LUCRARE PRACTIC|

METODE FIZICE DE EVALUARE A PROTEINELOR DIN SERUL SANGUIN

A. Date teoretice: refractometrie B. M\surarea prin refractometrie a concentra]iei proteinelor totale din serul sanguin C. Date teoretice: electroforez\, imunoelectroforez\ D. Separarea electroforetic\ a frac]iunilor proteice ale serului sanguin E. Date teoretice: fotocolorimetria F. Evaluarea fotocolorimetric\ a concentra]iei frac]iunilor proteice ale serului sanguin G. Aplica]ii n practica medical\ H. ntreb\ri [i exerci]ii

Evaluarea proteinelor serice este una din cele mai des `ntlnite determin\ri `n practica clinic\. Medicul poate ob]ine informa]ii deosebit de utile m\surnd att cantitatea total\ de proteine din serul pacientului (proteinemia), ct [i diferitele tipuri de proteine care pot fi separate `n prezent prin metode electroforetice. Astfel, cantitatea de albumine sc\zut\ poate indica o alterare a sintezei hepatice sau o pierdere a lor la nivel renal, `n diverse afec]iuni. Gamaglobulinele permit aprecierea func]iei imunitare etc. ~n lucrarea practic\ vor fi prezentate cele mai uzuale metode `ntlnite `n laboratorul clinic pentru determinarea proteinelor, dar vor fi f\cute referiri [i la alte metode mai complexe, care permit o separare mai bun\ a acestor molecule.

139

LUCRARE PRACTIC|

B. M\surarea prin refractometrie a concentra]iei proteinelor totale din serul sanguin

PARTEA PRACTIC|
Scopul refractometriei este m \ s u r a r e a c o n c e n t r a ] i e i u n e i s u b s t a n ] e . De exemplu, de interes medical este determinarea concentra]iei proteinelor totale din serul sanguin. Metoda se bazeaz\ pe faptul c\ i n d i c e l e d e refrac]ie variaz\ `n func]ie de concentra]ia moleculelor din mediul r e f r i n g e n t c o n s i d e r a t , dup\ o ecua]ie de forma: n = f ( c) ~n exemplul de mai sus, dac\ din sngele integral `ndep\rt\m prin coagulare elementele figurate (care sunt puternic refringente), vom ob]ine serul sanguin. I n d i c e l e s\u de refrac]ie depinde numai de con]inutul `n p r o t e i n e , deoarece ionii au o putere refringent\ foarte mic\. Aceasta `nseamn\ c\ evaluarea concentra]iei proteinelor din serul sanguin se poate face m\surnd fie indicele de refrac]ie al lichidului biologic, fie unghiul limit\ limit\ corespunz\tor (care depinde de indicele de refrac]ie). Ca urmare, exist\ dou\ tipuri de refractometre: I. R e f r a c t o m e t r u l A b b - a c\rui scal\ gradat\ permite citirea direct\ a i n d i c e l u i d e r e f r a c ] i e al lichidului de cercetat; II. R e f r a c t o m e t r u l P u l f r i c h - pe scala c\ruia se cite[te u n g h i u l l i m i t \ , care va fi apoi transformat `n indice de refrac]ie [i concentra]ie de substan]\. I. ~n cazul refractometrului P u l f r i c h , piesa esen]ial\ care permite m\surarea unghiului limit\ este
140

Refractometrul Pulfrich (1921)

Fig. 3

LUCRARE PRACTIC|

i90

n1 n2

Fenomenul de reflexie total\ la limita de separare a prismei de m\sur\ `n cazul refractometrului Pulfrich

Fig. 4

p r i s m a d e m \ s u r \ , confec]ionat\ din sticl\ optic\ cu un indice de refrac]ie cunoscut. ~ntre una din fe]ele acestei prisme (numit\ fa]a de inciden]\ inciden]\, corespunznd prismei de m\sur\) [i substan]a a c\rui indice de refrac]ie se determin\, se stabile[te un contact optic. Acesta constituie suprafa]a de separare pe care are loc refrac]ia total\. Razele emergente se observ\ `n lunet\ prin cea de-a doua fa]\ - fa]a de convergen]\ convergen]\ a prismei, care corespunde prismei de iluminare. S\ urm\rim fenomenul care se produce la limita de separa]ie `n acest caz (fig. 4). Conform principiului reversibilit\]ii razelor de lumin\, consider\m un fascicul de radia]ii monocromatice care p\trunde `n mediul mai pu]in dens (cu indice de refrac]ie n1) sub un unghi de aproximativ 90. ~n acest caz, unghiul de refrac]ie va avea valoarea corespunz\toare unghiului limit\ (l l). Legea a doua a refrac]iei se poate scrie: sin i n 2 = =n sin r n1

Dar i = 90, iar r va fi `nlocuit cu l; `n acest caz rela]ia se va scrie:

sin 90 n 2 = sin l n1
3 2 1 7 5 6 4

dar sin 90 = 1 [i atunci rela]ia devine: n 1 = n 2 sin l Aceasta este rela]ia fundamental\ fundamental\ pe care se bazeaz\ construc]ia [i folosirea refractometrelor. Din rela]ia precedent\ se observ\ c\, m\surnd valoarea unghiului limit\ (l) [i cunoscnd valoarea indicelui de refrac]ie al sticlei (n2), putem afla care este valoarea indicelui de refrac]ie al mediului mai pu]in dens (n1). Descrierea refractometrului Pulfrich ~n cazul lucr\rii noastre, evaluarea concentra]iei proteinelor totale se va face cu ajutorul refractometrului Pulfrich, a c\rui schem\ de principiu este redat\ `n figura 5. Pricipiul de func]ionare al acestuia se bazeaz\ pe fenomenul de reflexie total\.
141

Refractometrul Pul Pulfrich 1 - prism\ de m\sur\; 2 - prism\ de iluminare; 3 - compensator; 4 - ocular; 5 - [urub micrometric; 6 - sistem pentru etalonare; 7 - termometru

Fig. 5

LUCRARE PRACTIC|

-5 0 10 20 30 40 50 6 0 70 80 90 100

Scala

Fig. 6

refractometrului Pulfrich

n1<n2 n1 n2 l n1<n2 n1 n2 l
Dispersia luminii prin prismele refractometrului Pulfrich `n cazul folosirii luminii albe
Fig. 7

