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LABORATORIO N4 DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: 1. Aspectos te !cos: 1.1 "A#!$%s% s%$!&%$ ' p%(c e)t!c%.

. La saliva es una mezcla derivada de la secrecin de 3 pares de glndulas, las partidas, submaxilar y sublingual, como tambin de pequeas glndulas mucosas ubicadas difusamente sobre la mucosa de la boca. La cantidad normal secretada en una persona adulta es de a ,! "itros en #$ %oras. La composicin de la saliva es un &&,!' ( #) y *,! ' de slidos orgnicos e inorgnicos, el p( oscila entre +,# y ,,$. Los principales componentes orgnicos son las glicoprote-nas, prote-nas .alb/mina, globulinas0 y carbo%idratos. Los componentes inorgnicos principales son calcio, sodio, potasio, magnesio y fsforo. La secrecin pancretica es un l-quido acuoso no viscoso, que tiene un contenido de (#) seme1ante al de la saliva y que lleva cierta cantidad de prote-nas y compuestos inorgnicos, principalmente 2a 3, 43, (5)36 y 5l6, adems estn presentes en pequeas cantidades 5a 3#, 7n3# y (8)$6#. 9l p( del 1ugo pancretico es claramente alcalino de ,,! a :,* o mayor. 9n la secrecin pancretica se encuentran numerosas enzimas, la tripsina, amilasa, carboxipeptidasa, lipasa y otras. La enzima 6amilasa, presente en la saliva, inicia la degradacin del almidn, la principal fuente de carbo%idratos de la dieta %umana. 9sta enzima %idroliza al azar los enlaces . $0 que unen residuos de glucosa en el almidn, a excepcin de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificacin de las cadenas. 8or la accin de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la longitud de la cadena del almidn se reduce de varios miles a unas oc%o unidades de glucosa. La alta concentracin de protones del estmago inactiva la 6amilasa salival. La digestin del almidn contin/a en el intestino delgado por la accin de la 6amilasa pancretica, como producto se forma una mezcla del disacrido maltosa, el trisacrido maltotriosa y oligosacridos conocidos como dextrinas que poseen ramificaciones . +0.
%$#!*(
%#!$%s%

ENZIMAS DIGESTIVAS

#%$tos% + #%$tot !os% +

*e+t !(%s Ec,%c!( 4.1

9l almidn y dextrinas comple1as al ser tratados con una solucin de yodo dan un comple1o de coloracin azul, mientras que las dextrinas ms simples, la maltotriosa y maltosa no dan una reaccin positiva. ;s-, la accin de la 6amilasa sobre polisacridos puede ser seguida midiendo la decoloracin del comple1o azul %asta alcanzar el punto acrmico .solucin incolora0. 18

La maltosa y otros carbo%idratos reductores producidos en la reaccin pueden ser detectados por el test de <enedict. 9ste mtodo es cualitativo, consiste en una solucin alcalina de 5u#3 que se encuentra formando un comple1o con citrato. 9l in c/prico es reducido a 5u 3 por compuestos reductores con formacin de %idrxido cuproso amarillo o de xido cuproso ro1o. 9l cambio de coloracin o la formacin de un precipitado ro1o6ladrillo .5u #)0 indica la presencia de un compuesto reductor. 5arbo%idratos reductores tambin pueden detectarse y cuantificarse por los ensayos de =omogyi62elson y de la o6toluidina. 1.- L!p%s% p%(c e)t!c%. e/ecto *e $% s%$ 0!$!% . La mayor-a de los l-pidos de la dieta son triglicridos, esteroles y fosfol-pidos de membrana de origen vegetal y animal. La digestin de los l-pidos ocurre en el duodeno gracias a la secrecin pancretica. La lipasa pancretica act/a en la interfase ( #) > aceite de las gotitas de l-pidos finamente emulsificadas, formadas por la agitacin mecnica en el intestino en presencia de sales biliares. La degradacin de l-pidos en el sistema digestivo es incompleta, los triglicridos son transformados a una mezcla de diglicridos, monoglicridos, glicerol y cidos grasos. La reaccin puede ser seguida por el cambio de p( causado por la disociacin de los cidos grasos formados a travs del tiempo de la reaccin ocupando un indicador cido6base, compuestos que son cidos o bases cuyas distintas formas inicas tienen diferentes colores. 9l ro1o de fenol es un cido dbil con un intervalo de transicin entre valores de p( +,$ y :,*? la forma protonada es amarilla y la forma bsica es ro1a. @na transicin de p( de un medio neutro o alcalino a p( cido va acompaada de un cambio de coloracin, de ro1o a amarillo.
Lipasa

