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U.F.R. DE PHARMACIE
Année 1999 Thèse N°
THESE
présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER –
GRENOBLE I
SPECIALITE : Chimie Moléculaire
Option : Sciences Pharmaceutiques
Présentée et soutenue publiquement le 14 décembre 1999
Par
Philippe OP de BECK
ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE
LEEA GUINEENSIS G. DON (LEEACEAE)
JURY
1
M. LECLERC G. Professeur à l’Université de Grenoble I Président
M. HOSTETTMANN K. Professeur à l’Université de Lausanne
Mme MARIOTTE A.M. Professeur à l’Université de Grenoble I
Mme DIJOUXFRANCA M.G. Maître de Conférence à l’Université de Grenoble I
2
A ma sœur Christelle.
A mes amis.
3
Remerciements
Nous tenons tout d’abord à remercier les Laboratoires Pierre FABRE et notamment :
Au membre du jury :
A Monsieur le Docteur Bruno DAVID, Directeur du Département Phytochimie du Centre de
Ramonville.
Nous exprimons nos vifs remerciements pour avoir accepté de juger ce travail. D’un contact
toujours aimable, vous avez répondu présent à nos nombreuses demandes malgré vos multiples
taches Vos remarques et discussions ainsi que l’aide efficace que vous nous avez apportées
dans la réalisation de ce travail ont été très appréciées. Soyez en vivement remercié.
4
A Monsieur le Professeur Gérard LECLERC, Professeur de Chimie Organique à l’UFR de
Pharmacie de Grenoble et Directeur du Département de Pharmacochimie Moléculaire.
Nous sommes sensible à l’intérêt que vous portez à juger notre travail. Recevez ici le
témoignage de ma gratitude.
Aux personnes qui ont participé "de près ou de loin" à son élaboration :
5
A Monsieur Claude BOSSO, Directeur de l’unité de Spectrométrie de Masse du Centre
d’Etude et de Recherche sur les Macromolécules Végétales de Grenoble.
Soyez remerciez pour la réalisation et les analyses des spectres de masse. Vos conseils
judicieux et votre disponibilité ont été très appréciés.
6
A Monsieur Patrick RAVANEL, Professeur de Biologie Végétale, Directeur du Laboratoire
Ecosystèmes et Changements Environnementaux de Grenoble, pour tes encouragements tout
au long de ce travail, ton aide et ta disponibilité. J’ai aussi beaucoup aimé tes diapos sur les
plantes toxiques de France, il va de soit que ta narration avec l’accent d’la Yaute y sont pour
quelque chose !
A Madame Claude VIAL, pour sa gentillesse et sa disponibilité pour les nombreuses
recherches en ligne que nous avons effectuées.
A Diderot Noungoue Tchamo, je te remercie, entre autre, pour m’avoir offert ton amitié et
amené Leea guineensis. Reçois ici, toi qui es devenu Maître de Conférence à Yaoundé, un
témoignage de ma profonde amitié.
A Gilles BRUN, "le Dupont bis", ton travail sur Catharanthus roseus, nous aura confronté aux
mêmes situations. Reçois ici un témoignage de mon Amitié.
A Stéphane, thésard au Laboratoire de Chimie bioorganique pour avoir enregistré les spectres
au 300 MHz au CEA cet été !
A Jin, Médecin Pharmacologue de l’Université de Shanghai, en stage chez nous qui a essayé de
mettre au point un test antioxydant pour l’analyse de nos produits ainsi que pour les résultats
préliminaire sur la relaxation des muscles lisses.
A ma sœur Muriel et son entreprise O de Gamme pour avoir eu la gentillesse de me scanner les
planches et dessins de Leea.
7
Liste des abréviations
13
C J modulé spectre carbone 13 réalisé avec J modulation
BAW Butanol-Acide acétique-Eau
BuOH butanol
C(x) Solvant de Chromatographie de type (x)
C-18 Chromatographie sur support en phase inverse C-18
CCM Chromatographie sur Couche Mince
CCMprep Chromatographie sur Couche Mince Préparative
CDCl3 chloroforme deutérié
CD3OD méthanol perdeutérié
CG/SM couplage Chromatographie Gazeuse-Spectrométrie de Masse
CHCl3 chloroforme
cHex cyclohexane
CH2Cl2 dichlorométhane
CLMP Chromatographie Liquide Moyenne Pression
CO chromatographie sur Colonne Ouverte
COLOC XH shift Correlation by Long range Coupling
COSY Correlated SpectroscopY
CPG Chromatographie en Phase Gazeuse
CV Composés Volatils
DCI Desorption by Chemical Ionisation
DIC Degré d’Insaturation et de Cycle
DMSO diméthyl sulfoxyde
DMSO-d6 diméthyl sulfoxyde hexadeutérié
E(x) Elution de type x
EI Electronic Impact
EtOAc acétate d’éthyle
EtOH éthanol
FAB Fast Atom Bombardement
F () ST Flavonol Sulfotransférase
J (Hz) constante de couplage exprimé en Hz
L. Leea
LH-20 chromatographie sur gel de Sephadex LH-20
MeOH méthanol
m/z masse/charge électronique
nd non déterminé
PM Poids Moléculaire
ppm partie par million
Rdt rendement
rel relatif
Rf Rapport frontal
Rha Rhamnosyl
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
RP Phase Inverse
Si et SiO2 support chromatographique en silice
SM Spectrométrie de Masse
ST Sulfotransférase
uma unité de masse atomique
8
UV Ultra-Violet
Visiprep Colonne prête à l’emploi de type Visiprep
VLC Vacuum Liquid Chromatography
XHCORR XH shift CORRelated 2D NMR
δ (ppm) déplacement chimique exprimé en ppm
λmax longeur d’onde d’absorbance maximale
9
TABLE DES MATIERES
PAGE
Introduction 2
Première Partie – Bibliographie 4
I Position systématique 5
A) Historique de la taxonomie du genre Leea 5
B) Position systématique de la famille des Leeaceae 7
C) Conclusion 9
I- Etude phytochimique 27
A) Criblage phytochimique 27
B) Huile essentielle 28
C) Composés phénoliques 28
10
11
II- Etude biologique des Leea 31
A) Activités des différentes espèces de Leea 31
B) Activités de Leea guineensis 35
C) Conclusion 39
I Introduction 40
II Classification, Structure 40
A) Les flavones sulfatées 42
B) Les flavonols sulfatés 45
III Distribution 49
IV Fonctions 50
A) Détoxification 51
B) Transfert d’ion 51
C) Bioactivation 51
D) Régulation du transport de l’auxine 52
V Enzymologie 52
VI Métabolisation et Bioconversion 54
A) Métabolisation 54
B) Bioconversion 55
VII Propriétés biologiques des flavonoïdes sulfatés 55
A) Activité Antiallergique 55
B) Activité Mutagène – Carcinogène 56
C) Inhibition des déshydrogénases 57
D) Inhibition de l’aldose réductase 57
E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire 60
F) Chimioprévention des cancers du sein 61
12
Conclusion 63
13
Deuxième Partie Travaux Personnels 64
I- Matériel végétal 65
I- Extrait hexanique 68
II- Extrait dichlorométhane 69
III- Extrait acétate d’éthyle 70
IV- Extrait butanolique 71
V- Extrait aqueux 72
I- Analyse 73
II- Discussion 77
I- Identification de Terp-1 80
II- Identification de Terp-2 83
III- Identification de Terp-3 87
IV- Identification de Terp-4 89
V- Identification de Terp-5 91
14
VI- Identification de Terp-6 95
VII- Identification de Terp-7 100
15
I- Introduction 137
II- Résultats 138
III- Conclusion 138
Discussion 144
Conclusion 155
Bibliographie 159
Annexes 173
I Lyophilisation 174
II Matériel chromatographique 174
A Chromatographie analytique en couche mince (CCM) 174
B Chromatographie préparative
174
C Chromatographie en phase gazeuse (CPG) 176
16
E Extrait aqueux 183
IV Mesures spectrales 184
A spectre UV
184
B Spectre de masse (SM) 184
C Spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) 184
D Pouvoir rotatoire
184
V Méthodes chimiques 185
A Recherche de tanins
185
B Recherche d’alcaloïdes
185
C Recherche de saponines
185
D Hydrolyse du palmitate de β-amyrine
185
VI Tests biologiques 186
A Evaluation de la viabilité cellulaire 186
B Evaluation de la production de prostaglandines 6KF1α par les kératinocytes humains 188
C Evaluation de l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 189
D Evaluation d’une activité antiradicalaire
191
VII Fiches produits 193
17
Philippe OP de BECK
Etude Phytochimique et Biologique de Leea guineensis G. Don (Leeaceae)
Mots Clés :
Leea guineensis G. Don, Leeaceae, Composés volatils, Flavonoïdes, Flavonols sulfatés,
Terpènoïdes, Triterpènes acylés, Acides phénoliques, Antiinflammatoire, Cardiovasculaire,
Antiradicalaire, RMN, CG/SM
Résumé :
Très peu étudiée, Leea guineensis G. Don appartient à la famille monogénérique des
Leeaceae. Elle est utilisée en médecine traditionnelle notamment dans les domaines
cardiovasculaire et antiinflammatoire. Pou ces raisons, l’étude phytochimique et biologique
de cette plante est intéressante.
Dans une première partie, nous avons rappelé les données bibliographiques
concernant la classification et la description botanique de cette plante, ses utilisations en
médecine populaire et les études phytochimiques déjà réalisées.
Une deuxième partie présente les résultats de notre propre étude phytochimique et
biologique. Ainsi, 73 composés volatils et 17 métabolites provenant de cinq extraits (hexane,
dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et eau) des feuilles ont été identifiés. L’utilisation
conjointe de plusieurs méthodes spectroscopiques (CG/SM, UV, RMN 1D et 2D, SM) a
ainsi mis en évidence 7 terpénoïdes dont 3 triterpènes acylés, 7 flavonoïdes dont 3 flavonols
sulfatés, 2 acides phénoliques et 1 acide gras.
La présence de flavonoïdes sulfatés et de terpénoïdes dans cette famille est recensée
pour la première fois. Le coriolate de βamyrine, la quercitrine 3’sulfate et la quercétine
3,3’,4’trisulfate sont isolés pour la première fois du règne végétal.
Les activités antiinflammatoire et antiradicalaire ont été recherchées sur les extraits polaires
et quelques composés purs. L’activité antiinflammatoire, mesurée par la production de
prostaglandines, est peu significative pour les extraits alors que le palmitate de βamyrine
s’est montré actif. Par ailleurs ces mêmes extraits ainsi que les acides phénoliques et les
flavonols non sulfatés présentent une activité antiradicalaire.
Abstract :
The Leeaceae is a monogeneric family close to the Vitaceae. Leea guineensis is a
widespread shrub that grows in tropical climate. It was reported to be used in traditional
African medicine for its cardiac and antalgic properties.
Our phytochemical investigations led to the identification of 73 volatils compounds
from the wood and leaves, and of 17 compounds coming from five different extracts from
leaves (hexane, dichloromethane, ethylacetate, butanol and water). They were identified by
means of their spectroscopic data (GC/MS, UV, NMR, SM) and especially 2D NMR
experiments, as 7 terpenoids (including 3 acylated triterpens), 7 flavonoids (including 3
sulphated flavonols), 2 phenolic acids and 1 fatty acid.
18
Sulphated flavonoids and terpenoids have never reported previously in the Leeaceae.
Coriolic ester of β-amyrine, quercitrine 3’-sulphate and quercetine 3,3’,4’-trisulphate are
reported for the first time in the plant kingdom.
Biological activity of the polar extracts and of some pure compounds have been
evaluated on prostaglandins production and metalloproteinase expression in keratynocyts.
Besides these antiinflammatory activities, a potential antiradicalar property was mesured.
INTRODUCTION
19
INTRODUCTION
Dans cette optique, il m’a été confié l’étude d’une plante camerounaise, Leea
guineensis (Leeaceae). Celle-ci est notamment utilisée en médecine traditionnelle pour ses
effets anti-inflammatoires et antihypertensifs.
Or, l’analyse de la littérature montre que la famille des Leeaceae a été très peu étudiée.
On ne répertorie, de 1959 à 1991, qu’une vingtaine de dérivés phénoliques (flavonoïdes et
acides phénoliques), et quelques criblages préliminaires faisant apparaître des tanins, des
alcaloïdes et des saponines pour certaines espèces.
L’étude entreprise sur Leea guineensis offre deux intérêts majeurs. Premièrement, toute
l’analyse phytochimique sera nouvelle pour cette espèce, car avant nous, aucun travail n’a été
entrepris. L’identification des constituants majoritaires permettra aussi de mieux connaître la
famille et de la situer dans la systématique moderne. Deuxièmement, une étude des propriétés
biologiques des extraits ainsi que des composés isolés, permettront de valider les usages de
cette plante en médecine traditionnelle ou d’apprécier de nouvelles propriétés.
La première partie, bibliographique, est consacrée à une étude botanique très générale
de la famille des Leeaceae, et de l’espèce Leea guineensis G. Don. L’étude phytochimique et
biologique des Leeaceae fait l’objet d’un second chapitre. Cette étude bibliographique est
complétée par un troisième chapitre consacré aux flavonoïdes sulfatés. L’isolement de ces
composés n’ayant encore jamais été rencontrés chez les Leeaceae, il paraît intéressant de
rappeler leurs principales caractéristiques.
La deuxième partie est consacrée aux travaux personnels. Dans un premier temps, nous
exposons comment à partir de la préparation de différents extraits de polarité croissante, nous
avons purifié les composés. Puis nous analyserons les principaux composés obtenus par
20
hydrodistillation du bois et des feuilles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse. L’étude des extraits provenant des feuilles, a permis, après des
fractionnements successifs sur différents supports chromatographiques, d’isoler et d’identifier
des composés essentiellement de nature terpénique et phénolique. L’identification de ces
molécules est obtenue par l’analyse conjointe de plusieurs techniques spectrales comme l’UV,
la spectrométrie de masse, la résonance magnétique nucléaire RMN 1D et 2D (COSY,
COLOC, XHCORR).
Le chapitre suivant présente les recherches menées sur les activités biologiques des
extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles, ainsi que de quelques composés
purifiés, ceci afin de vérifier l’utilisation de la plante en médecine traditionnelle. Les activités
anti-inflammatoire et antiradicalaire sont ainsi déterminées.
21
Première Partie :
Bibliographie
Botanique
Phytochimie et biologie des Leeaceae
Flavonoïdes sulfatés
22
Chapitre I - Etude Botanique
I- Position systématique
Pour la plupart des auteurs, Leea guineensis G. Don appartient aux Dicotylédones
Dialypétales, à l’ordre des Rhamnales, à la famille des Leeaceae. Cette hypothèse soutient la
thèse de Cronquist [1988]. Cependant la position taxonomique du genre Leea van Royen ex L.
a subi diverses modifications au cours du temps.
Les recherches de Suessenguth [1953], Nair [1968] et Ridsdale [1975] montrent toutes
les difficultés rencontrées pour classer le genre Leea au sein de la systématique. Les premières
traces "pré-Linnéenne" montrent que le genre était connu par Rheede (vers 1678-79), qui fut le
premier à le décrire et l’illustrer sous le nom de Nalugu. Plus tard, Rumphius (1743) décrit et
représente deux espèces provenant d’Ambon, une île d’Indonésie. Ces taxons sont aujourd’hui
connus comme étant L. aculeata et L. aequata. Ce n’est que depuis 1767 que cette famille est
monogénérique et a pour nom de genre, Leea. Ce genre a été nommé ainsi en l’honneur de
James Lee (1715-1795), horticulteur qui a créé une pépinière à Hammersmith à Londres et qui
avec son collègue William Malcolm a été le premier à cultiver les Leea en Europe dès 1767.
Les collections de ces spécimens cultivés sont préservées au British Museum. Quant à la
famille Leeaceae, sa création est attribuée à Dumortier (1829), qui place cette famille près des
Sapotaceae. Cela n’empêchera pas au cours de l’histoire de voir les Leea ballottées dans
différentes familles et sous-familles.
23
Tableau 1 : Classement taxonomique du genre Leea
Classement Auteurs Années
genre Nalugu Rheede 1678
genre Leea Lee 1767
genre Staphylea Burm. 1768
genre Aquilicia Mantissa 1771
genre « Sapotis affinia » De Jussieu 1789
Leea dans une tribu Ampelideae De Candolle 1824
famille Leeaceae Dumortier 1829
Leea dans famille Meliaceae Mérat et De Lens 1829
famille monogénérique Leeaceae Bartling 1830
Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Lindley 1833
Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Bentham et Hooker 1862
Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) (relation avec Meliaceae) Le Maout, Decaisne 1876
Leea hors des Vitaceae Planchon 1887
Leea dans sous-famille Leeoïdeae à côté des Vitioïdae dans Gild 1896
famille Vitaceae
famille Leeaceae Gagnepain 1910
Leeoïdae élévés en famille Leeaceae Gild, Brandt 1912
famille Leeaceae (relation avec Buettnerinae des Sterculiaceae) Suessenguth 1953
genre Leea hors des Vitaceae Periasamy 1962
Leea inclus dans Vitaceae Hutchinson 1973
famille Leeaceae à côté des Vitaceae Behnke et Dahlgren 1976
famille Leeaceae Cronquist 1988
sous-famille Leeoïdae dans les Vitaceae Thorne 1992
famille Leeaceae Takhtajan 1997
Aujourd’hui, le genre Leea est placé dans la famille des Leeaceae proche des Vitaceae.
Mais si on remonte dans la systématique, on se rend compte que le choix d’appartenance à un
ordre est tout aussi difficile. En effet, la place des Leeaceae a subi aussi diverses modifications.
24
B) Position systématique de la famille dans un ordre
La famille des Leeaceae, tout en étant étroitement liée à celle des Vitaceae, est
généralement placée dans l’ordre des Rhamnales. Or cette position est parfois contestée. Ainsi
même s’il existe des différences entre les graines de Leeaceae et de Vitaceae, cellesci sont
trop différentes de celles des autres familles de l’ordre des Rhamnales pour justifier cette
inclusion [Corner 1976].