Refractometrul Pulfrich se compune din trei p\r]i principale: un s i s t e m d e p r i s m e , t u b u l o p t i c [i c o m p e n s a t o r u l . Partea principal\ a refractometrului o constituie s i s t e m u l d e p r i s m e format din p r i s m a d e m \ s u r a r e [i p r i s m a d e i l u m i n a r e . Cele dou\ prisme delimiteaz\ `ntre ele un spa]iu `n care se va introduce lichidul a c\rui concentra]ie dorim s\ o m\sur\m (`n cazul nostru serul sanguin). Deoarece indicele de refrac]ie variaz\ cu temperatura, sistemul de prisme este prev\zut cu o manta de termostatare. Prin aceasta circul\ ap\ men]inut\ la temperatur\ constant\ de c\tre un ultratermostat. T u b u l o p t i c al refractometrului este prev\zut cu un ocular ce are o scal\ divizat\ `n unit\]i cuprinse `ntre -5 [i 100, pentru citirea limitei de separa]ie dintre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\ (fig. 5). C o m p e n s a t o r u l este format dintr-un sistem de prisme Amici, care au rolul de a recombina lumina dispersat\, atunci cnd nu se lucreaz\ cu lumin\ monocromatic\. Fenomenul de dispersie apare `n cazul `n care se utilizeaz\ lumin\ alb\ deoarece indicele de refrac]ie [i, implicit, unghiul limit\ depind de lungimea de und\ a radia]iei incidente (fig. 6). Ca surs\ de lumin\ monocromatic\ se poate folosi o lamp\ de sodiu. ~n cazul refractometrului Pulfrich, razele p\trund sub diverse inciden]e prin prisma de iluminare, trecnd apoi prin lichidul de cercetat (ser) (fig. 8). Razele care ajung aproximativ paralele cu fa]a prismei de m\sur\ `n contact cu lichidul (i = 90) vor fi refractate sub un unghi egal cu unghiul limit\ (fig. 9). Toate razele care cad pe prisma de m\sur\ sub un unghi de inciden]\ mai mic de 90 vor fi refractate sub unghiuri mai mici dect unghiul limit\ [i vor contribui la apari]ia zonei luminoase `n ocular. Deasupra razei limit\ se va observa `n ocular zona `ntunecat\.

142

LUCRARE PRACTIC|

P
Raze care vin din toate direc]iile Prism\ de iluminare

Mod de lucru

Se parcurg doi timpi principali de lucru: 1. Verificarea exactit\]ii refractometrului; 2. M\surarea unghiului limit\ pentru serul sanguin. 1. V e r i f i c a r e a e x a c t i t \ ] i i r e f r a c t o m e t r u l u i necesit\ urm\toarele opera]iuni: Se conecteaz\ lampa de sodiu sau sursa de lumin\ alb\ la re]eaua de 220 V [i se ac]ioneaz\ comutatorul plasat pe alimentator. Se conecteaz\ ultratermostatul la re]eaua de 220V, temperatura de lucru (17,5 C) fiind fixat\ de personalul tehnic al laboratorului. Sistemul de prisme fiind `nchis, cu ajutorul unei pipete Pasteur se introduc cteva pic\turi de ap\ distilat\ `ntre cele dou\ prisme, prin orificiul din arm\tura prismelor. NU introduce]i vrful pipetei adnc `n orificiul din arm\tura prismelor pentru a nu zgria suprafe]ele acestora! Se a[eaz\ [urubul micrometric la zero ([urubul micrometric se afl\ lng\ ocularul refractometrului). Cnd se prive[te prin ocularul refractometrului se observ\ o zon\ luminoas\, o zon\ `ntunecat\ [i, de asemenea, imaginea scalei. Dac\ limita de separare a celor dou\ zone precum [i diviziunile scalei nu se v\d clar, se rote[te ocularul pentru a stabili claritatea imaginii. O b s e r v a ] i e : dac\ limita de demarca]ie `ntre cele dou\ zone nu se observ\ clar, `nseamn\ c\ filmul (pelicula) de lichid de pe suprafa]a prismelor nu este continuu, existnd bule de aer care au alt indice de refrac]ie fa]\ de mediul studiat. ~n acest caz se deschide sistemul de prisme, se [terg suprafe]ele cu o

Raze difuzate `n toate direc]iile

Prism\ de m\sur\

Fa]\ de inciden]\

Drumul razelor de lumin\ ajunse sub diverse inciden]e la prisma de iluminare

Fig. 8

Prism\ de iluminare

r i

Prism\ de m\sur\ Lunet\

Razele aproximativ paralele cu fa]a prismei de m\sur\ sunt refractate sub un unghi egal cu unghiul limit\

Fig. 9

143

LUCRARE PRACTIC|

Materiale necesare: Refractometru Pulfrich cu prisme termostatate. Lamp\ de sodiu cu transformator la 220 V sau surs\ de lumin\ alb\. Ultratermostat. Dou\ pipete Pasteur. Eprubet\ cu circa 2 ml ser sanguin. Flacon de 500 ml cu ap\ distilat\. Tifon. Hrtie de filtru.

buc\]ic\ de tifon `nmuiat\ `n ap\ [i apoi `n xilol, se `nchid prismele [i se reintroduce apa distilat\. ~n cazul apei distilate, linia de demarca]ie se va afla `ntre diviziunile 85 [i 86. Rotind viza micrometric\, aduce]i linia de demarca]ie la valoarea 85. Cifra pe care o indic\ viza micrometric\ reprezint\ valoarea zecimalei. Pentru ap\ distilat\ ve]i ob]ine valoarea 85,5 (orice abatere indic\ faptul c\ aparatul nu este bine pus la punct; solicita]i reglarea aparatului). Datorit\ faptului c\ suprafa]a de m\sur\ a prismei este `ndreptat\ `n sus, iar cea a prismei de iluminare `n jos, pozi]ia limitei de separare este `ntoars\ [i de aceea va trebui ca valorile ce se ob]in s\ fie sc\zute din 100. ~n cazul apei distilate, valoarea unghiului limit\ va fi: 100 - 85,5 = 14,5 2. M\surarea unghiului limit\ pentru serul sanguin Pentru serul sanguin, opera]iunile ce trebuie executate sunt identice celor de la ap\ distilat\, cu men]iunea c\ `naintea determin\rii se cur\]\ suprafe]ele celor dou\ prisme. Valorile unghiului limit\ citite pe scala refractometrului Pulfrich sunt convertite `n valori ale concentra]iei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul unor tabele speciale numite t a b e l e W a g n e r . Prezentarea rezultatelor determin\rilor Valorile ob]inute de fiecare dintre membrii subgrupei sunt trecute `ntr-un tabel asem\n\tor celui de mai jos:
Nr. det. 1 2 3 4 Unghiul limit\ limit\ Concentra]ia pro proteinelor (g/l)

Condi]ii de lucru cerute de metod\ tod\: temperatur\ constant\ [i cunoscut\ (17,5C); suprafe]ele prismelor perfect cur\]ate.

