PRUEBAS BIOQUIMICAS PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

VOGES-PROSKAUER

Positivo

negativo CATALASA

PRUEBA DE LA REDUCCIN DE NITRATOS

PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)

CITRATO DE SIMMONS

TSI

DESCARBOXILACION DE LA LISINA

TSI

MEDIOS DE CULTIVO AGAR ENDO: El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la deteccin de coliformes y otros microorganismos entricos.

Composicin Fosfato dipotsico 3,5 g Digerido pptico de tejido animal 10,0 g Agar 15,0 g Lactosa 10,0 g Sulfito de sodio 2,5 g Fucsina bsica 0,5 g Agua destilada c.s.p. 1000 mL

Fundamento La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin de sulfito de sodio y fucsina bsica que inhibe ligeramente el crecimiento de los microorganismos gram positivos. Colonias tpicas Los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias rosadas a rojas, mientras que las colonias de los microorganismos que no pueden fermentar este carbohidrato son incoloras o rosado plido. Las colonias tpicas de E. coli en el Agar Endo son rosadas con un brillo verde metlico caracterstico, debido a la elevada produccin de cidos y aldehdos como producto de la fermentacin de la lactosa.

AGAR EMB: Eosina azul de metileno Lactosa Sacarosa Selectivo para la demostracin y aislamiento de Entero bactericeas patgenas.

COMPOSICIN Peptona 10.0 Hidrogeno fosfato dipotsico 2.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 Eosina amarillenta 0.4 Azul de metileno 0.07 Agar agar 13.5

Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno Diferencial: Lactosa y sacarosa Indicado: Azul de metileno Color del agar: Rojo Forma de actuacin: La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los colorantes. Colonias caractersticas: Salmonella sp Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-) Shigella sp Traslucidas Lactosa (-) Sacarosa (-) Escherichia coli Verdes y brillantes Lactosa (+) Sacarosa (+)

FIG Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentacin de azcares, Escherichia coli produce un color verde metlico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida caracterstico para esta prueba positiva

CALDO FLUOROCULT

FORMA DE ACTUACIN El contenido en laurel sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de la flora acompaante. La deteccin de la presencia de E. coli se efecta mediante fluorescencia al iluminar con luz UV. Para confirmar el ensayo se utilizan como indicadores a formacin de gas debido a la fermentacin de la lactosa y el ensayo del indol positivo. COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 25.0 Lactosa 5.0 Cloruro sdico 5.0 Laurilsulfato, sal sdica 0.1 Hidrogenofosfato dipotsico 2.75 Hidrogenofosfato potsico 2.75 L triptfano 1.0 4 metilbeliferil D- glucornido 0.1 EMPLEO E INTERPRETACIN El empleo y evaluacin se efecta en la forma habitual. Inocular los tubos. Para 1ml de inoculo utilizar como mnimo 10ml de caldo e incubar a 37C durante 10 24 horas o segn los procedimientos preescritos. La fluorescencia se provoca mediante una lmpara UV. Las colonias que muestran fluorescencia azul claro corresponde a los de E. coli para la confirmacin del diagnostico colocar sobre el cultivo una capa de aproximadamente 5mm de altura con reactivo de Kovacs. Una coloracin roja cereza en la capa del reactivo de 1 a 2 minutos indica la presencia de E .coli. El gas formado en el tubo de Durham indica la presencia de E. coli y/u otras bacteria coliformes. Fluorocult caldo LMX

