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7 Replikation und Gentechnik


Mathias Montenarh

7.1 Der Zellzyklus – 220


7.1.1 Der zeitliche Ablauf des Zellzyklus – 220
7.1.2 Regulation des Zellzyklus – 221
7.1.3 Regulation der Cyclin-abhängigen Proteinkinasen – 221
7.1.4 Wirkung exogener Faktoren auf den Zellzyklus – 225
7.1.5 Apoptose oder der programmierte Zelltod – 225

7.2 Die Replikation der DNA – 228


7.2.1 Die DNA-Replikation ist semikonservativ – 228
7.2.2 Das Replikon als Grundeinheit der Replikation – 229
7.2.3 Für die Replikation benötigte Enzymaktivitäten – 230

7.3 Veränderungen der DNA-Sequenz – 236


7.3.1 Reparatur von DNA-Schäden – 237

7.4 Gentechnik – 241


7.4.1 Klonierung und Einschleusung fremder DNA in Zellen
oder Organismen – 241
7.4.2 Vektoren zum Einschleusen fremder DNA in Zellen – 241
7.4.3 Herstellung spezifischer DNA-Sequenzen – 244
7.4.4 Gentechnik und Grundlagenwissenschaften – 248
7.4.5 Herstellung transgener Tiere – 251

Literatur – 253
220 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

> > Einleitung

Der Zellzyklus beschreibt die Entstehung zweier Tochterzellen aus einer Ursprungszelle. Die dabei ablaufenden Vorgänge wer-
den durch ein komplexes, molekulares Netzwerk reguliert. Nach einer entsprechenden Vergrößerung der Zellmasse muss
sichergestellt werden, dass eine Zelle ihr komplettes Genom fehlerfrei dupliziert und während der Zellteilung zu gleichen Teilen
an die Tochterzellen weitergibt.
Geschädigte oder nicht mehr benötigte Zellen müssen eliminiert werden. Neben der Zellnekrose spielt hierbei der program-
mierte Zelltod, die Apoptose, eine große Rolle.
Sowohl Zellvermehrung als auch Apoptose werden über extrazelluläre Faktoren, z.B. Wachstumsfaktoren, aber auch einer
Reihe intrazellulär erzeugter Faktoren gesteuert. Die hierzu benötigten Informationen über den Aufbau eines Organismus,
seiner Gewebe und Organe sowie die Aufrechterhaltung lebensnotwendiger Vorgänge sind im Genom jeder Zelle niederge-
legt. Die Replikation des Genoms wird durch genau regulierte Multienzymkomplexe katalysiert. Entsprechende Kontrollme-
chanismen sorgen dafür, dass die Fehlerrate bei der DNA-Replikation niedrig gehalten wird. Darüber hinaus sind effiziente
Reparatursysteme vorhanden, die spontane oder durch chemische oder physikalische Noxen verursachte DNA-Schädigungen
beseitigen.
Insgesamt haben die Erkenntnisse über die Vorgänge bei der DNA-Replikation, aber auch bei der im folgenden Kapitel
besprochenen Transkription der DNA einen derartigen Umfang angenommen, dass sie auch als eigenes, Molekularbiologie
genanntes Teilgebiet der Biochemie behandelt werden. Molekularbiologische Erkenntnisse haben die Basis für die rasante
7 Entwicklung der Gentechnik geschaffen. Unter diesem Begriff werden alle technischen Verfahren zusammengefasst, die zur
Manipulation des Erbguts beliebiger Organismen durch Einführung fremder oder sogar künstlich hergestellter DNA-Abschnitte
benötigt werden. Durch Gentechnik werden Organismen mit neuen Eigenschaften erzeugt, die sich als Produzenten medizi-
nisch verwendeter Wirkstoffe oder neuartiger Nahrungsmittel eignen sollen.

7.1 Der Zellzyklus

Die Lebensspanne von Einzellern beginnt mit ihrer Entste-


hung aus der Zellteilung ihrer Mutterzellen, ist dann durch
eine Phase des Wachstums gekennzeichnet, die in etwa zur
Verdopplung ihrer Zellmasse führt, woran sich ihr indivi-
duelles Ende durch die Bildung zweier Tochterzellen durch
Zellteilung anschließt. Der Zeitraum vom Entstehen einer
Zelle durch eine Mitose bis zu ihrem Ende durch erneute
Zellteilung wird als Zellzyklus bezeichnet und ist besonders
gut an einzelligen Eukaryonten, wie z.B. bei Hefezellen, un-
tersucht worden. Bei ihnen führt das Durchlaufen des Zell-
zyklus zur exponentiellen Zunahme der Population.
Auch die Zellen höherer, vielzelliger Organismen
durchlaufen den Zellzyklus. Allerdings ist bei ihnen im . Abb. 7.1. Teilungsrate unterschiedlicher Zelltypen in mensch-
Gegensatz zu Einzellern ein dauerndes exponentielles lichen Organen oder Geweben

Wachstum nicht erwünscht und auch gar nicht möglich.


Für die Aufrechterhaltung der Zellmasse eines adulten, wie z.B. die Vorläuferzellen der Blutzellen, etwa einmal pro
nicht mehr wachsenden Organismus muss es also Mecha- Tag. Störungen im Zellzyklus bilden häufig die Grundlage
nismen geben, die eine weitere Zellvermehrung blockie- für das Entstehen von bösartigen Erkrankungen wie Krebs.
ren. Zu diesen gehört das Anhalten des Zellzyklus mit der Daher ist das Wissen um die molekularen Mechanismen
Folge, dass weitere Zellteilungen verhindert werden. Eine der Zellzyklusregulation ein wichtiger Schlüssel zum Ver-
weitere Möglichkeit besteht in der Eliminierung nicht ständnis solcher Erkrankungen.
mehr benötigter Zellen durch den programmierten Zell-
tod, die Apoptose.
Im erwachsenen Menschen finden sich neben Geweben 7.1.1 Der zeitliche Ablauf des Zellzyklus
mit hoher Zellteilungsrate auch solche, in denen Zell-
teilungen nie oder höchst selten stattfinden (. Abb. 7.1). Bei der Erzeugung zweier identischer Tochterzellen muss
Menschliche Nerven- und Muskelzellen teilen sich über- die gesamte genetische Information sorgfältig repliziert
haupt nicht, andere Zellen, wie Leberzellen, höchstens ein- und genau auf die Tochterzellen verteilt werden, sodass jede
mal pro Jahr. Im Gegensatz dazu teilen sich andere Zellen, Zelle eine Kopie des gesamten Genoms erhält. Darüber
7.1 · Der Zellzyklus
221 7

4 Der Entzug von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen


führt ebenfalls dazu, dass Zellen in die G0-Phase ein-
treten
4 Ruhende, nicht terminal differenzierte Zellen können
durch Zugabe von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen
dazu veranlasst werden, die G0-Phase zu verlassen und
den Zellzyklus wieder zu beginnen

7.1.2 Regulation des Zellzyklus

Durch die genaue Kontrolle des Zellzyklus wird verhindert,


dass die nächste Zellzyklusphase begonnen wird, bevor die
vorhergehende Phase beendet ist. Es wäre gefährlich, die
DNA-Synthese einzuleiten, wenn nicht genügend Nucleo-
tide und Enzyme für diesen Prozess vorhanden sind. Es
. Abb. 7.2. Die einzelnen Phasen des Zellzyklus mit zwei ausge- hätte ebenfalls katastrophale Folgen für die Zelle, wenn die
wählten Kontrollpunkten. (Einzelheiten 7 Text) Mitose eingeleitet würde, obwohl die DNA-Synthese noch
nicht vollständig abgeschlossen ist. Die Zelle verfügt daher
hinaus muss die übrige Zellmasse verdoppelt werden, weil über Kontrollpunkte (ckeckpoints), an denen sie den Fort-
sonst aus jeder Zellteilungsrunde kleinere Zellen resultie- schritt des Zellzyklus überprüft. Ein solcher Kontrollpunkt
ren würden. Bei Eukaryonten mit einem komplexen Zell- befindet sich in der späten G1-Phase des Zellzyklus, der
aufbau mit verschiedenen Kompartimenten müssen sämt- über den Eintritt in die S-Phase entscheidet. Hier wird
liche Vorgänge zeitlich und räumlich miteinander koor- überprüft, ob eine ausreichende Zellgröße erreicht ist und
diniert werden. Zudem müssen Zellen auf äußere Signale ob keine DNA Schäden vorliegen. Ein weiterer Kontroll-
reagieren, die der einzelnen Zelle mitteilen, dass weitere punkt befindet sich in der G2-Phase. Dort überprüft die
Zellen gebraucht werden. Zelle, ob die DNA erfolgreich repliziert wurde oder ob
DNA-Schäden vorliegen. Bei Fehlermeldungen wird der
! Der Zellzyklus umfasst vier verschiedene Phasen.
Zellzyklus angehalten und die Zelle hat Zeit, den DNA-
Bei kontinuierlicher Proliferation treten Zellen nach der Schaden zu beheben oder die Replikation abzubrechen und
Zellteilung, der Mitose (M-Phase), in die Interphase ein, die in die Apoptose zu gehen. An einem weiteren Kontroll-
aus der G1-Phase (gap), der S-Phase (Synthese) und der G2- punkt am Ende der M-Phase wird die korrekte Aufteilung
Phase besteht (. Abb. 7.2): der beiden Chromosomensätze in der Mitosespindel über-
4 Die erste Phase der Interphase, die G1-Phase, ist durch prüft.
Zellwachstum und die Synthese von Proteinen cha- Die Entscheidung, einen Kontrollpunkt zu passieren,
rakterisiert, die für die DNA-Replikation benötigt wer- wird durch externe Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, so-
den wie von einem inneren Uhrwerk der Zelle bestimmt. Dieses
4 In der S-Phase wird der DNA-Gehalt der Zelle verdop- Uhrwerk besteht aus Cyclinen und den sog. Cyclin-abhän-
pelt, RNA und Proteine werden synthetisiert gigen Proteinkinasen. Externe Signale wirken auf diese
4 In der anschließenden G2-Phase werden weiterhin RNA Cyclin-abhängigen Proteinkinasen regulierend ein. Der
und Proteine synthetisiert und die Zelle bereitet sich auf Verlust der Abhängigkeit der Zellzyklusprogression durch
die Zellteilung vor externe Wachstumsfaktoren und der Verlust der Zellzyklus-
4 Während der Mitose wird die DNA auf die mitotischen kontrolle an den Kontrollpunkten des Zellzyklus ist ein
Spindeln und Tochterchromatiden aufgeteilt, das Cyto- Charakteristikum von Tumorzellen.
plasma teilt sich und es entstehen zwei gleiche Tochter-
zellen
7.1.3 Regulation der Cyclin-abhängigen
Bei einer schnell wachsenden Säugerzelle dauert ein Zellzy- Proteinkinasen
klus etwa 24 Stunden, wobei auf die G1-Phase etwa 12 Stun-
den, die S-Phase etwa 6 Stunden, die G2-Phase 6 Stunden ! Cycline sind die Aktivatoren Cyclin-abhängiger Protein-
und auf die Mitose etwa 30 min entfallen. kinasen.
Zellen haben die Möglichkeit, den Zellzyklus vorüber-
gehend oder dauernd zu verlassen: Cycline sind eine Gruppe von strukturell verwandten Pro-
4 Differenzierte Zellen verlassen den Zellzyklus und tre- teinen, deren Gehalt während der spezifischen Phasen des
ten in die so genannte G0-Phase ein Zellzyklus oszilliert (. Abb. 7.3). Ihre Konzentration wäh-
222 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

! Die Aktivität der cdks wird durch Phosphorylierung und


Dephosphorylierung reguliert.

Cdks bilden eine Familie von Proteinen, die sich durch eine
hohe Konservierung der Aminosäuresequenz in den funk-
tionellen Domänen auszeichnen. Am Beispiel der cdk1
kann man zeigen, dass es sowohl inhibitorische als auch
aktivierende Phosphorylierungen der cdks gibt:
Eine Phosphorylierung von cdk1 an Threonin 161
. Abb. 7.3. Zeitlich regulierte Expression von Cyclinen während durch eine cdk aktivierende Kinase (Syn.: CAK, Cyclin
des Zellzyklus H/cdk7/Mat1) ist eine wesentliche Voraussetzung für die
Kinaseaktivität der cdks.
rend des Durchlaufens durch den Zellzyklus wird durch Andere Kinasen wie wee1, mik1 oder myt1 phospho-
regulierten proteolytischen Abbau im Proteasomen-System rylieren cdk1 an Threonin 14 und Tyrosin 15. Diese Ami-
bestimmt. nosäuren liegen im aktiven Zentrum der cdk1. Die Phos-
Cycline sind die Aktivatoren der Cyclin-abhängigen phorylierung an beiden Aminosäuren führt zur Inakti-
Proteinkinasen (cyclin-dependent kinases, cdks). Sobald vierung von cdk1. Wenn die Zelle zur Zellteilung bereit ist,
sie an die cdks binden, öffnet sich deren aktives Zentrum wird cdk1 an den beiden inhibitorischen Aminosäuren
7 und ihre Aktivität steigt um ein Vielfaches an. Die cdks sind Thr 14 und Tyr 15 durch die Phosphatase cdc25C dephos-
während des gesamten Zellzyklus vorhanden, dagegen wer- phoryliert. Damit wird der Cyclin B/cdk1-Komplex akti-
den Synthese und Abbau der Cycline phasenabhängig re- viert und die Zelle zum Eintritt in die Mitosephase sti-
guliert. Damit sind die Cycline die regulatorischen Kom- muliert (. Abb. 7.4; Abb. 7.6). Auch die Regulation anderer
ponenten eines Cyclin/cdk-Komplexes. Ein Cyclinmolekül am Zellzyklus beteiligter Cyclin/cdk-Komplexe erfolgt in
kann an unterschiedliche cdks binden und dadurch deren ähnlicher Weise durch Phosphorylierung/Dephosphory-
Enzymaktivität steuern. Für den geordneten Ablauf des Zell- lierung.
zyklus ist eine exakte Regulation der Cyclin/cdk-Komplexe Die Kinase wee1 und die Phosphatase cdc25C werden
notwendig. Sie erfolgt durch ihrerseits ebenfalls durch reversible Phosphorylierung
4 Reversible Phosphorylierung/Dephosphorylierung reguliert, beide Proteine sind auch Substrate des Cyclin
4 spezifische Inhibitorproteine und B1/cdk1-Komplexes. Man nimmt an, dass dadurch eine
4 Regulation der subzellulären Lokalisation »feed back« Regulation erfolgen kann.

. Abb. 7.4. Die Regulation von


Cyclin-abhängigen Proteinkinasen
durch Phosphorylierung und
Dephosphorylierung. Der trimere
Komplex aus cdk7/MAT1 und Cyclin
H wirkt als Proteinkinase, die Cyclin
B/cdk1 bzw. Cyclin D/cdk4/cdk6
phosphoryliert und damit eine
Voraussetzung für ihre Aktivität
schafft. Die für die Dephosphorylie-
rung der Cyclin/cdk-Komplexe
verantwortliche Familie von Protein-
phosphatasen wird als cdc25
bezeichnet. (Einzelheiten 7 Text)
7.1 · Der Zellzyklus
223 7

! Cyclin-abhängige Proteinkinasen werden über Inhibi-


toren reguliert.

Zur Zeit sind zwei Familien von Inhibitoren von Cyclin-


abhängigen Proteinkinasen bekannt, zum einen die p21WAF1
Familie mit den Mitgliedern p21WAF1 und p57KIP2, zum
anderen die p16INK4A-verwandten Inhibitoren, zu denen
zusätzlich die Proteine p15INK4B, p18INK4C und p19INK4D
gehören. Letztere beschränken ihre Inhibitorfunktion im
Wesentlichen auf die G1-spezifischen Cyclin D/cdk4- bzw.
Cyclin D/cdk6 -Komplexe (. Abb. 7.5)
! Die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen wird über
ihre subzelluläre Lokalisation reguliert.