144

LUCRARE PRACTIC|

*Valoarea normal\ a concentra]iei proteinelor `n serul sanguin este cuprins\ `ntre 6 0 - 8 0 g / l . Tabel Wagner
Serul sanguin Diviz scal\ scal\ 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Proteine (g/l) 6,3 8,6 10,8 13,0 15,2 17,4 19,6 21,8 24,0 26,2 28,4 30,6 32,8 35,0 37,2 39,4 41,6 43,8 46,0 48,1 50,3 52,5 54,7 56,8 59,0 61,2 63,4 65,5 67,7 69,8 72,0 74,2 76,3 78,5 80,6 82,8 84,9 87,1 89,2 91,4 93,5 95,7 97,8 99,9 102,0 104,1 Calcularea zeci imalelor zec Diferen]a 2,0 Diferen]a de zecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Diferen]a de zecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Diferen]a de zecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,1 1,3 1,5 1,7 2,2 0,2 0,4 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 2,0 Exudate [i tran transudate Diviz Proteine scal\ (g/l) scal\ 25 7,7 26 9,7 27 11,8 28 13,8 29 15,9 30 18,0 31 20,1 32 22,1 33 24,2 34 26,2 35 28,3 36 30,4 37 32,4 38 34,5 39 36,5 40 38,6 41 40,7 42 42,7 43 44,8 44 46,8 45 48,9 46 51,0 47 53,0 48 55,0 49 57,0 50 59,0 51 61,1 52 63,1 53 65,1 54 67,1 55 69,1 56 71,2 57 73,2 58 75,2 59 77,2 60 79,2 61 81,2 62 83,2 63 85,2 64 87,2 65 89,2 66 91,2 67 93,2 68 95,2 69 97,2 70 99,1

Cum folosim tabelul Wag Wagner? ner Presupunnd c\ refractometrul indic\ 44,5, valoarea unghiului limit\ va fi: 100 - 44,5 = 55,5 C\ut\m `n coloana valorilor `ntregi cifra 55 [i not\m valoarea corespunz\toare a concentra]iei proteinelor, `n cazul nostru 72,0 g/l. Pentru a stabili valoarea concentra]iei corespunz\toare zecimalei proced\m astfel: se face diferen]a dintre valorile `ntregi 56 [i 55 (unghiul limit\ este situat `ntre aceste dou\ valori), adic\: 74,2 - 72,0 = 2,2 C\ut\m `n coloana corespunz\toare diferen]ei `n zecimi ob]inut\, adic\ 2,2. Corespunz\tor valorii 5 (zecimalei) g\sim valoarea concentra]iei 1,1. Valoarea final\ a concentra-]iei va fi : 72,0 + 1,1 = 73,1 g/l

145

LUCRARE PRACTIC|

II. R e f r a c t o m e t r u l A b b (fig. 10) permite m\surarea indicelui de refrac]ie al lichidelor cu precizie de ordinul 10-4.
1

2 3 4 5

4 12 13 8

Refractometrul Abb (AR 3 - Krss Optronic )

9 10

Fig. 10

P\r]ile componente ale refractometrului (fig.11) sunt urm\toarele: 14 a.) Sistemul de prisme reprezint\ partea principal\ 11 a aparatului, fiind alc\tuit dintr-o prism\ de m\sur\ situat\ `n partea inferioar\ [i o prism\ de iluminare. Ambele prisme sunt confec]ionate din sticl\ flint (n=1,75), au dou\ fe]e de contact (care nu se ating) [i Fig.11 Schema refractometrului Abb formeaz\ un bloc paralelipipedic. Fiecare prism\ este fixat\ `ntr-o montur\ metalic\ prin care circul\ un 1 - ocular; 2 , 3 - racorduri pentru termostatarea prismei curent de ap\ cu temperatur\ constant\, de la un de iluminare; ultratermostat. Temperatura poate fi citit\ la un 4 - [urub pentru reglarea compensatorutermometru (10) ata[at la sistemul de prisme. lui; 5, 11 - racorduri pentru termostatarea prismei ~ntre planele prismelor se introduc 1-2 pic\turi de iluminare; din lichidul de cercetat, al c\rui indice de refrac]ie 6 - [urub pentru manevrarea scalei; 7 - luneta; este mai mic dect indicele de refrac]ie al prismelor. 8 - tambur pentru deschiderea blocului de Valoarea indicelui de refrac]ie al prismelor reprezint\ prisme; 9 - sursa de iluminare a scalei; limita superioar\ a scalei de m\sur\ a aparatului. 10 - termometru; Sursa de lumin\ utilizat\ este o lamp\ de sodiu (13) 12 - prisma de iluminare; situat\ `n fa]a prismei de iluminare, f\cnd corp 13 - lampa de sodiu; 14 - oglind\. comun cu aceasta. Razele de lumin\ ce provin de la surs\ sunt reflectate cu ajutorul oglinzii (14) situat\ la partea inferioar\ a prismelor. Fa]a de contact a prismei
146

LUCRARE PRACTIC|

de iluminare este mat\ [i difuzeaz\ lumina care o str\bate `n toate direc]iile. Datorit\ reflexiei totale, razele care p\trund `n prisma de m\sur\ vor face cu normala la fa]a de contact a acesteia un unghi mai mic sau egal cu unghiul limit\;