De même Behnke et Dahlgren [1976] montrent que les Vitaceae et Leeaceae ont des
plastides de type P (avec des protéines cristalloïdes polygonales) alors que chez les
Rhamnaceae, ils sont de type S (avec de l’amidon). Ainsi, il faut séparer clairement ces deux
groupes de familles. Cronquist sépare les Leeaceae des Vitaceae, et les place aux côtés des
Rhamnaceae [Cronquist 1988]. Ces trois familles sont placées dans l’ordre des Rhamnales.
Plus récemment, Takhtajan [1986, 1997], sépare le groupe des Leeaceae et Vitaceae de la
famille des Rhamnaceae, et place celui-ci dans un même ordre, les Vitales, issu du superordre
des Vitanae. En effet, les Leeaceae et Vitaceae diffèrent, entre autres, des Rhamnaceae par la
présence de raphides (absence chez les Rhamnaceae), de fruits qui sont des baies, (drupes chez
les Rhamnaceae), de plastides de type P (type S chez les Rhamnaceae) et par l’anatomie des
graines.
Ces derniers critères sont aussi ceux que Cronquist utilise pour étudier l’ordre très diversifié
des Rhamnales. Et bien que les Leeaceae et les Vitaceae soient très proches, ces deux familles
sont bien distinctes des Rhamnaceae.
L’évolution de la position des Leeaceae dans la systématique moderne peut être résumée dans
le tableau suivant :
25
Famille Vitaceae Vitaceae Leeaceae Vitaceae Leeaceae
(Leeaceae incluse)
Sous-famille Leeoideae
(Nbre d’espèces) (70) (34) (70) en 1986
(34) en 1997
Cet historique sur la taxonomie des Leea nous aura permis de les placer dans une
famille monogénérique, les Leeaceae, proche des Vitaceae. A l’heure actuelle, il est préférable
de placer ces deux familles dans un même ordre, celui des Rhamnales. Cette classification est
simple et a l’avantage de grouper des familles proches dans un même ordre, tout en les
séparant distinctement.
Mais comme nous avons pu le remarquer, la position systématique des Leea a été
quelque peu controversée. Des affinités ont même été suggérées avec les Sapotaceae
[Suessenguth 1953], les Meliaceae [Le Maout 1876] et les Sterculiaceae [Nair 1968].
Néanmoins, c’est surtout avec les Vitaceae qu’elles ont été longtemps classées. Or, les
Leeaceae semblent avoir suffisamment de caractères distinctifs pour en être séparées (Tableau
3), (Figure 1). Ce sont les études sur l’anatomie florale, l’embryologie, la palynologie et la
chimiotaxonomie qui ont permis de classer en tant que famille monogénérique les Leeaceae, et
de les séparer des Vitaceae [Gagnepain 1911, Suessenguth 1953, Nair 1957 et 1968,
Tarnavschi 1968, Ridsdale 1975, Corner 1976, Patil 1984, Gerrath 1990, Umadevi 1991,
Verdcourt 1993, Thakhtajan 1997].
26
Figure 1 : Différents types de graines de Vitaceae et Leeaceae [Ridsdale 1975]
Bien qu’il y ait de très fortes affinités avec les Vitaceae, les Leea ont suffisamment de
caractères distinctifs pour être considérées comme une famille monogénérique à part entière ;
les Leeaceae, appartenant à l’ordre des Rhamnales.
D’après tous ces critères, et avant d’aborder les généralités propres aux Leea, nous
pouvons situer dans la systématique la plante qui fait l’objet de ce travail, Leea guineensis G.
Don (Figure 2).
27
Magnoliophyta
Sous-embranchement (Angiospermes)
220000 espèces
Liliopsida
(Monocotylédones)
55000 espèces
Classes Magnoliopsida
(Dicotylédones)
165000 espèces
Magnoliidae Hamamelidae
Sous-classes
Caryophyllidae
Dilleniidae Asteridae
Rosidae
116 familles
Ordres (60000 espèces)
Rosales
Rhamnales
3 familles
(1700 espèces)
Familles
Rhamnaceae Leeaceae Vitaceae
(900 espèces) (70 espèces) (700 espèces)
Genre
Leea
Espèce
28
II- Généralités sur le genre Leea
Avant d’aborder les principaux caractères des Leea, nous discuterons des possibilités de
division du genre.
Ce genre a été divisé par Clarke en 1881 en deux séries en fonction de la couleur des
fleurs (Tableau 4). Puis, ces séries furent sousdivisées en sections contenant une ou plusieurs
espèces. Les sections dressées par Clarke consistent à grouper les espèces parentes, mais sont
insuffisantes pour former des séparations formelles entre elles [Suessenguth 1953, Ridsdale
1975].
Tableau 4 : Classification selon Clarke (1881)
Cette division du genre en deux séries n’est pas satisfaisante et d’autres caractères plus
Gagnepain [1910] a lui aussi tenté de classer les différentes Leea. Il commence l’analyse par
les caractères floraux qui, bien que très homogènes dans la famille, montrent des variations
très précises de l’androcée suivant les espèces. Il sépare ainsi en 4 groupes les Leea. A ces
caractères floraux, il ajoute l’analyse des feuilles (simples, composées, glabres ou plus ou
moins velues), et la coloration des fleurs pour distinguer 19 espèces de Leea asiatiques.
29
Selon les travaux de Burt (1935), on peut séparer le genre en subdivisions reposant sur
le type structural de la fleur (pentamère ou tétramère). Cette suggestion est pratique pour les
taxas des Philippines (qui présentent par ailleurs de nombreux types de graines). C’était un
bon moyen pour séparer le genre en groupes distinctifs, mais de récentes collections montrent
par exemple que L. tetramera est une espèce qui peut être tétra ou pentamère [Ridsdale 1975].
Kirtikar et Basu [1975] distinguent quant à eux 3 groupes selon les feuilles de quelques
Leea asiatiques :
Ces différentes études montrent, qu’il est difficile de diviser de façon formelle le
Ridsdale [1975].
Ridsdale [1975] a fait une révision complète de la famille, dans laquelle il reconnaît 34
espèces. 32 se rencontrent dans l’aire Indo-Malaisienne, et 2 sont limitées dans l’aire Afro-
Malgache. Il a remarqué qu’il était très difficile de différencier certaines espèces sur les seuls
critères des feuilles et des fleurs (la séparation des espèces n’étant possible qu’en considérant
de grosses différences dans la longueur de certains organes).
30
31
Voici la liste des différentes espèces qu’il reconnaît :
32
Avec le nouveau mode de communication qu’est Internet, on retrouve d’autres espèces
synonymiques non répertoriés ?
L. coccinea Boj.
L. guinensis
L. hirta Banks ex Roxb.
L. robusta
L. sambucina Schum. et Thonn.
Cette famille monogénérique Leea Royen ex Linn., Mant. I, 17, (1767), 124. comprend
à ce jour plus de 70 espèces réparties dans différentes régions d’Afrique, d’Asie, d’Australie et
d’Océanie.
Les Leea peuvent être des plantes herbacées, des arbres, ou des arbustes de 2 à 10 m
de hauteur.
Les tiges sont droites, ramifiées ou non, généralement lenticellées, parfois munies de fortes
épines, sans vrille, à feuilles généralement groupées aux extrémités.
Les feuilles sont composées, pennées, bi- ou triternées, à rachis caniculé, à pétiole élargi et
embrassant à leur base. Les stipules sont soudées aux pétioles, et caduques.
Les folioles
Les folioles de forme et de taille variables, sont généralement simples, à bord crénelé ou denté,
à nervation simple, pennée.
33
Les inflorescences
Elles sont grandes, corymbiformes et sont opposées aux feuilles supérieures.
Les fleurs
Elles sont rouge ou jaune verdâtre, de taille réduite (56 mm) et pédicellées.
Les fruits
Ce sont des baies globuleuses, côtelées faiblement charnues, à 46 graines avec la présence de
raphides.
Les graines
Elles sont ovales, anguleuses, à section transversale triangulaire par compression latérale et
présentent sur les faces latérales des dessins ou un léger creux. Elles sont constituées d’un
embryon linéaire à radicule infère, avec un albumen ruminé montrant de profondes fossettes.
C) Répartition géographique
On rencontre les Leea principalement dans les zones tropicales d’Asie et d’Afrique
alors qu’elles ne sont pas présentent sur le continent américain. Le genre est centré sur la
Malaisie et s’est développé vers l’ouest en Afrique et Madagascar, et vers l’est aux îles Fiji
[Suessenguth 1953, Harriman 1991, Ridsdale 1975].
Les espèces afro-malgaches ont des similitudes bien établies avec celles présentes en
Asie et en Indonésie. Cela laisse présumer une origine orientale fondée sur la théorie
wegenerienne de la dérive des continents plus qu’à un moyen de dispersion par les courants
marins [Cadet 1980].
34
Les Leea sont rencontrées dans des zones humides ne dépassant guère 900 m d’altitude
et de formations forestières ombragées. De plus, certaines d’entre-elles comme L. indica,
semblent jouer un grand rôle dans l’embroussaillement des trouées forestières car elles sont à
croissance rapide et à tempérament grégaire. Leur bois est tendre. Elles constituent donc
rapidement des fourrés denses dépassant 2m de hauteur à l’âge de 2 à 3 ans en présence
d’autres espèces telles que Trema orientalis (Ulmaceae) et Macaranga roxburghii
(Euphorbiaceae) [Blasco 1971].
___
zone de répartition
des Leea
35
III- Généralités sur l’espèce Leea guineensis G. Don
A) Dénomination et synonymies
Appelée Leea guineensis G. Don, Gen. Hist. I (1831) 712, on retrouve plusieurs noms
synonymiques pour cette espèce, qui peuvent être à l’origine de nombreuses confusions :
L. sambucina auct. non Will., L. maculata Desf., L. arborea Telf. ex W. & A., L. arborea
Sieber ex Boj., L. sambucina Willd. var. arborea Miq., L. manillensis Walp., L. aurantiaca
Zoll. & Mor., L. coccinea Planch., L. lucida Linden ex Planch., L. punctata Desf. ex Planch.,
L. cuspidifera Baker, L. javanica auct. non Bl., L. speciosa Sieb. ex Miq., L. laeta Wall., L.
sanguinea Wall., L. acuminata Wall., L. cumingii Clarke, L. pumila auct non Kurz, L. wightii
Clarke, L. parva Elm., L. negrosense Elm., L. palawanensis Elm., L. euphlebia Merr., L.
parvifoliola Merr., L. papillosa Merr., L. luzonensis Elm., L. robusta auct. non Roxb., L.
dentata Craib, L. schomburgkii Craib, L. brunoniana auct. non Clarke, L. pallidifolia
Kanehira, L. bulusanensis Elm.
36
Il faut noter que cette espèce présente de nombreuses variabilités dues à sa répartition
géographique ou écologique. C’est en partie pour cela que cette espèce est répertoriée sous
plus de 30 noms synonymiques car bien des travaux ont décomposé cette espèce en plusieurs
entités. Or la plupart de ces taxas ne sont séparés que par des différences végétatives mineures.
Ainsi, même entre des espèces africaines et asiatiques telles que L. guineensis et L.
manillensis, il n’existe qu’une petite différence de couleur du tube staminal (due semble-t-il
aux habitats différents) ; les caractères morphologiques des feuilles et des fleurs sont en tous
points identiques [Ridsdale 1975].
Ainsi, le mauvais usage des synonymies peut être illustré par l’exemple de L. rubra
sensu auct. non Blume ex. Sprengel et L. sambucina sensu auct. non Willd [Staples 1996]. Des
horticulteurs ont employé L. rubra pour désigner une forme de L. guineensis ayant des feuilles
rougeâtres, alors que L. rubra est une authentique espèce déjà existante. Quant à L.
sambucina, c’est une espèce dont le nom a été mal employé dans la littérature, car L.
sambucina est un des synonymes de L. indica.
Toutefois certaines différences ont permis à Descoings [1967] lors de son étude sur la
flore de Madagascar d’observer des variétés locales bien distinctes :
L. guineensis G. Don
var. longifoliolata Desc.
Folioles supérieures très grandes, jusqu’à 25 X 6cm, oblongues, très
étroites, de largeur plus grande vers la base, acuminées au sommet, à bords crénelés.
Folioles inférieures de taille réduite et de forme variable.
Dans les marais à raphias et bas fonds.
37
- var. spiculata Desc.
Folioles de taille moyenne à faible, 9-12 X 3-4cm, elliptiques, oblonges
elliptiques, acuminées, à bords présentant 5-7 paires de lobes très atténués, terminés par une
dent en spicule courte, épaisse, fortement saillante vers l’extérieur.
Plateaux calcaires.
38
Pour notre plante, l’échantillon présente une foliole supérieure très grande 18 X 6 cm,
acuminée au sommet, des folioles inférieures de taille réduite de forme variable, acuminées.
De plus, celleci provient d’une forêt à raphiales marécageuse ou périodiquement inondée.
Bien qu’aucune variété ne soit décrite pour Leea guineensis au Cameroun [Descoings 1972],
notre échantillon fait penser à la variété longifoliolata rencontrée à Madagascar.
B) Noms vernaculaires
La liste n’est pas exhaustive, car chaque tribu a sa propre appellation. Nous n’en
donnerons que quelques exemples :
La Réunion bois de source, bois de sureau
Inde karkatajihva (sanscrit)
République Centrafricaine gamboula (gbaya)
Gabon mopaga-poga (apindji), debole-nyembaka (bakele)
Madagascar fanamboavanana, mahimboavana, sadrakidraky
Côte d’Ivoire diawa (guimini), koulateo (guéré)
Cameroun essong, n’top fitta, utua-bisson (yaoundé), wabozeende (mabea)
39
C) Répartition géographique
L. guineensis pousse dans les forêts humides, les galeries forestières, notamment dans
les raphiales marécageuses, les forêts marécageuses ou périodiquement inondées et dans le lit
des ravines - d’où peut-être l’appellation de Bois de Source - des zones tropicales.
Elle est présente en Afrique tropicale, en Angola, au Bénin, Burkina Faso, Burundi,
Cameroun, Congo, Côte d’Ivoire, Gabon, Guinée, Kenya, Madagascar, Malawi, Mali, île
Maurice, Nigeria, Ouganda, île de La Réunion, République Centrafricaine, République
Démocratique du Congo, Sierra Leone, Soudan, Tanzanie, Togo, Zambie.
On la rencontre aussi en Asie : Ceylan, Cambodge, Chine, Inde, Indonésie (Java,
lle
Sumatra, N Guinée), Laos, Malaisie, Népal, Philippines, Taïwan, Thaïlande.
zone de répartition de L.
guineensis
40
D) Description botanique (Figure 8) [Descoings 1967]
C’est un arbuste de 2 à 5 m, à tiges droites, peu ramifiées, renflées aux nœuds, à
lenticelles nombreuses, petites, à feuilles groupées aux extrémités.
41
1 -représentation d’un rameau avec son inflorescence x1/3 ; 2 -détail du bord du limbe x1 ; 3 -fleur mature x8 ;
4 -bouton floral x8 ; 5 -coupe schématique de la fleur fermée (étamines omisent) x8 ; 6 -anthère (vue arrière)
x15 ; 7 -agrandissement de la couronne étalée x8 ; 8 -fruit x2 ; 9 -graine x5 ; 10 -section transversale médiane
de la graine x5
Figure 8 : Représentation de L. guineensis [Descoings 1972, Verdcourt 1993]
42
Les fleurs de ± 5 mm de long, ± 3 mm de diamètre sont glabres avec (Figure 9) :
- un bouton floral ovale ou conique ;
- un pédicelle de 1-2 mm de long, cylindrique, nettement épaissi sous le
calice, faiblement pubescent.
- un calice rouge corail, de 2-2,5 mm de haut, ± 2,5 mm de diamètre, épais,
rigide, généralement glabre, à dents deltoïdes, aiguës.
- une corolle rouge corail à l’extérieur, plus pâle à l’intérieur, de ± 4 mm de
long, en tube dans la partie inférieure sur ± 1,5 mm de hauteur.
- aux segments oblongs-ovales, rétrécis vers la base, à plus grande largeur
vers le tiers inférieure, au-dessus longuement atténués en coin, aigus au
sommet et nettement cucullés, de ± 1,6 mm de large, épais.
- une coronule blanche, rose ou citrine, de 2,5-3 mm de hauteur et 2-2,5 mm
de diamètre ;
- aux lobes de ± 2 X 0,8 mm, oblongs, épais, un peu élargis dans la partie
supérieure, présentant deux petites dents obtuses ; sinus très minces,
profonds, échancrés jusqu’à 0,8-1,2 mm en dessous du sommet des
lobes ;
- le talon ne descend pas au fond de la fleur et entoure à sa base le style
seulement, de 0,6-0,8 mm de haut, épais sauf dans sa partie inférieure,
fortement aminci du côté interne avec juste au-dessus un très fort
bourrelet en saillie vers l’extérieur, horizontal ou ± oblique, généralement
très net.
- les étamines à filets blancs, sont fixées un peu au-dessus du milieu du
connectif ;
- les connectifs sont oblongs, étroits, ± bilobés au sommet, aigus à la base, de
± 1,8 X 0,6 mm, dépassant un peu les loges au sommet.
- l’ovaire est 5-côtelé, de ± 1 mm de diamètre, ± 0,6 mm de haut, glabre ;
- le style de ± 1,5 mm de long, cylindrique, isodiamétrique ;
- et stigmate capité peu distinct.
43
feuille
bourgeon axillaire
inflorescence
sépale
pétale
étamines
gynoecium
axe d’inflorescence
44
Les baies rouges à maturité, sont glabres, à péricarpe mince, bourrées de raphides
comprimées sur les faces supérieure et inférieure. Elles ont 8 à 10 mm de diamètre, 6-7 mm de
longueur.
