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Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2008; 25(2): 204-7.

ArtculO OriginAl

PATOGENICIDAD DE LAS AMEBAS DE VIDA LIBRE AISLADAS DE FUENTES DE AGUA EN LIMA


Mara del Carmen Garaycochea1,a, Mara Beltrn1,a, Cecilia Morn2,b
RESUMEN Objetivos. Determinar la presencia de amebas de vida libre (AVL) en fuentes de agua del departamento de Lima y evaluar su capacidad patgena en ratones normales e inmunosuprimidos. Materiales y mtodos. Se recolectaron muestras de agua de ros, lagos, piscinas y pozos de Lima. El aislamiento se realiz por cultivo en agar no nutritivo al 2% con E. coli o E. aerogenes a 37 C. Posteriormente se instil en ratones normales e inmunosuprimidos (betametasona 1,4 mg/mL, dosis nica) una suspensin con las amebas aisladas. A los 15 das se evaluaron histolgicamente los daos en ambos grupos. Resultados. Se identificaron AVL en 40/83 muestras, 31,3% de las muestras se desarrollaron en los cultivos. Se aislaron 26 cepas de AVL de siete gneros (Hartmannella, Acanthamoeba, Mayorella, Naegleria, Vahlkampfia, Vannella y Saccamoeba), Acanthamoeba fue la ms frecuente (44,2%). Se encontraron AVL en 53,8% de los ratones inmunosuprimidos y 15,4% de los normales (p<0,05). Conclusiones. Existen AVL en cuerpos de agua de Lima, las cuales tienen un potencial patgeno en pacientes inmunosuprimidos, existiendo un riesgo de infeccin amebiana asociada con estas fuentes de agua. Palabras clave: Amebiasis; Acanthamoeba; Naegleria; Cuerpos de Agua; Per (fuente: DeCS BIREME).

PATOGENICITY OF FREE-LIVING AMOEBAS ISOLATES IN BODY WATERS FROM LIMA


ABSTRACT Objectives. To determine the presence of free-living amoeba (FLA) in water bodies from Lima department and assess their pathogenic ability in normal mice and immunosuppressed. Material and methods. Water samples were collected from rivers, lakes, swimming pools and wells in Lima, Peru. The isolation was performed by culture in non-nutritious agar with 2% of E. coli or E. aerogenes at 37 C. Subsequently were injected into normal mice and immunosuppressed (betamethasone 1.4 mg/mL, a single dose) with a suspension of amoeba isolated. For the 15 days were assessed histological damage in both groups. Results. AVL were identified in 40/83 samples, 31.3% of the samples were developed in cultures. 26 strains were isolated from AVL of seven genera (Hartmannella, Acanthamoeba, Mayorella, Naegleria, Vahlkampfia, Vannella and Saccamoeba), Acanthamoeba was the most frequent (44.2%). AVL was found in 53.8% of immunosuppressed mice and 15.4% of the normal (p <0.05). Conclusions. AVL exist in water bodies from Lima, which have a potential pathogen in immunosuppressed patients, there is a risk of amoebic infection associated with these water sources. Key words: Amebiasis; Acanthamoeba; Naegleria; Water Resources; Peru (source: MeSH NLM).

INTRODUCCIN Las amebas comprenden un grupo enormemente diverso, desde las amebas gigantes (Amoeba proteus, Chaos carolinense) tiles para estudios de biologa celular hasta otras con potencial patognico para el hombre (Acanthamoeba, Naegleria y Balamuthia). Las amebas de vida libre (AVL) son ubicuas en la naturaleza, encontrndose en aire, suelo, agua de mar, ros, lagos, fuentes, piscinas, etc. alimentndose de bacterias pero, comportndose en algunas ocasiones como parsitos oportunistas. Por esta caracterstica se les denomina tambin amebas anfizoicas, aludiendo a su capacidad de sobrevivir tanto en vida libre como en el interior de hospederos, pudiendo ocasionar meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP), encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) o queratitis amebiana (KA) (1-3). La infeccin humana por AVL es poco frecuente, sin embargo hay un incremento de casos con la emergencia del VIH/ SIDA en los reportes de MEAP y EGA, ya que los pacientes
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inmunosuprimidos son particularmente susceptibles a estas infecciones (3,4). Por otro lado, los casos de KA son ms frecuentes por el uso de los lentes de contacto (5). Diversas AVL han sido cultivadas de material de hisopado farngeo y nasal, sugiriendo que estos organismos son comnmente inhalados (6), Estudios serolgicos poblacionales han determinado la presencia de anticuerpos contra Acanthamoeba en personas sanas (7), por lo que se presume que tenemos exposicin a estos agentes, pero slo personas susceptibles inmunosuprimidos principalmente- desarrollan enfermedad. En el Per, los estudios son limitados, siendo en su mayora reportes de casos. En 1957, se publica el primer caso de abscesos amebianos cerebrales y meningoencefalitis sin compromiso heptico ni pulmonar (8), posteriormente en 21 casos de MEAP, se determin que Balamuthia mandrillaris fue la causa de 10 casos, sugirindose que podra ser el agente etiolgico ms frecuente en el Per (9), otros reportes han seguido presentando casos fatales por el mismo agente

