,5 mL/min
Detector: Espectrómetro de Fluorescencia.
D. TECNICA ANALÍTICA
E. RESULTADO
Para quinua :
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de 797.2 ppm de g tocoferol y 721.4 ppm de a tocoferol
Para kañiwa:
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Cromatograma obtenido en la determinación de a y g
tocoferoles por HPLC en el aceite de kañiwa
50
Cromatograma estándar en la determinación de a y g
tocoferoles por HPLC
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CONCLUSIONES
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
53
[6] “HPLC Data Systems”. 16 de Abril 2008.
<http://74.125.67.132/translate_c?hl=es&langpair=en%7Ces&u=http:
//www.lcresources.com/resources/getstart/2f01.htm&prev=/translate_
s%3Fhl%3Des%26q%3Dhplc%2Binstrumentacion%26tq%3DHPLC%2B
instrumentation%26sl%3Des%26tl%3Den&rurl=translate.google.com
&usg=ALkJrhh29iniyE8AblvXTOOT2a_N7rTwwg>.[Consulta: 27 junio del
2009]
[13] Clara Raquel Espinoza Silva, Ritva Repo Carrasco Valencia, &.S-
E. Jacobsen. “Determinación de Tocoferoles por HPLC En Aceite
De Quinua (Chenopodiun Quinoa) Y Kañiwa (Chenopodium
Pallidicaule)”. Organización de Las Naciones Unidas para La
Agricultura y La Alimentación. Disponible en:
<http://www.rlc.fao.org/es/agricultura/produ/cdrom/contenido/libro14/
cap5.9.htm.>[27/06/2009]
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