Limita de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\

Fig. 12

0%

95%

1,300

1,700

b.) Luneta Luneta este alc\tuit\ dintr-un sistem de lentile convergente avnd rolul de a capta razele care emerg din prisma de m\sur\. ~n cmpul vizual al lunetei se observ\ o zon\ luminoas\ [i una `ntunecat\ (fig. 12). Limita de separa]ie `ntre cele dou\ zone corespunde razelor cu `nclinare maxim\ fa]\ de normala la suprafa]a prismei. Pozi]ia acestei limite de separa]ie poate fi modificat\ rotind [urubul (6). ~n ocularul lunetei sunt fixate dou\ fire reticulare, perpendiculare `ntre ele (fig. 12). Pentru determinarea indicelui de refrac]ie, limita dintre zona `ntunecat\ [i cea luminoas\ se aduce exact la punctul de intersec]ie al firelor reticulare. ~n partea inferioar\ a cmpului vizual al lunetei se afl\ un fir reticular vertical `n fa]a c\ruia se deplaseaz\ o scal\ gradat\ `n indici de refrac]ie (1,300-1,700) [i o scal\ `n procente Brix (fig. 13). Scala Brix (dup\ numele inventatorului ei, omul de [tiin]\ german Adolf Brix) este `n direct\ corela]ie cu indicele de refrac]ie [i exprim\ procentual (0-95%) cantitatea de substan]\ solid\ (ex.: sucroz\, clorur\ de sodiu, etc.) dizolvat\ `n 100 ml de ap\. Cele dou\ scale sunt iluminate cu ajutorul unei surse de lumin\ alb\ (9);

Scala refractometrului Abb

Fig. 13

c.) Compensatorul este situat `ntre blocul de prisme [i lunet\ [i este alc\tuit din dou\ prisme Amici identice. Compensatorul are rol de a recombina lumina dispersat\ `n prisma de m\sur\, ob]inndu-se o limit\ de separa]ie net\ `ntre zona `ntunecoas\ [i cea luminoas\. Compensatorul se regleaz\ `n pozi]ia corect\ rotind [urubul (4).

147

LUCRARE PRACTIC|

Tabel 1.

Corec]ia de temperatur\ pentru indicele de refrac]ie al apei distilate

Temperatura (C) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Indice de refrac]ie 1,33369 1,33364 1,33358 1,33352 1,33346 1,33339 1,33331 1,33324 1,33316 1,33307 1,33299 1,33290 1,33280 1,33271 1,33261 1,33250 1,33240 1,33229 1,33217 1,33206 1,33194 1,33182 1,33170 1,33157 1,33144 1,33131 1,33117 1,33104 1,33090 1,33075 1,33061

Mod de lucru Se parcurg urm\toarele etape: 1. Verificarea exactit\]ii refractometrului Abb; 2. M\surarea indicelui de refrac]ie al serului sanguin. 1.) Verificarea exactit\ exactit\]ii refractometrului Abb se face cu ap\ distilat\ al c\rei indice de refrac]ie la temperatura de 17,5 C este 1,3329. Se conecteaz\ transformatorul la re]ea (220 V) [i se ac]ioneaz\ `ntrerup\torul plasat pe conductorii de alimentare a surselor; ATEN}IE! ATEN}IE! Nu modifica]i polaritatea curentului de alimentare a surselor! Se conecteaz\ ultratermostatul la re]ea, temperatura de lucru (17,5 C) fiind reglat\ de personalul tehnic al laboratorului; Cu ajutorul [urubului (8) se deschide sistemul de prisme. Fe]ele de contact ale celor dou\ prisme se cur\]\ cu o bucat\ de tifon umezit\ cu alcool [i se las\ s\ se usuce; cu o pipet\ Pasteur se a[eaz\ pe suprafa]a lucioas\ a prismei de m\sur\ 1-2 pic\turi de ap\ distilat\; Nu atinge]i suprafa]a prismei cu vrful pipetei! Se `nchide sistemul de prisme [i se a[teapt\ cteva minute pentru egalarea temperaturii lichidului de cercetat cu cea a apei din termostat. Temperatura se cite[te de pe scala termometrului (10); Privind `n ocularul lunetei se observ\ o zon\ `ntunecat\, una luminoas\ [i imaginea scalei. Se regleaz\ pozi]ia ocularului astfel `nct imaginea s\ fie clar\; Cu ajutorul [urubului (6) se aduce limita de separa]ie dintre cele dou\ zone la punctul de intersec]ie al firelor reticulare (fig. 12). Se rote[te [urubul (4) pn\ ce limita de separa]ie `ntre cele dou\ zone devine net\;
148

LUCRARE PRACTIC|

Nr. det.

Indice de refrac]ie

Concentra]ia pro proteinelor (g/l)

1 2 3 4

Se cite[te valoarea indicelui de refrac]ie de pe scal\, `n dreptul firului vertical. Pentru temperatura de lucru, valoarea indicelui de refrac]ie m\surat\ cu refractometrul Abb trebuie s\ coincid\ cu cea din tabelul 2. 2.) Se [terg prismele [i se trece la m\surarea indicelui indicelui de refrac]ie al serului sanguin, sanguin parcurgndu-se acelea[i etape ca `n cazul apei distilate. Valorile indicelui de refrac]ie citite pe scala refractometrului Abb sunt convertite `n valori ale concentra]iei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul tabelului 2. Datele ob]inute de fiecare dintre membrii subgrupei sunt trecute `ntr-un tabel asem\n\tor celui al\turat. Refractometrul clinic portabil (fig. 1 4 ) permite m\surarea direct\ a concentra]iei de albumine din serul sanguin (g/dl) [i a densita]ii urinii (g/cm3).