Laboratorio de Enteroparsitos, Centro Nacional de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud. Lima, Per. Laboratorio de Patologa, Centro Nacional de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud. Lima, Per. a Biloga; b Mdico patloga. Recibido: 20-12-06 Aceptado: 15-03-08

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Amebas de vida libre en Lima

(10,11)

. Posteriormente se han seguido comunicando casos en diferentes hospitales de Lima (12-14), algunos de ellos que producen lesiones cutneas (14,15) y otros queratitis (16). Por otro lado, se han realizado aislamientos de AVL en piscinas de Lima (17) y fuentes de agua de Ica (18), pero no se ha demostrado la capacidad patognica de las amebas aisladas en el ambiente. Esta investigacin busca evidenciar la presencia de AVL en aguas de diversas fuentes de Lima y establecer experimentalmente su poder patognico.

RESULTADOS
En 48,2% (40/83) de las muestras obtenidas se aislaron AVL en la observacin directa, de los cultivos o en ambos. Slo una (1/15) de las piscinas evaluadas present AVL, esta piscina tena deficiente limpieza y aparentemente se encontraba en desuso, por haber concluido la temporada de verano. La mayora (32/40) de las muestras positivas proceda de pozos y lagos de las provincias de Huarochir y Yauyos, que tenan gran presencia de materia orgnica. Ante la prueba para determinar la supervivencia de las cepas a 37 C, se determin crecimiento de amebas en el 31,3% de la muestras. De estas, se aislaron 26 cepas de amebas pertenecientes a siete gneros: Hartmannella, Acanthamoeba, Mayorella, Naegleria, Vahlkampfia, Vannella y Saccamoeba, con predominancia de Acanthamoeba entre las cepas aisladas (44,2%). La mitad (13/26) de los ratones pretratados con betametasona e inoculados con amebas mostraron sntomas de enfermedad, mientras que ninguno de los ratones no tratados present sintomatologa. Dos ratones del grupo inmunosuprimido murieron antes de terminar el periodo de observacin (das 9 y 11), en ambos se encontraron amebas en cerebro, hgado y pulmn. Se encontr presencia de AVL en 53,8% (14/26) ratones inmunosuprimidos a diferencia de 15,4% (4/26) del grupo no tratado (p<0,05). En los ratones tratados con betametasona se encontr evidencia de enfermedad tanto a nivel cerebral, pulmonar y heptico, a diferencia del grupo control en el cual la histopatologa no mostr lesiones en ninguno de los rganos evaluados (Tabla 1). Microscpicamente, con coloracin PAS y hematoxilina-eosina, en el 38,5% de los cortes histolgicos de cerebro de ratones tratados con betametasona, se encontr infiltracin de quistes y trofozotos de amebas, pero no se observ la presencia de granulomas. En los cortes histolgicos de hgado se observ granulomas, necrosis, congestin vascular e inflamacin, pero no se encontraron amebas. En los cortes histolgicos de pulmn, se observ que la mayora present congestin vascular (92%), aunque slo en 42,3% se observaron amebas (Tabla 1).

MATERIALES Y MTODOS
Se obtuvieron 83 muestras de agua procedentes de ros, lagos, piscinas y pozos que eran empleadas por los habitantes del lugar en actividades agrcolas, recreativas y medicinales as como para consumo o aseo, de las provincias de Huarochir, Yauyos, Oyn, Huaura y Lima del departamento de Lima, Per durante el segundo semestre del ao 2004. AISLAMIENTOS DE AMEBAS Para el aislamiento de AVL de muestras de agua se emple hisopos de gasa estriles y concentracin por centrifugacin (2500 g por 5 min) (19). El sedimento obtenido de la centrifugacin, fue aspirado y sembrado en placas de Petri con agar no nutritivo al 2%, estriadas con E.coli o E. aerogenes muertos por calor a 56 C, (durante 2-4 horas) e incubado a 37 C (20). Las placas fueron observadas cada cuatro das, macroscpica y microscpicamente, para observar el crecimiento de las amebas. Mediante estudio morfolgico de los quistes y trofozotos se hizo la identificacin mediante la clave de Page (21). Se emple la coloracin Giemsa - May Grunwald y hematoxilina frrica para la observacin de trofozotos y quistes. Luego se prepar una suspensin amebiana a partir del lavado de las placas con agua destilada estril, y centrifugacin a 2500 rpm por dos minutos, se hizo el recuento de amebas presentes en la suspensin, hasta ajustarlo a una densidad aproximada de 2,5 x104 trofozotos y quistes de amebas. DETERMINACIN DE PATOGENICIDAD Se formaron dos grupos de 26 ratones Balb-c de 12-15g de peso, un grupo sometido a tratamiento inmunosupresor con betametasona (1,4 mg/mL, dosis nica) y el otro grupo sin ningn tipo de tratamiento. Los ratones fueron instilados va intranasal con la suspensin amebiana en una sola ocasin (22,23) . Los ratones fueron alimentados ad libitum y observados diariamente para evaluar signos de enfermedad (debilidad, menor crecimiento, pelo erizado, comportamiento anormal) y mortalidad. A los 15 das de observacin fueron sacrificados todos los ratones, se les extrajo el cerebro, hgado y pulmn y luego de la evaluacin macroscpica de los rganos, fracciones de los mismos fueron cultivados en placas Petri con agar no nutritivo al 2% e inoculados con bacterias muertas por calor; el resto de los rganos fueron conservados con formol 10%. Posteriormente, se realiz el estudio histolgico empleando la coloracin PAS y hematoxilina-eosina. Se compar la presencia de AVL en ambos grupos con la prueba chi2 usando el programa Epidat 3.1.