Ariglicridos

diglicridos 3 monoglicridos 3 glicerol 3 )c!*os 1 %sos =ales biliares . R"COO" 2 324


Ec,%c!( 4.-

-. O05et!&os. Beterminar la actividad enzimtica de las enzimas digestivas 6amilasa y lipasa de acuerdo a las diferentes propiedades que presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas.

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6. 7% te e+pe !#e(t%$. 6.1 M%te !%$es bao termostatizado > termmetro tr-pode > re1illa > mec%ero espectrofotmetro > celdas # gradillas # pipetas graduadas de * ml # pipetas graduadas de ! ml pipeta graduada de ml pipeta graduada de ml pipeta graduada de # ml pizeta vaso precipitado de ** ml vaso precipitado de #!* ml vaso precipitado de !** ml 6.Re%ct!&os ;lmidn *,! ' en tampn fosfato *, C p( +,, Aampn fosfato *, C, p( +,, 2a5l ' Deactivo de <enedict =olucin de yodo #,! mC 8ancreatina mg> ml, como fuente de 6amilasa 8ancreatina * mg>ml, como fuente de lipasa Do1o fenol *,: mg>ml 2a#5)3 *,! C (5l ,* C Lec%e con #+' de material grasa 5olato de sodio !'. 4. 7 oce*!#!e(to. 9n forma previaE Biluya E! la solucin stocF de 6amilasa mg>ml. . ml de enzima mg>ml 3 $ ml de tampn fosfato *, C p( +,,0. 8repare una bater-a de tubos de ensayo rotulados con 3,* ml de la solucin de yodo .A*", A ", A#", A#", A!" y A !"0. 8repare una bater-a de tubos de ensayo rotulados con !,* ml del reactivo de <enedict .A*<, A <, A#<, A#<, A!< y A !<0.

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4.1 3!* $!s!s *e %$#!*( po "%#!$%s% p%(c e)t!c% 8repare los tubos rotulados como se indica en la tabla $. E
TABLA 4.1

T8BOS ;lmidn .ml0 Aampn fosfato *, C .ml0 2a5l ' .ml0

B 66666 !,* ,*

T *,* 66666 #,*

Not%E 9s importante que se mida exactamente los tiempos indicados en el procedimiento. 5oloque el tubo A en un bao de agua a 3, G5 durante ! minutos. "nicie la reaccin, agregando #,* ml de enzima diluida >! al tubo A. Cezcle sin agitacin violenta el contenido del tubo e incube inmediatamente a 3,G5. 9l momento en que agreg la enzima al tubo de ensayo se considera como tiempo cero de la reaccin. ; los tiempos *, , #, ! y ! minutos de iniciada la reaccin enzimtica, saque ,* ml de la solucin A para estimar cambios de concentracin del sustrato .almidn, punto $. . 0 y en forma paralela, ,* ml de la solucin A para cuantificar el producto de la reaccin .cuerpos reductores, punto $. .#0. Not%: Es !#po t%(te 9,e ,(% &e: s%c%*o e$ &o$,#e( !(*!c%*o e( /o #% !(#e*!%t% !(!c!e $os p oce*!#!e(tos *esc !tos e( 4.1.1 ' 4.1.-.