Mod de lucru: 1.) Verificarea exactit\ exactit\]ii refractometrului: 2 se `ndreapt\ refractometrul cu prisma spre o surs\ de lumin\, astfel `nct, rotind [urubul ocularului (5) Fig. 14 s\ ob]inem o imagine clar\ a scalei Refractometrul clinic portabil: refractometrului; 1 - prism\ de m\sur\, 2 - lam\ transparent\ pentru protec]ia se ridic\ lama de protec]ie (2) [i se depun cu o prismei, pipet\ din plastic 1-2 pic\turi de ap\ distilat\ pe 3 - [urub pentru reglajul scalei, suprafa]a prismei; 4 - tub optic, 5 - ocular. cu ajutorul [urubului (3) se regleaz\ scala astfel `nct linia de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\ s\ coincid\ cu reperul W (fig. 15); 2.) Se ridic\ lama de protec]ie (2), se [terge u[or suprafa]a prismei cu hrtie de filtru [i se trece la 12 m\surarea concentra]iei de albumine din s e r u l s a n g u i n , parcurgndu-se acelea[i etape ca `n cazul apei distilate. Limita de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea intunecat\ va indica concentra]ia de 1,040 albumine din ser. ~n acela[i mod se procedeaz\ pentru 0 m\surarea densit\]ii urinii. 1,000 W Scala pentru m\surarea concentra]iei de albudensitatea albumine `n urinii mine este gradat\ pentru temperaturi `ntre 5-35C, `n ser (g/dl) 3
(g/cm )

Scala refractometrului portabil

Fig. 15

149

LUCRARE PRACTIC|

diviziuni cu valoarea de 0,2 g/dl, iar pentru densitatea urinii diviziunea are valoarea de 0,002 g/cm3.
Tabel 2. Concentra]ia proteinelor `n func]ie de indicele de refrac]ie pentru temperatura de 17,5

C
Indice de refrac]ie (17,5C) 1,33705 1,33743 1,33781 1,33820 1,33858 1,33896 1,33934 1,33972 1,34010 1,34048 1,34086 1,34124 1,34162 1,34199 1,34237 1,34275 1,34313 1,34350 1,34388 1,34426 1,34463 1,34500 1,34537 1,34575 1,34612 1,34650 1,34687 1,34724 1,34761 1,34798 1,34836 1,34873 1,34910 1,34947 1,34984 1,35021 1,35058 1,35095 1,35132 1,35169 1,35205 1,35242 1,35279 1,35316 1,35352 1,35388 Concentra]ia proteinelor proteinelor serice ( g%) 6,3 8,6 10,8 13 15,2 17,4 19,6 21,8 24 26,2 28,4 30,6 32,8 35 37,2 39,4 41,6 43,8 46 48,1 50,3 52,5 54,7 56,8 59 61,2 63,4 65,5 67,7 69,8 72 74,2 76,9 78,5 80,6 82,8 84,9 87,1 89,2 91,4 93,5 95,7 97,8 99,9 102 104,1 Concentra]ia proteinelor `n exudate [i transudate (g%) 7,7 9,7 11,8 13 15,9 17 20,1 22,1 24,2 26,2 28,3 30,4 32,4 34,5 36,5 38,6 40,7 42,7 44,8 46,8 48,9 51 53 55 57 59 61,1 63,1 65,1 67,1 69,1 71,2 73,2 75,2 77,2 79,2 81,2 83,2 85,2 87,2 89,2 91,2 93,2 95,2 97,2 99,1

150

LUCRARE PRACTIC|

D. SEPARAREA ELECTROFORETIC| A FRAC}IUNILOR PROTEICE ALE SERULUI SANGUIN

PARTEA PRACTIC|

~n metoda electroforezei pe hrtie de filtru (metoda uzual\ folosit\ `n spitale) se utilizeaz\ o hrtie de filtru de tip Whatmann `mbibat\ `ntr-o solu]ie tampon cu pH = 8,6. Banda de hrtie este `ntins\ `ntr-un spa]iu `nchis (camera de electroforez\), `n care s-a creat un cmp electric prin introducerea a doi electrozi. Serul de analizat este aplicat pe banda de hrtie sub form\ de pic\tur\ sau dung\ [i sub influen]a tensiunii electrice aplicate la capetele benzii acesta se deplaseaz\ [i se desface `n frac]iuni: albumine [i globuline (1, 2, , ). Cele cinci frac]iuni proteice ale serului sanguin devin vizibile pe banda de hrtie dac\ dup\ migrare se coloreaz\ cu un colorant specific. Acesta poate fi de exemplu albastru de bromfenol, care se absoarbe diferen]iat, `n func]ie de concentra]ia de protein\ `ntlnit\. Se ob]ine astfel e l e c t r o f o r e g r a m a . +

Tampon

Hrtie de filtru Electrod

Aparat de electroforez\

Fig. 23

Instala]ia de electroforez\ se constituie din: camera de electroforez\ [i alimentatorul electric. C a m e r a d e e l e c t r o f o r e z \ prezentat\ `n figura 23 este o cutie etan[\ din material plastic. Ridicnd capacul vom observa la fiecare cap\t al cutiei cuvele pentru solu]ia tampon. Fiecare cuv\ are dou\ compartimente, unul `n care p\trunde electrodul de platin\, iar cel\lalt `n care p\trunde cap\tul benzii de hrtie. Cele dou\ compartimente comunic\ `ntre ele prin orificii. A[a cum am precizat, capacul `nchide etan[ camera de electroforez\ pentru a preveni evaporarea solu]iei tampon [i uscarea hrtiei.

151

LUCRARE PRACTIC|

A l i m e n t a t o r u l e l e c t r i c este un generator de curent continuu cu tensiune reglabil\ (0-500 V) [i o intensitate maxim\ reglabil\ de 50 mA, printr-o redresare a curentului alternativ de la re]ea. Generatorul electric este prev\zut cu miliampermetru [i cu voltmetru. Evaluarea cantitativ\ a frac]iunilor separate electroforetic se bazeaz\, `n general, pe m\surarea cantit\]ii de colorant care se leag\ de aceste frac]iuni. Aceast\ m\surare se poate realiza pe dou\ c\i: a) ` n m o d d i r e c t , prin determinarea densit\]ii optice, cu un spectrofotometru; b) ` n m o d i n d i r e c t , prin elu]ie [i m\surarea extinc]iei cu un fotocolorimetru. a) M e t o d a d i r e c t \ de m\surare a densit\]ii optice presupune o opera]ie numit\ d i a f a n i z a r e , care const\ `n `mbibarea electroforegramelor cu un lichid cu indice de refrac]ie egal cu cel al celulozei, banda de hrtie devenind translucid\. Dupa `mbibare, hrtia se preseaz\ `ntre dou\ pl\ci sub]iri de sticl\ [i se introduce `n dispozitivul de fotometrare. Concomitent cu m\surarea continu\ a absorb]iei se `nscriu grafic valorile corespunz\toare, iar prin intermediul unui dispozitiv integrator se `nscrie curba de integrare a suprafe]elor delimitate de curba de absorban]\ care corespunde fiec\rei frac]iuni (v. fotocolorimetria). Valorile ob]inute sunt direct propor]ionale cu cantit\]ile de colorant [i deci cu concentra]iile de substan]\ separat\ `n fiecare frac]iune. b) P r o c e d e u l e l u ] i e i este simplu, destul de precis [i nu necesit\ o aparatur\ deosebit\. Metoda const\ `n decuparea electroforegramei `n sec]iuni dup\ zone [i extrac]ia colorantului prin tratarea fiec\rei sec]iuni cu o aceea[i cantitate de solu]ie de eluent. Fiecare solu]ie se m\soar\ apoi fotocolorimetric. Figura 24 v\ prezint\ aspectul unei electroforegrame ob]inut\ pe hrtia de filtru, precum [i curba extinc]iilor (ob]inut\ prin metoda direct\) a celor cinci frac]iuni proteice separate din serul uman.
152

