Frotiul de sânge

 Frotiul este un preparat microscopic care se

realizează prin etalarea materialului biologic în
monostrat pe lame portobiect. Aceste preparate
se efectuează din sânge, din secreţii (mamare,
bronşice, vaginale), din celule provenite din
descuamări epiteliale sau exfoliere şi din
sedimente celulare (urină, suc gastric, bilă, LCR,
lichid de ascită sau lichid pleural). Indiferent de
materialul biologic utilizat, tehnica frotiului este o
metodă des utilizată în citologie, devenind
prioritară atât în domeniul cercetării biologice cât
şi ca procedeu diagnostic în practica medicală.
 Examenul morfologic al elementelor celulare se
face pe:
 preparate proaspete necolorate
 Metoda : Pentru examinarea elementelor
celulare sanguine pe preparate proaspete
necolorate, se recoltează cea de a doua picătură
de sânge apărută după puncţionare, pe partea
centrală a unei lame portobiect degresată, se
acoperă cu o lamelă şi se examinează imediat la
microscop.
 Rezultate : hematiile apar colorate galben-
verzui, aşezate în fişicuri, leucocitele apar ca
celule mai mari decât hematiile, mai rare şi mai
strălucitoare.
 preparate proaspete colorate supravital
 Metoda : Pentru examinarea preparatului
proaspăt colorat supravital, se procedează ca în
cazul preparatelor proaspete necolorate,
adăugându-se la marginea lamei portobiect, o
picătură de albastru de metilen. Colorantul
pătrunde prin capilaritate.
 Rezultate: Nucleii leucocitelor şi unele din
granulaţiile acestora, se colorează în albastru.
 preparate permanente, fixate şi colorate prin
tehnici de colorare obişnuite sau speciale,
cea mai des folosită fiind tehnica May
Grünwald Giemsa.
Materiale necesare:
 lame obişnuite degresate (se
spăla cu apă şi detergent,
apoi se degresează cu
alcool-eter)
 lame rodate
 ace sterilizate
 mănuşi de protecţie
 alcool, tampoane de vată
 hârtie de filtru
 stativ pentru aşezarea
lamelor
Efectuarea
frotiului permanent:
1. Recoltarea sângelui
 La adult se face prin puncţionarea părtii laterale a
pulpei mediusului sau inelarului de la mâna stângă.
Se dezinfectează pulpa degetului cu un tampon de
vată îmbibat în alcool, se puncţionează locul
dezinfectat cu un ac steril, având grijă să se
perforeze numai pielea, fără a se pătrunde prea mult
în adâncime. Se şterge prima picătură de sânge
apărută la locul înţepăturii, prin tamponare cu o hârtie
de filtru, deoarece conţine prea mult lichid interstiţial
şi impurităţi de pe piele. La noul născut şi la copilul
mic, locurile de puncţie sunt: tegumentul lobului
urechii şi pielea călcâiului.
2. Efectuarea frotiului permanent
 A doua picătură se recoltează cu marginea mică a
unei lame rodate şi se aplică pe una din extremităţile
unei lame portobiect, aşezată orizontal pe o suprafaţă
plană. Pentru recoltarea celei de a doua picături, se
poate chiar exprima (stoarce) pulpa degetului,
deoarece în rezultatul final formula leucocitară şi
aspectul morfologic al elementelor figurate sanguine
nu sunt influenţate de cantitatea de plasmă. Cu lama
şlefuită pe a cărei latură mică s-a recoltat picătura de
sânge, se imprimă picăturii câteva mişcări de
lateralitate pe o lamă portobiect, pentru ca sângele să
se întindă pe toată linia de contact. Se imprimă apoi
lamei rodate o unică mişcare de translaţie în lungul
lamei portobiect. Se recomandă ca unghiul realizat
între cele două lame să fie de 30-35 grade
3. Fixarea frotiului permanent
 Se realizează prin :
 metode fizice- uscare (desicare) la
temperatura camerei, prin agitarea lamei
pentru a se obţine o uscare rapidă
(uscarea lentă duce la ratatinarea
celulelor).
 metode chimice– cu alcool metilic timp
de 2 minute sau alcol etilic şi eter în părţi
egale, timp de 5-15 minute.