Cyclin B/cdk1-Komplex. Nahezu während der gesamten


Interphase liegt der Cyclin B/cdk1-Komplex im Cytosol
vor. Da Threonin 14 und Tyrosin 15 phosphoryliert sind
(7 o.), ist er zudem enzymatisch inaktiv. Während der G2-
Phase erfolgt die Aktivierung und Translokation des Kom-
plexes in den Zellkern in folgenden Schritten:
4 Dephosphorylierung durch die regulierte Proteinphos-
phatase cdc25C
. Abb. 7.5. Assoziation von Cyclinen mit cdks während des Zell-
zyklus und Wirkungsort der Inhibitoren. Einzelne Cycline können 4 Phosphorylierung von Cyclin B entweder katalysiert
mit verschiedenen cdks und einzelne cdks mit verschiedenen Cyclinen durch cdk1 selbst oder durch die Proteinkinase Plk-1.
komplexieren Dies ist die Voraussetzung für die Translokation von
Cyclin B/cdk in den Zellkern

. Abb. 7.6. Regulation des Cyclin B/cdk1-Komplexes sowie der Proteinphosphatase cdc25C durch unterschiedliche subzelluläre Loka-
lisation. PP2a = Proteinphosphatase IIa; (Einzelheiten 7 Text)
224 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.7. Wirkung der Tumorsup-


pressor-Proteine pRb und p53 auf
Cyclin-abhängige Proteinkinasen und
die Regulation der Transkription.
(Einzelheiten 7 Text)

Damit kommt der Proteinphosphatase cdc25C eine zen- 4 Für die Einleitung der Phosphorylierung ist ein aktiver
trale Rolle beim Übergang von der G2-Phase in die Mitose Cyclin D/cdk 4-Komplex notwendig.
zu (. Abb. 7.6). Das Protein verfügt über eine katalytische 4 Die Proteinkinasen Cyclin E/cdk2 und Cyclin A/cdk2
und eine regulatorische Domäne. Letztere enthält Amino- vervollständigen die Hyperphosphorylierung von pRb
säurereste, deren Phosphorylierung entweder aktivierend und damit die Freisetzung von E2F
oder inhibitorisch wirkt. Nach Phosphorylierung an Serin
216 bindet cdc25C an das 14-3-3-Protein, wodurch cdc25C Ist einer der Inhibitoren der Cyclin-abhängigen Protein-
in aktiver Form im Cytosol festgehalten wird. Nach Phos- kinase wie z.B. p21WAF1 aktiviert, unterbleibt die Phos-
phorylierung an Serin 214 und Dephosphoylierung an phorylierung von pRb, damit kommt es nicht zur Trans-
Serin 215 dissoziiert das 14-3-3-Protein von cdc25C ab. kriptionsstimulation. Ohne die für den weiteren Fortschritt
cdc25C wird in den Zellkern transportiert, wo es den Cyclin im Zellzyklus notwendigen Proteine kommt es zu einem
B/cdk1 Komplex bindet und anschließend dephosphory- Wachstumsarrest. Das Rb-Protein wird als Wachstums-
liert. Diese Dephosphorylierung von cdk1 führt zur Akti- suppressor oder Tumorsuppressor bezeichnet. Sein Verlust
vierung, so dass die Zelle in die Mitose eintreten kann. führt u.a. zu einem Tumor der Retina, einem Retinoblas-
tom. Die Bildung eines Retinoblastoms wird durch eine
Translokation von Cyclin D/cdk 4. Der für den Übergang Mutation des Rb-Gens auf einem Allel und einer weiteren
von der G1-Phase zur S-Phase des Zellzyklus benötigte unabhängigen Mutation auf einem zweiten Allel ausgelöst.
Cyclin D/cdk 4-Komplex wird zunächst durch die Protein- Mutationen im Rb-Gen treten auch bei anderen Tumoren
kinase CAK phosphoryliert und kann anschließend in den auf. Dies zeigt seine Schlüsselposition bei der Unterdrü-
Zellkern transloziert werden. Der für den weiteren Verlauf ckung von unkontrolliertem Wachstum.
des Zellzyklus entscheidende Vorgang ist die Freisetzung Einen weiteren wichtigen Wachstumssuppressor, der an
des Transkriptionsfaktors E2F. Dieser ist für die Trans- der Zellzyklusregulation beteiligt ist, stellt das Protein p53
kription der für die DNA-Synthese benötigten Enzyme und dar. Ähnlich wie das Rb-Protein wirkt p53 als Regulator
damit für den Übergang von der G1- zur S-Phase des Zell- der Transkription. Infolge von Stress oder nach DNA-Schä-
zyklus notwendig. Seine Freisetzung erfolgt in folgenden digung bindet p53 als Transkriptionsfaktor an den Promo-
Schritten (. Abb. 7.7): tor des Gens für den cdk-Inhibitor p21WAF1, wodurch die
4 In unphosphorylierter Form bindet das Retinoblastom- Expression von p21WAF1 heraufreguliert wird. p21WAF1
protein pRb den Transkriptionsfaktor E2F und blockiert hemmt Cyclin D/cdk4, Cyclin E/cdk2, und Cyclin A/cdk2,
so seine Wirkung auf die Transkriptionsmaschinerie wodurch der Zellzyklus angehalten wird. Die besondere
4 pRb enthält insgesamt 16 potentielle cdk-Phosphorylie- Bedeutung der Wachstumssuppressor-vermittelten Kon-
rungsstellen. Ihre Phosphorylierung ist notwendig, da- trolle des Zellzyklus wird dadurch deutlich, dass in mehr als
mit E2F freigesetzt werden kann 50% aller Tumore p53 genetisch verändert ist. Der Ausfall
7.1 · Der Zellzyklus
225 7

eines funktionstüchtigen p53 verhindert die bedarfsgerech- liferation anregen oder hemmen. Darüber hinaus haben
te Expression von p21WAF1, sodass die Cyclin-abhängigen solche Faktoren eine pleiotrope Wirkung, d.h. sie beeinflus-
Proteinkinasen die Zellen unkontrolliert in die S-Phase des sen zusätzlich Zellwachstum, aber auch Zellmigration, Dif-
Zellzyklus laufen lassen (. Abb. 7.7). ferenzierung und Überleben von Zellen. In Abwesenheit
Zusätzlich findet man Cyclin-abhängige Proteinkina- dieser Faktoren gehen Zellen in die G0-Phase des Zellzyklus
sen am Golgi-Apparat und an den Centrosomen. Die am oder sterben durch Apoptose.
Golgi-Apparat lokalisierten, Cyclin-abhängigen Protein- Die oben genannten Wachstumsfaktoren sind extra-
kinasen sind an der Auflösung der Golgimembranen wäh- zelluläre Proteine, die an membranständige Rezeptoren
rend der Mitose beteiligt. In der G2-Phase und in der M- binden. Viele der Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sind
Phase des Zellzyklus sind nucleäre Lamine und Mikrotu- so genannte Rezeptor-Tyrosinkinasen, deren Signaltrans-
buli-assoziierte Proteine weitere wichtige Substrate für duktion und Wirkungsspektrum in 7 Kapitel 25.7 beschrie-
Cyclin-abhängige Proteinkinasen. Damit unterstützen die ben sind.
an einzelnen Zellorganellen lokalisierten Cyclin-abhängi-
gen Proteinkinasen durch die Induktion von strukturellen
Veränderungen die im Zellkern den Zellzyklus regulie- 7.1.5 Apoptose oder der programmierte
renden cdks. Zelltod

Bei vielzelligen Organismen unterliegt die Zellzahl in ein-


7.1.4 Wirkung exogener Faktoren zelnen Organen einer genauen Regulation. Sie erfolgt nicht
auf den Zellzyklus nur über eine Steuerung der Zellteilung, sondern auch über
die Eliminierung nicht mehr benötigter Zellen. Diesem
Es ist seit langem bekannt, dass Säugetierzellen in Zellkul- Vorgang liegt ein in jeder Zelle vorhandenes »Todespro-
tur nur dann proliferieren, wenn dem Kulturmedium Se- gramm« zugrunde. Es wird auch als programmierter Zell-
rum zugesetzt wird. Serum enthält eine Reihe von Faktoren, tod oder Apoptose bezeichnet. Die Apoptose ist morpho-
die das Wachstum einer Zelle, eines Organs oder eines Or- logisch dadurch charakterisiert, dass nur einzelne indivi-
ganismus fördern (. Tabelle 7.1). Manche Wachstumsfak- duelle Zellen in einem sonst gesunden Organ zugrunde
toren wirken mitogen. Sie regen die Zellteilung an, indem gehen. Sie tritt in sich entwickelnden, aber auch in ausge-
sie intrazelluläre Kontrollen aufheben, die das Durchlaufen wachsenen Geweben auf. So sterben viele Nervenzellen
des Zellzyklus blockieren. Andere Wachstumsfaktoren sti- bereits kurz nach der Entstehung wieder ab. Dies liegt da-
mulieren das Zellwachstum, also die Zunahme der Zell- ran, dass im wachsenden Nervensystem die Apoptose die
masse, indem sie die Synthese von Proteinen und anderen Zahl der Nervenzellen an die Zahl der Zielzellen, die inner-
Makromolekülen in der Zelle fördern. Schließlich gibt es viert werden müssen, anpasst. Auch im gesunden Erwach-
Überlebensfaktoren (engl. survival factors), die die Apop- senen sterben laufend viele Zellen ab, z.B. in Geweben mit
tose, den programmierten Zelltod hemmen. einer hohen Proliferationsrate wie Knochenmark oder im
Der Blutplättchenwachstumsfaktor (PDGF, platelet- Darmepithel. Damit wird die Zahl der Zellteilungen aus-
derived growth factor) war einer der zuerst entdeckten geglichen und erreicht, dass Gewebe nicht wachsen oder
Wachstumsfaktoren mit mitogener Wirkung (7 Kap. 25.7.1). schrumpfen.
Er gehört zu einer umfangreichen Familie von Proteinen, Die Apoptose beginnt mit einer Schrumpfung des
die ein breites Spektrum an Zielzellen und viele Zelltypen Zellkerns aufgrund einer Kondensation des Chromatins
zur Teilung anregen können. PDGF wirkt auf so verschie- (. Abb. 7.8). Es folgen eine Fragmentierung des Zellkerns
dene Zelltypen wie Fibroblasten, glatte Muskelzellen oder und der Zerfall der Zelle in apoptotische Partikel. Die ge-
auch auf Gliazellen. Andere Wachstumsfaktoren wie z.B. töteten Zellen bzw. das aus ihnen entstandene Material wird
der transformierende Wachstumsfaktor E (TGF E, trans- rasch von benachbarten Makrophagen aufgenommen, wes-
forming growth factor E) können je nach Zelltyp die Pro- wegen es nicht zu Entzündungsreaktionen oder einer Akti-

. Tabelle 7.1. Wachstumsfaktoren im Serum (Auswahl)


Faktor Funktion
Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) Dient als sog. Kompetenzfaktor, d.h. führt dazu, dass Zellen für andere Wachstumsfaktoren
sensitiv werden.
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) Dienen als Progressionsfaktoren, d.h. stimulieren Proliferation von Zellen, die durch PDGF
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) kompetent gemacht wurden.

Insulinähnliche Wachstumsfaktoren Dienen als Proliferations- und Differenzierungsfaktoren.


(IGF-1 und IGF-2)
226 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.8. Zelluläre Vorgänge bei Apoptose


und Nekrose. (Einzelheiten 7 Text)

vierung des Immunsystems kommt. Alle diese Vorgänge 4 Die Aktivierung des Apoptosewegs benötigt sog. Ini-
machen die Apoptose klar unterscheidbar von der Zell- tiatorcaspasen, die mit Hilfe extrazellulärer Faktoren
nekrose, die mit einer Zellschwellung und einem Verlust durch den TNFα-Rezeptorweg (extrinsischer Weg,
der Membranintegrität, aber erst relativ spät mit einem 7 Kap. 25.8.2) oder durch intrazelluläre Mechanismen
Abbau der DNA einhergeht. Im Fall der Zellnekrose wer- auf dem mitochondrialen Weg (intrinsischer Weg)
den entzündliche und immunologische Reaktionen aus- aktiviert werden können
gelöst.
Die einzelnen Schritte der Apoptose sind in . Abb. 7.9
! Apoptose wird durch eine intrazelluläre Proteolyse-
zusammengestellt. Zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehört
Kaskade vermittelt.
der eigentliche TNFα-Rezeptor sowie der Fas-Rezeptor
Die intrazelluläre Signaltransduktion und die Auslösung oder CD 95. Die Bindung entsprechender Liganden an
der zur Apoptose führenden zellulären Veränderungen diese Rezeptoren führt zur Anlagerung von Adaptormole-
werden durch eine Familie von proteolytischen Enzymen külen (FADD), an die sich die Initiatorcaspase Procaspase 8
katalysiert, die als Caspasen bezeichnet werden und von anlagert und dort proteolytisch aktiviert wird. Die aktive
denen inzwischen mehr als 10 Mitglieder identifiziert wer- Caspase 8 führt dann zur Aktivierung von Effektorcaspa-
den konnten. Es handelt sich um Cysteinproteasen, die Pro- sen, z.B. der Caspase 3.
teine hinter Aspartyl-Resten spalten. Alle Caspasen liegen Die Aktivierung über den mitochondrialen Weg setzt
intrazellulär als enzymatisch inaktive Procaspasen vor. Ihre die Freisetzung von Cytochrom c (7 Kap. 9.1.1) aus den
Aktivierung erfolgt durch limitierte Proteolyse. Man unter- Mitochondrien voraus. Cytochrom c bindet an ein als
scheidet Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1) bezeichnetes
4 Sog. Effektorcaspasen, z.B. die Caspase 3, die wichtige Protein, das anschließend ATP-abhängig oligomerisiert
zelluläre Proteine, z.B. Reparaturenzyme, Lamin oder und die Initiatorcaspase 9 aktiviert. Diese ist anschließend
Proteinkinase C spalten und damit inaktivieren. Außer- zur proteolytischen Aktivierung von Effektorcaspasen im-
dem kommt es zu einer durch diese Caspasen ausge- stande.
lösten Aktivierung einer spezifischen DNase, die als 4 Die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien
Caspase-aktivierte DNase (CAD) bezeichnet wird. Die als Folge einer zellulären Schädigung wird von einer
Aktivierung dieses Enzyms beruht auf der Proteolyse Vielzahl von Faktoren ausgelöst und unterliegt einer
eines Inhibitors, der die DNase normalerweise bindet sehr genauen Regulation. In ihrem Zentrum steht eine
und somit von der DNA fern hält Reihe von Proteinen aus der Bcl-2-Familie, die sich
7.1 · Der Zellzyklus
227 7

. Abb. 7.9. Der Rezeptor-abhängige


und der mitochondriale Weg der Apoptose.
(Einzelheiten 7 Text)

in proapoptotische (Apoptose-fördernde) und anti- Einige Mitglieder der Bcl-2-Familie wirken antiapopto-
apoptotische (Apoptose-hemmende) Faktoren eintei- tisch. Zu ihnen gehört vor allem das eigentliche Bcl-2 sowie
len lassen: Proapoptotische Bcl-2-Proteine sind v.a. einige nahe Verwandte. Bcl-2 und Bax bilden Heterodimere
Bax/Bak, die als Heterodimer vorliegen. In aktiver und neutralisieren sich dadurch gegenseitig. Die Balance
Form bilden diese wahrscheinlich die Pore in der äu- zwischen pro- und antiapoptotisch wirkenden Proteinen
ßeren Mitochondrienmembran, durch die das Cyto- bestimmt damit letztendlich das Schicksal der Zelle.
chrom c verloren geht Von besonderer Bedeutung ist schließlich die Ver-
4 Die Aktivität von Bax/Bak hängt von weiteren Protein- knüpfung des Apoptosemechanismus mit dem Zellzyklus.
faktoren ab. Es handelt sich u.a. um Bid, Bad und Bim, Der Tumorsuppressor p53 bewirkt nach DNA-Schädigung
die durch verschiedene Mechanismen reguliert werden einen Arrest der Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus.
4 Bim ist mit dem Cytoskelett assoziiert und wird bei Damit gewinnt die Zelle Zeit, den DNA-Schaden zu be-
dessen Störungen freigesetzt heben. Ist die Zellschädigung zu umfangreich oder nicht
4 Bad wird durch die Proteinkinase PKB/Akt reversibel reparabel, induziert p53 die Expression des bax-Gens und
phosphoryliert und damit inaktiviert. Da PKB durch setzt damit den Apoptoseweg in Gang. Für den Gesamt-
Wachstumsfaktoren aktiviert wird (7 Kap. 25.7.1; 26.1.7), organismus ist es eher von Vorteil, eine Zelle mit DNA-
erklärt dies deren antiapoptotische Wirkung Schäden durch programmierten Zelltod zu verlieren, als
4 Von besonderer Bedeutung ist das Protein Bid. Es wird DNA Schäden im Zuge der Zellteilung an Tochterzellen
durch die Caspase 8 proteolytisch gespalten und das weiterzugeben.
dabei entstehende Bruchstück tBid (truncated bid) löst Fehler in der Apoptose führen zum Auftreten von Tu-
die Cytochrom c-Freisetzung aus. Dieser Mechanismus morzellen und zur Entstehung von Tumoren, sind aber
ist eine Verbindung zwischen dem extrinsischen und auch an der Entstehung von Autoimmunkrankheiten und
dem intrinsischen Apoptoseweg neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt.