Forma de actuacin Gracias a la modificacin del caldo LMX descrito en 1989 por MANAFI y KNEFEL se pudo aumentar claramente la conversin de sustrato. Esto, de una sensibilidad mejorada, lleva sobre todo a una clara reduccin del tiempo de identificacin, 24 horas generalmente. Debido a la alta calidad alimenticia y al tampn de fosfatos contenido garantiza un rpido crecimiento de coliformes. El contenido en laurilsulfato inhibe en gran medida el crecimiento de bacterias gram positivas. La identificacin simultanea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la adicin del sustrato crmogeno 5- bromo-4-cloro-3-indol--D-1 tiogalactopiransido (IPTG) acta como sustancia intensificadora en la sntesis enzimtica y aumenta el contenido de la actividad de -D- galactosidasa. El sustrato fluorgeno 4- metillumbeliferil- -D glucornido (MUG) es escindido por la enzima -D glucornidasa altamente especfico para E. coli . El contenido de triptfano mejora la reaccin del indol para la confirmacin adicional de E. coli y aumenta con ello la sensibilidad de identificacin en combinacin con la reaccin X-GAL y la reaccin MUG. COMPOSICION (gr/Lt) Triptosa 5.0 Cloruro sdico 5.0 Sorbita 1.0 Triptfano 1.0 Hidrgenofosfato dipotsico 2.7 Dihidrgenofosfato potsico 2.o Laurilsulfato, sal sdica 0.1 5-bromo-4cloro-3-indoli- -D-galactopiransido (X-GAL) 0.08 4-metilumbeliferil- -D-glucornido (MUG) 10.05 L-isopropil- -D-L-tiogalactopiransido 0.1

EMPLEO E INTERPRETACIN El empleo se rige los correspondientes mtodos de investigacin para agua y alimentos. Incubacin: 24 horas, eventualmente hasta 8 horas a 35-37C. E. coli la lectura de la fluorescencia tiene lugar mediante un alambra UV. Una fluorescencia azul claro en el cultivo indica E. coli (reaccin MUG).

AGAR CHROMOCULT

Composicin Peptona: 3gr Cloruro sdico: 5gr Dihidrogenofosfato potsico: 1.7g Hidrogenofosfato dipotsico: 3.0g Piruvato sdico: 1.0gr Triptfano: 1.0grAgar agar: 12.0gr Laurel sulfato sdico 0.1gr Mezcla de cromgenos 0.2grX Forma de actuacin Gracias a la accin conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampn de fosfatos, se garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos subletables. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacteria Gram (+) sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de coliformes. La identificacin simultanea de coliformes totales y E.coli se hace posible por la nueva combinacin de patente solicitada de dos sustratos cromgenos. El sustrato Salmo GAL como x- glucoronido, las colonias se tien de verde-azul oscuro y debido a ello son fciles de diferenciar de los restantes coliformes. Que se presentan de color rojo. En los tubos del caldo LMX se obtuvieron colores azul (cromgeno) debido a que la enzima de los coliformes D - galactosidasa reacciono con el x-Gal (5 bromo, 4 cloro, 3 indolin, - D - galactopiranoside) dando el color caracterstico (verde-azulado). En los tubos de caldo de fluorogeno llamado MUG (4 metilumbiliferil - - - D glucoronido) que reacciona con la enzima caracterstica del 94% de las especies de Escherichia coli la - - D glucoronidasa dando un compuesto fluorescente color azul a rayos U.V.

AGAR MAC CONKEY: Medio de cultivo utilizado en la investigacin de organismos coliformes.

Fundamento Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras. Frmula (por litro) Lactosa. 10,0 g Peptona 3,0 g Sales Biliares 1,5 g Peptona de Gelatina 17,0 g Rojo Neutro 0,03 g Sodio Cloruro 5,0 g Violeta Cristal 0,001 g Agar 13,5 g PH final: 7, 1 0, 2

FIG Agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a los microorganismos que fermentan lactosa). Colonias grandes con halo y rojas Selectivo: cristal violeta y sales biliares diferencial: lactosa indicador: rojo neutro color del agar: claros y rojo parduzco Forma de actuacin El cristal violeta y sales biliares inhiben biota gram (+). La degradacin de lactosa se manifiesta por viraje a rojo del indicador de ph, sirve para comprobar la degradacin de dicho azcar. Colonias caractersticas Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-) E.coli rojas con precipitado lactosa (+)

AGAR BISMUTO SULFITO (B.S): Selectivo para el aislamiento y diferenciacin de Salmonella sp a partir de material clnico y otros clases.

