Microbiologa General y Estomatologa ESOD FACS UNJBG. !

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TECNICA DE CULTIVO: SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I. INTRODUCCION Un medio de cultivo permite el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, para observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al contar con material en cantidad suficiente. Por ello consta de algunas propiedades (pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de aeroanaerobiosis, etc. , que ser!n las m!s idneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en particular, en la bacteriologa sistem!tica. "os medios de cultivo se dividen por su finalidad en# medios de enriquecimiento que tratan de aumentar el n$mero de bacteria e%istentes, si consideramos que se encuentran en cantidad muy e%igua, a la ve& que in'iben la flora de asociacin acompa(ante (y de aislamiento (que tienen por fin conseguir una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todas sus propiedades ) los dos primeros son principalmente lquidos y los segundos, slidos. "os medios selectivos son aquellos que poseen alg$n componente que permite o no le crecimiento de una especie bacteriana, car!cter de importancias para su identificacin, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies que 'ay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores (sustancias que varan su coloracin seg$n el pH del medio u otros ndices de reacciones qumicas definidas. *mbos medios selectivos o diferenciales pueden ser lquidos o slidos. +l aislamiento es la separacin de los microorganismos en grupos, que puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiologa. +l aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro (,e entiende por cultivo puro a la descendencia (clon de una sola c-lula , se reali&a principalmente en un medio slido. ,e inicia por la separacin de una sola c-lula a partir de una poblacin y requiere tambi-n que la colonia que surja de esta c-lula se mantenga separada de otras c-lulas o colonias. +l aislamiento de un cultivo puro puede 'acerse tambi-n en medios lquidos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por una dilucin en serie de la suspensin en un medio se consigue que en la $ltima dilucin se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedar!n separadas. II. OBJETIVOS .dentificar m-todos eficaces para el aislamiento de microorganismos. /onocer algunos m-todos para obtener un cultivo puro. III. MATERIALES 0uestras de cultivos bacterianos *sas y agujas de inoculacin Placas de Petri y tubos de ensayo con medio de cultivo *gar nutritivo 0ec'eros IV. METODOS 4.1 TECNICAS DE AISLAMIENTO Y SIEMBRA A. Aislamiento o! est!"a sim le: para muestras con poca cantidad de microorganismos. B. Aislamiento o! est!"a #!$%a&a: .nocular con el asa de 1o'lle la placa y reali&ar las estras tal y como se muestra en el siguiente esquema C. Aislamiento o! e'tensi(n #on )a!illa (asa de 2rigals3y Para el aislamiento de bacterias, mo'os y levaduras podemos reali&ar la t-cnica de e%tensin con varilla, donde el inculo sobre la placa con el medio es de 4,5 ml. "a t-cnica consiste en colocar el inculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o de acero ino%idable del que tenga la longitud del di!metro de la placa de Petri +sta varilla se introduce en un frasco con alco'ol y se flamea a la flama del mec'ero por lo menos tres veces para esterili&arla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar ,e deja en posicin vertical derec'a por 6 minutos, y se incuba

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D. Siem*!a o! la t+#ni#a &e )e!ti&o en la#a 5 /olocar 5 m" de la dilucin que le indiquen en una caja de Petri y reali&ar el procedimiento por duplicado. 7 *gregar de 56 a 74 ml de agar cuenta est!ndar, mantenido a 869/. : Homogeni&ar mediante ; movimientos de derec'a a i&quierda, ; en el sentido de las manecillas del reloj, ; en el sentido contrario y ; de atr!s a adelante, sobre una superficie lisa y 'ori&ontal 'asta lograr una completa incorporacin del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja. 8 +l tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente 'asta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe e%ceder de 74 minutos. 6 2ejar solidificar el medio e incubar a :6 9/ por 78 'oras o si es necesario 'asta las 8< 'oras, para el caso de bacterias y para el caso de los mo'os y levaduras de : a 6 das. "os movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribucin 'omog-nea del inoculo, claro est! que con la ayuda de las diluciones de tal forma que el recuento para bacterias sea de 76 a 764 Unidades =ormadoras de colonias (U=/ y para mo'os y levaduras de 56 a 564 U=/

E. Siem*!a en t$*os &e #$lti)o #on me&io s(li&o Por lo general se emplean para la conservacin de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioqumicas como el medio >=, ,.0 y 0.>. +l pico de flauta del medio agari&ado se inocula primero por puncin (cuando es necesario , seguido por una estra en el pico de flauta desde el fondo a la parte superior con un movimiento en ?,@ a medida que se retira el asa. +%isten dos variedades de cultivo en tubo# , -o! est!"as ,e utili&an los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el asa est-ril y sobre la superficie del medio se desli&a -sta en forma de estras. , -o! i#a&$!a ,e utili&an los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio pic!ndolo longitudinalmente. C$lti)o o! $nto +sta t-cnica de cultivo, generalmente se utili&a cuando necesitamos una gran cantidad de mo'o. .. C$lti)o en me&io l"/$i&o ,iembra en medios de cultivo lquidos. "a siembra en tubos de cultivo en medio lquido, el tubo debe inclinarse en un !ngulo de :4 9 y el asa de inoculacin debe tocar la superficie interna del vidrio, justo encima del punto donde la superficie del agar forma un !ngulo agudo. /uando el tubo es vuelto a su posicin vertical, el !rea de inoculacin queda sumergida debajo de la superficie, se puede agitar suavemente el asa en el interior del medio lquido. 0. C$lti)o en me&io semis(li&o * partir de un cultivo de 5<-78 'oras en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo . ,e debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 7 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. +s importante que la siembra se realice en lnea recta.

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Siem*!a en t$*os #on me&io s(li&o C$lti)o en me&io l"/$i&o C$lti)o en me&io semis(li&o

4.1 MOR.OLO02A COLONIAL 0orfologa colonial en placa para bacterias Una ve& sembrada la placa la descripcin de cada una de las colonias debe incluir# a3 TAMA4O: 2i!metro en mm, los lmites de tama(o de las colonias varan desde fracciones de milmetros 'asta 54 mm de di!metro. "a mayora de los microorganismos forman colonias de tama(o limitado al tiempo de incubacin. *3 .ORMA Y ELEVACI5N =>A0*# +s la apreciacin general de su figura# +"+B*/.CD# Eue puede ser#

#3 BORDE O MAR0EN: Se !e6ie!e al #onto!no &e las #olonias 7 $e&e se!: Ente!o8 on&$la&o8 Lo*$la&o8 #!ena&o8 6ilamentoso o !i%a&o. F>A2+ > 0*AG+D# Ot!as #a!a#te!"sti#as COLOR: Flanco, amarillo, marrn, anaranjado,negro, etc SU-ER.ICIE: "isa o rugosa AS-ECTO: H$medo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso CONSISTENCIA: ,uave (butirosa , viscosa, membranosa o dura, esta prueba se tiene que reali&ar con la ayuda de una asa. LU9 RE.LEJADA: colonias pueden ser brillantes o mate LU9 TRANSMITIDA: "as colonias pueden ser transl$cidas o transparentes V. RESULTADOS >bserve los diferentes tipos de crecimiento

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