In Kürze
Bei vielzelligen Organismen wie dem Menschen finden Zur Regulation der einzelnen Phasen existiert ein endo-
während des ganzen Lebens Zellteilungen statt. Dabei genes Kontrollsystem. Diese »innere Uhr« wird durch Cyclin-
verdoppelt die Zelle ihren Inhalt, bevor sie sich in zwei abhängige Proteinkinasen repräsentiert.
identische Tochterzellen teilt. Zellteilungen werden in Cyclin-abhängige Proteinkinasen werden reguliert über:
streng regulierten und kontrollierten Phasen des Zellzy- 4 Synthese und Abbau von Cyclinen und Anlagerung
klus vorbereitet. der Cycline an die katalytischen cdk-Untereinheiten
6
228 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

4 Phosphorylierung und Dephosphorylierung be- transduktionskaskade ins Zellinnere bis in den Zellkern
stimmter Aminosäuren der cdks weitergeben. Solche Signalkaskaden beruhen auf multi-
4 Inhibitormoleküle plen, hintereinander geschalteten Phosphorylierungsreak-
4 subzelluläre Lokalisation tionen, die darüber hinaus auch zur Verstärkung des Signals
führen.
Substrate der Cyclin-abhängigen Proteinkinasen sind Die Apoptose dient der gezielten Eliminierung von
Strukturproteine der Zelle, Proteine, die mit Transkripti- Zellen in einem multizellulären Organismus. Sie wird eben-
onsfaktoren wechselwirken oder Transkriptionsfaktoren falls über verschiedene Signalkaskaden in der Zelle regu-
selbst. Zellproliferation wird exogen über Wachstums- liert, wobei ein gemeinsamer Endpunkt aller Wege die Akti-
faktoren reguliert, die ihre Information über eine Signal- vierung von proteolytisch wirkenden Caspasen ist.

7.2 Die Replikation der DNA

Der gesamte Bauplan eines Lebewesens steht prinzipiell in


jeder Körperzelle zur Verfügung. Die DNA-Sequenzen ent-
7 halten die Informationen für ihre eigene Synthese, sowie für
die Synthese aller RNAs und Proteine. Vor jeder Zellteilung
muss die Zelle ihre DNA exakt replizieren und dann einen
eigenen vollständigen DNA-Satz an ihre Tochterzellen wei-
terreichen. Dieser Vorgang erfordert eine komplexe Ma-
schinerie aus Nucleotiden, Enzymen, Regulator- und Hel-
ferproteinen, die unter Energieverbrauch die DNA-Stränge
mit hoher Geschwindigkeit und Genauigkeit kopiert. Die
korrekte Replikation der DNA ist das zentrale Ereignis im
Zellzyklus. Sie hat sich in der Evolution sehr früh entwickelt
und zeigt wenig Unterschiede zwischen einfachen Organis-
men wie Bakterien oder sehr komplexen wie dem Men-
schen. Die mit der DNA-Replikation verknüpften Vorgänge
wurden ursprünglich in Bakterienzellen wie E. coli unter-
sucht. Viele der dabei gewonnenen Erkenntnisse können
auf eukaryote Organismen und damit auf Säugetiere ein-
schließlich des Menschen übertragen werden. Dabei hat . Abb. 7.10. Nachweis des semikonservativen Mechanismus der
sich herausgestellt, dass die Grundprinzipien der DNA- DNA-Replikation. E. coli-Bakterien bauen das schwere Stickstoff-
isotop 15N in die DNA ein, die dadurch schwerer wird. Lässt man
Replikation bei pro- und eukaryoten Organismen identisch
derartige Bakterien in einem Medium mit dem normalen Isotop 14N
sind, dass jedoch bei letzteren infolge der größeren Kom- weiter wachsen, so zeigt die DNA nach einer Generation eine Dichte,
plexizität ihres Genoms kompliziertere Regulationsvor- die genau zwischen derjenigen der 15N- bzw. der 14N-markierten
gänge existieren. DNA liegt. In der zweiten Generation finden sich jedoch zu je 50%
14
N-markierte DNA und DNA der intermediären Dichte. Die einzelnen
Formen der DNA können auf einem Dichtegradienten getrennt
werden
7.2.1 Die DNA-Replikation ist
semikonservativ
hielt. Nach Synchronisierung der E. coli-Bakterien stellten
Die DNA liegt in allen Organismen in Form eines Doppel- sie das Medium auf das normale Isotop 14N um. Die Aus-
strangs mit zwei antiparallel verlaufenden Einzelsträngen gangs-DNA und die DNA der ersten und zweiten Genera-
vor. In jedem der beiden Einzelstränge ist die gesamte gene- tion wurde in einem CsCl-Dichtegradienten zentrifugiert.
tische Information für einen Organismus enthalten. Während sie zu Beginn des Experiments natürlich nur eine
Matthew Meselson und Franklin Stahl zeigten schon DNA-Bande mit der dem Stickstoffisotop 15N entspre-
1958 in einem eleganten Experiment, dass die DNA-Repli- chenden Dichte nachweisen konnten, fand sich nach einer
kation semikonservativ erfolgt (. Abb. 7.10). Sie verwen- Generation in der isolierten DNA eine Dichte, die genau
deten hierzu E. coli-Bakterien, die sie über viele Genera- zwischen der 15N- und 14N-markierten DNA lag. Nach zwei
tionen in einem Medium gezüchtet hatten, das das schwere Generationen fanden sich zwei DNA-Spezies, von denen
Stickstoffisotop 15N anstatt des normalen Isotops 14N ent- die eine die Dichte der normalen 14N-markierten DNA auf-
7.2 · Die Replikation der DNA
229 7

wies, die zweite die intermediäre Dichte. Dieses Ergebnis


konnte nur durch die Annahme erklärt werden, dass es
bei der DNA-Replikation zu einer Aufspaltung der beiden
Doppelstränge kommt, von denen dann jeder als Matrize
für die Synthese eines neuen Strangs dient. Damit besteht
jeder aus einer Replikation hervorgegangene DNA-Doppel-
strang aus einem parentalen und einem neu synthetisierten
Einzelstrang. Spätere Untersuchungen haben gezeigt, dass
dieser Mechanismus der semikonservativen Replikation
nicht auf Bakterienzellen beschränkt ist, sondern universal
für alle Organismen gilt, deren Genom aus doppelsträn-
giger DNA besteht.

7.2.2 Das Replikon als Grundeinheit


der Replikation

Der Befund, dass die DNA-Replikation semikonservativ


erfolgt, weist schon auf eine wesentliche Voraussetzung für
die DNA-Replikation hin: die DNA-Doppelstränge müssen
zumindest partiell in Einzelstränge überführt werden. Bei
E. coli bindet zunächst das DNA-Doppelstrang-bindende
Protein DnaA an eine charakteristische Sequenz der DNA,
den Replikationsursprung (origin of replication). In . Abb.
5.13 wurde beschrieben, dass ein A-T-Basenpaar durch
zwei und ein G-C-Basenpaar durch drei Wasserstoffbrü-
ckenbindungen zusammengehalten wird. Deshalb sind
A-T-reiche DNA-Abschnitte leichter voneinander zu tren-
nen als G-C-reiche. DNA an Replikationsursprüngen ent-
halten daher typischerweise viele A-T-Basenpaare. Ein wei-
teres Protein, DnaB ist eine Helicase, welche die DNA in
einem ATP-abhängigen Prozess entwindet. Damit sich die
getrennten DNA-Stränge hinter der vorrückenden Helicase
nicht wieder paaren, stabilisiert das Einzelstrang-bindende
Protein SSB (single strand binding protein) den DNA-Ein-
zelstrang. Die Stelle, an der die neu synthetisierte DNA
sichtbar wird, wird auch als Replikationsgabel bezeichnet.
Von dort aus verläuft die bakterielle Replikation entlang des
ringförmigen Chromosoms, sodass am Ende zwei ring-
förmige Doppelstränge entstanden sind (. Abb. 7.11). Als
Replikon bezeichnet man dabei diejenige Einheit der DNA,
in der die einzelnen Schritte der Replikation stattfinden.
Jedes Replikon muss über einen Replikationsursprung ver-
fügen. Da bakterielle Chromosomen nur einen Replikations-
ursprung enthalten, stellen sie auch nur ein Replikon dar.
! Replikationsblasen vergrößern sich bidirektional.

Eine wichtige Frage für die DNA-Replikation war diejenige


nach der Richtung, in der sich die am Replikationsursprung
entstehende Replikationsgabel bewegt. Prinzipiell ist hier
eine unidirektionale und eine bidirektionale Replikation
möglich, dementsprechend müssen jeweils eine bzw. zwei
funktionelle Replikationsgabeln entstehen. Durch elektro-
nenmikroskopische Aufnahmen von replizierender DNA . Abb. 7.11. Replikation des aus einem Replikon bestehenden
ist diese Frage nicht zu entscheiden. Wenn jedoch während ringförmigen bakteriellen Chromosoms
230 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Tabelle 7.2. Pro- und eukaryote Replikons. bp Basenpaare


Organismus Replikons Durchschnittliche Länge Replikationsgeschwindigkeit Beispiel
Bakterium 1 4200 kb 50 000 bp/min E. coli
Hefe 500 40 kb 3600 bp/min S. cerevisiae
Fruchtfliege 3500 40 kb 2600 bp/min D. melanogaster
Nager 25 000 150 kb 2200 bp/min M. musculus
Pflanze 35 000 300 kb V. faba

der DNA-Replikation radioaktive Desoxyribonucleotide Gründe hierfür mag in dem wesentlich komplexeren Auf-
zugegeben werden, werden die synthetisch aktiven Replika- bau des eukaryotischen Chromatins (7 Kap. 5.3.3) liegen.
tionsgabeln markiert: im Falle der unidirektionalen Repli-
kation nur eine, bei bidirektionaler Replikation jedoch
beide. Dabei hat sich gezeigt, dass pro- und eukaryote 7.2.3 Für die Replikation benötigte
Chromosomen während der S-Phase des Zellzyklus durch Enzymaktivitäten
bidirektionale Replikation verdoppelt werden.
In Anbetracht der Komplexizität der Chromatinstruktur ist
7 ! Bei der Replikation des eukaryoten Genoms treten
es einleuchtend, dass Zellen einen außerordentlich kompli-
multiple Replikationsblasen auf.
zierten Apparat zur Replikation ihrer DNA benötigen. Vom
Die Replikation der eukaryoten DNA ist auf die S-Phase des Konzept her kann man diesen Vorgang in die drei Stadien
Zellzyklus beschränkt. Bei Säugetieren dauert diese etwa 4 Initiation
6 Stunden, in denen die etwa 3×109 Basenpaare verdoppelt 4 Elongation und
werden. Auf Grund der maximalen Aktivität der für die 4 Termination
Replikation verantwortlichen DNA-Polymerasen (7 u.) ist
es von vornherein ausgeschlossen, dass jedes Chromosom unterteilen (die gleiche Unterteilung wird auch für Trans-
nur ein Replikon darstellt. Es enthält vielmehr eine große kription und Proteinbiosynthese (7 Kapitel 8 und 9) ver-
Zahl unterschiedlicher Replikons, die jeweils zu unter- wendet).
schiedlichen Zeiten der S-Phase repliziert werden. Der Ab- Die Initiation beginnt damit, dass ein Replikationsur-
lauf der DNA-Replikation in Anwesenheit zweier Replika- sprung von entsprechenden Proteinkomplexen erkannt
tionsblasen ist schematisch in . Abb. 7.12 dargestellt. Die und damit der Start der DNA-Replikation festgelegt wird.
Replikation erfolgt in den Replikationsblasen bidirektional Damit dieser erfolgen kann, muss der DNA-Doppelstrang
und wird dadurch beendet, dass zwei aufeinander zulaufen- in die beiden Einzelstränge getrennt werden, was einem
de Replikationsblasen miteinander verschmelzen. Wie aus Schmelzen der DNA (7 Kap. 5.3.2, 8.1.2) entspricht. So lange
. Tabelle 7.2 zu entnehmen ist, sind die Replikons bei eu- die neu synthetisierten Stränge zur Verfügung stehen, muss
karyoten Zellen relativ klein und replizieren die DNA we- verhindert werden, dass die beiden parentalen Stränge
sentlich langsamer als die bakteriellen Replikons. Einer der wieder reassoziieren. Für die Elongation der DNA wird ein
auch als Replisom bezeichneter Proteinkomplex benötigt,
der sich am Replikationsursprung zusammenlagert und
danach an der Replikationsgabel entlangwandert. Die
Termination der DNA-Replikation erfolgt durch das Zu-
sammentreffen zweier Replikationsgabeln. Bei linearen
DNA-Molekülen treten besondere Probleme auf, die später
besprochen werden.
Aufgrund der vorliegenden Daten muss man anneh-
men, dass die DNA-Replikation durch Regulation der Ini-
tiationsphase gesteuert wird. Bei Eukaryoten sind die Ver-
hältnisse wegen der Komplexizität ihres Genoms wesentlich
komplizierter. Bei der Hefe ist ein DNA-Motiv gefunden
worden, das dieselbe Funktion hat wie der bakterielle Re-
plikationsursprung und welches als ARS (autonomously
replicating sequence) bezeichnet wird. Darüber hinaus ha-
ben sich auch in Eukaryoten Einzelstrangbindungsproteine
. Abb. 7.12. Replikation eukaryotischer DNA mit Hilfe multipler nachweisen lassen.
Replikationsblasen. (Einzelheiten 7 Text)
7.2 · Die Replikation der DNA
231 7

. Tabelle 7.3 gibt einen Überblick über Aufbau und Funk-


tion der DNA-Polymerasen eukaryoter Zellen. Allen DNA-
Polymerasen ist eine Reihe von Eigenschaften gemeinsam.
Sie katalysieren beispielsweise die gleichen Polymerisations-
schritte wie in . Abb. 7.13 dargestellt.
Es handelt sich um einen nucleophilen Angriff der frei-
en 3c-OH-Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs an
die Pyrophosphatbindung zwischen dem D- und E-Phos-
phat des anzuknüpfenden Desoxyribonucleosidtriphos-
phats. Als Desoxyribonucleosidtriphosphate für die DNA-
Polymerasen werden die Purinnucleotide dATP und dGTP
sowie die Pyrimidinnucleotide dCTP sowie dTTP verwen-
det. Durch diesen Reaktionsmechanismus ist die Richtung
der Kettenverlängerung festgelegt: Sie erfolgt immer vom
5c-Ende zum 3c-Ende hin. Ein unentbehrlicher Cofaktor
für die Polymerisation ist Magnesium (Mg2+).
DNA-Polymerasen benötigen einen als Matrize be-
zeichneten Einzelstrang, dessen Basensequenz die Reihen-
folge der für die Neusynthese gewählten Desoxyribonucle-
osidtriphosphate bestimmt. Hierdurch wird gewährleistet,
dass der neue DNA-Strang tatsächlich komplementär zum
parentalen Strang ist.
Einige, aber nicht alle DNA-Polymerasen haben die
Fähigkeit zum Korrekturlesen. Sie verfügen hierzu über
eine 3ⴕ-5ⴕ-Exonucleaseaktivität, können also Nucleotide
am 3c-Ende eines DNA-Moleküls abspalten. Der biolo-
gische Sinn dieser Nucleaseaktivität liegt darin, dass falsch
eingebaute Nucleotide erkannt und unmittelbar nach ihrem
. Abb. 7.13. Mechanismus der DNA-Replikation. (nach Alberts
Einbau wieder hydrolytisch abgespalten werden. Bei der
et al 2002) (Einzelheiten 7 Text) DNA-Polymerase III aus E. coli führt dies zu einer 103-fa-
chen Steigerung der Genauigkeit.
Die verschiedenen zellulären DNA-Polymerasen kön-
! DNA-Polymerasen sind für die Replikation der DNA nen zwischen weniger als 50 bis maximal 1000 Nucleotide
verantwortlich. pro Sekunde an die wachsende DNA-Kette ankondensie-
ren. Diese Angabe der Aktivität allein ist jedoch nicht aus-
Folgende Faktoren müssen für die DNA-Replikation vor- reichend zur Charakterisierung von DNA-Polymerasen.
handen sein: Eine ihrer wesentlichen Eigenschaften wird auch als Pro-
4 DNA als Matrize zessivität bezeichnet. Diese wird als die Zahl von Nucleo-
4 Desoxyribonucleotide tiden bestimmt, die im Durchschnitt von einem DNA-
4 DNA-Polymerasen Polymerasemolekül an eine wachsende DNA-Kette ange-
4 Topoisomerasen fügt wird, bevor das Enzym von seinem Substrat, der
4 Helicasen DNA-Kette, abdissoziiert. Für die verschiedenen DNA-
4 Ribonucleotide für den Primer Polymerasen schwankt der Wert für die Prozessivität von
4 Einzelstrangbindungsproteine weniger als 10 bis mehr als 1000.