COMPOSICIN Extracto de carne 5.0 Peptona de carne 10.0 D (+)-glucosa 5.0 Hidrogeno fosfato disdico 4.0 Sulfato ferrosos 0.3 Verde brillante 0.025 Indicador bismuto-sulfito 8.0 Agar agar 15.0 Selectivo: Verde brillante y bismuto Diferencial: sulfuro de hierro y bismuto sulfito Color del agar: Crema Forma de actuacin El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente los grmenes de acompaamiento. Las colonias de Salmonella sp H2S (+) presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. El brillo metlico alrededor de las colonias se debe a la reduccin de los iones bismuto a bismuto metlico. Colonias caractersticas: Shigella sp: centro negro, borde claro, precipitado negro, brillo metlico alrededor de las colonias. Coliformes: pequeas, verdes hasta pardas, a veces mucosas.

FIG colonias marrones o negras, algunas veces con brillo metlico alrededor de la colonia (S.typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o ningn oscurecimiento del medio. El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradacin a cido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol que acta como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta un color rojo intenso la flora acompaante Gram positiva, as como Salmonella thypi y Shiguella resulta muy reprimidas por la presencia de verde brillante. Para la inhibicin en grupo de Proteus, recomienda ADAM la adicin de 0.2% sodio de desoxicolato, al medio de cultivo. EMPLEO E INTERPRETACIN En medio de cultivo se siembra masivamente en superficie con material objeto de investigacin directamente, o a partir de un cultivo de enriquecimiento, incubacin de 18-24 horas a 37C.

Colonias Rosa plido, transparentes con halo rojo. Verde- amarillenta, opacas con halo verde amarillento

Microorganismo Lactosa- Negativa: Salmonella y ocasionalmente Proteus, Citrobacter. Lactosa positiva: E. coli, Enterobacter, klebsiella, con buen crecimiento. De lo contrario notable inhibicin

AGAR S.S (SALMONELLA - SHIGELLA)

FIG Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Est compuesto por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirn cidos y cambiar el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la produccin de cido sulfhdrico de las bacterias sulfato-reductoras. Este cido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en el centro. Para el aislamiento de Salmonella sp, Shigella sp a partir de heces, alimentos y otros materiales objetos de investigacin. Selectivo: Verde brillante, Bilis de Buey, Tiosulfato de sodio y citrato Diferencial: Tiosulafato, iones de hierro y lactosa. Indicador: Rojo neutro Color del agar: Claras y parduscas

Forma de actuacin: El brillante y la Bilis de Buey y la elevada concentracin de tiosulfato y de citrato inhiben considerablemente la biota acompaante. Con tiosulfato y los iones de hierro se pone en manifiesto la formacin de sulfuro, para las colonias H2S (+). Las colonias de coliformes quedan sealadas para la degradacin de lactosa y produccin de cido demostrado por el viraje del indicador (rojo neutro). Colonias caractersticas: Salmonella sp. Traslucidas y centro negro Lactosa (-) sulfuro (+) Shigella sp. Traslucidas sin centro negro Lactosa (-) sulfuro (-) Escherichia coli Rojas a rosadas sin precipitado Lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR HEKTOEN

Agar selectivo para la demostracin y aislamiento de bacterias intestinales patgenas, inclusive shigella sp a partir de los ms diversos materiales, tales como: heces, alimentos y otros. Selectivo: sales biliares Diferencial: bisulfato, sales de hierro, fucsina cida y lactosa. Indicador: azul de bromotimol Color del agar: azul verdoso claro Forma de actuacin Las colonias lactosa (-) muestra una expresiva diferencia cromtica frente a las colonias lactosa (-) por el viraje a rojo anaranjado. La combinacin de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloracin negra de las colonias sulfuro (+) Salmonella sp. Las sales biliares inhiben la biota acompaante. Colonias caractersticas Salmonella sp verdes con o sin precipitado negro en el centro lactosa (+) sulfuros (-) Shigella sp verdes, hmedas, planas y trasparentes lactosa (+) sulfuros (-) E.coli rojas- anaranjadas con halo de precipitado lactosa (+) sulfuros (-)