 ! Executarea unui
frotiu permanent
corect depinde de :
 -mărimea picăturii de
sânge
 -unghiul dintre lama
rodată şi lama
portobiect să fie de 30-
35 grade
 -viteza de întindere : la
viteză mare se obţin
frotiuri groase.
 ! Frotiul permanent corect executat trebuie să
îndeplinească următoarele condiţii :
 să fie omogen
 să fie subţire
 să aibă margini drepte
 să fie mai mic decât suprafaţa lamei
 să aibă culoare roz-cărămiziu după uscare
 să se termine în franjuri

Frotiu corect executat
 Nu se utilizează frotiurile care nu îndeplinesc condiţiile
mai sus arătate.
 În practica medicală se notează numele celui de la care
s-a recoltat produsul pe un capăt al lamei, cu un ac
subţire sau cu creionul.
Tehnica colorării frotiului
sanguin permanent
 Frotiurile de sânge se pot
colora cu tehnici de colorare
obişnuite (hematoxilin-eozină,
tricromic) sau cu tehnici de
colorare speciale. În practica
medicală curentă se foloseşte
tehnica de colorare panoptica
May Grünwald Giemsa.
Materiale necesare
 -cutii Petri sau cristalizoare cu capac
 -suporturi de sticlă sub formă de “u” sau “v”.
 -soluţie May Grünwald (eozinat de albastru de
metilen, colorant neutru, dizolvat în alcool
metilic pur, neutru)
 -soluţie Giemsa concentrată (amestec de
eozinat de azur de metilen, azur de metilen,
glicerină neutră, alcool metilic)
 -apă bidistilată
 -cilindru gradat
 -pipete
Tehnica de colorare
1. Pe lamelele aşezate cu frotiul în sus se picură 10-15
picături din soluţia May Grümwald pentru a acoperi
toată suprafaţa frotiului. Se lasă 2-3 minute, timp în
care se produce o fixare a frotiului, alcoolul metilic
din coloratul May Grünwald acţionând ca un fixator.
2. Se toarnă apoi peste soluţia May Grünwald, un număr
egal de picături de apă distilată neutră. Soluţia May-
Grünwald diluată acţionează ca un colorant, colorând
granulaţiile acidofile şi bazofile. Se lasă 1-2 minute.
3. Se îndepărtează soluţia May Grünwald diluată fără
spălare, prin înclinarea lamelelor, după care se
acoperă frotiurile cu soluţia Giemsa diluată 1:1 cu
apă distilată neutră. Se lasă 15-20 minute.
Tehnica de colorare
4. Se spală lama sub jet de apă.
5. Se sugativeaza usor, se usucă.
6. Se examinează la microscop cu obiectivul cu
imersie, pentru a observa morfologia
eritrocitelor, frecvenţa şi morfologia
leucocitelor .
 Pentru a se studia frecvenţa şi morfologia
trombocitelor, frotiul se colorează 45 de
minute cu soluţie Giemsa şi nu se spală sub
jet de apă , deoarece jetul de apă antrenează
trombocitele.
Rezultatele colorării 
 Hematiile (globulele roşii, eritrocitele)
 Pe frotiul sanguin hematiile reprezintă
majoritatea elemetelor celulare şi sunt
răspândite pe toată suprafaţa frotiului. Elesunt
considerate echivalente celulare(celule
anucleate), au formă de disc biconcav, cu
diametrul de 7.1-7.3 microni (figura 6). Mişcând
alternativ în sus şi în jos viza micrometrică,
observăm centrul hematiei mai subţire, mai
palid colorat (la periferie hematia este mai
groasă).
 Aceste aspecte de mai sus, sunt datorate şi
faptului că hematia conţine în citoplasmă
hemoglobină în cantitate mai mare în zona
periferică (unde grosimea este mai mare) ;
încărcarea cu hemoglobină este uniformă şi
proporţională cu cantitatea de citoplasmă. În
aspectul normal denumim aceasta ca
izocromie, iar încărcarea inegală cu
hemoglobină (în stările patologice),
anizocromie.
 Dimensiunile hematiei sunt constante
(izocitoză), dar pot varia în plus sau în minus
în diferite boli (anizocitoză). Forma poate şi
ea varia în stări patologice : aspect inelar, în
rachetă, (poikilocitoză).