Les graines de ± 5 X 4 mm, sur leurs faces latérales présentent des dessins très nets en
lignes larges, épaisses, saillantes, beaucoup plus visibles en creux sur l’albumen mis à
nu, (une ligne courbe concave avec parfois 1-3 petites ramifications simples et peu
prononcées du côté ventral, et du côté dorsal, 1-5 ramifications courtes et simples).
E) Divers
Leea guineensis G. Don est considérée comme plante fétiche par plusieurs ethnies de
Côte d’Ivoire et du Burkina Faso : le charbon de racines constitue un fard bénéfique. Il est
recommandé, lorsqu’on part pour un long voyage, de se munir de bâtonnets de tiges qui, sucés
pendant la route, préservent des accidents et des mauvais sorts toujours possibles [Kerharo
1950]. La population locale au Cameroun s’en sert aussi comme bois de chauffage.
Par ailleurs, L. guineensis ou "Bois de sureau" est un arbuste très élégant, de part ses
grandes feuilles composées, sa jolie floraison, et ses fruits décoratifs. S’acclimatant à de faibles
conditions lumineuses, il peut être cultivé en zone humide et ombragée comme plante
ornementale d’extérieure ou d’intérieure [Lavergne 1990, Gerrath 1997].
45
Chapitre II – Etudes phytochimique et biologique des Leeaceae
Les plantes de la famille des Leeaceae sont très peu étudiées, sans doute parce qu’elles
ont été souvent intégrées dans la famille des Vitaceae qui comprend plus de 700 espèces (Vitis
vinifera...).
Néanmoins, quelques études relativement récentes ont été faites sur la phytochimie de
différentes Leea.
I- Etude phytochimique
A) Criblage phytochimique
Les données présentées ici doivent être considérées avec une certaine réserve, car ce
sont essentiellement des tests d’orientation. Ces tests ont été réalisés pour trois espèces
différentes, et ont montré la présence de saponosides, d’alcaloïdes, de flavonoïdes et de tanins :
Tableau 6 : Criblage de quelques Leea
Plantes Sap Alc Tri St Flav Ta Référence
(partie utilisée si connue)
L. indica + - - - [Bin Rahmani 1985]
L. compactiflora (Kurz) - + + - [Brahman 1989]
racines
L. indica (Burm. F) Merr. - - - - [Brahman 1989]
tiges, feuilles et fruits
L. guineensis G. Don - - - - + + [Lavergne 1990]
feuilles cat
Sap=saponines, Alc=alcaloïdes, Tri=triterpènes, St=stéroïdes, Flav=flavonoïdes, Ta=tanins, cat=catéchiques
Test phytochimique positif (+) ou négatif (-)
Par ailleurs, l’étude de Lavergne [1990] montre pour L. guineensis G. Don, plante
médicinale de l’Ile de la Réunion :
-la présence de phénols, de flavanes et de proanthocyanidols.
-l’absence d’anthraquinones libres ou hétérosidiques, de coumarines et
d’anthocyanes.
-l’absence d’alcaloïdes (réactions négatives aux tests de Mayer, de Dragendorff
et silicotungstique).
B) Huile essentielle
46
C’est en 1953 que Gupta et Chopra isolent pour la première fois une huile essentielle
d’une plante appartenant à la famille des Leeaceae : L. hirta Roxb. Les seules données sont les
caractéristiques physiques et biochimiques. Cette huile essentielle provient d’une
hydrodistillation avec un rendement de 0,15 %. Elle est odorante, se solidifie à température
ambiante et présente une activité tuberculostatique [Gupta 1953].
Chez L. rubra Blume, on recense dans les feuilles un flavonoïde et trois acides phénols
: la myricétine 3-O-α-rhamnosyl (6), l’acide p-hydroxybenzoïque (12), l’acide syringique (14)
et l’acide gallique (17), et dans les tiges une leucoanthocyane, le leucocyanidol (10) [Yem Yok
Siv 1971].
Hegnauer [1990] cite pour les Leea, en plus des composés déjà cités pour L. coccinea
Planch (kaempferol (1), quercétine (2), myricétine (3), leucodelphinidine (7), leucocyanidine
(8)), la présence de tanins dans les fruits de L. rubra Blume, et dans les feuilles et les racines de
L. sambucina Willd.
L’étude de la taxonomie des Vitaceae a permis une analyse de quatre Leea qui sont L.
herbaceum Wall., L. indica Merrill., L. macrophyla Roxb. et L. sambucina Willd où l’on
recense un grand nombre de flavonoïdes et d’acides phénoliques [Umadevi 1991].
47
L. L. L. L. L. L.
Composés herbaceum indica macrophyla sambucina coccinea rubra
Wall. Merrill. Roxb. Willd. Planch. Blume
a a a a b c
kaempferol (1) + +
quercétine (2) + + +
myricétine (3) + + + + +
3’-OMe-quercétine (4) + + +
3’,4’-di-OMe-quercétine (5) + + +
3-O-rhamnosyl de myricétine (6) +
delphinidine (7) +
cyanidine (8) +
proanthocyanidine (9) + + + +
leucocyanidol (10) +
acide gentisique (11) + +
acide p-hydroxybenzoïque (12) + + + +
acide vanillique (13) + + + +
acide syringique (14) + + + +
acide mélilotique (15) + +
acide protocatéchuique (16) +
acide gallique (17) + + + + +
acide cis-p-coumarique (18) + +
acide trans-p-coumarique (19) + +
acide férulique (20) + + +
glycoflavone +
tanins + + + + +
alcaloïdes +
Références : a) [Umadevi 1991], b) [Bates-Smith 1959], c) [Yem Yok Siv 1971] et [Hegnauer 1990].
48
R1 OMe OH
R2 OR OH
HO O HO O HO O
R3 OH
OH OH O
OH O OH O OH O
OH
OH
O
OH
CH3
(1) R1=R3=H, R2=OH (4) R=H
Kaempferol 3’-OMe-quercétine
(2) R1=R2=OH, R3=H (5) R=Me (6)
Quercétine 3’,4’-diOMe-quercétine 3-O-rhamnosyl de myricétine
(3) R1=R2=R3=OH
Myricétine
OH
OH OH HO
OH
OH
HO O
HO O
O HO O
R OH
H H
OH OH
OH
H
OH
OH H OH
O OH
H
HO
(7) R=OH
(10)
Delphinidine H OH
Leucocyanidol
(8) R=H HO
Cyanidine (9)
Proanthocyanidine
R4 R5 O O
O R
OH OH
R3
OH
OH HO
R2 R1
49
II- Etude biologique
Les différentes activités biologiques seront présentées pour chaque espèce connues
(avec leur synonymies), puis nous recenserons les activités propres à Leea guineensis G. Don.
La plupart des données sur ce sujet sont assez récentes, mais en règle générale les
espèces du genre ont des propriétés calmantes, émollientes et astringentes [Kirtikar 1975].
L. sp. :
-l’extrait aqueux de feuilles de L. sp. présente des propriétés antifongiques avec
100% d’inhibition contre Drechslera oryzae [Ganesan 1994].
L. aequata L. :
- au Népal, les tubercules et les tiges de L. aequata Linn. sont astringentes et
mucilagineuses [Suwal 1970] ;
- utilisée en cas de blessures, elle est calmante, antiseptique, bactéricide. Elle est
aussi préconisée pour soigner la fièvre, la dysenterie, la dysurie, la neuralgie, la paralysie, la
pleurésie, la pneumonie, la tuberculose, les rhumatismes [Phytochemical and Ethnobotanical
Database].
50
L. angulata Korth. :
- comme répellant du tigre à Java [Phytochemical and Ethnobotanical
Database].
L. crispa Linn :
- en Inde et au Bengal, les feuilles sont froissées et appliquées sur les blessures.
Les tubercules sont un remède contre le vers de Guinée [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ;
- comme larvicide et contre les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical
Database].
L. curtisii King :
- contre l’alopécie [Phytochemical and Ethnobotanical Database].
L. indica Merrill :
- une des premières traces d’une activité biologique potentielle, remonte à 1829
[Mérat 1829]. Il est dit de Leea sambucina Willd. (appelé autrefois Aquilicia) que :
“ Aquilicia sambucina , arbrisseau de l’Inde, contient des baies à suc violent et caustique. La
décoction de ses racines est employée contre les douleurs de l’estomac ; celle du bois, contre la
soif ; ses feuilles broyées, torréfiées et appliquées sur la tête, soulagent le vertige et la faiblesse
du cerveau ; la vapeur de leur décoction suspend les douleurs de la goutte ; le suc, exprimé de
ses feuilles tendres, pris en boisson, aide la digestion... ”. Plus loin, “ ...La décoction de ses
feuilles est usitée en Guinée pour les femmes enceintes dont le ventre est douloureux ; elle
dissipe les nausées. La poudre de l’écorce sert à frotter les parties enflées. ”.
- en Inde, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les diarrhées, la
dysenterie et sont sudorifiques. La décoction de racines est prescrite contre les coliques,
comme rafraîchissant et soulageant de la soif. Les feuilles grillées sont appliquées sur la tête
contre les vertiges [Chopra 1956] ;
51
- en Inde, dans le Goa, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les
diarrhées et dysenteries chroniques. Le jus de jeunes feuilles est digestif [Kirtikar 1975] ;
- en Malaisie, l’intérêt porté aux plantes utilisées en médecine indigène montre
que l’extrait éthanolique de feuilles de L. indica a une activité antivirale contre le virus herpes
simplex de type 1 (HSV1) à 0,05 mg/ml [Ali 1996] ;
- on retrouve l’usage de L. indica contre les maux de tête, les piqûres de
chenilles, les dermatoses, les furoncles, la colique, les diarrhées, la dysenterie, les vertiges, les
verrues. Elle est apaisante et sudorifique [Phytochemical and Ethnobotanical Database].
L. linearifolia :
- les racines de cette herbe de saveur froide, insipide selon la médecine
bouddhique traditionnelle Theravada, neutralisent les fièvres « supérieures », le vent
« Sandan », cause de coliques chroniques [Phou Ngeun Souk-Aloun 1995].
larvicide et vermifuge. Elle est préconisée contre la dysenterie, le vers de Guinée (ou
dracunculose), les fractures vétérinaires, les neuralgies, la pleurésie, la pneumonie, la teigne,
les douleurs, et les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical Database].
L. robusta Roxb. (syn. L. macrophylla Roxb.)
- en Inde et dans le Chota Nagpur, les racines (molles et charnues) sont
appliquées localement pour apaiser les douleurs et sont données au bétail pour soigner les
diarrhées [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ;
- au Bengale, à Orissä et au Bihär, la médecine vétérinaire utilise 25 ml d’extrait
aqueux de racine en association avec 20 mg de gingembre pour le traitement des diarrhées et
1
Du grec alexein (défendre contre), c’est un antidote actif contre les poisons et les venins.
52
dysenteries des buffles, vaches et moutons. De plus, 15 ml de cet extrait avec la poudre de 7
grains de poivre noir et d’une petite quantité de sel est administré en cas de fièvre, aux chèvres
et moutons [Pal 1980] ;
- au Népal, on retrouve les mêmes propriétés, mais il est fait mention de
l’utilisation des racines contre la dysenterie [Suwal 1970] ;
- la plante est aussi indiquée pour soigner les diarrhées, la dysenterie
[Phytochemical and Ethnobotanical Database].
L. rubra Blume :
- au Cambodge, les racines bouillies constituent une boisson contre les coliques
[Douk 1966] ;
- cette plante est aussi employée comme diurétique [Yem Yok Siv 1971] ;
- l’irritation provoquée par les baies a été mise en relation avec la présence de
raphides (cristaux d’oxalate de calcium) [Sakai 1984] ;
- elle soigne la dysenterie, les intoxications. Elle est aussi taenifuge
[Phytochemical and Ethnobotanical Database].
Sur Internet, on trouve les résultats d’un sreening effectué par le NCI (National Cancer
Institute) fait sur quatre extraits de Leeaceae (espèce(s) non précisée(s) !) sur diverses cellules
tumorales humaines. Ils montrent une inhibition significative de la croissance des cellules
tumorales de leucémie, du colon et du sein. La DL50 n’est pas significative ou est modeste pour
les cellules tumorales du sein, et du colon [Cancer cell line screening data].
53
B) Activités propres à Leea guineensis
A la Réunion, Cordemoy (1895) n’attribue que des effets néfastes au Bois de Sureau. “ Le suc
de ses baies est caustique. Une personne qui en avait écrasé et manié une certaine quantité
pour en faire une encre de couleur vit une heure après sa main rougir, puis se tuméfier. Elle
éprouva une forte douleur, et un sentiment de brûlure. Un érysipèle se déclara, qui fut suivi de
démangeaisons pendant trois semaines ”.
Selon Ducheman (1900), la décoction de fleurs ou de feuilles de Bois de Sureau “ combat
l’éléphantiasis par bain chaud ”. Plus tard, Bosse (1977) et Bersez (1983) reparleront de
l’éléphantiasis, alors que cette parasitose est oubliée dans l’île de la Réunion.
Les racines quant à elles, sont connues pour être sudorifiques [Kirtikar 1975].
L’utilisation de L. guineensis est aujourd’hui plus restreinte [Lavergne 1990]. Une
recette consiste en l’association de Bois de sureau, Bois de reinette (Dodonea viscosa
2
Fomentation : action d’appliquer la chaleur comme moyen thérapeutique.
3
Affection tropicale des jeunes enfants dont les principaux symptômes sont : diarrhée rebelle, selle verdâtre,
éruptions cutanées (et du cuir chevelu). L’enfant est amaigri et couvert de petits boutons.
54
(Sapindaceae)), Bois puant (Foetidia mauritiana (Lecythidaceae)), Patate à durand (Ipomoea
pescaprae (Convolvulaceae)), Eucalyptus (Eucalyptus sp. (Myrtaceae)), Pignon d’Inde,
Thombé (Leucas lavandulaefolia (Lamiaceae)) et marc de Café pour soigner les rhumatismes.
D’autres tisaneurs considèrent le Bois de sureau comme rafraîchissant. Ainsi, il est prescrit
également pour les troubles circulatoires, les douleurs articulaires, les douleurs dentaires et
contre les refroidissements. Les bains aux Bois de sureau sont également indiqués contre les
rhumatismes, les douleurs, la polynévrite.
Certains la préconisent pour soigner le tambave, d’autres l’utilisent en boisson et en bain,
contre la goutte et “ l’enflure ”, ou pour des tisanes dites de « refroidissement et
saisissement ».
Dernièrement, Leea guineensis est citée dans le catalogue des plantes médicinales
majeures de l’Afrique. Les parties utilisées sont les feuilles et les racines, qui sont anti-
infectieuses, analgésiques, antidiabétiques, et aphrodisiaques [Iwu 1993].
55
Plus récemment, l’utilisation comme diurétique de L. guineensis à la Réunion a été mis
en relation avec l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). On note 90 et
100% d’inhibition de l’ACE respectivement pour les extraits acétonique et éthanolique des
feuilles [Adsersen 1997]. Cette inhibition enzymatique est également à rapprocher de son
usage contre les troubles cardiovasculaires.
On lui attribue aussi des effets contre les maux de dents, les coliques, les convulsions, la
dyspepsie, l’épilepsie, la blennorragie, les rhumatismes, les enflures, les vertiges et les
problèmes liés à la grossesse. Elle est aussi purgative et apaisante [Phytochemical and
Ethnobotanical Database].
56
Tableau 8 : Différentes activités biologiques décrites pour le genre Leea
L. aequata L.
L. crispa Linn.
L.curtissi King
L. gigantea Griff
L. hirta Roxb.
L. indica Merr.
L. macrophylla Roxb.
L. robusta Roxb.
L. rubra Blume
L. linearifolia
L. guineensis G. Don.
Activités
analgésique - antalgique + + + + + + +
antiseptique - cicatrisant - vulnéraire - + + + + + +
contre blessures et brûlures
antiarthritique - antirhumatismal - + + + +
goutte
anti-inflammatoire + + + +
(pleurésie, pneumonie, bronchite,
polynévrite, blennorragie, conjonctivite,
brûlure)
antidermatique – antiprurigineux + + + +
(dermatose, teigne, pelade, érysipèle,
alopécie)
antidiarrhéique - tambave + + + + +
antidysentérique + + + + + +
anti-infectieux - anticontagieux + + +
(lèpre, tuberculose, érysipèle)
anthelminthique - parasiticide - + + + + + + +
larvicide
antifongique - bactéricide - vers Guinée
digestif - dyspepsique + + +
diurétique + +
dysurie + + +
contre hydropisie astringent + + + + +
elephantiasis
antihemmoragique +
anti-ulcéreux + +
anti-arythmique - antihypertensif - +
trouble circulatoire
antipyrétique + + + + + +
sudorifique + +
anesthésique local +
antidiabétique +
neuralgie - paralysie + + +
vertige - nausée - maux de tête + +
épilepsie - convulsions +
accouchement difficile - maux de ventre + +
des femmes enceinte
aphrodisiaque +
mucilagineux + +
contre intoxications +
contre soif - rafraîchissante + +
refroidissements +
57
L’intérêt pour les Leeaceae semble justifié par leurs capacités à soigner les problèmes
d’ordre infectieux, inflammatoire, digestif, urinaire et circulatoire. Leea guineensis a aussi
ses activités. Les tradipraticiens la préconisent essentiellement pour ses vertus
antirhumatismale, antalgique, antihypertensive et diurétique.
C) Conclusion
En résumé, cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan chimique que
biologique.
Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de flavonoïdes, d’acides
phénoliques et de tanins.
L’utilisation en médecine traditionnelle montre que le genre a des propriétés
essentiellement calmante, anti-infectieuse, anti-inflammatoire, antidysentérique,
antirhumatismal et cardiovasculaire.
Ainsi, une étude phytochimique et pharmacologique sur les extraits et les composés
qu’ils contiennent semble intéressante afin d’établir un lien avec ces utilisations en médecine
traditionnelle.