. Tabelle 7.3. Beim Menschen vorkommende DNA-Polymerasen (human protein reference database)
DNA-Polymerase α δ ε β γ
Lokalisation Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern Mitochondrien
Funktion Synthese des Primers und Synthese des Führungs- Reparatur Reparatur Replikation der
des Verzögrungsstrangs; strangs mitochondrialen DNA
enthält Primaseaktivität
Molekülmasse (Da) 165 870 123 642 364 860 38 180 139 570
232 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

novo Synthese starten. Daraus ergeben sich Probleme für


die Replikation der DNA, die auf unterschiedliche Weise
gelöst worden sind (. Abb. 7.14).
4 Bei Prokaryoten wird durch eine als Primase bezeich-
nete RNA-Polymerase ein kurzes RNA-Stück syntheti-
siert, das dann als sog. Primer für die Ankondensation
weiterer Desoxynucleosidtriphosphate mit Hilfe der
DNA-Polymerase dient
4 Bei Eukaryoten ist die Primase eine Teilaktivität der
DNA-Polymerase D
4 Eine von manchen Viren benutzte Möglichkeit besteht
darin, dass ein Nucleotid-bindendes Protein an den
. Abb. 7.14. Start der DNA-Replikation durch Synthese eines
RNA-Primers. Die hierfür benötigte Primase ist bei Prokaryoten ein ei- DNA-Einzelstrang bindet, sodass die DNA-Polymera-
genes Enzym, bei Eukaryoten eine Teilaktivität der DNA-Polymerase α sen an diesem Nucleotid angreifen und weitere Nucleo-
tide ankondensieren können
! Bei der DNA-Synthese wird der Verzögerungsstrang
! Jede DNA-Replikation startet mit der Synthese eines
diskontinuierlich synthetisiert.
RNA-Primers.
7 Ein besonderes Problem für die DNA-Replikation ergibt
Eine weitere, allen DNA-Polymerasen gemeinsame Eigen- sich daraus, dass DNA-Polymerasen den neuen Strang
schaft besteht darin, dass sie ein neues Nucleotid nur mit nur in der 5c-3c-Richtung synthetisieren können, die DNA-
einem Basen-gepaarten Nucleotid einer DNA Doppelhelix Doppelstränge aller bekannten Organismen jedoch anti-
verbinden können. DNA-Polymerasen können keine de parallel verlaufen. In . Abb. 7.15 sind die Verhältnisse

. Abb. 7.15. Die Replikation der DNA-Doppelhelix. Da die Strang- rungsstrang (blau) kontinuierlich ablaufen. Im antiparallelen sog.
verlängerung immer nur in 5c-3c-Richtung erfolgen kann, kann die Verzögerungsstrang (grün) erfolgt die Replikation wegen der Synthe-
Replikation nur in einem der beiden Einzelstränge, dem sog. Füh- serichtung der DNA-Polymerase diskontinuierlich; rot = Primer
7.2 · Die Replikation der DNA
233 7

. Abb. 7.16. Funktion der DNA-Polymerase I bei der Prozessie-


rung des Verzögerungsstrangs. Von besonderer Bedeutung für
diesen Vorgang ist bei Prokaryoten die 5c-3c-Exonucleaseaktivität der
DNA-Polymerase I, bei Eukaryoten die Ribonuclease H1

schematisch dargestellt. Die Richtung der DNA-Polymeri-


sation durch die DNA-Polymerase entspricht nur an einem
der beiden neu synthetisierten Stränge der Wanderungs-
richtung der Replikationsgabel. Dieser Strang wird, nach-
dem einmal ein Primer-Molekül synthetisiert wurde, kon-
tinuierlich in einem Stück synthetisiert und als sog. Füh-
rungsstrang (Leitstrang, leading strand, blau) bezeichnet.
Beim anderen Strang verläuft die Polymerisierungsrichtung
dagegen von der Replikationsgabel weg. Der Japaner Reiji
Okazaki fand heraus, dass die DNA-Synthese an diesem
Strang diskontinuierlich in Stücken aus 1000–2000 Basen
erfolgt, welche nach ihm auch als Okazaki-Fragmente be-
zeichnet werden. Sie entstehen dadurch, dass nach der Syn-
these eines derartigen Fragments jeweils wieder an der
Replikationsgabel ein neuer Primer synthetisiert und durch
die DNA-Polymerase solange verlängert wird, bis er an das
vorher synthetisierte Fragment stößt. Der diskontinuierlich
. Abb. 7.17. Mechanismus der DNA-Ligasen. (Einzelheiten 7 Text)
synthetisierte Strang wird auch als verzögerter Strang
(lagging strand, grün) bezeichnet.
vorangegangenen DNA-Stücks Desoxyribonucleosidtri-
! 5c-3c-Exonuclease und DNA-Ligase werden für den
phosphate komplementär zur Basensequenz des Matrizen-
Abschluss der DNA-Replikation benötigt.
strangs in die entstehende Lücke ein. Dadurch entsteht ein
Um bei der Replikation zwei funktionell äquivalente DNA- Muster aus aneinander stoßenden DNA-Strängen im neu
Doppelstränge zu erhalten, müssen natürlich die Okazaki- synthetisierten Strang, die mit Hilfe der DNA-Ligase mit-
Fragmente entsprechend bearbeitet und danach zusam- einander verknüpft werden. . Abbildung 7.17 stellt den all-
mengefügt werden. Bei Prokaryoten werden hierfür zwei gemeinen Mechanismus der DNA-Ligasen dar. ATP (oder
weitere Enzyme, die DNA-Polymerase I sowie die DNA- NAD+) dient dabei als Donor eines AMP-Rests, der cova-
Ligase benötigt. Die DNA-Polymerase I verfügt über eine lent mit der H-Aminogruppe eines Lysylrests des Ligase-
5ⴕ-3ⴕ-Exonucleaseaktivität, mit deren Hilfe spezifisch der proteins verknüpft wird. Die Spaltung dieser energiereichen
RNA-Primer entfernt wird (. Abb. 7.16). Gleichzeitig fügt Bindung dient dazu, den AMP-Rest auf das 5c-Phosphat-
dieses Enzym, beginnend mit dem freien 3c-OH-Ende des ende der einen DNA-Kette zu übertragen. Dabei entsteht
234 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

- Führungsstrang. Nach der Synthese des Primers (5–15 Nu-


cleotide) synthetisiert die DNA-Polymerase α noch etwa
20 weitere Nucleotide. Mit Hilfe des Proteins RFC (eu-
karyotic replication factor C) wird aus einem als PCNA (pro-
liferating cell nuclear antigen) bezeichneten Protein eine Art
Gleitring geformt, der die DNA-Polymerase α verdrängt
und die DNA mit der für die weitere Synthese im Führungs-
strang benötigten DNA-Polymerase G und eventuell DNA-
Polymerase ε belädt (polymerase switching). Die DNA-Syn-
these erfolgt ab hier kontinuierlich.

Verzögerter Strang. Das Problem bei der Synthese des Ver-


zögerungsstrangs beruht auf der Tatsache, dass die Syn-
theserichtung von der Replikationsgabel wegführt. Es wird
dadurch umgangen, dass die DNA des verzögerten Strangs
eine Schleife bildet (. Abb. 7.18). Im Prinzip entspricht die
DNA-Synthese im verzögerten Strang der im Führungs-
strang. Nach der Primersynthese durch die DNA-Polyme-
7 rase α kommt es zum polymerase switching. Die DNA-Poly-
merase G setzt die Synthese des verzögerten Strangs fort,
allerdings nur bis sie auf ein bereits synthetisiertes Stück
des Doppelstrangs stößt. Sie löst sich dann von der DNA ab
und setzt am folgenden Primer die Synthese fort.
! Für die Replikation der Enden doppelsträngiger, linearer
DNA werden besondere Mechanismen benötigt.

Die beschriebenen Mechanismen der DNA-Replikation


sind in perfekter Weise dazu geeignet, die zirkulären Ge-
nome vieler Viren und Bakterien zu replizieren. Ein zusätz-
. Abb. 7.18. Struktur des für die Replikation eukaryoter DNA
liches Problem ergibt sich jedoch bei der Replikation line-
benötigten Multienzymkomplexes. Der Verzögerungsstrang (grün)
bildet eine Schleife, sodass die beiden DNA-Polymerasen in enger arer DNA-Doppelstränge, wie sie in den Chromosomen
Assoziation bleiben können. Die Primase ist eine Untereinheit der der Eukaryoten vorliegen. Wie aus . Abb. 7.19 hervorgeht,
DNA-Polymerase α. Topoisomerasen sind zur Vereinfachung wegge- kann zwar das 5c-Ende des parentalen Strangs ohne be-
lassen. (Weitere Einzelheiten 7 Text) sondere Schwierigkeiten vollständig repliziert werden, da es
hier als Führungsstrang dient. Anders ist es aber beim komp-
lementären parentalen Strang, der an dieser Position das
eine Phosphorsäureanhydrid-Bindung zwischen AMP und 3c-Ende bildet. Hier liegt unmittelbar nach der DNA-Repli-
dem 5c-Phosphatende der DNA. Unter Abspaltung dieses kation der RNA-Primer, der nach erfolgter Replikation
Rests kann nun die Verknüpfung zwischen dem 5c-Phos- durch die 5c-3c-Exonuclease entfernt wird. Die DNA-Poly-
phatende des einen DNA- mit dem 3c-OH-Ende des nächs- merase hat jedoch an diesem Ende keine Möglichkeit mehr,
ten DNA-Bruchstücks erfolgen, womit die Verknüpfung die entstandene Lücke aufzufüllen. Dies führt dazu, dass die
beendet ist. Chromosomen mit jeder Replikation um ein definiertes
Stück kleiner werden, was letztendlich eine Instabilität der
! Die für die Replikation benötigten Proteine sind im
Chromosomen und damit eine verminderte Lebensfähig-
Replisom assoziiert.
keit der betreffenden Zelle auslöst. Diese Schwierigkeit wird
. Abbildung 7.18 stellt den an der Replikationsgabel euka- durch einen für die Enden doppelsträngiger DNA spezi-
ryoter Zellen befindlichen Multienzymkomplex dar, der für fischen Replikationsapparat behoben. Analysiert man die
die DNA-Replikation verantwortlich ist und auch als Repli- auch als Telomere bezeichneten Enden von Chromosomen,
som bezeichnet wird. Der hochkonservierte DNA-Poly- so findet man bei allen Eukaryoten sehr ähnliche Struk-
merase D/Primase-Komplex stellt die einzige eukaryote turen. Telomerische DNA besteht aus einigen hundert (ein-
Polymerase dar, die eine DNA-Synthese de novo initiieren fache Eukaryote wie Hefe) bis einigen tausend (Vertebra-
kann. Aufgrund ihrer Primaseaktivität wird sie für die Her- ten) Basenpaaren, bei denen G-reiche repetitive Sequenzen
stellung der Primer am Führungsstrang und am verzöger- vorkommen. Bei Säugern und damit auch beim Menschen
ten Strang benötigt. Wegen der Antiparallelität unterschei- lautet diese Sequenz 5c-TTAGGG-3c. Diese G-reiche Se-
den sich die Vorgänge an den beiden Strängen. quenz befindet sich am 3c-Ende jedes parentalen Einzel-
7.2 · Die Replikation der DNA
235 7

. Abb. 7.19. Replikation an den Telomeren der Chromosomen. noch entfernt werden, es gibt jedoch keine DNA-Polymerase, die die
Der am 3c-Ende des parentalen Strangs gelegene Primer kann zwar dadurch entstandene Lücke auffüllen könnte

strangs und ragt zwölf bis sechzehn Nucleotide über den


komplementären C-reichen Strang hinaus. Bei jeder Re-
plikation gehen 50–200 Nucleotide dieser telomerischen
Sequenz verloren, sodass man Telomere auch als eine Art
molekularer Uhr ansehen kann, mit deren Hilfe Zellen die
Zahl ihrer Mitosen zählen können. Auf jeden Fall bieten die
Telomere eine Erklärung dafür, dass die Zahl der möglichen
Teilungen somatischer Zellen höherer Eukaryoter wie auch
des Menschen auf 30–50 beschränkt ist. Eukaryote Zellen
enthalten ein für die Replikation der Telomeren verant-
wortliches Enzym, die Telomerase. Sie ist dafür verant-
wortlich, dass sich die Zellen beliebig oft teilen können.
Telomerasen sind Ribonucleoprotein-Enzyme. Sie enthal-
ten ein RNA-Stück, welches eine der telomeren Sequenz
komplementäre Basensequenz enthält und für die Telo-
merenreplikation essentiell ist (. Abb. 7.20). Die terminalen
Nucleotide des G-reichen überhängenden Endes paaren
mit der entsprechenden Sequenz der Telomerase-RNA.
Anschließend erfolgt die Verlängerung des 3c-Endes durch
Anhängen einzelner Nucleotide, wobei wiederum die Telo-
merase-RNA als Matrize dient. Dieser Vorgang wiederholt
sich mehrmals, sodass eine repetitive G-reiche Sequenz ent-
. Abb. 7.20. Mechanismus der für die Replikation der Telomeren
steht. Die Polymerisation sowie die Anlagerung der Telo- verantwortlichen Telomerase. Telomerasen sind Ribonucleopro-
merase erfolgt ohne ATP-Verbrauch. Die Telomerase ist teine. Sie e nthalten eine RNA-Sequenz, die als Matrize für die Verlän-
damit eigentlich eine reverse Transkriptase (7 Kap. 7.4.3), gerung des 3c-Endes eines parentalen Strangs dient. Dabei entsteht
deren RNA-Matrize ein intrinsischer Bestandteil des En- eine beträchtlich verlängerte Sequenz, die dann die komplementäre
Sequenz für die Auffüllung der Verkürzung am Verzögerungsstrang
zyms ist. Die durch die Telomerase verlängerten 3c-Enden
liefert
werden bei der nächsten Replikationsrunde zwar verkürzt
repliziert (7 o.), jedoch kann dieser Defekt in der darauf
folgenden Replikationsrunde durch Verlängerung mit der
Telomerase wieder behoben werden. Bei niederen Eukaryo-
236 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

ten führt ein Verlust der Telomerasefunktion in Folge von hindert dabei die Trennung der Stränge, die für die DNA-
Mutationen zur allmählichen Verkürzung der Chromo- Replikation notwendig ist. Da es sowohl bei Mikroorganis-
somen und schließlich zum Zelltod. Normale somatische men als auch bei Eukaryoten als Mitosehemmstoff wirkt,
menschliche Zellen enthalten keine Telomerase, jedoch ist hat es nur in der Tumortherapie Bedeutung.
eine solche in den Keimbahnzellen der Testes und den
Ovarien vorhanden. Darüber hinaus hat sich eine aktive Actinomycin D. In niedrigen Konzentrationen hemmt Acti-
Telomerase bei allen bisher untersuchten Tumoren nach- nomycin D die DNA-abhängige RNA-Biosynthese (7 Kap.
weisen lassen. Offenbar ist dieses Enzym normalerweise 8.3.5), in höheren Konzentrationen auch die DNA-Repli-
reprimiert und wird erst bei der malignen Transformation kation. Dabei kommt es zur Bildung eines Komplexes von
aktiviert. Daher sind Inhibitoren der Telomerase attraktive Actinomycin D mit den Guaninresten der DNA. Actino-
Substanzen für die Behandlung von Tumorerkrankungen. mycin D findet Anwendung in der Tumortherapie sowie bei
experimentellen Fragestellungen, bei denen geklärt werden
! Hemmstoffe der DNA-Replikation können als experi-
soll, ob ein beobachteter Effekt auf die Neubildung von
mentelle Werkzeuge oder zur Tumortherapie einge-
RNA zurückgeführt werden kann.
setzt werden.

Einige Antibiotika hemmen die DNA-Replikation bzw. die Gyrasehemmstoffe. Eine Reihe einfacher, von der 4-Oxo-
Transkription und haben sich deswegen als wertvolle Hilfs- chinolin-3-carbonsäure abstammender Verbindungen sind
mittel bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen wirksame Hemmstoffe der prokaryotischen DNA-Topoiso-
7 der Replikation erwiesen und darüber hinaus teilweise Ein- merase (7 Kap. 5.3.2). Wegen dieser Wirkung beeinträch-
gang in die Tumortherapie gefunden: tigen sie die bakterielle Replikation und Transkription und
können zur Therapie eines breiten Spektrums bakterieller
Mitomycin. Mitomycin verursacht die Bildung covalenter Infekte eingesetzt werden.
Quervernetzungen zwischen den DNA-Strängen und ver-

In Kürze
Die DNA-Replikation ist semikonservativ, das heißt, dass terbindung. Sie benötigen zum Start der DNA-Synthese
das doppelsträngige Tochter-DNA-Molekül aus einem einen Primer, ein kurzes RNA-Molekül, an das das erste Des-
parentalen Strang und einem neu synthetisierten Strang oxyribonucleotid angeknüpft werden kann. Da die Synthe-
besteht. se der DNA immer in 5c-3c-Richtung erfolgt, gibt es einen
Die DNA hat einen (Prokaryot) oder mehrere (Eukaryot) kontinuierlich synthetisierten Führungsstrang und einen
Ursprünge der DNA-Replikation. verzögerten Strang aus sog. Okazaki-Fragmenten. Nach
Für die DNA Replikation werden benötigt: Abspaltung der Primer und Auffüllen der Lücke werden die
4 partiell aufgewundene einzelsträngige DNA als Matrize DNA-Abschnitte durch eine DNA-Ligase miteinander ver-
4 Desoxyribonucleotide knüpft.
4 DNA-Polymerasen Telomerasen verlängern die Enden linearer DNA z.B. an
4 Topoisomerasen Chromosomenenden, den Telomeren. Sie verhindern damit
4 Ribonucleotide für die Synthese des Primers die mit jeder Replikation einhergehende Verkürzung der
4 DNA Ligasen Chromosomen. Eine hohe Aktivität der Telomerasen wird
4 Helicasen bei Tumoren gefunden.
Die als Hemmstoffe der DNA-Replikation eingesetzten
Im wachsenden DNA-Molekül verknüpfen DNA-Polyme- Reagenzien verhindern die Entwindung oder das Auf-
rasen Desoxyribonucleotide zu einer Phosphodies- schmelzen der DNA.