 Numărul hematiilor este constant (4-5 milioane
hematii/ml. sânge), iar numărătoarea hematiilor se face
prin diferite metode. Variaţiile în plus, peste limita
superioară a numărului de hematii admis la omul normal,
le denumim poliglobulie; aceasta poate fi fiziologică (la
nou-născut, la cei care trăiesc la mare altitudine), sau
patologică.
 Scăderea numărului de hematii sub limita admisă ca
normală, apare în stări de anemie, de obicei asociată cu
scăderea încărcării cu hemoglobină sau cu modificări de
formă celulară.
 Uneori hematiile pot prezenta resturi nucleare, de
exemplu : corpi Jolly, 1-3 granule bazofile sau resturi de
membrană nuclear, Inelele Cabot, mai numeroase în
stări patologice.
Leucocitele (globulele
albe)
 Aceste elemente figurate prezintă nucleu, deci sunt
celule. Pe un frotiu sanguin colorat May Grünwald
Gimsa, se pot observa aspecte de structură, număr,
ş.a
 Dupa forma nucleului şi prezenţa (sau absenţa ) în
citoplasmă a granulaţiilor specifice, leucocitele se
clasifică în :
 -leucocite polimorfonucleare sau granulocite -
neutrofile
-
acidofile
-
bazofile

Polimorfonuclearele
neutrofile
 Aceste leucocite apar pe frotiul colorat May
Grunwald Gimsa ca celule sferice, de 9-15
microni, cu citoplasma acidofilă care conţine
fine granulaţii specifice, colorate în
violet.Aceste granulatii au dimensiuni mici, sunt
foarte dese si răspândite egal în toată
citoplasma. Nucleul lor este format din mai
mulţi lobi uniţi între ei prin filamente de
cromatină. Numărul lobilor unui nucleu arată
gradul de maturitate al granulocitului. Cu cât
sunt mai mulţi lobi , 5-6, cu atât celula
respectivă este mai bătrână (formula Arneth)
Polimorfonuclear neutrofil, col MGG, ob X40
1. nucleu polilobat, 2. granulatii specifice, 3.
hematie
 În sângele recoltat de la femei, 80% din neutrofile
prezintă un corpuscul cromatinian, sferic sau oval, ataşat
printr-un filament de unul din lobii nucleului. Acest
corpuscul reprezintă cromatina sexuală şi după aspect
se numeşte « drumstick » (beţişor de tobă).
 Numărul neutrofilelor dintr-o sută de leucocite variază
între 62-68 ; când această proporţie este mai mare,
apare neutrofilia, ce caracterizează infecţiile acute, iar
când numărul lors cade, apare neutropenia.
 Polimorfonuclearele neutrofile intervin activ în apărarea
organismului, în procesele inflamatorii. Rolul lor este fie
acela de a excreta fermenţi proteolitici în focarul
inflamator, ce vor acţiona distrugând microbii sau
ţesuturile alterate, fie prin fagocitarea microorganismelor
pe care le distrug apoi cu ajutorul fermenţilor. Viaţa unui
polimorfonuclear neutrofil este foarte scurtă, se admite
că în sângele circulant ele nu depăşesc 3-4 zile.
Polimorfonuclearul
acidofil (eozinofilul)
 Apare ca o celulă sferică, de12-17 microni. Nucleul este
în general bilobat, cei doi lobi fiind legaţi printr-o fină
punte de cromatină (aspect de nucleu în desagă). În
citoplasmă observăm granulaţii colorate în roşu viu,
egale între ele, rotunde, uniform răspândite, mai mari
decât la neutrofile. Prin forma şi culoarea lor, aceste
granulaţii amintesc de Icrele de Manciuria (figura 8).
Granulaţiile conţin peroxidaze, diferite de
mieloperoxidazele neutrofilelor şi hidrolaze acide.
 Mobilitatea lui este scăzută şi au o slabă capacitate de
fagocitoză.
 Proporţia de eozinofile la suta de leucocite este de 1-3.
Creşterea numărului lor poartă denumirea de eozinofilie,
întâlnită în stări alergice precum astmul, urticaria sau
parazitoze, iar scăderea numărului lor, eozinopenie.
Eozinofil, ME. În microscopie electronică,
granulaţiile(2)
sunt voluminoase, de 0.5-1.5 µmin diametru şi
conţin o matrice granulară, iar nucleul este în
general bilobat(1).