58
Chapitre III - Les Flavonoïdes Sulfatés
I- Introduction
Les flavonoïdes sont connus pour être d’importants métabolites synthétisés par les
plantes, responsables entre autres de la pigmentation et de la protection des plantes en réponse
à un stress d’irradiation UV, ou d’attaque microbienne (les phytoalexines). Récemment, ces
molécules ont été impliquées dans l’induction et l’inhibition des gènes de nodulation du
Rhizobium ou comme régulateur du transport de l’auxine (phytohormone de croissance) [Varin
1992a].
Dès 1975, tous ces composés possédant un ou des groupements sulfates ont été
classés dans un groupe appelé flavonoïde sulfaté [Harborne 1975a]. Une récente étude a
recensé toutes les données concernant ces composés (distribution, méthodes générales
d’extraction, de purification, d’analyse structurale, et de synthèse) [Barron 1988a, 1987c,
1988b, c]. Aussi, nous n’avons pas souhaité reprendre ici ces travaux, mais préférons plutôt
effectuer une « mise à jour » à partir de 1988 de ces données bibliographiques.
En 1988, Barron répertorie 101 flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a]. A ce jour, nous
avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés dans la littérature, qui se répartissent en 131 flavones
et flavonols sulfatés. On dénombre 74 flavonols sulfatés dont 19 structures sont nouvelles et
57 flavones sulfatées dont 12 nouvelles (Tableaux 9 p 42 et 10 p 45). A cela, nous pouvons
ajouter 2 anthocyanes sulfatées extraites de Babiana stricta (Iridaceae) (Figure 11) et 1
dihydroflavonol sulfaté, isolé de Myrica rubra (Myricaceae) (Figure 12).
59
OMe
OH
+
HO O
OMe
O-Gluc
RO OSO3H
HO HO
R= H 3-glucosyl-5-(2’’-sulfatoglucosyl)-malvidine
R= malonyl 3-glucosyl-5-(2’’-sulfato, 6’’-malonylglucosyl)-malvidine
Figure 11 : Antocyanes sulfatées isolées de Badiana stricta (Iridaceae) [Toki 1994]
OSO3K
OH
HO O
OH
OH O OH
O
OH
OH
3-galloyl-3’-sulfate-dihydromyricitine ou myricatine
60
A) Les flavones sulfatées
Apigénine
Hispiduline
Isoscutellaréine
Lutéoline
Chrysoeriol
Diosmétine
6-OH Lutéoline
Népétine
Nodiflorétine
Jaceosidine
Hypolaétine
Tricétine
Tricine
Vitéxine
Isovitéxine
Orientine
Iso-Orientine
Position de Sulfatation
Génine Monosulfatée
6 +
7 + + + + + + + + + + + + +
8 +
3’ + + +
4’ + +
Génine Disulfatée
6, 7 + +
7, 3’ + + +
7, 4’ + +
3’, 4’ +
Sulfatoglycosylée
6-sulfatoglucoside
7-sulfatoglucoside + + + + + +
7-sulfatogalactoside +
7-sulfatoglucuronoside + + +
7-sulfatorutinoside + +
7-disulfatoglucuronoside +
7-disulfatoglucoside
Glycosylée et sulfatée
3’-glucuronoside, 7-sulfate +
3’-rutinoside, 7-sulfate +
8-glucoside, 7-sulfate
8-glucoside, 3’-sulfate +
Divers
7-OMe, 3’-sulfatoglucuronoside
7-OMe, 3’-sulfatogalactoside
4’-OMe, 8-Glucoside, 3’-sulfate +
4’-OMe, 8-(2’’-sulfatoglucoside)
7,4’-diOMe, 3’-sulfate
= produits nouvellement recensés depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 13 p 44)
61
- le chrysoériol 7-sulfatoglucuronoside isolé de Meeboldinama hysanantha
(Restionaceae) [Williams 1998].
- le premier sulfatoglucoside, fixé en position 6 sur l’hydroxylutéoline a été isolé
chez Tradescanta (Commelinaceae) [Del Pero Martìnez 1993].
- trois sulfatoglycosides de l’hypolaétine ont été isolés chez des Restionaceae
[Williams 1998], les 7-sulfatoglucoside et 7-sulfatogalactoside chez
Leptocarpus elegans (Restionaceae), ainsi que le 7-sulfatoglucuronique chez
Meeboldinama hysanantha (Restionaceae).
- On ne recense que 4 flavones dont la génine est à la fois sulfatée et glycosylée. Une
seule structure de ce groupe est nouvelle, c’est l’hypolaétine 8-glucoside, 7-sulfate
toujours isolée d’une Restionaceae, l’Hypolaena fastigiata (Restionaceae) [Williams
1998].
- Dans le dernier groupe, 4 flavones sulfatées sont nouvelles car elles sont à la fois
méthoxylées et sulfatées ou sulfatoglycosylées. Nous avons :
- l’isoscutellaréine 4’-méthoxy, 8-(2’’-sulfatoglucoside) de Althaea officinalis
(Malvaceae) [Gudej 1991],
- la lutéoline 7,4’-diméthoxy, 3’-sulfate [Harborne 1994], toujours des
Restionaceae,
- deux hypolaétines, la 7-méthoxy, 3’-sulfatoglucuronoside de Leptocarpus
elegans (Restionaceae), et la 7-méthoxy, 3’-sulfatogalactoside de
Leptocarpus tenax (Restionaceae) [Williams 1998].
62
R2
R3
R1 O
OH O
R4
OH
R3
R2 O
R1
OH O
OH OH
H
O
HO OCH3
HO O
OSO3-
HO O
OH O
63
B) Les flavonols sulfatés
Kaempferol
Kaempferide
Rhamnocitrine
6-OH Kaempferol
Eupafoline
Eupalitine
Quercétine
Rhamnétine
Isorhamnétine
Tamarixétine
Rhamnazine
Ombuine
Quercétagétine
Patulétine
Eupatolitin
Spinacetine
Jaceidine
Veronicafoline
Eupatine
Gossypétine
Myricétine
Position de Sulfatation
Génine Monosulfatée
3 + + + + + + + + + + + + + + + +
7 + + +
3’
4’ +
Génine Disulfatée
3, 7 + + +
3, 3’ + + +
3, 4’ + +
Génine Trisulfatée
3,5,4’
3, 7, 3’ +
3, 7, 4’ + + +
Génine Tétrasulfatée
3, 7, 3’, 4’ +
Sulfatoglycosylée
3-sulfatoglucoside
3-(3’’-sulfatoglucoside) + +
3-(4’’-sulfatorutinoside)
3-(6’’-sulfatoglucoside) +
3-(6’’-sulfatogentiobioside) +
3-sulfatorhamnoside + + +
3-sulfatorutinoside + + +
Glycosylée et sulfatée
3-glucuronoside, 7-sulfate + + +
3’-glucuronoside, 3,5,4’-trisulfate +
8-glucuronoside, 3-sulfate +
8-glucoside, 3-sulfate +
3-glucoside, 7-sulfate +
3-rhamnoside, 3’-sulfate
3-glucuronoside, 3’-sulfate
Divers
3’-OMe, 3-sulfate
7,4’-diOMe, 3-sulfate +
6-OMe, 3-sulfate
6,7,4’-triOMe, 3-sulfate
7,3’,4’-triOMe, 3-sulfate
3-OMe, 7-sulfate + +
3,7-diOMe, 4’-sulfate
3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate +
6,3’,4’-triOMe, 3-sulfate +
3-glucoside, 4’-OMe, 7-sulfate
3-OMe, 5-glucoside, 3’-sulfate
7-OMe, 3,3’-disulfate
= produits nouveaux depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 14 p 47 et 48)
64
Dans le tableau précédent, nous avons recensé 21 flavonols comme structure de base dont :
- 24 sont monosulfatés sur les génines, la plupart en position -3. Il existe trois
exceptions (jacéidine (qui porte un méthoxyl à cette position), quercétagétine et
myricétine). Dans ces dérivées monosulfatés, il y a 4 nouvelles structures ;
- le kampferide 3-sulfate isolé de Tamarix spp. (Tamaricaceae) [Tomàs-
Barberan 1990],
- le 6-hydroxykaempferol 3-sulfate d’Inula britanica (Compositae) [Öksüz
1987]
- la quercétine 7-sulfate isolée chez Frankenia pulverulenta (Frankeniaceae)
[Harborne 1975b],
- et la quercétine 3’-sulfate de Hypericum elodes (Guttiferae) [Seabra 1991].
- 14 flavonols sont polysulfatés, avec le plus souvent, la quercétine comme génine. Il y
a une seule génine tétrasulfatée, 8 génines disulfatées, 5 trisulfatées dont 1 est
nouvelle ;
- la rhamnétine 3,5,4’-trisulfate de Tamarix aphylla (Tamaricaceae) [Harborne
1988]. Ce composé semble provenir de la rhamnétine 3’-glucuronyl-
65
structures nouvelles. Il s’élève à 10 dont la plupart dérive de la quercétine. Nous
avons :
- le 6-méthoxykaempferol 3-sulfate isolé de Flaveria chloraefolia (Compositae)
[Ibrahim 1995],
- le 6-hydroxy-7,4’-diméthoxykaempferol 3-sulfate, le
6,7,4’-triméthoxykaempferol 3-sulfate, et la 6,7,4’-triméthoxyquercétagétine
3-sulfate isolés chez Brickellia longifolia (Compositae) [El-Sayed 1990].
- Enfin, nous comptons 6 nouveaux dérivés de la quercétine, la
3’-méthoxyquercétine 3-sulfate ou percicarine et la 3-glucosyl-
4’-méthoxyquercétine 7-sulfate isolées de Polygonum hydropiper
(Polygonaceae) [Haraguchi 1996], la 7,3’,4’-triméthoxyquercétine 3-sulfate et
la 3,7-diméthoxyquercétine 4’-sulfate de Ipomoea regnellii (Convolvulaceae)
et la 7-méthoxyquercétine 3,3’-disulfate isolée d’une autre Convolvulaceae
Argyreia mollis [Mann 1999], la 3-méthoxy-5-glucosylquercétine 3’-sulfate
isolée de Calorophus elongatus (Restionaceae) [Williams 1998].
OMe
HO O
OSO3-
OH O
3-sulfate de kaempferide
R3
R2 O
R1 OSO3-
OH O
Figure 14 : Structure des nouveaux flavonols sulfatés
66
R3
R4
R2 O
R1
OH O
OH
OMe
MeO O
MeO OSO3-
OH O
6,7,4’-triméthoxy-3-sulfate de quercétagétine
OSO3-
OH
HO O
OMe
O-gluc O
3-méthoxy-5-glucosyl-3’-sulfate de quercétine
OH
OSO3-
MeO O
OSO3-
OSO3- O
3,5,4’-trisulfate de rhamnétine
67
III- Distribution
Les flavonoïdes sulfatés bénéficient d’une large distribution. C’est pour cette raison
que nous ne pouvons pas parler de traceur chimiotaxonomique au sens strict. Leur répartition
fait d’avantage référence à leur situation géographique et écologique (milieux salins et/ou
marécageux). En 1988, les travaux de Barron dénombraient 250 espèces réparties dans 17
familles des Dicotylédones et dans 15 familles des Monocotylédones [Barron 1988a]. Depuis,
nous avons dénombré, 3 nouvelles familles chez les Dicotylédones (Cf. Tableau 11 ).
Quelques espèces sont représentées chez les Ptéridophytes, comme Adiantum capillaris
veneris (Adiantaceae), Asplenium filixfoemina, A. fontanum, A. septentrionale (Aspleniaceae)
et Cystopteris fragilis (Athyriaceae). Par contre, aucun flavonoïde sulfaté n’a encore été
rencontré chez les Bryophytes et les Gymnospermes.
On peut cependant noter que les flavonoïdes sulfatés permettent de séparer les espèces
en groupes distincts dans certaines familles comme les Cyperaceae, les Palmae ou les
Zosteraceae [Ibrahim 1995].
De même, les flavonoïdes sulfatés rencontrés chez les espèces de Flaveria
(Compositae) peuvent être classés en étroite relation avec les 4 groupes déjà créés selon leurs
modèles photosynthétiques [Hanoufa 1994].
On rencontre par exemple pour le modèle photosynthétique de type C3, des monosulfates de
quercétine et patulétine. Pour le type C3-C4, des mono et disulfates principalement de
quercétine et de patulétine. Pour le type C4-like, des mono, di, tri et tétrasulfates
principalement de quercétine. Et pour le type C4, des mono, di et trisulfates de kaempferol,
d’isorhamnétine et d’apigénine [Hannoufa 1994].
A petite échelle, ces flavonoïdes sulfatés peuvent donc jouer un rôle dans la
systématique.
68
Tableau 11 : Répartition des flavonoïdes sulfatés dans les Magnoliophyta (Angiospermes)
Classe Sous-classe Ordres Familles
Magnoliopsida Hammamelidae Myricales Myricaceae
(Dicotylédones) Caryophyllidae Caryophyllales Chenopodiaceae
Polygalales Polygonaceae
Plumbaginales Plumbaginaceae
Dilleniidae Dilleniales Dilleniaceae
Theales Guttiferae
Malvales Malvaceae
Violales Bixaceae
Cistaceae
Frankeniaceae
Tamaricaceae
Rosidae Rosales Davidsoniaceae
Rosaceae
Myrtales Onagraceae
Rhamnales Leeaceae
Sapindales Zygophyllaceae
Apiales Umbelliferae
Asteridae Solanales Convolvulaceae
Lamiales Verbenaceae
Asterales Compositae
Liliopsida Alismatidae Alismatales Alismataceae
(Monocotylédones) Hydrocharitales Hydrocharitaceae
Najadales Zamielelliaceae
Zosteraceae
Arecidae Arecales Palmae
Arales Araceae
Commelinidae Commelinales Commelinaceae
Cyperales Cyperaceae
Gramineae
Restionales Restionaceae
Juncales Juncaceae
Zingiberidae Zingibérales Marantaceae
Liliidae Liliales Liliaceae
Iridaceae
Orchidales Orchidaceae
IV- Fonction
En dépit des récentes avancées en phytochimie, le rôle des flavonoïdes sulfatés dans les
plantes reste encore mal connu. On peut cependant, avancer quatre hypothèses :
69
A) Détoxification
Tout comme dans le règne animal, la sulfatation des flavonoïdes peut être considérée
comme un mécanisme de détoxification, en rendant hydrosolubles les produits en vue de leur
stockage dans des compartiments cellulaires hydrophiles. Il s’agit notamment de détoxifier la
plante à l’égard des groupes hydroxyles des flavonoïdes très réactifs, et de pouvoir excréter,
tout comme les mécanismes de glycosylation, les flavonoïdes afin d’éviter leurs interactions
avec des sites enzymatiques [Harborne 1977].
B) Transfert d’ions
La sulfatation peut aussi être un moyen de séquestrer les ions sulfates, et ainsi de jouer
sur le dynamisme de la balance ionique. En effet, la plupart des plantes qui synthétisent ces
dérivés, vivent dans un environnement écologique aquatique et/ou salin. La plante aurait donc
par ce système, la possibilité de stocker l’excès d’ions sulfates présents dans son
environnement. Ce phénomène pourrait également servir de transfert de groupes sulfates ou
de soufre inorganique à une forme organique. Une expérience consistant à l’incorporation de
35
SO42 dans les tissus de Zostera (Zosteraceae) a révélé que 36 heures après, 50% de la
radioactivité était présente dans la fraction contenant les flavonoïdes [Nissen 1964, Harborne
1975a, 1977].
C) Bioactivation
On sait aussi que la sulfatation dans le règne animal est un moyen de bioactivation d’un
certain nombre de composés comme les hormones stéroïdiennes, et les neurotransmetteurs,
pour la modulation des activités biologiques. La sulfoconjugaison est même impliquée dans
l’activation des prodrogues (c’est le dérivé sulfaté du Minoxidil® agent antihypertenseur, qui
est actif) [Falany 1997]. Il en est de même chez certaines plantes, comme le Limonium
70
(Plumbaginaceae), qui, en réponse à un stress de salinité, accumule du sulfate de choline, ou
chez le Mimosa (Fabaceae), dont l’acide 4-(6’-sulfoglucosyl)-gallique est responsable des
mouvements seismonastique et nyctinastiques [Varin 1997].
D) Régulation du transport de l’auxine
V- Enzymologie
Dans les plantes il existe peu de sulfatases. Ce n’est que très récemment que des
flavonols sulfotransférases (F-ST) ont été identifiées à partir de Flaveria (Compositae) : la
flavonol 3-sulfotransférase (3-ST), ainsi que la 3’-ST, la 4’-ST et la 7-ST [Varin 1989, 1991,
1992b]. Ces enzymes sont très spécifiques, ainsi, la 3-ST ne reconnaît que la position 3 des
flavonols pour produire exclusivement le flavonol 3-sulfate selon une préférence allant de la
rhamnétine, l’isorhamnétine, la quercétine, la patulétine au kaempferol.
La 3’ et 4’ST ne reconnaissent que les flavonols 3sulfate, et la 7ST que les flavonols
enzymatique de sulfatation pour expliquer la présence des flavonols déjà isolés dans cette
espèce (Figure 15). La première étape étant la sulfatation en position 3 [Varin 1992a].
71
Flaveria
Quercétine
Flavériachloraefolia
3-ST
Quercétine-3-sulfate
chloraefolia
3'-ST 4'-ST
Quercétine-3,3'-disulfate Quercétine-3,4'-disulfate
7-ST 7-ST
Flaveria bidentis
Quercétine-3,7,3'-trisulfate Quercétine-3,7,4'-trisulfate
4'-ST 3'-ST
Quercétine-3,7,3',4'-tetrasulfate
Sulfatase
Quercétine-3,7,3'-trisulfate/3,7,4'-trisulfate
Sulfatase
Quercétine-3,7-disulfate
Figure 15 : Modèle biosynthétique des flavonoïdes sulfatés des espèces de Flaveria (Compositae) [Varin 1992a]
Il y a de très fortes homologies de séquences entre les ST [Varin 1992a, 1997]. Ainsi
entre la 3ST et la 4’ST il y a 70% d’homologie de séquence entre elles et environ 30% avec
les ST animales, justifiant ainsi la présence de régions très conservées.