4.1.1 Est!#%c!( ;se#!c,%(t!t%t!&%< *e$ %$#!*(. Cezcle ,* ml del ensayo de la %idrlisis enzimtica del almidn .tubo A0 obtenido al tiempo cero de reaccin con 3,* ml del reactivo de yodo en el tubo de ensayo ya rotulado. (omogenice. Depita la operacin anterior a los diferentes tiempos de incubacin . , #, ! y ! min0. 8repare el blanco con ,* ml del tubo < y 3,* ml de la solucin de yodo. Lea la absorbancia a =4> (#, calibrando el equipo con el blanco. Hrafique absorbancia versus tiempo de reaccin. 4.1.- Est!#%c!( *e c,e pos e*,cto es. Cezcle ,* ml del ensayo de la %idrlisis enzimtica del almidn .tubo A0 obtenido al tiempo cero de reaccin con !,* ml del reactivo de <enedict en un tubo de ensayo ya rotulado. (omogenice. 5oloque el tubo de ensayo en un bao en ebullicin por !,* minutos exactos. 9nfr-e ba1o llave de agua con cuidado. Depita la operacin anterior .3 pasos0 a los diferentes tiempos de incubacin . , #, ! y ! min0. 8repare el blanco con ,* ml del tubo < y !,* ml de la solucin de <enedict, incube en un bao de agua a ebullicin por ! min y enfr-e. Lea la absorbancia a =?> (#, calibrando el equipo con el blanco. )bserve si %ay aparicin de un precipitado ro1o. 21

Hrafique absorbancia versus tiempo de reaccin.

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4.-. De1 %*%c!( *e t !1$!c@ !*os po $% $!p%s% p%(c e)t!c%. 9n forma previaE 9n un tubo de ensayo prepare * ml de una suspensin de * mg>ml de pancreatina en agua destilada. Be1e la enzima en un vaso de agua con %ielo. 2eutralice la lec%e fresca adicionando * ml de 2a #5)3 *,! C a $* ml de lec%e con *, ml de una solucin de ro1o fenol .*,: mg>ml0. 8repare # tubos de ensayo con ! ml de lec%e neutralizada cada uno. ;dicione a uno de ellos *,$ ml de (5l ,* C. 9stos dos tubos servirn como referencia para el cambio de color, el color rosado indica medio neutro y bsico, el amarillo indica medio cido. Be acuerdo a la tabla $.#E 8repare una bater-a de tubos de ensayo rotulados. ;gregue la lec%e neutralizada que contiene el indicador. ;gregue la solucin de colato de sodio. ;gregue el agua destilada. 5oloque los tubos en un bao de agua termostatizada a 3,G5 durante !,* min. "nicie la reaccin enzimtica adicionando #,* ml de la solucin de pancreatina a los tubos A y A#. ;gite y de1e incubando siempre a 3,G5. ;dicione #,* ml de agua destilada a los tubos controles 5 y 5#. ;gite y de1e incubando siempre a 3,G5. ;note el tiempo requerido para el cambio de color y olor desde que agreg la pancreatina, compare tambin los cambios de color y densidad en los tubos.
TABLA 4.-

T,0o Lec%e neutralizada .mL0 =olucin de colato de 2a .mL0 (#) destilada . mL0

T1 !,* 666 ,*

T!,* ,* 666

C1 !,* 666 ,*

C!,* ,* 666

=. B!0$!o1 %/A% Dobert <o%insFi, && . <ioqu-mica, !I 9dicin, ;ddison6Jesley, "beroamericana. 7 e1,(t%s. . K5on qu propsito agrega 2a5l a la reaccin de %idrlisis del almidnL #. @sando maltosa y sacarosa como e1emplos, discuta las caracter-sticas de los az/cares que tienen propiedades reductoras. 3. 9l reactivo de <enedict presenta color azul debido al cobre. K8or qu en presencia de maltosa se observa un cambio de colorL $. K5ul es la estructura de las sales biliares y por qu funcionan como detergentesL !. KMu accin e1erce el colato de 2a en la reaccin catalizada por la lipasa pancreticaL +. KMu puede concluir de los resultados obtenidos de los tubos 5 y 5# con respecto al colato de 2aL 23

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