albumine

globuline
1 2

Fig. 24

Electroforegrama proteinelor serice

LUCRARE PRACTIC|

Mod de lucru:

Materiale necesare:

hrtie de filtru Whatmann sub form\ de benzi; solu]ie tampon veronalmedinal cu pH = 8,6; cuva de electroforez\; surs\ de curent continuu; ser; micropipet\.

o pauz ... v rog ...

Se umecteaz\ benzile de hrtie `n solu]ia tampon; se elimin\ excesul de lichid prin tamponarea lor cu hrtie de filtru obi[nuit\. Se introduc volume egale din solu]ia tampon `n cele dou\ compartimente ale cuvei. Se `ntind benzile de hrtie `n pozi]ie perfect orizontal\ pe suportul din cuv\, imersndu-se capetele lor `n solu]ia tampon din cele dou\ compartimente. Se las\ s\ circule curentul electric timp de 15 min. pentru diminuarea fenomenelor de electroendosmoz\. Se aplic\ cu o micropipet\ 50 ml ser; aplicarea se face prin mi[c\ri liniare repetate ale vrfului micropipetei de-a lungul liniei de start marcat\ `n prealabil cu creionul, avnd grij\ s\ se p\streze un spa]iu liber de 0,5 cm pn\ la marginile benzii. (Linia de start se amplaseaz\ spre catod, deoarece direc]ia de migrare a proteinelor va fi spre anod.) Se `nchide capacul cuvei. Se conecteaz\ sursa de curent continuu la tensiunea de 150-200 V. Timpul necesar separ\rii frac]iunilor proteice este de aproximativ 7-8 ore, `n func]ie de tensiunea aplicat\. Dup\ migrare, hrtia de electroforez\ este colorat\ cu albastru de bromfenol pentru punerea `n eviden]\ a spoturilor corespunz\toare frac]iunilor de proteine [i pentru dozarea lor cantitativ\ (prin fotocolorimetrie). ~n aceast\ sec]iune a]i `nv\]at s\ separa]i 5 frac]iuni din totalitatea proteinelor prezente `n serul sanguin uman. Pentru a [ti cum afl\m `n ce cantitate se g\se[te fiecare din aceste frac]iuni, trebuie s\ `n]elege]i metoda fotocolorimetric\.

153

LUCRARE PRACTIC|

F. EVALUAREA FOTOCOLORIMETRIC| A CONCENTRA}IEI FRAC}IUNILOR PROTEICE DIN SERUL SANGUIN

PARTEA PRACTIC|

c Este un aparat ce permite compararea a dou\ fluxuri

Fotocolorimetrul Pulfrich
luminoase provenind de la aceea[i surs\. P\r]ile componente ale aparatului sunt prezentate `n fig. 30. Aparatul se compune din: d i s p o z i t i v u l d e i l u m i n a r e , s u p o r t u l p e n t r u c u v e [i c a p u l f o t o m e t r i c . Lumina provenind de la o surs\ (L) este divizat\ `n dou\ fascicule paralele prin intermediul unor oglinzi (O1, O2).
T1 C1 O1 L Oc F P2 D2 T2 C2 O2

D2

P1

Fig. 30 Fotocolorimetrul Pulfrich (explica]ii n text)

difuzie difuzie I0 I absorb]ie solu]ie reflexie

Surse de eroare care apar la trecerea unui fascicul de lumin\ prin cuva de m\sur\

Fig. 31

Cele dou\ fascicule trec prin cuvele C1, respectiv C2 ce sunt a[ezate pe suportul special. ~n figura 31 sunt reprezentate fenomenele fizice care se produc la trecerea fasciculului de lumin\ prin cuvele cu solu]ii ale fotocol fotocolorimetrului. Un sistem de prisme cu reflexie total\ P1 [i P2 apropie cele dou\ fascicule dup\ traversarea cuvelor, trecndu-le prin luneta de observa]ie (Oc) spre ochiul observatorului. Egalizarea fluxului luminos se poate face prin intermediul unor diafragme D1 si D2 care sunt ac]ionate de tamburii grada]i T1 [i T2, pe care se
154

LUCRARE PRACTIC|

1 2 3

7 6 5 4

10 9 8

Fotocolorimetrul FEK 56M: 1- comutator; 2- capac superior; 3- vizor scal\; 4- tambur; 5- tambur amplificare fotocurent; 6- tambur cu ajutorul c\ruia se aduce ini]ial acul microampermetrului la zero; 7- tambur filtre; 8- cadranul microampermetrului; 9- tambur; 10- tambur pentru manevrarea suportului mobil.