Par mutagénèse, on connaît à présent les sites de fixation du flavonol spécifique et du
co-substrat [Marsolais 1997, 1998]. L’activité de ces ST est fortement liée au développement
végétatif de la plante [Hannoufa 1991].
72
On localise même les flavonols sulfatés dans le compartiment nucléaire, et de manière
transitoire dans le cytosol. Une protéine nucléaire qui a d’ailleurs une forte affinité avec la
quercétine 3sulfate (85 nM) est en cours d’étude [Grandmaison 1996]. Tout cela suggère une
fonction probable de régulation. Rappelons que les flavonoïdes activent l’expression du gène
nod du Rhizobium [Harborne 1994], et que chez les mammifères, les métabolites sulfatés sont
impliqués dans la croissance et le développement cellulaire.
A) Métabolisation
Il est maintenant admis que les flavonoïdes sont métabolisés par les cellules de
mammifères et excrétés dans la bile et/ou l’urine sous forme de dérivés glucuronoconjugués ou
sulfatés [Harborne 1982, 1994]. La sulfatation enzymatique joue un grand rôle dans la
détoxification des métabolites endogènes et des xénobiotiques, mais cette sulfatoconjugaison
est aussi impliquée dans la bioactivation. Ainsi, la quercétine est métabolisée par le foie et
donne des dérivés monosulfatés ainsi que des dérivés sulfatés et glucuronoconjugués [Shali
1991]. De plus, la quercétine, au pouvoir antioxydant reconnu, est administrée par sonde
intragastrique à des rats. Le sang prélevé au bout d’une heure, puis de six heures, de l’aorte
abdominale ne contient plus de quercétine libre, mais plusieurs de ses métabolites, dont des
dérivés sulfatés et sulfoglucuronés. Le plasma de rat contenant ces métabolites inhibent
d’avantage la peroxydation lipidique induite par le sulfate de cuivre, que le plasma contenant
seulement de la quercétine [da Silva 1998]. Aussi, la liquiritine (7,4’-dihydroxyflavone) qui a
une activité antihépatotoxique in vivo par voie orale chez le rat est métabolisée en 5 composés
dont les dérivés sulfatés suivants : 7,4’-disulfate, 7-sulfate-4’glucuronoside et 7-glucuronoside-
4’-sulfate. Le rein participe aussi à la métabolisation en dérivé 7,4’-disulfate [Shimamura
1993]. Il en est de même pour la génistéine qui est connue pour son activité inhibitrice de la
protéine tyrosine kinase ou pour son activité oestrogénique. Ces activités sont essentiellement
dues à ces dérivés sulfatés. En effet, l’administration de génistéine par voie orale chez le rat est
rapidement suivie d’une métabolisation, conduisant à l’élimination par voie urinaire et biliaire
de la génistéine 4’-sulfate et de son dérivé glucuroné en –7 essentiellement [Yasuda 1996].
B) Bioconversion
73
Les synthèses spécifiques de dérivés sulfatés ne sont pas toujours faciles [Barron
1988a]. Aussi, la bioconversion semble avoir un avenir certain par l’obtention de réaction
spécifique avec de bons rendements.
Par exemple, Streptomyces fulvissimus est capable, en suspension, de biotransformer la
5-hydroflavone en son dérivé 4’-sulfate [Ibrahim 1989].
De même, dans la flore intestinale humaine, il existe une arylsulfotransférase qui sulfate
des polyphénols comme les xanthones, chalcones et flavonols. Ainsi, la bactérie isolée de la
flore intestinale (Eubacterium A-44) peut catalyser par exemple, le transfert d’un sulfate sur la
quercétine à partir du sulfate de p-nitrophenyl ou PNS (et non pas à partir du PAPS). Cette
enzyme bactérienne est plusieurs milliers de fois plus active que les enzymes d’origine animale
ou végétale. Si le PNS est en excès, on obtient les dérivés 3,3’-disulfate et 3,3’,7-trisulfate.
Lorsque le PNS est mis dans des conditions équimolaires ou en léger excès, seul le dérivé
3,3’-disulfate est obtenu [Koizumi 1990].
Cette étude montre aussi qu’administrée oralement, la quercétine peut être sulfatée par
les bactéries intestinales et devenir plus hydrosoluble et par conséquent moins absorbable.
Par ailleurs, il est connu que la quercétine est mutagène in vitro mais ne semble pas être
carcinogène in vivo [Fukuoka 1980]. La sulfatation de la quercétine par la flore intestinale
entraînerait-elle cette détoxification ?
HO O
OH O
74
R=OH Baicaléine
R=OSO3Na Baicaléine 6-sulfate de sodium
Il existe trois groupes de réactions d’hypersensibilité allergique :
- L’hypersensibilité de type I ou hypersensibilité immédiate se produit lorsqu’un
allergène est reconnu par une IgE qui active un mastocyte. Le mastocyte activé
libère de l’histamine qui provoque la réaction allergique. Lorsque l’allergène pénètre
dans les bronches, l’hypersensibilité peut se manifester par une crise d’asthme avec
diminution du volume d’air inhalé.
- L’hypersensibilité de type II est liée à la présence d’anticorps dirigés contre les
membranes et d’antigènes cellulaires qui activent le complément.
- L’hypersensibilité de type III est le résultat du dépôt du complexe immun (Ac-Ag)
sur les parois des vaisseaux et dans les tissus provoquant la destruction de ceux-ci
par la libération par les phagocytes de dérivés actifs de l’oxygène. Cette
hypersensibilité est mise en évidence par la réaction d’Arthus qui est une réaction
cutanée qui se présente sous forme d’une zone rouge et gonflée après injection
intradermique de l’antigène.
Cette étude a montré que BPS et BSS inhibent les hypersensibilités de type I et II,
mais qu’ils n’ont aucun effet sur l’hypersensibilité de type III (responsable de la polyarthrite
rhumatoïde ou du lupus érythémateux disséminé entre autres).
75
OR
OH
HO O
OSO3-
OH O
Ils soulignent bien que ces flavonols sulfatés sont mutagènes in vitro mais pas
carcinogènes in vivo ! Avec un apport journalier de 33% de poudres de feuilles et de graines, le
taux de flavonols sulfatés n’est pas suffisant pour induire des tumeurs.
métabolisme des sucres :
76
Aldose réductase
Glucose Sorbitol
NADPH NADP
Polyol déshydrogénase
Sorbitol Fructose
NAD NADH
L’aldose réductase est présente dans de nombreux tissus dont le cristallin. Chez les
diabétiques, cette enzyme produit beaucoup de sorbitol, et cette accumulation dans le cristallin
est responsable de la cataracte. Ce sont ces polyols qui sont responsables de l’opacification du
cristallin car ils diffusent mal à travers les membranes cellulaires et provoquent une
importante entrée d’eau dans les cellules par osmose. Ce phénomène serait responsable de
certaines rétinopathies et neuropathies périphériques associées au diabète humain.
La recherche de composés inhibiteurs de l’aldose réductase est d’un grand intérêt
thérapeutique dans la lutte contre les complications du diabète. Certains flavonoïdes inhibent
cette enzyme comme la quercitrine notamment qui a une CI50 de 10-7M. Mais la limitation de
l’usage de ces flavonoïdes en thérapeutique est leur faible hydrosolubilité. Pour cela, les
Laboratoires Zyma© (Nyon Suisse) ont synthétisé des dérivés sulfatés pour les rendre plus
hydrosolubles. Il s’avère que ces flavonoïdes sulfatés sont les composés les plus actifs (CI50 10-
8
M).
Tableau 13 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin obtenus par synthèse
Composés % d’inhibition à 10-8M
Quercitrine 0
Quercétine 3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate 70
Quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate 55
Quercétine 3,5-diacétyl, 7,3’,4’-trisulfate 75
Quercétine 5,7,3’-triacétyl, 3,4’-disulfate 75
77
Cette action a été également démontrée pour d’autres flavonoïdes sulfatés isolés de
Polygonum hydropiper (Polygonaceae) sur l’aldose réductase du cristallin de porc [Haraguchi
1996].
Ce tableau montre que les dérivés sulfatés les plus actifs sont l’isorhamnétine-3,7-
disulfate (IC50 =1,8 µmol.l-1) et la tamarixétine-3-glucoside-7-sulfate (IC50 = 5,0 µmol.l-1). La
sulfatation de l’hydroxyle en 7 semble être un facteur important dans l’inhibition de l’aldose
réductase. On remarque aussi que l’introduction d’un groupement sulfate sur une génine
augmente son activité de façon non négligeable. Ainsi l’activité de la rhamnazine-3-sulfate (IC 50
= 30,1 µmol.l-1) est trois fois plus importante que la génine correspondante (IC 50 >91,0 µmol.l-
1
).
R4
R5
R3 O
R1
R2 O
78
E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire
OH
RO O
O-Gluc-Rha
OH O
R=H Rutine
R=OSO3Na Rutine sulfate
On observe que la rutine reste la plus active. Les auteurs soulignent tout de même que
le sulfate de rutine qui est testé, bien que majoritaire, contient des impuretés ( notamment des
dérivés de rutine dont le système ortho-dihydroxyl du cycle B n’est plus libre).
79
Antioxydante [Yagi 1994]
R3
R4
R2 O
R1
OH O
De même, la méthode utilisant l’anion superoxyde montre qu’ils sont plus actifs que la
quercétine pour capter ces anions induits par le système xanthine-xanthine oxydase (l’IC50 étant
en dessous de 10 ppm).
Des études épidémiologiques ont montré le très faible taux de cancer chez les
personnes ayant une alimentation riche en isoflavones (asiatiques,…). Bien que ce soit des
génines non sulfatées qui sont consommées, cellesci sont métabolisées en dérivés sulfatés par
l’organisme. Ce sont ses dérivés qui sont fortement impliquées dans le processus d’inhibition
de la croissance des tumeurs mammaires.
En effet, dans les cellules de cancer du sein MCF7, la génistéine est métabolisée en
dérivés sulfatés dont la génistéine 7sulfate. Ces métabolites sont rapidement excrétés,
80
entraînant une chute de la concentration intracellulaire en génistéine. Ce processus permet
d’inhiber la croissance mammaire.
De même, la biochanine A, active les cellules MCF7 par la métabolisation en génistéine puis
conversion en génistéine 7sulfate.
R2 O
R1 O
R3
Une autre voie dans la prévention des cancers du sein est celle de l’inhibition d’enzyme
spécifique comme la stérol sulfatase.
En effet, les stéroïdes oestrogéniques jouent un rôle dans l’évolution cancéreuse. Ces stéroïdes
sont véhiculés sous forme de sulfoconjugués, inactifs sous cette forme. La stérol sulfatase les
activent en les désulfatant. C’est cette désulfatation qui entraîne l’évolution cancéreuse. Or, les
dérivés sulfatés de daidzéine inhibent la stérol sulfatase. La daidzéine 4’-sulfate et
7,4’-disulfate ont une IC50 de 6 et 1,5 µM respectivement, alors que le Tamoxifen® (et ses
métabolites non-sulfatés), principal antioestrogène, inhibe cette même enzyme à 270 µM. La
génistéine ou la biochanine A ont une IC50 de 1,2 µM alors que la daidzéine n’inhibe pas cette
enzyme. Notons aussi que la daidzéine et la génistéine inhibent une enzyme de synthèse de
l’œstrogène et des androsténédiols ce qui a pour conséquences de diminuer leurs
concentrations dans les cellules mammaires et donc de diminuer l’évolution cancéreuse.
81
Conclusion
Depuis 1988, nous avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés, dont 33 sont nouveaux (la
plupart étant à la fois méthylés et/ou glycosylés et sulfatés). Hormis une flavone sulfatée chez
les Malvaceae, notons que les nouvelles flavones sulfatées, proviennent des
Monocotylédones. Nous avons vu aussi que les flavonoïdes sulfatés sont présents dans 38
familles avec trois nouvelles familles chez les Dicotylédones et que leur répartition est liée au
milieu dans lequel ces plantes poussent (salin ou marécageux).
La plupart des propriétés décrites sont les mêmes que celles des flavonoïdes en
général. Mais le fait que les flavonoïdes se métabolisent en dérivés sulfatés hydrosolubles et
les travaux effectués montrent que les propriétés citées pour les flavonoïdes sont étroitement
liées aux activités de ces dérivés sulfatés.
82
Deuxième Partie :
Travaux personnels
Chimie extractive
Isolement des composés
Analyse structurale
Activités biologiques
83
Chapitre I Chimie Extractive
I- Matériel végétal
Toute l’étude a été effectuée sur l’espèce Leea guineensis G. Don. Celle-ci a été
récoltée en avril 1995 au Cameroun à Bella au sud d’Edea (3°14’N, 10°13’E) par le botaniste
le Dr Achoundoung. Un échantillon de la plante est conservé à l’Herbier National de Yaoundé
sous le numéro 3145 : Achoundoung.
Les feuilles et le bois provenant du même arbuste ont été séchés séparément à l’ombre
pendant une quinzaine de jours, puis ont été respectivement broyés. Les poudres de feuilles 1,5
Kg et de bois 1,5 Kg ont alors été envoyés au laboratoire de pharmacognosie de Grenoble.
1 Kg de poudre de feuilles est soumis à une extraction à l’hexane (25 L) pendant 11H
dans un appareil de type Soxhlet. Les marcs sont séchés et épuisés au dichlorométhane (25 L,
15H). Ces deux extraits obtenus sont ensuite concentrés alors que les marcs subissent une
extraction hydroalcoolique 50% (30 L pendant 4 jours à température ambiante) (Figure 17 p
67).
B Extraction liquide-liquide
L’extrait hydroalcoolique est concentré sous vide afin d’obtenir 10 L de solution, dont
1 L est prélevé après homogénéisation et lyophilisé. Le reste subit une succession d’extraction
liquide-liquide avec les solvants de polarité croissante suivants : dichlorométhane, acétate
d’éthyle et butanol.
L’extraction est réalisée plusieurs fois pour chaque solvant. Les solutions extractives sont alors
concentrées. Les résidus des extraits EtOAc et BuOH sont repris dans l’eau et lyophilisés
(Figure 18 p 67).
84
Au total, nous obtenons 7 extraits dont les rendements d’extraction sont les suivants :
C Hydrodistillation
La recherche des composés volatils (CV) de L. guineensis G. Don, est menée par un
entraînement classique à la vapeur d’eau à partir d’échantillons de 100g de feuilles ou de bois
sec.
Le protocole utilisé est celui de la Pharmacopée Française Xèmeéd. [1983]. La durée
d’hydrodistillation a été de 4H pour les feuilles et le bois.
Les distillats obtenus dans les deux cas sont de couleur jaune foncée et sont plus légers
que l’eau.
85
FEUILLES broyées
1Kg
Extrait
Dichlorométhane Marc
4,2 %
Macération EtOH-H2O 50:50 30 L, 4J, TA
Extrait
Hydroalcoolique Marc
14,3 %
Extrait EtOH-H2O
30L
Concentration
Extrait H2O
Prélèvement d’ 1L lyophylisé
10 L
CH2Cl2 1 x 25 L
Extrait
Aqueux final
Figure 18 : Extraction liquide – liquide 3,6 %
86
Chapitre II - Isolement des composés
I- Extrait hexanique
CO charbon
20 g CO Si
E1
E2
A B C
CLMP Si CLMP Si
E3 E3 CLMP C18
E4
Terp-5 Aa Ab Terp-5 Ba Ca
(1g) (500mg)
CCMP Si CLMP Si CLMP Si CLMP C18 CCMP Si
C7 E5 E5 E4 C1
Baa Terp-2
Aaa Aba
Terp–7 CLMP C18 (25mg)
Visiprep Si
(6mg) CLMP C18
E4 E6
E4
Terp-3
(9mg)
Aaaa Terp-1 Abaa
(20mg)
CLMP C18 E1 CH2Cl2
E4 CCMP Si
C2 E2 CHCl3
Terp-4 Visiprep Si
E3 gradient cHex-CHCl3-MeOH
E7
(20mg)
E4 gradient MeOH-CHCl3
E5 gradient cHex-CHCl3
Terp-6 112B Terp-3 E6 gradient cHex-EtOAc
(9mg) (1mg) E7 CHCl3-MeOH 9:1
C1 cHex
Figure 19 : Isolement des composés de l’extrait hexanique
C2 cHex-EtOAc 7:3
C7 cHex-EtOAc 9 :1
87
II- Extrait dichlorométhane
Cet extrait verdâtre a subit dans un premier temps une chromatographie sous vide afin
d’obtenir deux fractions enrichies A et B. Une chromatographie d’exclusion diffusion sur
Sephadex© LH-20 de la fraction A conduit à deux fractions importantes Aa et Ab. La fraction
Aa riche en chlorophylle est passée sur charbon avant d’être chromatographiée sur une colonne
de silice. La fraction Ab est chromatographiée sur un support inverse pour conduire à deux
composés. La fraction B, plus polaire subit différentes chromatographies classiques. Ainsi, de
l’extrait dichlorométhane sont isolés 3 composés, un hydrocarbure (AG-1), un ester
phénolique (Ac Ph-2) et un flavonoïde (Flav-7).
E8 gradient cHex-CH2Cl2-MeOH
Extrait
E9 CHCl3-MeOH 5:5 dichlorométhane
E10 gradient CHCl3-MeOH
6g VLC silice
E11 gradient H2O-MeOH E8
Aa Ab Ba Bb
CO Charbon CLMP C18
E10 E11 CLMP C18
E13
Flav-7
Figure 20 : Isolement des composés de l’extrait dichlorométhane(3mg)
88
III- Extrait à l’acétate d’éthyle
10 g de cet extrait brunâtre sont chromatographiés sur une colonne de silice sous
moyenne pression, et permettent d’obtenir un composé et 3 fractions majoritaires A, B et C.