7.3 Veränderungen der DNA-Sequenz der Degeneriertheit des genetischen Codes vielfach keiner-
lei Konsequenzen für das betreffende Protein. Gelegentlich
Das Überleben eines Individuums hängt davon ab, dass sei- kommt es zum Austausch ähnlicher Aminosäuren, sodass
ne DNA während der oft außerordentlich langen Lebens- die funktionellen Konsequenzen gering sind und nur in den
zeiten seiner Zellen stabil bleibt und bei der DNA-Replika- relativ seltenen Fällen, wo durch die Mutationen schwerwie-
tion mit großer Genauigkeit verdoppelt wird. Treten den- gende strukturelle Änderungen des betroffenen Proteins
noch stabile, vererbliche Änderungen der DNA-Struktur ausgelöst werden, ergeben sich Defekte mit häufig tödlichen
auf, so spricht man von Mutationen. Wie in 7 Kapitel 9.1.2 Konsequenzen für den betroffenen Organismus. Die meis-
ausführlich erörtert, haben derartige Mutationen in den ten Mutationen kommen zusätzlich in den somatischen
für Aminosäuren/Proteinen codierenden Bereichen wegen Zellen vor und werden infolgedessen nicht vererbt. Muta-
7.3 · Veränderungen der DNA-Sequenz
237 7

. Tabelle 7.4. Erbkrankheiten mit Defekten in der DNA-Reparatur


Name der Krankheit Phänotyp betroffenes Enzym oder Prozess
Ataxia teleangiectatica (AT) Leukämie, Lymphome, zelluläre Empfindlichkeit ATM-Protein, eine Proteinkinase, die durch
gegenüber Röntgenstrahlung, Genominstabilität Doppelstrangbrüche aktiviert wird
Bloom-Syndrom Krebs an mehreren Stellen, beeinträchtigtes zusätzliche DNA-Helicase für die Replikation
Wachstum, Genominstabilität
BRCA-2 Brust- und Eierstockkrebs Reparatur durch homologe Rekombination
Fanconi-Anämie angeborene Fehlbildungen, Leukämie, Reparatur von Überkreuzungen
Genominstabilität der DNA-Stränge
MSH2, 3, 6, MLH1, PMS2 Dickdarmkrebs Fehlpaarungs-Reparatursystem
Werner-Syndrom vorzeitige Alterung, Krebs an mehreren Stellen, zusätzliche 3’-Exonuclease und DNA-Helicase
Genominstabilität
Xeroderma pigmentosum (XP) Hautkrebs, zelluläre UV-Empfindlichkeit, Basen-Excisionsreparatur
neurologische Anormalitäten

tionen in den Keimzellen werden zwar vererbt, setzen sich Instabilitäten der DNA gegen Chemikalien und Strahlung.
meist innerhalb einer Art nicht durch, da das betroffene Erstaunlicherweise steht der biologischen Stabilität der
Individuum entweder nicht in das fortpflanzungsfähige DNA keine gleichwertige chemische Stabilität gegenüber.
Alter kommt oder in seiner Fortpflanzungsfähigkeit er- Eine Reihe von Bindungen in der DNA ist nämlich relativ
heblich vermindert ist. Dies führt zu einer beträchtlichen labil (. Abb. 7.21). So kommt es beispielsweise bereits bei
Stabilität der DNA innerhalb einer Species. Aus Unter- normaler Körpertemperatur zur thermischen Spaltung der
suchungen der Fibrinopeptide (7 Kap. 29.5.3), bei denen N-glykosidischen Bindung von Purinbasen mit der Des-
Änderungen der Aminosäuresequenz wenig funktionelle oxyribose. Die Depurinierung zerstört das Phosphodies-
Konsequenzen haben, lässt sich errechnen, dass für ein tergerüst der DNA nicht. Sie ist die Ursache für Schäden,
durchschnittliches Protein aus 400 Aminosäuren eine sta- die die DNA ohne Basen wie ein Gebiss mit fehlenden Zäh-
bile Änderung einer Aminosäure etwa einmal pro 200000 nen aussehen lässt. Dieser Vorgang der Depurinierung be-
Jahre erfolgt. Ähnliche Zahlen lassen sich aus der Häufig- trifft beim Menschen in 24 Stunden etwa 5000 Purinbasen
keit von Änderungen der Basensequenz in nicht für Pro- pro Zelle. Kaum weniger häufig ist die spontane Desami-
teine codierenden DNA-Strukturen ableiten. Ein Grund nierung von Cytosin in der DNA. Da hierbei Uracil ent-
für diese niedrige Mutationsrate ist, dass die Genauigkeit steht, das sich wie Thymin mit Adenin statt mit Guanin
der DNA-Replikation durch die 5c-3c- und die 3c-5c- paart, ist diese Desaminierung auf jeden Fall mutagen.
Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerasen gewährleistet
wird (7 Kap. 7.2.3). Darüber hinaus werden spontane Ver- Ultraviolette Strahlung erzeugt Thymindimere. Über diese
änderungen der DNA sowie Veränderungen, die durch spontanen Änderungen der DNA-Struktur hinaus ist die
Umweltein-flüsse wie Hitze, verschiedene Strahlenarten DNA anfällig gegenüber einer großen Zahl weiterer Noxen.
oder durch mutagene Substanzen entstehen, mit Hilfe Hierzu gehören die ultraviolette Strahlung, welche zur
von DNA-Reparatursystemen beseitigt. Für diese DNA- Ausbildung von Thymindimeren führt (. Abb. 7.22). Wei-
Reparatur steht eine Reihe von Reparaturenzymen zur tere Basenmodifikationen werden beispielsweise durch
Verfügung. Die Bedeutung der DNA-Reparatur erkennt Sauerstoffradikale (7 Kap. 15.3, 15.4) ausgelöst. Insgesamt
man auch daran, dass die Inaktivierung eines Repara- sind bis heute etwa 100 unterschiedliche radikalische Schä-
turgens zu einer stark erhöhten Mutationsrate führt. Als digungen der DNA-Basen identifiziert worden. Die meisten
Konsequenz einer verminderten DNA-Reparatur bei von ihnen sind mutagen und würden bei jeder Replikation
Menschen können verschiedene Erkrankungen auftreten an die Tochterzelle weitergegeben. Um die damit einher-
(. Tab. 7.4). gehenden katastrophalen Schädigungen zu verhindern,
So führt ein Defekt im Gen, das für die Korrekturlese- verfügt jede Zelle über hochaktive DNA-Reparatursys-
funktion der 3c-5c Exonucleaseuntereinheit der DNA-Poly- teme, die die auftretenden DNA-Schäden erkennen und
merasen codiert, dazu, dass die betroffenen Individuen reparieren.
anfällig für bestimme Krebsarten werden. Bei einer Art von
Darmkrebs, dem erblichen nicht-polypösen colorektalen
Tumor (hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) 7.3.1 Reparatur von DNA-Schäden
lässt die spontane Mutation eines solchen Gens Zellklone
entstehen, die schnell Mutationen anhäufen und so zu einer Die Behebung eines DNA-Schadens ist immer dann relativ
Krebsentstehung beitragen. unproblematisch, wenn dieser sich auf einen der beiden
238 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.21. Instabilität der DNA durch Depurinierung und Desaminierung. (nach Alberts et al. 2002) (Weitere Einzelheiten 7 Text)

Stränge der Doppelhelix beschränkt. Die zur Behebung des


Schadens notwendigen Schritte (. Abb. 7.23) bestehen in:
4 Erkennung des beschädigten Nucleotids oder der Base
4 Excision des beschädigten Nucleotids oder der Base
4 Auffüllen der Lücke mit den zu dem unbeschädigten
Strang komplementären Nucleotid und
4 Schließen der Lücke

Während für die Excision der beschädigten Region spezi-


fische enzymatische Aktivitäten notwendig sind, werden
für die sich anschließenden Schritte dieselben Enzymakti-
vitäten benutzt, die auch für die Verknüpfung der Okazaki-
Fragmente während der DNA-Replikation verwendet
werden. Für das Auffüllen der Lücke wird eine DNA-Poly-
merase benötigt, für das Schließen der Lücke eine DNA-
Ligase.
! DNA-Schäden können durch Basen-Excisionsreparatur
oder durch Nucleotid-Excisionsreparatur beseitigt
werden.

Einer der Reparaturmechanismen ist die Basenexcisions-


reparatur, die in . Abb. 7.24 dargestellt ist. Die zugrunde
liegenden Mechanismen finden sich in gleicher Weise so-
wohl bei pro- als auch bei eukaryoten Organismen, sind
allerdings bei den Ersteren wesentlich besser untersucht.
Basenveränderungen, die meist im Gefolge von oxidativen
. Abb. 7.22. Dimerisierung von benachbarten Thyminresten
durch UV-Licht Schädigungen auftreten, werden als Änderung der Raum-
struktur der DNA von spezifischen Proteinen erkannt.
Diese bilden mit DNA-Glycosylasen aktive Komplexe, wel-
che die beschädigte Base eliminieren. DNA-Glycosylasen
bilden eine Familie von Enzymen unterschiedlicher Spezi-
7.3 · Veränderungen der DNA-Sequenz
239 7

fität, die die einzelnen Typen geschädigter Basen, aber auch


das durch Desaminierung von Cytosin entstehende Uracil
erkennen und entfernen. Um die richtige Base einsetzen zu
können, muss nun das Desoxyribosephosphat entfernt
werden, zu dem die durch die DNA-Glycosylase herausge-
schnittene Base gehörte. Hierfür ist zunächst eine AP-
Endonuclease notwendig (AP, apurinic bzw. apyrimidinic).
Die Entfernung von Desoxyribose und Phosphat erfolgt
dann durch eine Phosphodiesterase. Mit Hilfe von DNA-
Polymerasen und DNA-Ligasen kann nun die Lücke aufge-
füllt und geschlossen werden. Für die Behebung der durch
spontane Depurinierung (s.o.) entstandenen DNA-Schädi-
. Abb. 7.23. Allgemeine Strategie zur Behebung von DNA- gungen werden im Prinzip dieselben Schritte benötigt, es
Schäden. (Einzelheiten 7 Text) fällt lediglich die durch die DNA-Glycosylase katalysierte
Entfernung der beschädigten Basen weg.
Ein zweiter Reparaturweg ist die Nucleotid-Excisions-
reparatur. Sie dient dazu, Defekte zu beheben, die zu grö-
ßeren Veränderungen in der DNA-Doppelhelix führen.
Solche Veränderungen treten auf, wenn die DNA Wech-
selwirkungen mit größeren Molekülen z.B. mit dem Benz-
pyren aus Zigarettenrauch eingeht.
Im Prinzip geht das aus einer Reihe unterschiedlicher
Untereinheiten bestehende hierfür verantwortliche Repara-
tursystem so vor, dass nach der Erkennung der Schädigung
durch den Multienzymkomplex ein aus etwa 10–20 Nu-
cleotiden bestehendes Oligonucleotid aus dem geschä-
digten Einzelstrang entfernt wird. Dies geschieht durch eine
Nucleaseaktivität, die oberhalb und unterhalb der Schä-
digung schneidet und das entsprechende Oligonucleotid
entfernt. Die entstandene Lücke wird durch DNA-Poly-
merase mit den komplementären Nucleotiden aufgefüllt
und mit Hilfe von DNA-Ligase geschlossen (. Abb. 7.25).
Die allgemeine Bedeutung dieses Reparatursystems
durch Nucleotidexcision wird in einer relativ seltenen
hereditären Erkrankung des Menschen deutlich, die als
Xeroderma pigmentosum bezeichnet wird. Die betroffenen

. Abb. 7.24. Mechanismus der Basenexcisionsreparatur. Nach . Abb. 7.25. Mechanismus der Nucleotidexcisions-Reparatur.
dem Lokalisieren der beschädigten Stelle (rot) erfolgt durch DNA- Der Reparaturkomplex enthält eine Nucleaseaktivität, die ein etwa
Glycosylasen die Excision der Base, anschließend die Entfernung des 10–20 Basen langes Oligonucleotid in der Umgebung der beschädig-
zugehörigen Deoxyribosephosphats durch AP-Endonucleasen. Da- ten Stelle entfernt. Die dabei entstehende Lücke wird anschließend
nach wird die Lücke aufgefüllt aufgefüllt und mit Hilfe einer Ligase verschlossen
240 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.26. Schematische Darstellung der Vorgänge bei der homologen Rekombination und des nicht homologen »end-joining«.
(Weitere Einzelheiten 7 Text)

Patienten sind sehr empfindlich gegenüber Sonnenbestrah- mentierung von Chromosomen entstehen. Letztlich wäre
lung, zeigen Störungen ihrer Hautpigmentierung und nei- die betroffene Zelle nicht lebensfähig. Um diese potenzielle
gen mit einem im Vergleich zu Gesunden etwa 2000-fach Gefahr zu beheben, kennt man zwei unterschiedliche Me-
höheren Risiko zur Bildung von Hauttumoren. chanismen (. Abb. 7.26). Beim nicht-homologen Verbinden
Bislang wurden DNA-Schäden besprochen, die nur auf von DNA–Enden (nonhomologous end-joining, NHEJ) wer-
einem der beiden DNA-Doppelstränge auftreten. Dabei ist den die DNA-Enden an den Bruchstellen durch DNA-Liga-
zumindest auf dem intakten DNA-Strang noch die gesam- se wieder miteinander verbunden. Dabei kommt es zu einem
te genetische Information erhalten. Problematischer sind Verlust von einem oder mehreren Nucleotiden an der Ver-
Schäden, bei denen beide Stränge der DNA-Doppelhelix knüpfungsstelle. Obwohl dadurch an der Bruchstelle eine
brechen und kein intakter Strang als Matrize für die Re- Mutation auftritt, scheint dieser Mechanismus eine akzep-
paratur vorhanden ist. Schäden dieser Art entstehen z.B. table Lösung zum Erhalt der Chromosomen darzustellen.
durch ionisierende Strahlung oder oxidative Reagenzien. Ein zweiter wesentlich leistungsfähigerer Mechanismus
Bei fehlender Reparatur dieser Brüche würde bald eine Frag- zur Doppelstrangbruchreparatur ist das homologe Verbin-
7.4 · Gentechnik
241 7

den von DNA-Enden (homologous end-joining). Bei diesem mosomen und führen sie zusammen. Dabei wird das in-
Mechanismus wird die Tatsache ausgenutzt, dass diploide takte Chromosom als Matrize benutzt um die genetische
Zellen zwei Kopien der gesamten genetischen Information Information auf das defekte Chromosom zu übertragen.
enthalten. Besondere Rekombinationsproteine erkennen Eine Reparatur ist so ohne Verlust von DNA Sequenzen
die entsprechenden Sequenzen auf den betroffenen Chro- möglich.