Fig. 32

pot citi direct diferen]ele de extinc]ie sau transmisie dintre cele dou\ solu]ii. Se rote[te tamburul din dreptul solu]iei mai transparente, `nchizndu-se astfel diafragma corespunz\toare [i mic[ornd fluxul luminos care ajunge la ochiul observatorului, pn\ cnd devine egal cu cel de partea opus\. Restul sistemului optic con]inut `n capul fotometric permite ochiului observatorului s\ vad\ cmpul fotometric format din dou\ semicercuri desp\r]ite printr-o linie fin\. Pentru m\rirea sensibilit\]ii metodei, capul fotometric con]ine un sistem de filtre care las\ s\ treac\ numai un domeniu `ngust de lungimi de und\ din spectrul vizibil. De obicei se recomand\ s\ se selecteze un filtru colorat `n culoarea complementar\ culorii solu]iei de m\surat. Astfel se elimin\ razele care nu sunt absorbite de substan]\, dar care ar impresiona retina ochiului observatorului. Pentru m\rirea sensibilit\]ii [i preciziei metodei, precum [i pentru evitarea erorilor subiective, sistemul prisme - lunet\ din capul fotocolorimetrului Pulfrich se poate `nlocui cu un sistem de dou\ celule fotoelectrice montate `n opozi]ie fa]\ de un ampermetru. Lumina este astfel transformat\ `n curent electric. Egalizarea celor dou\ fluxuri luminoase se realizeaz\ `n acela[i mod. Condi]ia de egalitate se `ndepline[te atunci cnd intensitatea curen]ilor de sens opus este aceea[i, deci aparatul de m\sur\ va ar\ta valoarea 0.

Fotocolorimetrului Fotocolorimetrului FEK 56M

Fotoelectrocolorimetrul FEK 56M prezentat `n figurile 32 [i 33 este alc\tuit dintr-un sistem optic, dou\ elemente active reprezentate de cele dou\ fotoelemente [i dintr-o parte mecanic\. S i s t e m u l o p t i c este format din:

1. S u r s a d e l u m i n \ (11) ce poate fi o lamp\ cu filament incandescent pentru domeniul vizibil

155

LUCRARE PRACTIC|

2. F i l t r e l e d e l u m i n \ (12), numerotate de la 1 la 9, sunt montate `ntr-un disc ce se poate roti cu Vizibil ajutorul tamburului (7). ~n tabelul 3 sunt prezentate lungimile lor de und\. Filtrele de lumin\ sunt mediile colorate (sticle, pelicule, solu]ii) care las\ s\ treac\ prin ele numai radia]iile unui anumit domeniu spectral. Cunoscnd curba de absorb]ie a Tabel 3. 3. luminii de c\tre solu]ia de analizat, se poate alege un Lungimile de und\ asociate filtrelor filtru care las\ s\ treac\ prin el numai radia]iile absorbite fotocolorimetrului FEK 56 M de solu]ie [i le re]ine pe toate celelalte. Cu filtrul de lumin\ se separ\ deci acel domeniu de cercetat al spectrului care este absorbit de substan]\. Cnd nu se cunosc caracte-risticile spectrale ale solu]iei de analizat (nu se cunoa[te spectrul de absorb]ie), filtrul se alege 11 astfel `nct culoarea lui s\ fie complementar\ culorii solu]iei. 12
15 14 13 15

Nr. fil filtru 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Lungimea de und\ und\ (nm) 315 5 364 5 400 5 440 10 490 10 540 10 582 10 597 10 630 10

Domeniu Ultraviolet

(utiliznd filtrele de la 3 la 9) sau o lamp\ cu mercurcuar] pentru domeniul UV (filtrele 1-2).

3. P r i s m a o p t i c \ (13) care divide fasciculul incident `n dou\ fascicule (drept [i stng) de aceea[i intensitate. 4. L e n t i l e l e (15, 15, 18, 18) [i o g l i n z i l e (14, 14) permit trecerea fasciculelor luminoase prin cuve.

16

16

17 18

17 18

E l e m e n t e l e a c t i v e sunt dou\ fotoelemente (20, 20) de Sb-Cs sensibile la radia]iile cuprinse `ntre 315 - 630 nm, fiind introduse `n montaj prin intermediul unui microampermetru (8).

20 19

14

20 19

14

Fotocolorimetrul FEK 56M: 11-sursa de lumin\; 12-filtru de lumin\; 13-prism\; 14,14-oglinzi; 15,15, 18,18-lentile; 16,16-cuve; 17,17-diafragme variabile; 19,19-sticl\ mat\; 20,20-fotoelemente

Fig. 33

P a r t e a m e c a n i c \ este format\ din: 1. S u p o r t p e n t r u c u v e , situat `n interiorul aparatului, la care se poate accede prin ridicarea capacului (2). ~n partea dreapt\ se afl\ suportul mobil pe care se a[eaz\ dou\ cuve, `n dreapta cuva cu martorul M1, iar `n stnga cuva cu proba P. Schimbarea cuvelor din fa]a fasciculului monocromatic drept se face prin rotirea tamburului exterior (10) pn\ la refuz. ~n fa]a fasciculului monocromatic din stnga se monteaz\ o singur\ cuv\ ce con]ine martorul M2.

156

LUCRARE PRACTIC|

2. Dou\ d i a f r a g m e v a r i a b i l e "ochi de pisic\" reglabile cu ajutorul tamburilor (4 [i 9) modific\ intensitatea fasciculului luminos ce cade pe fotoelement. Fotoelectrocolorimetrul FEK 56M este prev\zut cu un bloc de alimentare.

Mod de lucru

Se decupeaz\ spoturile electroforegramei corespunz\toare celor cinci frac]iuni proteice. Se introduc fragmentele de hrtie rezultate `n cinci flacoane, peste care se adaug\ cte 8 ml solu]ie eluent, cu ajutorul pipetei gradate. Are loc fenomenul de elu]ie, adic\ de trecere a colorantului de pe hrtia de filtru `n solu]ie. Timpul de elu]ie este de aproximativ 20 min, cu men]iunea c\ aceste flacoane trebuie agitate din 5 `n 5 minute.

Materiale necesare: fotocolorimetru Pulfrich tip IOR cu alimentator la 6-8V; fotoelectrocolorimetru FEK 56M cu alimentator [i cuve de 10 mm grosime; electroforegrama developat\ [i uscat\; solu]ie de NaOH 0,1 N; 5 flacoane pentru elu]ie; pipet\ gradat\ de 10 ml; foarfece; hrtie de filtru; ap\ distilat\.