Ces fractions subissent ensuite des chromatographies classiques en phase inverse et des CCM
préparatives afin de purifier 5 composés, un acide phénol (Ac Ph-1) et 4 flavonoïdes (Flav-1
à Flav-4).
10 g CLMP silice
E17
A B C
Flav-1
(36mg) CLMP C18
E11
CLMP C18
CLMP C18 E11
E18
Aa Ac Ph-1 Ba Bb Bc Ca
(30mg) CMMP Si CMMP Si CO Sephadex LH20
C5 C5 E14
CMMP Si
CO Sephadex LH20 C5
E9
Flav-3
Flav-4
E9 CHCl3-MeOH 5:5
(8mg)
E11 gradient H2O-MeOH
E14 MeOH
E17 gradient EtOAc-MeOH
E18 gradient H2O-MeOH-CHCl3
C5 EtOAC-MeOH-H2O 100:16,5:13,5
89
IV- Extrait butanolique
Une chromatographie sous vide sur 2 g de cet extrait butanolique conduit à deux
fractions A et B. Celles-ci sont alors chromatographiées sur un gel de Sephadex LH20 et si la
purification n’est pas suffisante, elle est poursuivie par une CLMP en C18. Nous purifions ainsi
3 flavonoïdes (Flav-4 à Flav-6).
Extrait butanol
2g VLC silice
E20
A B
CO Sephadex LH20
E14
CO Sephadex LH20
E14
Flav-4 Flav-5 Aa Ba
(6mg) (20mg)
CLMP C18
E11
CLMP C18
E11
Flav-6 Flav-5
(6mg) (3mg) Baa
CLMP C18
E21
E11 gradient H2O-MeOH
E14 MeOH Flav-6
E20 gradient CH2Cl2-MeOH (3mg)
E21 H2O
90
V- Extrait aqueux
4 g de cet extrait après une chromatographique rapide sous vide, conduit à l’obtention
d’un composé pur et d’une fraction A qui après une CLMP C-18 conduit à une autre fraction
Aa et à deux composés purs. La fraction Aa est alors purifiée sur Sephadex LH20 pour obtenir
un dernier composé. De cet extrait aqueux nous obtenons 3 composés appartenant à la classe
des flavonoïdes (Flav-2, 5 et 6).
Extrait aqueux
4g VLC silice
E22
Flav-5 A
(6mg) CLMP C18
E11
Aa Flav-5 Flav-2
CO Sephadex LH20
E14
91
Chapitre III - Etude Phytochimique - Analyse Structurale
I- Analyse
Ac. myristique
Ac. Laurique
Ac. nonanoïque
Ac. caprique
(a)
92
Hexahydrofarnésylacétonee
Acide myristique
Naphtalène
Acide nonanoïque
Anethole
géranylacétone
Acide laurique
Acide caprique
(b)
Figure 24 (suite) : Profil chromatographique des composés volatils des feuilles (b).
Au total, 69 composés volatils sont recensés. Ils ont été identifiés par leur indice de
rétention [Jenings 1980, Kondjoyan 1996, Davies 1990], leur spectre de masse [Jennings
1980, McLafferty 1989, Stenhagen 1974, Banque informatisée de l’INRA 1997], et après
comparaison avec les données de la littérature [Kim Ha 1989].
On peut remarquer que, pour chaque échantillon, l’huile volatile est un mélange
complexe de plusieurs composés. La classe la plus représentée est celle des hydrocarbures et
de leurs dérivés (51,5% et 39,2% respectivement pour le bois et les feuilles). On retrouve
beaucoup d’acides gras et d’esters (37,3% et 28,7% au total) avec notamment les acides
nonanoïque, caprique, laurique, myristique et pentadécanoïque. Nous avons aussi, dans cette
classe, des alcanes, des alcools, des aldéhydes et des composés cétoniques.
Les autres classes sont celles des terpénoïdes (17,6% et 46,7% comprenant mono-, di-
et sesquiterpénoïdes), des phénylpropanoïdes rencontrés uniquement dans le bois et des
composés divers (9,1% et 0,7%).
93
Tableau 17 : Composés volatils de bois et de feuilles de L. guineensis
Composés Indice de Bois Feuilles
Rétention % rel. % rel.
Dérivés d’hydrocarbures
a) alcanes, alcools
Undécanol* 1381 - 2,4
Tétradécanol* 1677 - 0,4
Heptadécane 1700 - 0,2
Σ 0,0 Σ 3,0
b) aldéhydes
Heptanal 882 0,2 -
n-octanal 989 0,2 0,2
(E)-2-octènal 1042 0,5 -
Nonanal 1089 1,2 1,3
(E)-2-nonènal 1146 - 0,3
Décanal 1188 1,4 0,8
(E, E)-2,4-nonadiènal 1193 - 0,8
(E)-2-décènal 1249 - 0,5
(E, Z)-2,4-décadiènal 1274 0,4 -
(E, E)-2,4-décadiènal 1294 10,3 0,4
(E)-2-undécènal 1345 - 0,9
Pentadécanal 1698 - 0,3
Σ 14,2 Σ 5,5
c) cétones
(E)-3-nonèn-2-one 1122 - 0,2
Undécan-2-one 1288 - 0,2
Dodécan-2-one 1389 - 0,9
Pentadécan-2-one 1683 - 0,3
Heptadécan-2-one 1887 - 0,4
Σ 0,0 Σ 2,0
d) acides gras et esters
Acide caproïque (hexanoïque) 1008 1,6 -
Acide heptanoïque 1091 0,4 -
Caprilate de méthyle 1175 0,3 -
Acide caprilique (octanoïque) 1183 1,9 -
Acide nonanoïque 1278 4,3 3,8
Acide (E)-non-2-ènoïque 1321 0,8 -
Acide caprique (décanoïque) 1371 5,3 2,7
Acide undécanoïque 1469 1,0 1,0
Laurate de méthyle 1508 - 0,5
Acide laurique (dodécanoïque) 1566 3,3 7,4
Acide tridécanoïque 1668 - 1,0
Acide myristique (tétradécanoïque) 1765 10,0 7,3
Acide pentadécanoïque 1866 5,1 2,1
Palmitate de méthyle 1908 0,9 2,4
Acide (Z)-hexadéc-9-ènoïque 1939 2,4 -
Acide palmitique 1965 - 0,5
Σ 37,3 Σ 28,7
Terpènoïdes
6-méthyl-hept-5-èn-2-one 973 0,3 0,2
1,8-cinéole 1024 0,2 -
(Z)-linalyloxide 1066 0,4 -
(E)-linalyloxide 1079 0,6 0,3
6-méthyl-3,5-heptadièn-2-one* 1085 0,3 -
Linalol 1094 2,9 0,8
α-terpinéol 1181 1,8 0,3
β-cyclocitral 1197 - 0,3
Vitispirane 1270 - 1,2
α-ionone 1408 0,7 4,2
Géranylacétone 1433 2,3 3,4
94
(E)-β-ionone 1466 0,3 2,3
Dihydroactinidiolide 1490 - 0,5
(E, E)-pseudoionone 1563 - 0,3
4-oxo-β-ionone 1635 - 0,7
Cadalène 1662 - 1,2
Hexahydrofarnésylacétone 1836 5,4 28,2
6,10,14-triméthylpentadéc-3-èn-2-one* 1877 - 1,5
Farnésylacétone* 1895 0,4 0,5
Isophytol 1943 2,0 0,3
(E)-phytol 1950 - 0,5
Σ 17,6 Σ 46,7
Phénylpropanoïdes
Estragole 1181 1,8 -
Anisaldéhyde 1221 1,0 -
(E)-cinnamaldéhyde 1239 2,1 -
(E)-anéthole 1267 3,5 -
Anisylacétone 1350 0,2 -
Σ 8,6 Σ 0,0
Composés divers
Naphthalène 1165 4,8 -
Salicylate de méthyle 1174 0,4 -
γ-heptalactone 1324 0,5 -
Triméthyldihydronaphthalène* 1338 - 0,3
Dibenzofurane 1490 0,2 -
Benzoate de benzyle 1730 - 0,4
Muskolactone 1846 3,2 -
Σ 9,1 Σ 0,7
HE BOIS HE FEUILLES
Divers Divers
Phénylpropanoï de 1%
10%
s Hydrocarbures
10% Hydrocarbures
45%
60%
Terpenoï des
Terpenoï des 54%
20%
Ainsi, nous pouvons constater que l’huile volatile du bois diffère significativement de
celle des feuilles. La composition respecte bien les données de la littérature en ce qui concerne
les taux de terpénoïdes et de phénylpropanoïdes en fonction de la partie végétale étudiée
[Engel 1998]. On observe une quantité appréciable de phénylpropanoïdes (8,6%) dans l’huile
volatile de bois, parmi lesquels figurent l’estragole (1,8%), l’anisaldéhyde (1,0%), le
cinnamaldéhyde (2,1%), l’E-anéthole (3,5%) et l’anisylacétone (0,2%). Ceux-ci sont absents
dans le distillat de feuilles.
95
Par contre, le distillat de feuilles est bien plus riche en terpénoïdes (46,7% contre
17,6%). On note un fort taux d’hexahydrofarnésylacétone (28,2%), et la présence de deux
composés à 13 carbones, qui sont des composés rares d’huiles essentielles, le
triméthyldihydronaphthalène (0,3%) et le vitispirane (1,2%).
Ce dernier est un composé important de l’arôme de vanille [Schulte-Elte 1978]. Il a
aussi été identifié dans les composés volatils du jus de raisin, de vin de table et de spiritueux de
vin [Simpson 1977,Tattje 1979].
Pour les calculs, l’analyse est classiquement arrêtée à l’acide palmitique. Cependant,
nous avons pu, après celui-ci, identifier (Rt, SM ) 4 acides gras. Ce sont : l’acide margarique
(C-17), l’acide stéarique (C-18), l’acide oléique (C-18:1) et l’adipate de dioctyle.
II- Discussion
L’analyse des composés volatils de L. guineensis (Leeaceae) a été réalisée car une HE a
été décrite dans une autre espèce de Leea, L. hirta Roxb. La composition de celle-ci n’est pas
connue, par contre, elle aurait une activité tuberculostatique [Gupta 1953].
L’analyse des distillats de feuilles et de bois permet l’identification d’un grand nombre
de composés qui n’ont jamais été décrits dans cette plante, ni même dans la famille. On
remarque toutefois que les acides gras sont les composés majoritaires du bois, contrairement
aux feuilles, où la fraction en terpénoïdes est la plus importante même si on retrouve aussi en
grande quantité ces acides gras.
Par ailleurs, l’identification du vitispirane est un élément important. Ce composé rare,
présent dans les distillats de vin (Vitis vinifera (Vitaceae)) montre une fois de plus la proximité
des deux familles Leeaceae et Vitaceae.
96
α-terpinéol vitispirane
OH
linalol α-ionone
OH
Hexahydrofarnésylacétone E-anéthole
OCH 3
97
estragol isophytol
OH
OCH3
Géranylacétone E-cinnamaldéhyde
Anisaldéhyde
OCH3
98
B- Etude des Terpénoïdes
I- Identification de Terp-1
Le spectre de masse en DCI indique l’adduit à m/z 314 [M+NH4]+ et l’ion pseudo-
moléculaire à m/z 297 [M+H]+ correspondant à la formule brute C20H40O. Cette formule
indique la présence d’une insaturation ou d’un cycle, DIC de 1 [McLafferty 1980].
Nous observons différents pics identifiables tels que les pics à m/z 296 [M+NH4-H2O]+ et m/z
279 [M-H2O+H]+ qui correspond à la perte d’un hydroxyle par α-clivage. Plusieurs pics sont
caractéristiques d’un squelette de type phytol : m/z 81 (C6H9+), 83 (C6H11+), 97 (C7H13+) et 123
(C9H15+) [Rasool 1991].
Par ailleurs, nous avons un pic m/z 85 (C5H9O+) qui résulte d’un clivage alpha d’un alcène.
L’allure générale du spectre RMN 1H ci-dessous, suggère que le composé est de nature
terpénique.
Me-3 H-16
H-1 Me-15
Me-7
Me-11
H-4
H-2
H-15
99
couplage vicinal avec H-1 à 4,13 ppm (d, J = 6,9 Hz, 2H) dont le carbone est hydroxylé. Ces
couplages sont confirmés par le spectre COSY. La troisième substitution est un CH2 déblindé à
1,97 ppm (H-4, t, J = 7,4 Hz) qui couple lui-même avec un RCH2.
Nous pouvons donc dessiner le motif suivant :
4
3 CH3
R
OH
H 2
1
On devine vers 1,53 ppm un heptuplet (J = 6,4 Hz, 1H) relatif au proton H-15, qui couple avec
2 méthyles H-16 et Me-15. Parallèlement, ces deux méthyles résonnent sous forme de doublets
caractéristiques à 0,85 ppm (d, J = 6,5 Hz, 6H).
Les méthyles en 7 et en 11 résonnent quant à eux à 0,83 ppm (d, J = 6,3 et 6,2 Hz, 6H).
En outre, la zone à 1,5-1,0 ppm correspond à 20 protons.
Sur le spectre RMN 13C, de nombreux carbones ont le même déplacement chimique.
Nous confirmons la présence d’une double liaison par les carbones à 140,3 ppm (C-3), 123,1
ppm (C-2) et par le carbone déblindé à 39,9 ppm (C-4) qui est en alpha de celle-ci.
La configuration E de la double liaison est confirmée par les valeurs spectrales et la
comparaison faite avec le géraniol (E) et le nérol (Z) [Breitmeier 1990]. Notons que le méthyle
en position 3 est significativement moins déblindé dans l’isomère E, alors que le carbone 4 est
au contraire plus déblindé.
OH
Géraniol Nérol
OH
Nous observons aussi, un carbone hydroxylé (56,5 ppm), 3 groupes de méthyles à 22,7,
19,8 et 16,2 ppm correspondant aux méthyles C16 et Me15, Me7 et Me11, et Me3
respectivement.
100
Position 13
C H 1
Toutes ces données comparées à celles de la littérature [Rasool 1991, Hasan 1991] permettent
d’identifier Terp-1 au E-Phytol :
OH
11 7 1
15
Rappelons par ailleurs, qu’il a été caractérisé dans le distillat des feuilles avec son
homologue l’isophytol.
Il a été isolé pour la première fois en 1907 par Willstätter [Merck Index]. C’est un
diterpène acyclique largement répandu dans le règne végétal qui provient de la décomposition
de la chlorophylle. Il sert à la préparation des vitamines E et K1 [Harborne 1999]. Il est
cependant recensé pour la première fois chez les Leeaceae.
101
II- Identification de Terp-2
Issue de l’extrait hexanique, cette huile incolore, réagit sur CCM comme un dérivé
terpénique (25mg).
Le spectre de masse en mode DCI révèle 2 pics caractéristiques à m/z 411 [M+H]+ et
m/z 428 [M+NH4]+ qui conduisent à une formule brute de C30H50 (6 insaturations ou cycles).
De plus, par clivage alpha-allylique, on identifie différents fragments caractéristiques de la
perte du même motif en C5, à m/z 342 [M-C5H9+H]+, m/z 274 [M-C10H17+H]+, m/z 206 [M-
C15H25+H]+, m/z 138 [M-C20H33+H]+, m/z 70 [M-C25H41+H]+. Ce type de fragmentation est
rencontré dans des structures de type squalène.
PM = 410
L’allure générale du spectre RMN 1H présente 3 régions distinctes (Figure 29, Tableau
19 p 86) :
- une zone de protons éthyléniques à 5,10 ppm (m) qui intègre pour 6H,
102
- une zone des CH2 à δ 2,10-1,90 (m) qui intègre pour 20H,
- enfin, une zone pour les méthyles avec, à 1,66 ppm, un singulet large qui correspond aux
méthyles trans en bout de chaîne C-1, C-24, intégrant pour 6H, et à 1,58 ppm un singulet qui
intègre pour 18H correspondant aux méthyles Me-2, -6, -10, -15, -19 et -23.
Sur le spectre 13C (J modulé), on observe 12 signaux qui laissent penser que les motifs
en C5 intramoléculaires sont équivalents (Figure 30, Tableau 19 p 86).
C-2
C-23
Me-6
Me-10
Me-15
Me-19
Me-2
C-1 Me-23
C-3, C-22 C-24
C-7, C-11, C-14, C-18
On distingue :
-trois carbones quaternaires oléfiniques à 135,1, 134,9 et 131,2 ppm
correspondant à C-6, C-10 et C-2 respectivement,
-deux signaux éthyléniques dont un à 124,4 ppm attribuable à C-3 et un à 124,3
ppm relatif à C-7 et C-11,
-quatre CH2 à 39,7 ppm (C-5 et C-9), 28,3 ppm (C-12), 26,8 ppm (C-4) et 26,7
ppm (C-8),
-trois signaux caractéristiques de carbones méthyliques : le premier à 25,7 ppm
correspond aux méthyles trans (C-1 et C-24) en bout de chaîne qui sont les plus déblindés, le
second à 17,7 ppm est attribuable au Me-2 et enfin celui à 16,0 ppm aux Me-6 et Me-10.
103
L’expérience XHCORR permet d’attribuer à partir des protons éthyléniques les
carbones correspondant, et montre également l’existence de deux groupes de méthyles. Le
premier correspondant à C-1 et C-24, le second aux méthyles en -2, -6, -10, -15, -19 et -23.