In Kürze
Die bei der DNA-Replikation auftretenden natürlichen Xeroderma pigmentosum ist eine Erkrankung des Men-
Fehler werden mit Hilfe der 3c-5c-Exonucleaseaktivitäten schen, bei der das DNA-Reparatursystem defekt ist. Die be-
der DNA-Polymerasen beseitigt. Darüber hinaus führen troffenen Personen haben ein erhöhtes Risiko für die Bil-
chemische oder physikalische Noxen zur Schädigung der dung von Tumoren. DNA-Doppelstrangbrüche werden
DNA. Solche Schäden werden entweder durch durch nicht-homologes »end-joining« oder durch homo-
4 Basenexcisionsreparatur oder loges »end-joining« beseitigt.
4 Nucleotidexcisionsreparatur beseitigt

7.4 Gentechnik Klonierung dieser DNA und den Vorgang der Einschleu-
sung rekombinanter DNA in Empfängerzellen als Trans-
Die in den vergangenen Jahren gewonnenen Erkenntnisse fektion oder Transformation. Ein Klon ist dann diejenige
über Struktur und Funktion von Nucleinsäuren haben zur Zellkolonie, die den Vektor mit Fremd-DNA enthält.
Entwicklung eines breiten Arsenals von molekularbiolo-
gischen Verfahren geführt, das zusammenfassend als Gen-
technik bezeichnet wird. Diese ermöglicht nicht nur die 7.4.2 Vektoren zum Einschleusen
Gewinnung neuer Erkenntnisse in der Grundlagenfor- fremder DNA in Zellen
schung, sondern auch die technische Herstellung von Nu-
cleinsäuren oder Proteinen. Wegen ihrer allgemeinen Be- ! Bakterielle Vektoren leiten sich von natürlichen Plasmi-
deutung werden im Folgenden ausgewählte gentechnische den oder Bakteriophagen ab.
Verfahren beschrieben.
Für alle gentechnischen Verfahren ist die Vermehrung iso-
lierter, spezifischer DNA-Sequenzen in beliebigen Mengen
7.4.1 Klonierung und Einschleusung eine unabdingbare Voraussetzung. Bakterien sind ideale
fremder DNA in Zellen Werkzeuge für diesen Zweck, da sie eine hohe Vermeh-
oder Organismen rungsrate zeigen und es relativ leicht gelingt, DNA unab-
hängig von ihrer Herkunft in sie einzuschleusen. . Abb. 7.27
Alle gentechnischen Verfahren beruhen darauf, dass Zellen stellt die Grundzüge der hierzu verwendeten Verfahren dar.
oder Organismen dazu gebracht werden, Bakterienzellen verfügen häufig über sog. Satelliten-DNA
4 fremde DNA mit spezifischen Eigenschaften aufzu- oder Plasmide. Plasmide sind kleine ringförmige DNAs
nehmen mit einer Größe bis zu 200 kb. Sie replizieren sich selbst
4 gegebenenfalls in ihr Genom zu integrieren unabhängig vom bakteriellen Chromosom. In Bakterien
4 zu replizieren und eventuell tragen derartige Plasmide die Gene für die Konjugation
4 die in der fremden DNA enthaltene Information zu ex- von Bakterienzellen oder auch für Antibiotikaresisten-
primieren zen. Plasmide können nach Lyse der Bakterien durch ein-
fache Zentrifugationsschritte vom bakteriellen Chromo-
Hierzu ist eine Reihe von Schritten notwendig, denen man som abgetrennt und in hoher Reinheit isoliert werden. Auf
bei gentechnischen Arbeiten immer wieder begegnet. Nach diese Weise isolierte Plasmide werden von intakten Bak-
der Isolierung der gewünschten DNA-Sequenzen, die im terien wieder aufgenommen, wenn diese durch eine
Folgenden als Fremd-DNA bezeichnet werden sollen, müs- entsprechende Vorbehandlung (Temperaturerhöhung,
sen diese mit einer geeigneten Träger-DNA verknüpft wer- Erhöhung der Calciumkonzentration) hierfür kompetent
den, die die Aufnahme in die Empfängerzelle, die Replika- gemacht werden. Gelingt es, nach der Isolierung in ein
tion und gegebenenfalls die Integration in das Genom er- derartiges Plasmid eine fremde DNA einzubauen (zu
möglichen. Derartige Träger-DNA-Moleküle werden als klonieren), so können mit diesen »künstlichen« Plasmiden
Vektoren bezeichnet, das Konstrukt aus Fremd-DNA und Bakterien transformiert und damit mit neuen, für die
Vektor auch als rekombinante DNA. Den Einbau von Bakterienzelle untypischen Eigenschaften ausgestattet
fremder DNA in einen Vektor bezeichnet man auch als werden.
242 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.28. Aufbau des Vektors pUC 18 als Beispiel für einen
typischen Plasmidvektor. Ori = Replikationsursprung in Bakterien;
AmpR = Gen für Ampicillinresistenz als Selektionsmarker; Polyklonie-
rungsstelle = Sequenz mit den Schnittstellen für die angegebenen
Restriktionsendonucleasen. Derartige Polyklonierungsstellen bieten
entsprechende Möglichkeiten bei der Wahl der verwendeten Restrik-
tionsendonucleasen; lacZc = Fragment des lacZ-Gens aus E. coli, wel-
ches für ß-Galactosidase codiert; lac promotor = Promotor für das
. Abb. 7.27. Klonierung fremder DNA in ein Plasmid und Trans- lacZc-Gen
formation von Bakterienzellen. (nach Watson et al.: Recombinant
DNA, 1992)

! Resistenzgene erlauben die Kontrolle der Klonierung. Um das Einfügen der fremden DNA zu erleichtern, ver-
fügen die für gentechnische Zwecke verwendeten Plasmide
Geeignete Plasmide, die für den Gebrauch im Labor kon- über eine sog. Polyklonierungsstelle (. Abb. 7.28). Sie
struiert wurden, sollen eine Reihe von spezifischen Eigen- besteht aus einer Basensequenz, in der hintereinander die
schaften besitzen (. Abb. 7.28). Sie müssen zunächst über Schnittstellen häufig verwendeter Restriktionsendonuclea-
einen Marker verfügen, der den Nachweis zulässt, dass das sen (7 Kap. 5.6.1) eingefügt sind. Mit der entsprechenden
Plasmid auch wirklich in Bakterienzellen vorhanden ist. Restriktionsendonuclease wird das Plasmid zunächst auf-
Meist geschieht dies durch Einführung eines Resistenzgens. geschnitten. Sorgt man dafür, dass die fremde DNA die für
So enthält der in . Abb. 7.28 dargestellte, sehr häufig ver- diese Restriktionsendonuclease typischen Basensequenzen
wendete Vektor pUC18 hierfür das Gen für die Ampicillin- am 3c- bzw. 5c-Ende trägt, so fügt sie sich unter entspre-
Resistenz. Bakterien, die mit diesem Plasmid erfolgreich chenden Inkubationsbedingungen in die Lücke ein und
transformiert wurden, können auf Ampicillin-haltigen kann danach mit Hilfe der DNA-Ligase (7 Kap. 7.2.3) fest in
Nährböden wachsen. Damit ein derartiges Plasmid auch als das Plasmid eingebaut werden. Bakterienzellen, die mit
Vektor verwendet werden kann, muss der Einbau fremder derartigen Plasmiden transformiert wurden, sind sog. gen-
DNA möglichst einfach gemacht werden. Im Prinzip muss technisch veränderte Organismen (GVOs), da sie eine
hierfür das Plasmid an einer definierten Stelle aufgeschnit- fremde, für sie nicht typische DNA tragen.
ten werden, sodass ein lineares Molekül entsteht, in welches Da die Ausbeute der Plasmidherstellung häufig weniger
die fremde DNA eingefügt werden kann. Nach Verknüp- als 100% beträgt, ergibt sich das Problem, diejenigen Bak-
fung der Fremd-DNA mit dem Plasmid entsteht wieder ein terien, die ein Plasmid mit eingebauter Fremd-DNA tragen,
ringförmiges DNA-Molekül, mit dem Bakterien transfor- von denjenigen zu unterscheiden, die ein Plasmid ohne
miert werden können. fremde DNA enthalten. Bei dem Plasmid pUC18 ist die
7.4 · Gentechnik
243 7

Polyklonierungsstelle in das lacZ-Gen von E. coli inkorpo-


riert, das für die E-Galactosidase codiert. Da die Polyklo-
nierungsstelle alleine die Expression des lacZ-Gens nicht
stört, exprimieren E. coli-Zellen, die das Plasmid ohne ein-
gebaute Fremd-DNA enthalten, die E-Galactosidase. Der- . Abb. 7.29. Aufbau eines künstlichen Hefechromosoms. Das
artige Bakterien können leicht daran erkannt werden, dass künstliche Hefechromosom besitzt an beiden Enden ein Telomer
sowie ein ARS-Element für die zelluläre Replikation. Dieses wird durch
sie eine Verbindung mit einer galactosidischen Bindung
ein Centromer (CEN) stabilisiert. In die Hefe-DNA kann über eine Poly-
(X-Gal) unter Bildung eines blauen Farbstoffs spalten kön- klonierungsstelle Fremd-DNA einkloniert werden. Das Leu-Gen ist ein
nen, also in blau gefärbten Kolonien wachsen. Wird in die Selektionsmarker, der für die Verwendung von Hefestämmen geeig-
Polyklonierungsstelle eine fremde DNA eingeschleust, so net ist, die einen Defekt bei der Biosynthese der Aminosäure Leucin
wird der Leserahmen des lacZ-Gens zerstört und die Bakte- zeigen. Zellen, die dieses YAC aufgenommen haben, können auf
Leucin-freien Nährböden wachsen
rien sind nicht mehr imstande, E-Galactosidase zu produ-
zieren. Sie bilden aus diesem Grund ungefärbte Kolonien.
Aufgrund ihrer beschränkten Größe können Plasmide
Fremd-DNA nur in einer Länge von einigen tausend Basen- ! Vektoren für die Expression von Proteinen enthalten
paaren aufnehmen. Für DNA-Abschnitte bis zu einer Kontrollsequenzen für die Transkription und Translation
Größe von etwa 20 kb empfiehlt sich deren Einbau in be-
stimmte Bakteriophagen, z.B. den Bakteriophagen λ. Im Bis etwa Mitte der 80er Jahre des vorigen Jahrhunderts
Prinzip wird dabei so vorgegangen, dass die lineare Phagen- konnten zelleigene Proteine nur dann weitergehend unter-
DNA durch entsprechende Restriktionsenzyme aufgeschnit- sucht werden, wenn sie in großem Maßstab aus Zellen ge-
ten und die fremde DNA in die entstandene Lücke einge- reinigt wurden. Dabei bewegte sich die Ausbeute an reinem
baut wird. Derartig modifizierte Phagen-DNA kann in vitro Protein bei einer Ausgangsmenge von mehreren Gramm
in infektiöse Phagenköpfe verpackt und damit zur Trans- Zellmaterial oft im Milligramm- oder Mikrogramm-Be-
formation von Bakterien verwendet werden. reich. Mit Hilfe der Gentechnik und geeigneten Expres-
sionsplasmiden (. Abb. 7.30) lassen sich inzwischen große
! Für Hefezellen können künstliche Chromosomen her-
Mengen eines Proteins entweder in Bakterien, Hefen oder
gestellt werden.
auch tierischen und menschlichen Zellen herstellen. Expres-
Bakterien können für die Expression eukaryoter Gene dann sionsplasmide enthalten starke Promotoren, die eine hohe
von Nachteil sein, wenn die exprimierten Proteine post- Expressionsrate gewährleisten. Oftmals stammen solche
translational, beispielsweise durch Anfügung von Kohlen- Promotoren aus Viren. Darüber hinaus enthalten die Expres-
hydratseitenketten, modifiziert werden müssen. In diesem sionsplasmide Spleiß-Signale, was den Transport des primä-
Fall ist eine Amplifizierung der fremden DNA in eukaryo- ren Transkripts aus dem Kern einer eukaryoten Zelle in das
ten Zellen notwendig. Häufig werden hierfür Hefezellen Cytosol zur Translation erleichtert.
verwendet, da diese wie Bakterien in beliebig großen Sus- Polyadenylierungssignale tragen zur korrekten post-
pensionskulturen gehalten werden können und ihre Genetik transkriptionalen Prozessierung bei. Zur Vermehrung in
sehr gut untersucht ist. Bakterien wie auch in tierischen Zellen verfügen die Plas-
Viele der für die Transfektion von Hefezellen verwen- mide sowohl über einen bakteriellen als auch einen eukaryo-
deten Plasmide leiten sich von bakteriellen Plasmiden ab. ten Replikationsursprung. Bei der Synthese von eukaryoten
Damit sie in Hefezellen auch repliziert werden können, be- Proteinen in Bakterienzellen ergibt sich die Schwierigkeit,
nötigen sie lediglich ein für Hefe typisches Element, welches dass eukaryotische Gene oft Introns besitzen, die zwar trans-
auch als ARS-Element (autonom replizierende Sequenz) kribiert werden, die aber vor der Translation aus der mRNA
bezeichnet wird. Sehr große Bruchstücke fremder DNA (bis herausgeschnitten werden. Bakterien fehlt die Maschinerie,
etwa 300 kb) können mit Hilfe künstlicher Hefechromo- diese Introns zu eliminieren. Daher verwendet man für
somen, den sog. YACs (yeast artificial chromosome) in die Expression von Genen in Bakterien cDNA-Sequenzen
Hefezellen eingebracht werden. Wie aus . Abb. 7.29 zu ent- (7 Kap. 7.4.3), denen die Introns fehlen.
nehmen ist, handelt es sich um lineare DNA-Moleküle, die Häufig produzieren Bakterien die Fremdproteine in
die typischen Eigenschaften von Chromosomen zeigen. An großen Mengen und schließen sie in unlöslicher, denatu-
den beiden Enden befinden sich telomere Sequenzen, da- rierter Form in sog. inclusion bodies ein. Hier müssen dann
rüber hinaus trägt das künstliche Chromosom ein ARS- aufwendige Aufschluss- und Reinigungsverfahren bis zur
Element, ein Centromer sowie einen Selektionsmarker, Gewinnung eines reinen Proteins angewandt werden.
Leu 2+, der die Identifizierung transfizierter Hefezellen er- Viele eukaryote Proteine werden posttranslational
möglicht. Das YAC verfügt über Schnittstellen für Restrik- durch Phosphatgruppen oder Kohlenhydratketten modifi-
tionsendonucleasen, in die fremde DNA nach dem für ziert. Da Bakterien derartige Modifikationen nicht durch-
bakterielle Vektoren beschriebenen Vorgehen inseriert führen können, müssen solche Proteine in tierischen Zellen
werden kann. exprimiert werden. Für die anschließende Abtrennung des
244 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.30. Zusammensetzung eines typischen für tierische


Zellen geeigneten Expressionsvektors. Der Vektor enthält den Pro-
motor des Cytomegalievirus (CMV), ein starker Promotor, hinter dem
sich die Polyklonierungsstelle befindet. Anschließend an die Fremd-
7 DNA befindet sich zur Verbesserung der Expression ein Intron, ein . Abb. 7.31. Schematische Darstellung der Herstellung einer
Polyadenylylierungssignal, sowie eine Terminationssequenz aus dem genomischen Genbank. (Einzelheiten 7 Text)
SV40-Virus (7 Kap. 5.6.1). Für die Verwendung in Prokaryoten trägt
der Vektor das Ampicillinresistenzgen ampR sowie einen bakteriellen
Replikationsursprung (ColE1ori). PKS = Polyklonierungsstelle
Zur Herstellung einer genomischen Genbank geht man
nach dem in . Abb. 7.31 dargestellten Schema vor. Die Ge-
gewünschten Proteins von den Proteinen der Wirtszelle samt-DNA einer Zellpopulation wird isoliert und mit Hilfe
werden Expressionsvektoren verwendet, die dem zu expri- geeigneter Restriktionsenzyme (7 Kap. 5.6.1) in entspre-
mierenden Protein eine zusätzliche Proteinsequenz anhän- chende Bruchstücke zerlegt. Je nach der Art der gewählten
gen, die die Reinigung des Proteins erleichtert. Eine solche Restriktionsendonuclease werden diese Bruchstücke unter-
Sequenz ist z.B. ein Cluster aus 6 Histidinresten, der eine schiedliche Längen, jedoch identische 5c- und 3c-Enden
Reinigung über eine Affinitätschromatographie an einer haben. Dieses Gemisch von DNA-Bruchstücken wird nun
mit Ni2+-Ionen beladenen Matrix erleichtert. mit einer entsprechenden Menge von mit derselben Re-
striktionsendonuclease aufgeschnittenen Plasmiden inku-
biert und anschließend ligiert. Bei der Wahl der richtigen
7.4.3 Herstellung spezifischer Bedingungen lässt sich die gesamte DNA des betroffenen
DNA-Sequenzen Organismus in Bruchstücke zerlegen und so in Vektoren
einbauen, dass jeder Vektor möglichst nur ein Bruchstück
Die erfolgreiche Verwendung der oben beschriebenen Vek- enthält. Transformiert man nun eine entsprechende Bak-
toren setzt natürlich voraus, dass die gewünschte fremde terienpopulation mit diesen Bruchstücken, lassen sich die
DNA in hoher Reinheit zur Verfügung steht und darüber Bedingungen so wählen, dass durchschnittlich eine Bakte-
hinaus die für die Einfügung passenden, den Schnittstellen rienzelle ein Plasmid aufgenommen hat. Die gesamte DNA
der jeweils verwendeten Restriktionsendonucleasen ent- des betreffenden Organismus ist nun in Bruchstücke zer-
sprechenden Sequenzen enthält. Die Auswahl der verwen- schnitten und in Form von Plasmiden auf Bakterien ver-
deten Fremd-DNA hängt vom Ziel der geplanten Untersu- teilt. Die ganze Sammlung dieser Plasmide bezeichnet man
chungen ab. Für wissenschaftliche Untersuchungen, wie als genomische DNA-Bibliothek. Da die DNA mit den
z.B. die Erforschung der Genregulation, wird man häufig Restriktionsenzymen nach dem Zufallsprinzip geschnitten
genomische DNA benötigen. Kommt es dagegen auf die wurden, enthalten nur wenige Plasmide komplette Gene.
Produktion eines spezifischen Proteins an, so wird es güns- Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass in bakteriellen
tig sein, ein DNA-Molekül zu verwenden, dessen Sequenz Plasmiden nur relativ kleine DNA-Fragmente unterge-
derjenigen der mRNA entspricht, d.h. keine Introns mehr bracht werden können. Häufig wählt man aber für die Her-
enthält (cDNA). Eine besonders elegante Möglichkeit ist die stellung genomischer Genbanken Restriktionsenzyme, die
Herstellung spezifischer DNA-Sequenzen durch die Poly- relativ große DNA-Bruchstücke erzeugen. Diese werden
merase-Kettenreaktion (7 Kap. 7.4.3). dann in die DNA von Bakteriophagen kloniert. Bei diesen
Organismen handelt es sich um Viren, die Bakterien befal-
! Genomische DNA wird in genomischen DNA-Banken len und sich in diesen vermehren. Eine weitere Alternative
amplifiziert. ist die Verwendung von künstlichen Hefechromosomen.
7.4 · Gentechnik
245 7