Tehnica de lucru cu fotocolorimetrul Pulfrich

Practic, m\surarea extinc]iei cu ajutorul fotocolorimetrului cuprinde doi timpi de lucru: verificarea etalon\rii aparatului [i m\surarea extinc]iei probelor de analizat. Pentru v e r i f i c a r e a e t a l o n \ r i i aparatului se umplu cuvele cu ap\ distilat\ [i se introduc `n suportul lor. Se introduce filtrul S57 prin rotirea discului cu filtre pn\ cnd `n fereastra suportului discului cu filtre apare cifra 6. Se conecteaz\ fotocolorimetrul la bornele de 6 V ale transformatorului. Fi[a transformatorului se conecteaz\ la re]eaua de 220 V. Se a[eaz\ tamburii T1 [i T2 la grada]ia 0-100 (valoarea 0 corespunde extinc]iei minime; valorile extinc]iei sunt trecute pe partea interioar\ a
157

LUCRARE PRACTIC|

tamburului, culoare ro[ie). ~n aceste condi]ii, dac\ aparatul este etalonat, vom observa privind prin ocular cele dou\ semicercuri egal iluminate. Pentru m \ s u r a r e a e x t i n c ] i e i p r o b e l o r se procedeaz\ astfel: Se gole[te cuva din stnga, se usuc\ [i se introduce `n ea lichidul colorat corespunz\tor albuminelor. Privind prin ocular, vom roti tamburul din dreapta pn\ cnd cmpul este uniform iluminat (se rote[te tamburul din dreapta deoarece prismele fotometrului inverseaz\ direc]ia razelor de lumin\, astfel c\ lumina ce trece prin cuva stng\ ilumineaz\ partea dreapt\ a cmpului). Se noteaz\ valoarea extinc]iei corespunz\toare albuminelor. Se procedeaz\ `n mod asem\n\tor [i cu celelalte patru probe, notndu-se de fiecare dat\ valoarea extinc]iei.

Tehnica de lucru cu fotoelectrocolorimetrul FEK 56M

Se vor m\sura fotocolorimetric tot extinc]iile celor 5 solu]ii ob]inute prin elu]ia colorantului din spoturile electroforegramei. Ca tehnic\ de lucru se folose[te metoda de zero: cele dou\ fascicule luminoase cad pe fotoelemente; fotocuren]ii se compenseaz\ reciproc [i acul microampermetrului conectat `n circuit nu deviaz\. La a[ezarea solu]iei de analizat are loc perturbarea compens\rii. Pozi]ia zero a acului microampermetrului se restabile[te prin diminuarea fluxului luminos din dreptul cuvei cu ap\ distilat\. Se fixeaz\ filtrul 7 prin intermediul tamburului (7). Se conecteaz\ blocul alimentator la re]ea, se pune comutatorul acestuia pe pozi]ia "pornit" [i se verific\ dac\ comutatorul l\mpii este pe pozi]ia "vizibil". Cu ajutorul tamburului (6) se aduce acul microampermetrului la zero.
158

Spre exemplu, presupunem c\ am ob]inut urm\toarele valori pentru extinc]ii: albumine 0,252, 1 globuline 0,018, 2 globuline 0,027, globuline 0,056 [i globuline 0,061. Suma lor este 0,414. Se calculeaz\ procentul pentru fiecare frac]iune, considernd valoarea total\ a extinc]iilor egal\ cu 100. Exemplu: 0,414extinc]ie............0,252extinc]ie total\ albumine 100.......................................x 0,252 100 x= = 61 0 0 0,014

LUCRARE PRACTIC|

S\ presupunem c\ refractometric am g\sit o concentra]ie proteic\ total\ de 72,0g . Calculul se va efectua astfel: 100 g proteine..............61g albumine 72 g proteine.......................y 61 72 y= = 43,9g albumine 100

c1 . C a l c u l u l
2. Calculul

~n suportul pentru cuve din stnga se pune ap\ distilat\; suportul din dreapta are la rndul s\u dou\ l\ca[uri: `n cel din stnga se pune proba, iar `n cel din dreapta tot ap\ distilat\. Ini]ial, `n dreptul fasciculului de lumin\ se afl\ cuva cu proba de determinat. Se aduce comutatorul (1) `n pozi]ia "deschis". La `nceputul determin\rii, cele dou\ diafragme sunt complet deschise (tamburii 4 [i 9 se afl\ la diviziunea 0-100). Ca urmare a absorb]iei luminii de c\tre solu]ie, pe fotoelementul din dreapta cade un fascicul luminos de intensitate mai mic\ dect cel din stnga [i acul microampermetrului deviaz\. Se rote[te tamburul diafragmei variabile din stnga [i se `nchide fanta pn\ cnd intensit\]ile celor dou\ fascicule se egaleaz\ [i acul microampermetrului revine la zero. Se aduce acum `n dreptul fasciculului luminos din dreapta cuva cu martor (ap\ distilat\) prin rotirea tamburului (10). Acul microampermetrului va devia `n sens opus celui ini]ial (fasciculul din dreapta este acum mai intens). Se rote[te tamburul diafragmei variabile din dreapta pn\ cnd se egaleaz\ din nou fluxurile luminoase, iar acul microampermetrului ajunge din nou la zero. ~n acest moment se cite[te extinc]ia pe tamburul din dreapta. Calculul [i interpretarea rezultatelor

procentual al diferitelor frac]iuni proteice (valori relative) Se face suma extinc]iilor citite [i se calculeaz\ ce procent reprezint\ extinc]ia ob]inut\ pentru fiecare frac]iune `n parte. concentra]iei frac]iunilor proteice `n g/l(valori absolute) Pentru determinarea valorii absolute a diferitelor frac]iuni proteice (g/l) se va ]ine seama `n calcul de valoarea concentra]iei proteice totale stabilit\

159

LUCRARE PRACTIC|

refractometric [i de procentul frac]iunii respective rezultat din calculul extinc]iilor. Cu valorile absolute ob]inute pentru fiecare frac]iune proteic\ se va calcula raportul:
A albumine = G globuline

~n mod normal acest raport este supraunitar. Prezentarea rezultatelor experimentale Valorile ob]inute se trec `n urm\torul tabel:
Valori Valori Valori Extinc]ia rela relative abso absolute rela relative ( %) (g/l) nor rmale (g/l) no (%) 60 4 8 12 16 Valori absolute normale (g/l) 36-54 2,4-3,6 4,8-7,2 7,2-10.8 9,6-14,4

Frac]iunea proteic\ proteic\ Albumine 1 Globuline 2 Globuline Globuline Globuline

160