1.5 ppm
C-6
C-2
C-10
C-23
C-15
C-1 C-19
C-24
2.0 ppm
Avec l’expérience COSY45, on ne peut pas attribuer de manière précise les corrélations
observées du fait de la superposition des signaux. Cependant, des corrélations existent entre
des protons éthyléniques et des CH2. On remarque également un couplage trans-allylique entre
le méthyle en 1 et le proton éthylénique H-3 (4JH1-H3). Comme pour Terp-1, cela confirme la
présence de fragments en C5, et l’enchaînement suivant :
H3C
104
Position C
13 1
H
1, 24 25,7 CH3 1,66 (s, 6H)
2, 23 131,2 C
3, 22 124,4 CH 5,10 (m)
4, 21 26,8 CH2 2,0-2,1 (nd)
5, 9, 16, 20 39,7 CH2 1,9-2,0 (nd)
6, 19 135,1 C
7, 11, 14, 18 124,3 CH 5,10 (m)
8, 17 26,7 CH2 2,0-2,1 (nd)
10, 15 134,9 C
12, 13 28,3 CH2 1,95-2,05 (nd)
Me-2, 23 17,7 CH3 1,58 (s, 18H)
Me-6, 10, 15, 19 16,0 CH3
19 23
15
6 10
C’est un produit cité pour la première fois dans le genre et l’espèce, alors qu’il est
présent dans tout le règne végétal. Il est le précurseur de tous les triterpènes via son
époxydation, sa cyclisation et son réarrangement [Bruneton 1993]. Isolé en 1926 par Heilbron,
il est utilisé dans la synthèse d’un grand nombre de composés pharmaceutiques [Merck Index].
Notons que le squalène est présent dans l’huile d’olive à 0,10,7% [Harborne 1999].
105
III- Identification de Terp-3
Il est isolé sous forme d’aiguilles blanches (10 mg) dans la phase hexanique. Sa
coloration rose puis violette après acide sur CCM laisse penser qu’il s’agit d’un triterpénoïde.
[M-H2O+H]+
[a-OH+H]+
Par ailleurs, le spectre montre les fragments classiques des squelettes du type lupane
[Shiojima 1992] (Figure 33). Ainsi, le fragment « a » (m/z 207), par perte de l’hydroxyle
conduit au fragment m/z 190 [a-OH+H]+ et le fragment « g » (m/z 218) perd à son tour un
méthyle et donne le fragment « g-15 » à m/z 203. Nous rencontrons aussi la coupure au niveau
du cycle D qui conduit à un fragment à m/z 136 qui perd un proton pour donner un fragment à
m/z 135 qui perd lui-même un méthyle pour donner le fragment à m/z 121.
106
CH2
a
a-OH m/z 207
m/z 190
- Me m/z 121
m/z 394 m/z 409
-Me
-H m/z 135
m/z 136
HO g g-15
m/z 218 m/z 203
13
Le spectre C (J modulé) confirme le squelette triterpénique avec 30 carbones
correspondant à la série des lupanes avec deux carbones éthyléniques caractéristiques à 151,0
ppm (C-20, C) et à 109,3 ppm (C-29, CH), un carbone hydroxylé à 79,0 ppm (C-3 CHOH), 27
signaux entre 14 et 56 ppm correspondant à 6 C, 5 CH, 9 CH2 et 7 CH3 (Tableau 22 p 102).
Ces données spectrales sont comparables avec celles de la littérature [Mahato 1994], et
confirment ainsi les données 1H et SM. Ces résultats nous permettent d’identifier Terp-3 au
lupéol :
29
30 CH2
20
21
19
22
25 26 28
3 27
HO
24 23
C’est un produit nouvellement cité dans le genre qui est très répandu dans le monde végétal. Il
a été isolé la première fois par Cohen en 1909 [Merck Index].
107
IV- Identification de Terp-4
Ce sont des aiguilles blanches (20 mg) isolées de l’extrait hexanique, qui sur CCM
présente toutes les caractéristiques d’un triterpène.
Le spectre DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 427 [M+H]+, qui correspond à
une formule brute de C30H50O (6 insaturations ou cycles). Le fragment à m/z 409 [M-H2O+H]+
indique la perte d’un hydroxyle par α-clivage. De même, nous rencontrons la perte d’un
méthyle à m/z 412 [M-CH3+H]+.
De plus, nous observons les clivages classiques de triterpènes, caractéristiques d’une structure
oléanène [Shiojima 1992] (Figure 34). Il y a cassure de la liaison C-8-C-14. Le C-14 voisin de
la double liaison est alors chargé positivement. Puis il y a clivage allylique entre C-9-C-11. Cela
conduit aux fragments « g’ » à m/z 218 et « a » à m/z 207. La double liaison semble se trouver
en C-12-C-13 du fait de l’important fragment « g’ ».
a-18 a
m/z 189 m/z 217
m/z 409
- CH3
m/z 412
Ce fragment « g’ » perd un groupe méthyle par migration d’un proton et conduit au fragment
« g’-15 » à m/z 203, puis la migration d’un proton entraîne la perte de C-11 d’où le fragment
« g’-29 » à m/z 189. Ce fragment est aussi dû à la perte d’un hydroxyle du fragment « a » d’où
ce même fragment « a-18 » à m/z 189.
108
Me-26
Le spectre RMN 1H suggère également une structure oléanène hydroxylée. Me-25
Me-23
H-12
H-3
En effet, le proton éthylénique à 5,17 ppm (H-12, t, J = 3,6 Hz, 1H) est très
caractéristique ainsi que le proton porté par un carbone hydroxylé à 3,21 ppm (H-3, dd, J =
5,4 et 9,9 Hz, 1H). La présence de 7 signaux de méthyles angulaires est caractérisée par des
singulets entre 1,15 et 0,75 ppm (Tableau ci-dessous).
Le spectre 13C montre 30 carbones répartis dans des zones caractéristiques (Tableau p
102). Notamment nous avons à 145,2 ppm (C-13, C) et 121,7 ppm (C-12, CH) les
déplacements chimiques des carbones éthyléniques qui correspondent à une structure de type
oléan-12-ène, dont le carbone à 79,0 ppm (C-3, CHOH) est β-hydroxylé [Mahato 1994].
109
Tableau 21 : Différences essentielles entre le noyau oléan-12-ène et urs-12-ène
Carbones Oléan-12-ène Urs-12-ène
3β 78,8 78,8
3α 76,4 76,0
12 121,8 124,3
13 145,1 139,3
12
25 26 28
3 27
HO
24 23
Bien que très largement répandue, la β-amyrine est citée pour la première fois dans le
genre. Il semble qu’elle ait été isolée pour la première fois en 1835 de Manila elemi
(Burseraceae) par Rose, et redécouverte par Tschirch en 1902 de Amyris elemi (Rutaceae)
[Radt 1940].
V- Identification de Terp-5
Ce composé se présente sous forme de cristaux en feuillets blancs (+1 g). Produit très
apolaire, il est isolé de l’extrait hexanique et présente sur CCM toutes les caractéristiques d’un
triterpéne.
Le spectre de masse en EI montre l’ion moléculaire à m/z 665 [M]+. Cette erreur de 1
uma est due à un problème de décalage en masse qui a été confirmé par le spectre effectué en
FAB mode négatif où l’on obtient bien le fragment m/z 663 pour [M-H]-. De même, le spectre
en DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 665 [M+H]+ et l’adduit à m/z 682 [M+NH4]+.
Ces données sont cohérentes pour une formule brute de C46H80O2 (7 insaturations ou cycles).
110
g’
Palm+
a-18
g’-29
[M]+
[M-Palm] +
Nous observons la perte d’un méthyle grâce au fragment à m/z 650 [M-CH3+H]+. Le
fragment à m/z 409 indique la perte de 255 uma correspondant à une chaîne hydrocarbonée en
C16. De plus, nous observons les clivages classiques de la β-amyrine rencontrés précédemment,
qui conduisent aux fragments « g’ » à m/z 218, « a » à m/z 207, « g’-15 » à m/z 203, et enfin
« a-18 » et « g’-29 » à m/z 189.
Notons que l’on observe bien la chaîne aliphatique avec les fragments à m/z 257 et 239
relatifs dans un premier temps à une chaîne palmitoyle qui perd un hydroxyle. De plus, on
distingue les premiers fragments dus aux clivages successifs des liaisons C-C du côté Cterminal de
C2H5+ à C10H41+.
a-18 a
m/z 189 m/z 217
m/z 409
m/z 650
m/z 239
111
- le proton éthylénique H-12 à δ 5,16 (t, J = 3,5 Hz),
- le proton en alpha d’un hydroxyle, H-3, à δ 4,49 (dd, J = 7,6 et 8,3 Hz), qui
est plus déblindé que dans la β-amyrine. Ce déblindage est caractéristique d’une
estérification de l’hydroxyle géminal.
Me-16’
Me-27
H-2’
H-12 H-3
Par ailleurs, les déplacements chimiques des méthyles sont perturbés par cette chaîne.
Nous avons un méthyle à δ 1,11 (s, Me-27), 2 méthyles à δ 0,95 (sl, Me-25 et Me-24 ou Me-
26), 5 méthyles à δ 0,85 (sl, Me-23, Me-24 ou Me-26, Me-28 , Me-29 et Me-30), et enfin le
méthyle de fin de chaîne du palmitate à δ 0,81 ppm (Me-16’, s, 3H).
La présence de cette chaîne est très bien indiquée par le triplet caractéristique H-2’ en α
de l’ester bien déblindé (δ 2,27, t, J = 7,5 Hz, 2H) par rapport aux autres CH2 (δ 1,1-2,0, m).
En ce qui concerne le spectre 13C, seuls les carbones du cycle A de la β-amyrine sont
perturbés par la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p 102). L’estérification est caractérisée par le C-
1’ à 173,5 ppm et le carbone C-3 qui est plus déblindé à 80,6 ppm que dans la β-amyrine.
112
C-12 C-3 C-5
C-16’
C-1’
C-13
Sur le spectre COSY 1H-1H, nous observons plusieurs systèmes de spins, H1-H2-H3,
H5-H6-H7, H9-H11-H12, H15-H16, H18-H19, H21-H22. Ces corrélations confirment la
structure de l’amyrine. Nous voyons aussi les premières corrélations (H2’-H3’-H4’-...) qui
appartiennent au grand système de spin que constitue le reste palmitoyle.
21
12
18
15
H
3
5
CH3(CH2)12CH2CH2COO
2'
113
L’hydrolyse alcaline de Terp-5 a conduit à l’obtention de la β-amyrine et de l’acide
palmitique (Annexe p 186) isolés et caractérisés par CCM comparative avec des témoins et les
techniques spectrales RMN, SM.
Ce composé très apolaire est isolé sous forme de poudre blanchâtre (10 mg) de l’extrait
hexanique. Son comportement CCM rappelle les caractéristiques des triterpénes acylés.
L’ion pseudo-moléculaire à m/z 705 [M+H]+ et l’adduit à m/z 722 [M+NH4]+ sur le
spectre DCI conduisent à la formule brute C48H80O3 (9 insaturations ou cycles).
Nous rencontrons la perte d’un méthyle à m/z 690 [M-CH3+H]+ ainsi que probablement une
déshydratation suivie d’un réarrangement à m/z 685 relative à un produit hydroxylé. Comme
pour le palmitate de β-amyrine, nous observons les fragments m/z 409, « g’ » à m/z 218, « a »
à m/z 207, « g’-15 » à m/z 203, et enfin « a-18 » et « g’-29 » à m/z 189 qui signent la présence
d’une génine de type oléanène [Shiojima 1992].
114
M-Cor+
[M+H]+
C18H31O3+ [M+NH4]+
g’
Les fragments à m/z 409 et 425 de la génine indiquent bien la perte d’une chaîne en C18.
Cette chaîne est clivée au niveau de sa jonction avec la génine et conduit aux fragments à m/z
295 (C18H31O3+) et 279 (C18H31O2+) par coupure anté ou post-oxygène. L’α-clivage au niveau
des doubles liaisons conduit à deux fragments m/z 167 pour la coupure du côté de la génine et
m/z 71 pour celle du côté C-terminale. Ce dernier fragment à m/z 71 (C5H11+) implique une
position Cterm de type CH3-(CH2)4-CHR’-R. De plus, on observe que les premiers fragments
provenant de clivages successifs des liaisons carbone-carbone du côté Cterminal tels que C2H5+ à
C5H11+.
a-18 a
m/z 189 m/z 207
m/z 409
m/z 279
OH
CH2(CH2)6CO-O
m/z 295 g'
m/z 218
CH3-(CH2)3-CH2
g'-29
m/z 189
115
La démarche et l’analyse des spectres 1H et 13C sont identiques à celles du palmitate de
β-amyrine Terp-5. En effet, le spectre 1H a la même allure générale avec, H-12 à 5,16 ppm (t,
J = 3,5 Hz, 1H), H-3 à 4,49 ppm (dd, J = 7,6 et 8,2 Hz, 1H) et H-2’ à 2,27 ppm (t, J = 7,3 Hz,
2H).
Cependant, des signaux supplémentaires sont observés. Ainsi, entre 6,5 ppm et 5,6 ppm
quatre protons éthyléniques révèlent la présence d’un système diénique conjugué sur cette
chaîne latérale.
H-2’
H-11’ est le plus déblindé à 6,47 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,2 et 3J11’-12’ = 15,1 Hz, 1H). Ce couplage
vicinal de 15 Hz est relatif à une configuration E [Stadler 1994].
H-10’ résonne à 5,95 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,1 et 3J10’-9’ = 11,4 Hz, 1H). Ce couplage vicinal de
11 Hz est relatif à une configuration Z [Stadler 1994].
H-12’ est à 5,65 ppm (dd, 3J11’-12’ = 15,2 et 3J12’-13’ = 8,2 Hz, 1H),
H-9’ est à 5,48 ppm (dd, 3J9’-10’ = 11,5 et 3J8’-9’ = 7,5 Hz, 1H).
116
H-12
H-3
Figure 44 : Agrandissement du spectre 1H entre 4,0 et 6,7 ppm de Terp-6 (500 MHz, CDCl3)
(Rem : à 500 MHz, on aperçoit des signaux indiquant que Terp-6 est en mélange avec d’autres composés !)
Parallèlement à ces protons éthyléniques, nous observons un proton à 4,11 ppm (H-13’,
m, 1H) caractéristique d’un proton en alpha d’un hydroxyle. Le spectre COSY révèle un
couplage entre ce dernier proton et un des protons du diène conjugué à δ 5,65 (H-12’) et des
corrélations successives de H-8’ à H-14’, ce qui confirme l’enchaînement suivant :
OH H
H H H
Le spectre COSY permet de mieux visualiser ces différents couplages ainsi que ceux
déjà observés pour les amyrines acylées.
117
H-11’ H-10’ H-12’ H-9’ H-12 H-3 H-13’ H-8 H-11 H-2a H-2b
H-14’
H-13’
H-3
H-12
H-9’
H-12’
H-10’
H-11’
13
En ce qui concerne le spectre C (J modulé), les déplacements chimiques sont
comparables à ceux du dérivé palmitoylé (Tableau 22 p 102). De plus, nous observons les
carbones éthyléniques du système conjugué de configuration Z, E, à 135,8, 133,0, 127,7, et
125,8 ppm ainsi que celui du carbone hydroxylé CHOH (C-13’) à 72,9 ppm. Par comparaison,
les déplacements chimiques des carbones éthyléniques du E, E coriolate de méthyle résonnent
à 135,9, 133,7, 130,9, 129,5 ppm [Kann 1990].
C-13 C-19
C-1’
C-18’
C-13’
C-9’
C-5 C-9
C-18
C-12 C-3
C-12’
118
Carbones
Z, E Z, E E, E
# Terp-6 *
1
H 1
H 13
C 1
H 13
C
9’ 5,41 5,48 125,8 5,68 129,5°
10’ 6,02 5,95 127,7° 6,01 130,9°
11’ 6,46 6,47 133,0° 6,17 133,7°
12’ 5,69 5,65 135,8 5,57 135,9°
13’ 4,16 4,11 72,9 4,11 72,9°
* [Kann 1990] 13-hydroxy-9(E),11(E)-octadecadiènoate de méthyle
# [de Montarby 1988] 9-hydroxy-5(Z),7(E)-tridécadiènoate de méthyle
° interchangeable
Les attributions de la β-amyrine acylée comparées à Terp-5 ainsi que la présence d’une
chaîne de type acide coriolique [Stadler 1994, Kann 1990, de Montarby 1988] nous permettent
d’identifier Terp-6 au coriolate de β-amyrine. Il est, à notre connaissance, isolé pour la
première fois du règne végétal :
30 29
12
25 26 28
1' 3 27
9' COO
Z
13' 23
18' 24
E
11'
OH
Isolé sous forme de cristaux blancs, ce composé est issu de l’extrait hexanique (6 mg).
Très apolaire sur CCM, il possède un Rf comparable à celui des triterpènes acylés comme
Terp-5 ou Terp-6.
Le spectre de masse en DCI indique l’ion pseudomoléculaire à m/z 665 [M+H]+ qui est
le même que Terp-5, d’où une formule brute de C46H80O2. On retrouve les mêmes fragments
d’un triterpène acylé comme Terp-5 dont le pic à m/z 409 [M-palm+H]+.
119
Le spectre proton ressemble aussi à celui de Terp-5 avec les signaux du proton
éthylénique H-12 à δ 5,11, du proton H-3 à δ 4,48 et le signal caractéristique de la chaîne en
alpha de l’ester avec le CH2 à δ 2,27.
La différence entre Terp-7 et Terp-5 se trouve dans le spectre 13C (Figure 47). En effet,
les carbones de la double liaison C-12 à 124,4 ppm et C-13 à 139,6 ppm sont significatifs d’un
noyau de type urs-12-ène (Tableau 21 p 91) [Mahato 1994]. Après comparaison avec les
données de la littérature, nous pouvons attribuer tous les carbones de la génine, l’α-amyrine
estérifiée et quelques carbones de la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p 102).