DISCUSIN
Se demostr la presencia de AVL en fuentes de agua de Lima, slo una muestra (1/15) correspondiente a piscinas pblicas fue positiva, a diferencia de estudios previos realizados en Lima donde 15/34 fueron positivas (17), en Ica 5/24 (18) y en Santiago de Chile 5/8 (24). En forma similar a lo que encontr Suarez et al. (18) fueron ms frecuentes las AVL en muestras de fuentes de agua natural que artificial. Entre los gneros aislados, slo dos de ellos son reconocidos como potencialmente patgenos para los humanos: Acanthamoeba y Naegleria. No se ha reportado patogenicidad de los gneros Hartmannella, Saccamoeba y Vahlkampfia, Mayorella y Vannella (1). Coincidiendo con estudios previos (18,24,25), Acanthamoeba fue la especie ms frecuentemente aislada. Se demostr que las AVL aisladas tiene potencial patognico y este fue mayor en aquellos ratones que fueron inmunosuprimidos

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Garaycochea MC et al.

Tabla 1. Hallazgos histopatolgicos en ratones instilados con amebas aisladas de cuerpos de agua de Lima.
Hallazgos histopatolgicos Cerebro AVL Granulomas Hemorragia Pulmn AVL Congestin vascular Colapso de alveolos Secrecin purulenta Hgado AVL Inflamacin Congestin vascular 0 9 9 (34,6) (34,6)

verano para garantizar que estn libres de riesgo de infeccin con AVL para sus usuarios.

Grupo inmunosuprimido* n (%)

Grupo control n (%)

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10 0 5

(38,5) (19,2)

4 0 0

(15,4) -

11 24 8 2

(42,3) (92,3) (31,0) (7,7)

3 0 0 0

(11,5) -

0 0 0

* Tratado con betametasona1,4 mg/mL; AVL: amebas de vida libre.

con betametasona. Si bien, otros modelos han trabajado con diferentes corticoides para generar inmunosupresin (4,23), el modelo que fue usado en este estudio demostr ser til para estos fines. El hallazgo de cepas de Acanthamoeba y Naegleria en estas fuentes de agua, que han demostrado su capacidad patognica, sugiere el riesgo de adquirir una infeccin si existe una exposicin a fuentes de agua -principalmente naturalesdel departamento de Lima, particularmente si las personas expuestas tienen algn nivel de inmunosupresin. Estudios previos han podido determinar, el riesgo de infeccin por Naegleria segn su concentracin en fuentes de agua (26). Algunos reportes, han podido demostrar la relacin entre casos clnicos de meningoencefalitis por AVL y amebas aisladas en muestras ambientales (27). Por otro lado, se ha encontrado tambin la presencia de AVL en muestras hospitalarias de Brasil (28,29), lugares que an no han sido estudiados en Per. Podemos observar una tendencia de las cepas de Acanthamoeba de establecerse en el cerebro y el pulmn, lo cual se encuentra en concordancia con trabajos anteriores, donde se destaca la tendencia neumotrpica de algunas especies de Acanthamoeba y de asentarse en el cerebro luego de la inoculacin intranasal (30). Las fuentes de agua fueron seleccionadas por conveniencia, y no son en ningn sentido representativas de las que se encuentran en el departamento de Lima, por lo que los resultados no pueden reflejar -necesariamente- lo que sucede realmente en Lima; sin embargo, son tiles para mostrar la presencia del riesgo. Prximos estudios deben evaluar mejor las caractersticas de las fuentes de agua que puedan estar infestadas con AVL, por otro lado, aunque no encontramos muchas piscinas con AVL, es necesario hacer una vigilancia de stas en temporada de

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Amebas de vida libre en Lima

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