. Abb. 7.33. Das bakterielle Expressionsplasmid pET. ori = Repli-


kationsursprung in Bakterien; ampR = Gen für Ampicillinresistenz als
Selektionsmarker; PKS = Polyklonierungsstelle; lacO = Lactoseopera-
tor; lacI = LacI Gen; PT7 = Promotor für die virale RNA-Polymerase T7

H), welche den RNA-Teil des entstehenden RNA-DNA-


Hybridstrangs hydrolysiert, sodass in einem zweiten Durch-
gang die reverse Transkriptase einen vollständigen DNA-
Doppelstrang synthetisieren kann. Die auf diese Weise
entstandenen cDNA-Moleküle müssen an den Enden mit
Oligonucleotiden versehen werden, die für ihren Einbau
in Plasmide und andere Vektoren geeignet sind. Nach
Transformation von Bakterien mit derartigen Vektoren ent-
steht auf diese Weise eine cDNA-Bibliothek. Jeden einzel-
nen Klon bezeichnet man als cDNA-Klon, der einer für ein
Protein codierenden Sequenz entspricht.
. Abb. 7.32. Herstellung von cDNA durch Behandlung von mRNA Wenn nicht nur die Amplifizierung einer bestimmten
mit reverser Transkriptase. (Einzelheiten 7 Text) DNA-Sequenz gewünscht ist, sondern auch die Herstellung
des gewünschten Genprodukts in Form eines Proteins, so
bietet sich als Möglichkeit die Herstellung einer Expres-
! cDNA-Banken enthalten DNA-Sequenzen, die komple- sions-cDNA-Bank an. Hierzu müssen die verwendeten
mentär zu mRNA sind. Plasmide oder andere Vektoren so modifiziert werden, dass
sie starke Promotoren (7 Kap. 8.1.2) enthalten. . Abbildung
Genbanken, die ausschließlich für Proteine codierende 7.33 zeigt das für diese Zwecke häufig verwendete und zur
Sequenzen enthalten sollen, müssen nach einem anderen Transformation von Bakterien geeignete Plasmid pET. Als
Verfahren hergestellt werden. Man erzeugt hierzu DNA- Selektionsmarker enthält es das Gen für Ampicillinre-
Kopien von mRNA-Molekülen (. Abb. 7.32). Hierzu wer- sistenz. Vor der Polyklonierungsstelle liegt ein Lactose-
den zunächst die in einer Zellpopulation vorhandenen operator, gefolgt vom Promotor der viralen RNA-Polyme-
mRNA-Moleküle isoliert. Da sie alle über eine längere rase T7. Außerdem enthält das Plasmid das lacI-Gen und
Poly(A)-Sequenz am 3c-Ende verfügen (7 Kap. 8.3.3, 8.3.6), zwei weitere, als ori bezeichnete genetische Elemente, die
gelingt dies mit Hilfe einer Affinitätschromatographie an für die Vermehrung des Plasmids in Bakterienzellen sor-
Oligo-dT-Cellulose. Anschließend werden die mRNA-Mo- gen. Die Verwendung dieses Plasmids gewährleistet eine
leküle in sog. cDNA (complementary DNA) umgeschrieben. sehr starke Expression einklonierter Gene als Protein, aller-
Hierfür wird ein in Retroviren (7 Kap. 10.2.4) vorkommen- dings nur in Bakterienzellen, die die virale RNA-Polymerase
des Enzym verwendet, die reverse Transkriptase. Sie ist T7 exprimieren. Für die Klonierung einer cDNA und deren
eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und kann als Ma- Expression als Protein sind folgende Schritte notwendig:
trize sowohl RNA- als auch DNA-Einzelstränge verwenden. 4 Einklonieren der durch reverse Transkription (7 o.) er-
Die reverse Transkription wird dadurch gestartet, dass an stellten cDNA in die Polyklonierungsstelle des Plasmids
das Poly(A)-Ende der mRNA-Moleküle Thymin-Oligo- pET
nucleotide anhybridisiert werden, welche als Primer für 4 Transformieren des Plasmids in spezielle, gentechnisch
die weitere Kettenverlängerung dienen. Als Teilaktivität modifizierte Bakterienzellen, die die bakterielle RNA-
enthält die reverse Transkriptase eine Ribonuclease (RNase Polymerase T7 in hoher Aktivität exprimieren
246 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

. Abb. 7.34. Verfahren zum Screenen (Durchmustern) von Gen-


banken (nach Watson et al.: Recombinant DNA, 1992)

4 Selektion und Vermehrung der das Plasmid tragenden


Bakterienzellen. Wegen des Vorhandenseins des lacI-
Gens wird der lac-Repressor produziert, der an den lac-
Operator im Plasmid bindet und die Transkription der
einklonierten cDNA mit Hilfe des T7-Promotors ver-
hindert
7 4 Nach der Vermehrung der Plasmide in den transfor-
mierten Bakterienzellen setzt man den Induktor Isopro-
pylthiogalactosid zu. Dieses Galactosid bindet an den
lac-Repressor und gibt damit den Operator frei. Da in
der Zelle hohe Aktivitäten der T7-RNA-Polymerase
vorhanden sind, beginnt jetzt die Transkription der
cDNA. Es werden große Mengen mRNA erzeugt, die
rasch vom bakteriellen Proteinbiosynthese-Apparat in
Proteine translatiert werden
! Aus DNA-Banken können spezifische DNA-Sequenzen
isoliert werden.

Die oben geschilderten Verfahren zur Herstellung von Gen-


Banken liefern eine Sammlung von Bruchstücken von ge-
nomischer DNA oder von revers transkribierter mRNA. Da
sich Bakterien nahezu unbegrenzt vermehren lassen, kön-
nen derartige Sequenzen auf diese Weise beliebig ampli-
fiziert werden, was den Vorteil bietet, auch in nur geringer
Kopienzahl vorkommende DNA-Sequenzen in großer
Menge zur Verfügung zu haben.
Das Problem, aus diesem Gemisch jeweils eine spe-
zifische DNA-Sequenz zu isolieren, wird durch das Durch-
mustern oder screenen von DNA-Banken gelöst. Eine häu-
fig hierfür verwendete Methode ist in . Abb. 7.34 darge-
stellt. Zunächst ist es notwendig, die Bakterienpopulation
in Petrischalen zu vereinzeln und zu Einzelzellkulturen
hochzuziehen. Von der Petrischale wird ein Abklatsch auf
einen Nitrocellulosefilter gemacht. Die auf dem Abklatsch
befindlichen Bakterien werden lysiert und mit einer Sonde ermittelt werden, so genügt es, aus dem gereinigten Protein
identifiziert. Die entsprechenden Bakterienkolonien kön- durch proteolytische Verdauung einige geeignete Bruch-
nen danach auf der Petrischale aufgesucht, in Kultur ge- stücke herzustellen, die sequenziert werden können. Aus
nommen und hochgezogen werden. Die benötigten DNA- den erhaltenen Partialsequenzen lassen sich leicht die zu-
Sonden können dann besonders leicht hergestellt werden, gehörigen Oligonucleotidsequenzen ableiten, die chemisch
wenn bereits Teilsequenzen der gesuchten DNA bekannt synthetisiert und als Sonden verwendet werden können.
sind. Die minimale Länge einer derartigen Sonde sollte Eine Alternative ist das Durchmustern von Expressions-
etwa 20 Nucleotide betragen. Soll mit Hilfe gentechnischer banken mit Hilfe von Antikörpern gegen das synthetisierte
Verfahren die gesamte Aminosäuresequenz eines Proteins Protein.
7.4 · Gentechnik
247 7

! Spezifische DNA-Sequenzen können durch die Poly-


merase-Kettenreaktion amplifiziert werden.

1984 veröffentlichte Kary Mullis eine Methode zur Am-


plifizierung von Nucleinsäure-Fragmenten in vitro, die in-
zwischen zu einer der am meisten benutzten Standard-
methoden der Molekularbiologie geworden ist. Sie kommt
ohne die Verwendung von Zellen als Werkzeuge aus. Das
Prinzip dieser auch als Polymerase-Kettenreaktion (PCR,
polymerase chain reaction) bezeichneten Methode ist in
. Abb. 7.35 am Beispiel der Amplifizierung einer spezi-
fischen Sequenz eines DNA-Doppelstrangs dargestellt.
Dieser wird zunächst durch Erhöhung der Temperatur auf
etwa 90°C denaturiert. Danach wird das Gemisch auf etwa
50°C abgekühlt und zwei aus etwa 15–25 Basen bestehende
Oligonucleotide zugesetzt, die der Sequenz an den 5c-En-
den der beiden Einzelstränge komplementär sind. Durch
Zusatz einer DNA-Polymerase und Desoxyribonucleotiden
werden die beiden Einzelstränge nun zum jeweiligen Dop-
pelstrang komplementiert. Anschließend wiederholt sich
derselbe Reaktionszyklus, welcher aus
4 Denaturierung
4 Anheften der Oligonucleotide sowie
4 Extension zu neuen Doppelsträngen besteht

Werden diese Zyklen mehrfach wiederholt, so ergibt sich


eine exponentielle Zunahme der amplifizierten DNA-Mo-
leküle. In der Theorie ist die Amplifizierung mit dieser
Methode außerordentlich effektiv. Mit nur 20 Reaktions-
zyklen ergibt sich eine 220 (106)-fache Amplifizierung eines
Moleküls doppelsträngiger DNA. In der Praxis benötigt
man 20–30 Reaktionszyklen um eine ausreichende DNA-
Vermehrung zu erreichen. Ein einzelner Zyklus dauert etwa
5 min, sodass eine solche DNA-Vermehrung in 1.5 bis
2 Stunden erzielt werden kann. Da in jedem Zyklus zur
Trennung der DNA-Doppelstränge eine kurze Hitzebe-
handlung notwendig ist, benötigt man für die PCR eine
besondere DNA-Polymerase, die z.B. aus thermophilen
Bakterien stammt. Diese Bakterien leben in heißen Quellen
und produzieren Enzyme, die auch bei Temperaturen von
90–95°C stabil sind. Das für die PCR heute am meisten ver-
wendete Enzym stammt aus dem Organismus Thermus
aquaticus und wird infolgedessen als Taq-Polymerase be-
zeichnet. Die einzelnen Reaktionszyklen werden in der mo-
dernen PCR in automatisierten Thermostaten (Thermo-
cycler) durchgeführt.
Das PCR-Verfahren wurde ursprünglich für die Ampli-
fizierung von DNA-Fragmenten beschrieben und eignet
sich für DNA-Stücke von einigen 100 bis mehreren 1000
Basenpaaren Länge. Inzwischen sind eine Reihe von Va-
rianten der PCR beschrieben worden. So ist es beispiels-
weise mit Hilfe der RT-PCR (Reverse Transkription-PCR)
möglich, auch RNA als Ausgangsmaterial zu verwenden.
Isolierte mRNA wird zunächst mit der reversen Transkrip- . Abb. 7.35. Amplifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz
tase in cDNA umgeschrieben, die dann als Ausgangsma- durch die Polymerase-Kettenreaktion
248 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

trize für die Amplifikation dient. Die PCR-Methodik hat sucht werden. Ein besonders elegantes Verfahren für die
ein ungewöhnlich breites Feld von Anwendungsmöglich- Mutagenese benützt den gezielten Austausch von Basen
keiten. Mit ihrer Hilfe können nicht nur herkömmliche Hilfe der PCR.
molekularbiologische Aufgaben wesentlich einfacher durch-
! Die Funktionen regulatorischer Sequenzen können
geführt werden, sondern auch charakteristische DNA-Se-
durch gentechnische Verfahren analysiert werden.
quenzen einzelner Zellen analysiert, neue Gene identifiziert,
neue Krankheitserreger bestimmt und Untersuchungen Die Expression aller eukaryoten Gene hängt ebenso wie die
über die Evolution der Arten durchgeführt werden. Eine von prokaryoten Genen von der Anwesenheit von Kontroll-
mit der besonders hohen Amplifikationsfähigkeit der PCR- elementen ab. Diese befinden sich meist, aber nicht immer,
Methode zusammenhängende Fehlerquelle besteht in der in DNA-Bereichen, die sich am 5c-Ende, d.h. oberhalb des
Kontamination durch nicht in den PCR-Ansatz gehörende Startpunkts für die Transkription, über mehrere hundert
DNA. Diese kann z.B. aus Hautschuppen oder im Speichel Basen erstrecken und auch als Promotoren bezeichnet wer-
enthaltenen Zellen des Experimentators stammen, am den (7 Kap. 8.1.2). Die Analyse derartiger Kontrollelemente
häufigsten aber aus vorangegangenen PCR-Ansätzen. Aus ist für das Verständnis der Genregulation von ganz beson-
diesem Grund sind für alle PCR-Experimente die ver- derer Bedeutung.
schiedensten Negativkontrollen eine unabdingbare Voraus- Ein besonderer Fortschritt für die Analyse von Pro-
setzung. motoren besteht in der Verwendung von sog. Reporter-
genen.
7 Ein besonders häufig verwendeter Reporter ist das
7.4.4 Gentechnik und Grundlagen- Luciferase-Gen. Luciferase ist ein bei Leuchtkäfern oder
wissenschaften Leuchtbakterien vorkommendes Enzym, das unter Licht-
emission die Umsetzung des Pigments Luciferin nach fol-
Gentechnische Verfahren ermöglichen eine derartige Fülle gender Reaktion katalysiert:
von Anwendungsmöglichkeiten, dass sie für die heutige
molekularbiologisch orientierte Biochemie, aber auch für
viele Aspekte der Mikrobiologie, Botanik, Zoologie, sowie
besonders der Medizin von ganz besonderer Bedeutung
sind. Im Folgenden sollen einige besonders häufig ange- . Abbildung 7.36 stellt die Verwendung des Luciferasegens
wandte gentechnische Verfahren eingehender geschildert für die Analyse der Funktionsfähigkeit von Promotoren
werden.
! Gentechnische Verfahren werden zur Analyse der
Struktur neuer unbekannter Gene eingesetzt.

Im Prinzip müssen hierzu die durch das Durchmustern von


Genbanken aufgefundenen spezifischen DNA-Sequenzen
noch einmal in einer Reinkultur der betroffenen Bakterien
amplifiziert und danach sequenziert werden. Die hierfür
notwendigen Techniken sind inzwischen so weit verfeinert,
dass Projekte, wie die vollständige Sequenzierung des Hefe-
genoms oder gar des menschlichen Genoms abgeschlossen
werden konnten.
! Gentechnische Verfahren erlauben die Analyse von
Struktur-Funktions-Beziehungen in Proteinen.