AGAR XLD (xilosa lisina-desoxicolato)

Para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas, especialmente de Salmonella sp y shigella sp . Selectivo: tosulfato, desoxicolato de sodio y sales biliares Diferencial: Tosulfato, sales de hierro, Xilosa, Lisina, Lactosa. Indicador: Rojo de fenol. Color del agar: Rojo claro. Forma de actuacin La degradacin a acido de xilosa, lactosa y sacarosa vira el medio amarillo. El tiosulfato y sales de hierro revelan la formacin de H2S. La descarboxilacin de lisina (Produccin de cadaverina) se reconoce por la presencia de un color rojo prpura, por aumento del pH alrededor de la colonia. Varias de estas reacciones pueden presentarse simultneamente o sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversas matices de color del indicador de pH, o a un viraje de a Amarillo a Rojo en el transcurso de una incubacin mas prolongada. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es dbil. Colonias caractersticas Salmonella sp Traslucidas con precipitado negro. Lactosa (-) Sulfuros (+) Shigella sp Traslucidas en contraste con el medio. Lactosa (-) Sulfuros (-) E. coli Amarillas, con zonas amarillas alrededor opacas, halo de precipitacin. Lactosa (+) Sulfuros (-) AGAR RAMBACH

Medio de cultivo para diagnostico diferencial para identificacin de Salmonella sp en muestras clnicas. Selectivo: desoxicolato sdico Diferencial: prolenglicol

Color del agar: guayaba Forma de actuacin El desoxicolato inhibe biota gram (+). Las Salmonellas sp forman acido a partir del propilenglicol y en combinacin con el indicador de pH producen colonias rojas caractersticas. Para diferenciar las colonias coliformes con las de Salmonella sp hay un compuesto cromgeno, que indica la separacin de B-Galactosidasa, caractersticas para los coliformes totales. Colonias caractersticas Salmonella sp Rojas Shigella sp Incoloro-amarillento E. coli Verde azulado CALDO RAPPAPORT (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO) Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp, con excepcin de S. Typhi a partir de material de investigacin de origen fecal. Selectivo: verde de malaquita, cloruro de magnesio Diferencial: tetrationato y amarillo de metacromo Color del caldo: azul. Forma de actuacin El verde de malaquita y el cloruro de magnesio inhiben notablemente la biota intestinal normal, en tanto que la mayora de Salmonellas se multiplican sin obstculos. Por regla general, nicamente S. Typhi y Shigellas resultan inhibidos tambin por el verde de malaquita. Por este motivo no es adecuado este medio de cultivo para el enriquecimiento de estos agentes patgenos. CALDO SELENITO (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO)

Para el enriquecimiento de Salmonellas a partir de heces, alimentos y otros materiales. Forma de actuacin El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y Enterococos en las primeras 6-12 horas siguientes al inicio de la incubacin. Despus el efecto inhibidor disminuye lentamente. Por el contrario Salmonella sp, Proteus sp, Pseudomonas sp no son inhibidas. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO TETRATIONATE Para el enriquecimiento selectivo de Salmonellas, a partir de diversos materiales de investigacin. Forma de actuacin El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhiben a coliformes y otras bacterias acompaantes. En cambio, todas las bacterias reductoras de tetrationate, como por ejemplo: Salmonella sp y Proteus sp pueden multiplicarse mas o menos sin obstculo. El cido procedente de la reduccin del tetrationato es neutralizado por carbonato calcio. Las sales biliares inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia no obligatoria en el intestino. La adicin del verde brillante sirve, sobre todo para inhibir a la biota gram (+). Dado que le medio de cultivo con verde brillante posee un efecto inhibidor muy intenso, resulta ventajoso a veces suprimir la adicin de verde brillante a fin de obtener un rendimiento satisfactorio de Salmonellas.