 Aceste celule acţionează sinergic cu celelalte
celule în reacţiile de hipersensibilitate de tip
imediat şi întârziat. Ele au rol esenţial în
distrugerea paraziţilor prin intermediul
proteinelor (Eosinophil Cationic Protein - ECP şi
Major Basic Protein - MBP) conţinute în cistalele
din granulaţii . Membrana plasmatică are
receptori pentru IgE şi pentru histamină.
Numărul eozinofilelor poate fi influenţat
hormonal. Granulocitul eozinofil are o viaţă mai
lungă decât a neutrofilului, considerându-se că
ajunge până la 9-12 zile.
Polimorfonucleatul bazofil.
 Este o celulă sferică de 10-14 microni. Nucleul bazofilului
este ovalar, mai puţin lobulat, apărând uşor scobit,
uneori ca o frunză de trifoi. Citoplasma deşi uşor
acidofilă, conţine granulaţii răspândite în citoplasma de
culoare albastră, de formă şi mărime diferită, deseori
suprapuse pe nucleu, mascându-l (figura 9).
 Aceste granulaţii bazofile sunt metacromatice. Bazofilul
poate trece prin peretele capilar în ţesuturi,
transformându-se în mastocit.


 Proporţia bazofilelor la suta de leucocite este de 0.25-
0.50. creşterea numărului lor, bazofilie, poate să ne
indice o leucemie mieloidă.
 Mobilitatea lor este scazuta si nu fagociteaza. Pot trăi în
sânge 12-15 zile.
Polimorfonucleatul bazofil, ME. În microscopia
electronică granulaţiile (1) apar omogene
formate din mici granule dense înconjurate de o
membrană. Aceste granulaţii bazofile conţin
histamină şi heparină, (glicozaminiglicani
sulfataţi)
Limfocitul
 Este o celulă sferică, de 7-16 microni, cu nucleul mare
ce ocupă aproape toată celula, sferic, intens colorat cu
coloranţi bazici, datorită faptului că prezintă o cromatină
bogată dispusă în grunji mari, conglomeraţi.
 Citoplasma este mult redusă, (apare ca o banda îngustă
dispusă în jurul nucleului), intens bazofilă, colorată în
albastru. Obiectivul cu imersie poate detecta inconstant
în citoplasmă, rare granulaţii mici, azurofile, nespecifice.
 Dupa dimensiunile lor se clasifică în :
 -limfocite mici ( 7-8 microni)
 -limfocite mijlocii ( 8-10 microni)
 -limfocite mari (10-14 microni)
 Fiecare dintre aceste limfocite prezintă caracteristici
morfofuncţionale (vezi cursul)
Limfocit, ME. În microscopia electronică se
observă că nucleul prezintă cromatină densă şi
nu prezintă nucleol(1). Citoplasma este saracă în
organite(2)
Monocitul
 Este leucocitul cel mai mare din sânge, 16-20
de microni, are formă sferică sau ovalară, cu
citoplasmă abundentă, slab bazofilă, putând
prezenta granulaţii nespecifice, azurofile.
Nucleul este mare, deseori reniform, sărac în
cromatină, având aspect spongios. Cromatina
este dispusă sub forma unor reţele fine , slab
cromatică, nu conţine nucleol (figura 11). Este
socotit histiocit sanguin.
 Numărul lor este de 6-10 la 100 leucocite.
Creşterea numărului lor poartă denumirea de
monocitoză, apare în boli infecţioase : sifilis,
etc.
Monocit, ME. 1. nucleu reniform, 2. granulaţii
azurofile, 3. citoplasmă abundentă.
 Studiul sângelui se efectuează
prin tehnici cantitative
(numărători), calitative şi
biochimice. Caracterele
morfologice ale elementelor
figurate sanguine se studiază
prin tehnici calitative.
Trombocitele
 Trombocitele - (plachetele sanguine) au
dimensiuni care variază între 2-5/lm şi se
găsesc în sângele periferic în număr de
150.000-400.000/mm3.
 Trombocitele se formează în măduva
hematogenă, din citoplasma unui precursor,
megacariocitul. Trombocitul adult este elipsoidal,
cu formă de lentilă biconvexă. Este anucleat,
fiind alcătuit din membrană şi citoplasmă.
 Pe frotiu poate avea forme diferite: de stea,
discoidală, poligonal, depinzând de gradul de
uscare a frotiului, timpul scurs de la recoltare la
fixare, etc
Trombocite, col MGG,
obX40