Die Möglichkeiten zur Untersuchung von Struktur-Funk-


tions-Beziehungen von Proteinen sind durch gentechnische
Verfahren ganz wesentlich erweitert worden. So gelingt es
beispielsweise relativ leicht, gezielte Mutationen in die
cDNA von interessierenden Proteinen einzuführen. Im ein-
fachsten Fall geschieht dies durch Behandlung mit muta-
genen Verbindungen. Die mutagenisierten Plasmide wer-
. Abb. 7.36. Funktionsanalyse von Promotoren mit dem Luci-
den anschließend zur Transfektion von Bakterien verwen-
ferase-Gen als Reportergen. An einen vollständigen bzw. einen
det, sodass eine Genbank mutierter Plasmide entsteht. Aus partiell deletierten Promotor wird das Luciferase-Gen fusioniert und
ihnen können in entsprechenden Expressionssystemen in mit diesem Konstrukt transfizierten Zellen anschließend die Bio-
mutierte Proteine hergestellt und auf ihre Funktion unter- lumineszenz bestimmt
7.4 · Gentechnik
249 7

dar. Zunächst wird die interessierende Promotorsequenz ! Das Hefe-Zwei-Hybrid-System erlaubt den Nachweis
bzw. Bruchstücke derselben isoliert und mit dem Luciferase- von Protein-Protein-Wechselwirkungen.
gen fusioniert. Eukaryote Zellen werden mit den auf diese
Weise hergestellten Fusionsgenen transformiert. Aktive Pro- Das Hefe-Zwei-Hybrid-System (yeast two hybrid system)
motoren können anschließend sehr leicht anhand der benützt Transkriptionsfaktoren der Hefe zur Aufdeckung
Luciferaseaktivität in Zelllysaten analysiert werden. Zu ih- von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Grundlage ist der
nen muss lediglich Luciferin, ATP und Sauerstoff gegeben für die Hefezellen spezifische Transkriptionsfaktor GAL4.
und anschließend über eine festgelegte Zeit die Lichtemis- Wie alle Transkriptionsfaktoren ist dieser aus zwei Domä-
sion beobachtet werden. Da die gemessene Biolumineszenz nen zusammengesetzt, einer DNA-Bindedomäne (GAL4-
direkt proportional der Menge an Luciferase ist, kann man DBD) sowie einer Domäne, die für die Aktivierung der
auf die durch die Promotoren bzw. ihre Bruchstücke ausge- Transkription verantwortlich ist, die so genannte Transak-
löste Transkriptionsrate schließen. tivierungsdomäne (GAL4-AD). Normalerweise sind beide
Zur Analyse der Funktion eines Gens ist es in vielen Fäl- Domänen auf einem Protein zusammengefasst. Man kann
len nützlich zu wissen, wo das betreffende Gen in der Zelle die beiden Domänen jedoch auch als jeweils getrennte Pro-
exprimiert wird. Dazu erzeugt man Vektoren, die für ein Hy- teine exprimieren. Diese sind nur dann aktiv, wenn sie über
bridprotein codieren. Dieses Hybridprotein besteht aus dem nichtcovalente Protein-Proteinwechselwirkungen zusam-
Protein, dessen Expression man untersuchen möchte und mengebracht werden. Diese Tatsache macht man sich ex-
dem grün fluoreszierenden Protein (green fluorescent pro- perimentell zunutze. Die Einzelheiten des Verfahrens sind
tein, GFP) der Qualle Aequoera victoria. Die Fluoreszenzin- in . Abbildung 7.38 dargestellt:
tensität ist dann proportional zur Menge des experimentellen Ausgangspunkt sind zwei für die Hefe geeignete Ex-
Proteins. Mit Hilfe mikroskopischer Methoden können zu- pressionsplasmide. Das erste codiert für ein Fusionsprotein
dem Änderungen der Lokalisation des Proteins in lebenden aus der GAL4-DNA-Bindedomäne und dem Protein, für
Zellen verfolgt werden. . Abb. 7.37 zeigt dies am Beispiel des das potentielle Bindungspartner gesucht werden, den so
Glucocorticoidrezeptors. Glucocorticoid-empfindliche Zel- genannten Köder (. Abb. 7.38a). Das zweite Plasmid co-
len wurden mit einem Expressionsplasmid transformiert, diert ebenfalls für ein Fusionsprotein, diesmal aus der
welches für ein Fusionsprotein aus dem Glucocorticoidre- GAL4-Transaktivierungsdomäne und dem möglichen Bin-
zeptor mit dem green fluorescent protein codiert. Der Gluco- dungspartner für den Köder, der als Beute bezeichnet wird
corticoidrezeptor ist in solchen Zellen an seiner intensiv (. Abb. 7.38b).
grünen Fluoreszenz mikroskopisch gut zu erkennen. Nach Passen Beute und Fänger tatsächlich zusammen, so wer-
Behandlung der Zellen mit dem Glucocorticoid Dexametha- den durch die sich daraus ergebenden Protein-Proteinwech-
son ist die Translokation des markierten Glucocorticoidre- selwirkungen die GAL4-DNA-Bindedomäne und die GAL4-
zeptors in den Zellkern gut zu sehen. Innerhalb einer Stunde Transaktivierungsdomäne so nahe zusammengebracht, dass
nach Zugabe des Glucocorticoids befindet sich der gesamte
Rezeptor im Zellkern, was aufgrund seines Mechanismus
auch der Erwartung entspricht. Köder

. Abb. 7.37. Nachweis der subzellulären Lokalisation des Gluco-


corticoidrezeptors. Glucocorticoidempfindliche Zellen wurden mit
einem Fusionsprotein aus Glucocorticoidrezeptor und green fluores-
cent protein transformiert. Nach Zugabe des Glucocorticoids Dexa-
methason ist die vollständige Translokation des Fusionsproteins in
den Zellkern zu beobachten. (Mit freundlicher Erlaubnis von M. Kawata . Abb. 7.38. Das Hefe-Zwei-Hybrid-System zur Analyse von
und Arch Histol Cytol, 2001) Protein-Protein-Interaktionen. (Einzelheiten 7 Text)
250 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

sie über einen Minimalpromotor die Transkription eines Re-


portergens aktivieren können (. Abb. 7.38c). Als Reporter-
gen wählt man zweckmäßigerweise ein Protein, das in Hefe-
zellen leicht nachgewiesen werden kann. Fusioniert man die
GAL4-Transaktivierungsdomäne mit den Proteinen aus ei-
ner cDNA-Bank, so lassen sich unter entsprechenden Bedin-
gungen mehrere potentielle Bindungspartner für das Fänger-
Protein auffinden. Da in diesem System sowohl falsch nega-
tive als auch falsch positive Ergebnisse auftreten können, ist
in jedem Fall eine Verifikation der gewonnenen Ergebnisse
mit einem anderen Verfahren notwendig.
! DNA-Mikroarrays können zur gleichzeitigen Analyse
der Expression von Tausenden von Genen benutzt
werden.

DNA-Mikroarrays sind Objektträger, auf die auf sehr engem


Raum eine Vielzahl von DNA-Sonden mit Hilfe entspre-
chender Roboter aufgebracht wurden. Als derartige Sonden
7 dienen DNA-Fragmente aus cDNA-Bibliotheken oder kür-
zere Nucleotidsequenzen aus einer Synthesemaschine bzw.
aus einer Polymerasekettenreaktion. Dabei ist die jeweilige
DNA-Sequenz und die Position der Sonde genau bekannt.
Somit kann jedes DNA-Fragment, das durch Hybridisie-
rung an eine DNA-Sonde auf dem Chip bindet, genau zu-
geordnet werden. Soll der DNA-Chip beispielsweise zur
Überprüfung der Genexpression in einer Zelle eingesetzt
werden, muss die mRNA isoliert und mit Hilfe von reverser
Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden. Dabei wird
. Abb. 7.39. Ausschalten (»knock-down«) von Genen mit Hilfe
die cDNA häufig noch mit einem Fluoreszenzfarbstoff von siRNA. (Einzelheiten 7 Text)
markiert. Anschließend erfolgt eine Hybridisierung. Die
Position auf dem Chip, an die die fluoreszierende DNA bin-
det, kann bestimmt und das korrespondierende DNA-Frag- bezeichnet. Die siRNA-Moleküle reagieren anschließend mit
ment identifiziert werden. Auf diese Weise werden z.B. einem Multienzymkomplex, der als RNA-induced silencing
Expressionsmuster von Krebszellen mit dem Expressions- complex (RISC) bezeichnet wird. In einer ATP-abhängigen
muster von normalen Zellen verglichen. Man erhält damit Reaktion entsteht zunächst aus der doppelsträngigen siRNA
Informationen über Fehlsteuerungen der Genexpression in einzelsträngige siRNA. Anschließend reagiert diese mit
Krebszellen, die wiederum dazu benutzt werden können, den komplementären Sequenzen auf der zellulären mRNA.
um neue Therapiestrategien zu entwickeln. Dies führt zur Aktivierung einer als Argonaute bezeichne-
ten RNAse, welche die mRNA abbaut.
! Gentechnische Verfahren eignen sich auch zur ge-
Die benötigte doppelsträngige RNA wird häufig durch
zielten Ausschaltung von Genen.
Mikroinjektion in die Zellen eingebracht. Da sie allerdings
Genausschaltung durch RNA-Interferenz. Die Technik der relativ rasch abgebaut wird, ist ihr Effekt nur von kurzer
RNA-Interferenz (RNAi) ermöglicht die Verminderung Dauer. Wünscht man längerfristige Genausschaltungen, so
der Expression spezifischer Gene und ermöglicht so die werden die Zellen üblicherweise mit einem Plasmid trans-
Gewinnung wichtiger Erkenntnisse über die Funktion formiert, das eine zur benötigten doppelsträngige RNA
dieser Gene. Sie beruht auf physiologischen Regulations- komplementäre DNA-Sequenz vor einem starken RNA-
mechanismen bei der Transkription eukaryoter Gene Polymerasepromotor enthält.
(7 Kap. 8.3) Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind in
. Abb. 7.39 dargestellt: Genausschaltung durch homologe Rekombination. Frem-
In die Zielzellen muss ein doppelsträngiges RNA- de DNA, welche von eukaryoten Zellen aufgenommen wird,
Molekül (dsRNA) eingeführt werden, welches komple- wird zu einem geringen Anteil durch Rekombination in das
mentär zu Sequenzen des auszuschaltenden Gens ist. Genom der Wirtszelle eingebaut. Dies geschieht in aller
dsRNA ist Substrat einer als DICER bezeichneten RNAse, Regel durch heterologe Rekombination, d.h. Einbau in eine
die doppelsträngige RNA in Bruchstücke aus etwa 20 Nuc- mit dem fremden Gen nicht verwandte Sequenz. Homologe
leotiden spaltet. Diese werden als silencing RNA (siRNA) Rekombination, d.h. Aufnahme in die identische Sequenz
7.4 · Gentechnik
251 7

. Abb. 7.40. Genausschaltung durch homologe Rekombination.


In die klonierte DNA des auszuschaltenden Gens wird, allerdings ohne
einen Promotor, ein Resistenzgen für ein zytotoxisches Antibiotikum
eingebaut. Nur bei homologer Rekombination kommt dieses unter
die Kontrolle eines Promotors und macht somit die Zellen resistent
gegen das Antibiotikum

des Genoms, findet sich zwar häufig bei Bakterien, Hefen


und bestimmten Viren, jedoch außerordentlich selten bei
tierischen Zellen. Da jedoch in der Theorie die homologe
Rekombination ein ideales Verfahren zur gezielten Modifi-
kation oder Ausschaltung von Genen darstellt, sind hoch
empfindliche Selektionsverfahren entwickelt worden, die
das Auffinden der wenigen homologen Rekombinanten aus
einer großen Zellpopulation erlauben. Eines der häufig ver-
wendeten Verfahren ist in . Abb. 7.40 dargestellt. Es beruht
darauf, dass in das durch homologe Rekombination einzu-
bauende Gen durch gentechnische Verfahren ein Resistenz-
gen für ein zytotoxisches Antibiotikum, z.B. Neomycin,
eingeführt wird. Dieses Gen darf allerdings keinen eigenen
Promotor enthalten. Wird ein derartiges Konstrukt durch
nicht homologe Rekombination in das Genom der Wirts-
zelle integriert, so wird wegen des Fehlens eines Promotors
das Resistenzgen nicht aktiviert und die Zellen bleiben . Abb. 7.41. Herstellung transgener Mäuse. (Einzelheiten 7 Text;
empfindlich gegenüber dem zytotoxischen Antibiotikum. nach Watson et al.: Recombinant DNA, 1992)
Bei homologer Rekombination gelangt das Resistenzgen
unter die Kontrolle des Promotors für das auszuschaltende Zellen höherer Organismen. Ein ganz anderes aufwendige-
Gen, die Zellen werden resistent gegenüber Neomycin und res Verfahren ist notwendig, um höhere Organismen mit
können aufgrund dieser Eigenschaft selektiert werden. stabilen, d.h. an die Nachkommen vererbbaren, neuen ge-
netischen Eigenschaften auszustatten. Die Technik zur Her-
stellung derartiger transgener Organismen ist ursprüng-
7.4.5 Herstellung transgener Tiere lich an Mäusen entwickelt worden. Inzwischen hat sich
gezeigt, dass nicht nur tierische, sondern auch pflanzliche
Die bisher besprochenen Veränderungen des genetischen Organismen genetisch manipuliert werden können. Das Vor-
Materials durch Einbringung fremder DNA betrafen pro- gehen zur Herstellung transgener Mäuse ist schematisch in
karyote, einzellige eukaryote Organismen und kultivierte . Abb. 7.41 dargestellt. Es beginnt mit der in vitro-Fertilisie-
252 Kapitel 7 · Replikation und Gentechnik

rung von Mäuseeiern. Fremde DNA kann mit einer Aus-


beute von bis zu 40% erfolgreich in das Mäusegenom ein-
gebracht werden, wenn sie in einen der beiden unmittelbar
nach der Fertilisierung nachzuweisenden Pronuclei inji-
ziert werden. Normalerweise werden einige hundert Kopien
der fremden DNA injiziert. Bringt man so modifizierte Ei-
zellen in scheinschwangere Mäuse ein, so entwickeln sie
sich normal. Das Vorhandensein des fremden Gens kann
bei den Nachkommen durch PCR-Analyse nachgewiesen
werden. Meist nimmt man hierzu eine kleine Gewebeprobe
vom Schwanz. Viele Untersuchungen haben gezeigt, dass
die auf diese Weise eingeführte Fremd-DNA stabil in das
Genom dieser Mäuse integriert wird und sich nach den
Mendel’schen Regeln vererbt. Durch geeignete Züchtung
können für die fremde DNA homozygote Mäuselinien her-
gestellt werden. Eine Alternative zu dem beschriebenen
Verfahren besteht darin, aus der durch Kaiserschnitt ent-
nommenen Blastozyste embryonale Stammzellen in Kul-
7 tur zu nehmen. Dabei können sie mit der fremden DNA
transfiziert werden. Durch Injektion derartiger Zellen in
neue Blastozysten nehmen diese an der folgenden Embryo-
nalentwicklung teil und bilden schließlich chimäre Mäuse
entsprechend der Verteilung der Stammzellen auf die un-
terschiedlichen Gewebe während der Embryogenese. Nor-
malerweise verwendet man als Donoren der embryonalen
Stammzellen sowie der Empfänger-Blastozysten Mäuse un-
terschiedlicher Fellfarbe, sodass chimäre Nachkommen an
der Fellfarbe leicht erkannt werden können.
An derartigen transgenen Mäusen werden viele Unter-
suchungen z.B.
4 zur Regulation der Embryogenese
4 zur gewebsspezifischen Genexpression
4 zur Biochemie der Geschlechtsausprägung und
4 zur Funktion einzelner Genprodukte durchgeführt

Ein weiteres Verfahren zur Funktionsanalyse spezifischer


Genprodukte beruht auf der Ausschaltung dieser Gene in
embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombina-
tion mit einem funktionslosen Gen. Nach Injektion der-
artiger Transfektanten in neue Blastozysten entstehen chi-
märe Mäuse mit dem entsprechend ausgeschalteten Gen,
aus denen durch Zuchtverfahren eine homozygote Mäuse-
linie hergestellt werden kann (. Abb. 7.42). Derartige
. Abb. 7.42. Herstellung transgener chimärer Mäuse durch
»Knockout-Mäuse« haben zu überraschenden Erkenntnis-
gentechnische Manipulation von Zellen aus der Blastozyste.
(nach Watson et al.: Recombinant DNA, 1992)
sen über die Funktion unterschiedlichster Genprodukte
geführt.
Literatur
253 7

In Kürze

Alle gentechnischen Verfahren beruhen im Prinzip Genomische Genbanken enthalten die Gesamtheit
darauf, dass Zellen oder Organismen dazu gebracht aller Gene in Form von Fragmenten in Vektoren. cDNA-
werden, fremde DNA aufzunehmen, sie gegebenenfalls Banken leiten sich von mRNA ab, aus der durch reverse
in ihr Genom zu integrieren, zu replizieren und wenn Transkription cDNA entstanden ist. Sie spiegeln das
gewünscht, die in der fremden DNA enthaltene Infor- Expressionsmuster einer Zelle oder eines Gewebes
mation in Form von Proteinen zu exprimieren. wider.
Als Genfähren (Vektoren) werden Gene können im Labor mit Hilfe der Polymerase-
4 Plasmide Kettenreaktion amplifiziert werden. Durch mehrere
4 λ-Phagen Reaktionszyklen stellt eine thermostabile DNA-Polyme-
4 künstliche Hefechromosomen (YACs) oder Viren rase zahlreiche Kopien von einer DNA-Matrize her.
benutzt Promotorregionen können mit Hilfe von Reporter-
genen analysiert werden. Dabei codieren die Reporter-
Resistenzgene sind nützliche Elemente zur Überprü- gene für Enzyme oder für fluoreszierende Proteine. Die
fung der erfolgreichen Klonierung. Ausschaltung eines Gens erlaubt in vielen Fällen Rück-
Sollen die Vektoren zur Expression von Proteinen schlüsse auf seine Funktion. Eine solche Ausschaltung
dienen, benötigen sie einen starken Promotor vor dem kann erfolgen durch die Verwendung von siRNA oder
zu exprimierenden Gen. homologe Rekombination.

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