C-1’
C-13
C-3
C-12
12
3
1'
C15H31CO-O
Tableau 22 : Récapitulatif des données 13C des triterpènes et de leurs esters (50 MHz, CDCl3)
120
Carbones Lupéol β-amyrine Palmitate Coriolate Palmitate
de de d’
δ en ppm β-amyrine β-amyrine α-amyrine
1 38,7 38,6 38,3 38,3 38,5
2 27,5 27,3 23,5 23,5 23,7
3 79,0 79,0 80,6 80,6 80,6
4 38,8 38,8 37,7 37,8 37,8
5 55,4 55,2 55,3 55,3 55,3
6 18,4 18,4 18,3 18,3 18,3
7 34,3 32,7 32,6 32,6 32,9
8 40,8 39,8 39,8 39,8 40,1
9 50,5 47,7 47,6 47,6 47,7
10 37,2 37,0 36,9 36,9 36,8
11 21,0 23,6 23,6 23,6 23,4
12 25,2 121,7 121,7 121,7 124,4
13 38,1 145,2 145,2 145,2 139,8
14 42,8 41,7 41,7 41,7 42,1
15 27,5 26,2 26,2 26,2 29,3
16 35,6 27,0 26,9 27,0 26,6
17 43,0 32,5 32,5 32,5 33,8
18 48,4 47,3 47,3 47,3 59,1
19 47,8 46,9 46,8 46,8 39,6
20 151,0 31,1 31,1 31,1 39,6
21 29,7 34,8 34,8 34,8 31,3
22 40,0 37,2 37,2 37,3 41,6
23 28,0 28,1 28,1 28,1 28,7
24 15,4 15,6 16,8 16,8 16,8
25 16,1 15,6 15,5 15,5 15,7
26 16,0 16,8 16,8 16,8 16,8
27 14,5 26,0 25,9 26,0 23,3
28 18,0 28,4 28,4 28,4 28,1
29 109,3 33,3 33,3 33,3 17,5
30 19,4 23,7 23,7 23,7 21,4
1’ 173,5 173,6 173,6
2’ 34,8 34,8 34,9
3’ 25,2 25,3 25,2
4’ 29,7 29,7
5’
6’
7’
8’
9’ 125,8
10’ 127,7*
11’ 133,0*
12’ 135,8
13’ 29,6 72,9 29,2
14’ 31,9 31,9
15’ 22,7 22,7
16’ 14,1 14,1
17’ 22,6
18’ 14,0
* interchangeable
121
C- Etude des Flavonoïdes
I- Identification de Flav-1
Composé isolé sous forme de laque jaune (36 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle. Sur
CCM, l’apparence du spot présente toutes les caractéristiques d’un flavonol. En effet, ce
composé est très jaune sous UV à 366 nm, révélateur d’un 3-OH libre [Mabry 1970].
Cela est confirmé par le spectre UV qui indique une absorbance à λmax 365 nm pour la
bande I dans le MeOH (Tableau 28 p 124). De plus, le déplacement bathochromique de la
bande II de 9 nm après l’ajout de NaOAc apporte la preuve d’un hydroxyle libre en 7.
L’hydroxyle libre en 4’ est suggéré par le déplacement bathochromique de la bande I de 50 nm
qui se décompose rapidement suite au système 3,4’-dihydroxylé [Mabry 1970].
L’ion pseudo-moléculaire à m/z 285 [M-H]- sur le spectre de masse en FAB mode
négatif indique une formule brute de C15H10O6 (11 insaturations ou cycles).
122
H-3’
H-2’ H-5’
H-6’
H-6
OH-5 H-8
OH
OH
OH-7
Le spectre 13C montre 13 carbones. Ceci est dû à la symétrie du cycle B. Ainsi C-2’ et
C-6’ sont à 129,4 ppm et C-3’ et C-5’ à 115,4 ppm. Les autres CH aromatiques résonnent à
98,1 ppm (C-6) et 93,4 ppm (C-8). Les carbones phénoliques, quaternaires résonnent entre
135 et 165 ppm, la fonction cétonique est à 175,9 ppm (C-4) (Tableau 27 p 123). Ces données
sont en accord avec la littérature [Harborne 1982].
HO O
3
OH
5
OH O
123
II- Identification de Flav-2
Isolé sous forme de laque jaune (50 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle, son
comportement chromatographique révèle aussi une structure de type flavonol.
La bande I du spectre UV, à 369 nm, dans le MeOH indique un flavonol polyhydroxylé.
La décomposition rapide après addition de base est révélatrice d’un système
3,3’,4’-trihydroxylé. D’ailleurs, le retour de bande de 30 nm suite à l’ajout d’HCl dans AlCl3
indique bien le système ortho-dihydroxyl en 3’,4’ [Mabry 1970].
Cette structure est vérifiée avec les données du spectres RMN 1H où l’on observe 2
protons aromatiques H-6 (δ 6,17, d, J = 1,6 Hz, 1H) couplant avec une constante meta à H-8
(δ 6,40, d, J = 1,7 Hz, 1H) sur le cycle A, ainsi que 3 protons aromatiques sur le cycle B, H-2’
(δ 7,66, d, J = 1,8 Hz, 1H) qui a un couplage meta avec H-6’ (δ 7,53, dd, J = 8,4 et 2 Hz, 1H),
lui-même ayant un couplage ortho avec H-5’ (δ 6,87, d, J = 8,5 Hz, 1H) (Tableau 26 p 123).
124
OH-5
H-6
OH
H-2’ H-5’ H-8
OH
OH-7 OH
H-6’
C-7
C-3
C-5 C-4’
C-3’
C-1’
C-2
C-4
C-9
C-10
125
Tout comme Flav-1, le spectre 13C de Flav-2 est en accord avec la littérature [Harborne
1982, Agrawal 1989], et confirme la structure quercétine.
OH
3'
OH
HO O
3
OH
5
OH O
Flavonol très commun, la quercétine est déjà connue dans le genre [Umadevi 1991,
Bates-Smith 1959].
Issu de l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme de laque jaune (20 mg), son
comportement chromatographique laisse supposer un flavonoïde glycosylé. La fluorescence
sous UV à 366 nm en violet sombre suggère une position 3 substituée [Mabry 1970].
126
moins déblindé et se retrouve plus proche de H-6’ (δ 7,24 ppm, dd, J = 8,4 et 2,2 Hz, 1H)
(Tableau 26 p 123).
OH-7 Rha-6
OH-5
H-2’ H-8
H-6’ H-6
OH
H-5’ Rha-1 Rha-4 Rha-5
OH
Rha-3
Rha-2
Cette perturbation est due à la fixation en 3 d’un glycosyle et, comme attendu, nous
n’observons plus le proton de l’hydroxyle en 3. Cette unité osidique est confirmée par son
proton anomérique à 5,24 ppm (Rha-1, d, J = 1,1 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4 et 3
ppm et un méthyle doublet à 0,81 ppm (Rha-6, d, J = 5,5 Hz, 3H). Les différentes constantes
de couplage indiquent qu’il s’agit de l’α-rhamnose (Tableau 26 p 123).
13
Le spectre C confirme, avec ses 21 carbones, le rhamnose et la présence de la
quercétine comme génine (Tableau 27 p 123). Les carbones C-2 et C-4 en alpha du C-3 sont
plus déblindés que pour la quercétine, alors que ce dernier est plus blindé, indiquent la fixation
en 3 du rhamnose sur une génine de type quercétine.
127
C-3’ C-2’ Rha-2
C-5’
C-4’ Rha-3
Rha-5
C-5
Rha-1
C-6’ C-8 Rha-4
C-7 C-1’
C-2 C-3
C-6
C-10 Rha-6
C-4
C-9
Ces données spectrales sont en accord avec la littérature [Harborne 1982] et nous
permette d’identifier Flav-3 comme étant la quercitrine :
OH
3'
OH
HO O
O
5
OH O 1''
OH
OH
O
OH
CH3
6''
Ce composé est nouveau dans le genre bien que très répandu dans le règne végétal.
C’est le deuxième flavonol glycosylé isolé des Leea après son homologue la myricitrine ou 3-
O-rhamnosyl-myricétine [Yem Yok Siv 1971]
Plus polaire que Flav-3, ce composé isolé des extraits à l’acétate d’éthyle, et
butanolique a été isolé sous forme de laque jaune (30 mg). Le spot de Flav-4 sur CCM a
128
tendance à « traîner ». Il est aussi violet foncé sous UV à 366 nm, ce qui est significatif d’une
substitution en 3.
Le spectre de masse haute résolution enregistré avec la technique FAB– sur le pic
pseudo-moléculaire à m/z 527 [M-H]– a permis de déterminer la formule moléculaire comme
étant C21H20O14S. Le fragment à m/z 447 correspond à la perte d’un groupe sulfate alors que le
pic à m/z 300 indique les pertes d’un groupe sulfate et d’une unité desoxyhexosyl (Tableau 29
p 124). Il est bien établi qu’en technique FAB négative, nous observons ces fragmentations
typiques des flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a].
[M-SO3-Rha-H]-
[M-H]-
[M-SO3-H]-
[Mabry 1970] (Tableau 28 p 124). L’addition d’HCl entraîne un déplacement bathochromique
[Barron 1988a, 1988b].
Par ailleurs, le fort effet bathochrome de 50 nm sur la bande I avec la base NaOMe indique
clairement que l’hydroxyle en 4’ est libre. L’ajout de H3BO3 après NaOAc ne change rien et
montre que la position 3’ est bien substituée [Mabry 1970].
129
Sur le spectre RMN 1H on observe les 5 protons aromatiques relatifs au flavonol
tétrasubstitué entre 6 et 8 ppm, ainsi que les protons osidiques de 5,2 à 0,81 ppm avec, entre
autres le proton anomérique Rha-1 à δ 5,2 et le groupe méthyle sous forme de doublet à δ 0,80
caractéristiques d’un α-rhamnopyranosyl (Tableau 26 p 123). Ceci est confirmé par
l’expérience COSY qui attribue totalement les protons osidiques.
Rha-6
Rha-4
H-5’ H-8 Rha-3 Rha-5
H-2’ Rha-1
H-6
OH-5
H-6’
Rha-2
OH-7 OH-4’
La présence du sulfate en 3’ influence les protons en ortho et meta, qui sont plus
déblindés que dans la quercitrine. Notons qu’il y a aussi absence du signal du OH-3’ et que, par
rapport à la quercitrine (Flav-3), les protons aromatiques du cycle A et les protons osidiques ne
sont pas influencés.
D’ailleurs, les déplacements chimiques en 13C des 6 carbones osidiques sont en accord
avec ceux de Flav-3 : 1 carbone anomérique à δ 102,0, 4 carbones osidiques entre δ 71,4 et
70,1 et le méthyle à δ 17,4. Les 15 autres carbones sont comparables à ceux de la génine, avec
pour seules différences significatives, les déplacements chimiques des carbones du noyau B
(Tableau 27 p 123).
130
Rha-2
C-7
C-2’ Rha-3 Rha-5
C-5
C-1’ C-8
C-4’
C-6’ Rha-1
C-5’ Rha-6
C-3’
Rha-4
C-6
C-2
C-4
C-9 C-3
C-10
Ces variations sont connues, et sont attribuées à la présence du groupe sulfate qui
provoque un blindage du carbone qui le porte (C-3’) et un déblindage des carbones ortho (C-2’
et C-4’). Cet effet étant moindre pour les carbones en meta (C-1’ et C-5’) [Barron 1986,
1987a et 1988a].
131
Rha-6
Rha-4, Rha-5
Rha-3
Rha-2
Rha-1
H-6-C-6
H-8-C-8
H-5’-C-5’
H-6’-C-6’
H-2’-C-2’
L’expérience COLOC quant à elle avec ces couplages longues distances à travers 2 ou
3 liaisons, confirme l’attribution des carbones protonés et des carbones quaternaires,
« noyaute » la structure, et surtout, précise la fixation d’un rhamnopyranosyl en position 3 par
la tache de corrélation 3JH-1’’-C-3.
L’expérience COSY comme nous l’avons dit, présente les trois systèmes de spins bien
distincts de la molécule.
132
H-2’ H-6’ H-5’ H-8 H-6 Rha-1 Rha-2 Rha-3 Rha-4 Rha-6
Rha-5
Rha-6
Rha-4
Rha-5
Rha-3
Rha-2
Rha-1
H-6
H-8
H-5’
H-6’
H-2’
3'
OH
HO O
O
5
OH O 1''
OH
OH
O
OH
CH3
6''
Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. C’est aussi la première
fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la famille des Leeaceae [Op de Beck
1998].
133
V- Identification de Flav-5
C’est une laque jaune (20 mg) isolée de l’extrait butanolique et retrouvée également
dans l’extrait aqueux. Produit très polaire, il montre sur CCM toutes les caractéristiques d’un
flavonoïde sulfaté. Il « traîne » sur CCM et semble sous UV être substitué en 3.
[M-SO3-H]-
[M-2SO3-H]-
[M-SO3+Na-2H]-
[M+Na-2H]-
[M-H]-
Cette filiation est confirmer par une expérience SM/SM où l’on observe la cascade de
désulfatation successive.
Pour les spectres UV, l’addition des différents réactifs et l’analyse des résultats obtenus
permettent de conclure à un flavonol tétrasubstitué [Mabry 1970] (Tableau 28 p 124). Le
déplacement bathochromique de 7 nm par l’ajout d’une base faible (NaOAc) montre bien que
l’hydroxyle en 7 est libre, alors qu’après l’addition d’une base forte (NaOMe) le déplacement
134
bathochromique de 56 nm indique que l’hydroxyle en 4’ est libre [Mabry 1970]. L’ajout d’HCl
conduit à un déplacement bathochromique de 27 nm, significatif d’une substitution en 3 et 3’
par des groupements sulfates [Barron 1987b, 1988b].
Sur le spectre RMN 1H, les 5 protons aromatiques du noyau quercétine sont visibles
(Tableau 26 p 123). Les protons H-6 et H-8 ont bien le même déplacement chimique que ceux
de la quercétine alors que H-2’ et H-6’ sont déblindés. Cela est dû à la présence des groupes
sulfates.
H-5’
H-8 H-6
H-6’
H-2’
De même, sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables,
avec, comme pour Flav-4, des variations provoquées par les groupements sulfates en 3 et 3’.
135
C-1’
C-5’ C-8
C-6
C-3’
C-6’
C-5
C-7 C-9
C-2’
C-4 C-2
C-4’ C-10
C-3
3' OH
HO O
3 OSO3-
5
OH O
Ce composé rare est isolé pour la deuxième fois du règne végétal, puisque déjà isolé de
Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b].
136
VI- Identification de Flav-6
Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (6 mg) à partir des extraits
butanolique et aqueux. Tout comme Flav-5, il s’agit d’un flavonol polysulfaté, celui-ci étant
plus polaire.
[M-3SO3-H]-
[M+2Na-3H]-
[M-2SO3-H]- [M-SO3+K-2H]-
[M+Na-2H]-
[M+2K-4H]-
[M-H] -
[M-SO3-H]- [M+3K-4H]-
137
protons du noyau B (H-2’, H-5’ et H-6’) sont fortement déblindés par la présence des groupes
sulfates tout comme Flav-5 (Tableau 26 p 123).
H-6
H-8
H-2’ H-5’
H-6’
Sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables (Tableau 27 p
123). Là aussi, les variations sont dues aux trois groupes sulfates en 3, 3’ et 4’, groupements
électroattracteurs.
138
C-5
C-1’ C-2’
C-7 C-9
C-4’ C-5’
C-3’ C-6
C-10 C-8
C-6’
C-4 C-2
C-3
3'
OSO3-
HO O
3 OSO3-
5
OH O
Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. Il est le troisième
flavonoïde sulfaté isolé chez Leea.
Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (3 mg) à partir de l’extrait
dichlorométhane. Son comportement chromatographique rappelle un flavonol glycosylé
comme Flav-3.
Le spectre de masse en DCI confirme cette hypothèse. Nous avons en effet en plus du
pic pseudomoléculaire à m/z 479 [M+H]+, un fragment dû à une perte d’un groupement
desoxyhexosyl à m/z 333 [M-146+H]+. Ce glycosyl est aussi mis en évidence par le pic à m/z
164 [Rha-H2O+NH4]+.
139
L’analyse des spectres UV confirme le squelette de type flavonol hexahydroxylé
(Tableau 28 p 124). La bande I à λMeOH à 337 nm confirme comme pour Flav-3, la fixation du
glycosyl en position 3. Mais contrairement à celui-ci, l’ajout de base indique que l’hydroxyle en
4’ n’est pas libre. De plus, l’ajout de H3BO3 à NaOAc ne modifie pas le spectre et montre que
nous n’avons pas de système ortho-dihydroxyl sur le cycle B [Mabry 1970].
Le spectre RMN 1H dans le DMSO-d6 est comparable une nouvelle fois à Flav-3 avec
en plus, un méthoxy à 3,72 ppm (s, 3H, 4’-OMe). Les deux protons du cycle A à δ 6,20 (H-6,
d, J=2 Hz) et δ 6,37 (H-8, d, J=2 Hz) sont identiques à ceux de Flav-3 (Tableau 26 p 123).
Seuls changent les protons du cycle C. L’apparition du singulet à δ 6,82 (H-2’ et H-6’, 2H)
montre la symétrie du cycle B et donc la fixation du méthoxy en position 4’. Notons qu’un
méthoxy fixé en 3’ entraîne deux signaux bien distincts pour H-2’ et H-6’ comme dans la
larycitrine par exemple [Hoffmann-Bohm 1992]. Le proton anomérique à 5,13 ppm (Rha-1, d,
J=1,5 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4,1-3,0 ppm et un méthyl doublet à 0,79 (d, J=5,4
Hz, 3H) sont comparables à ceux de Flav-3 et appartiennent à l’α-rhamnose.
H-2’ 4’-OMe
H-6’
Rha-3
Rha-4
OH-3’ Rha-5
OH-5’
OH-5 140
Le spectre 13C obtenu dans CD3OD permet d’attribuer notre produit à une génine myricétine
qui a, en position 3, la fixation d’un rhamnose et en position 4’, la présence d’un méthoxy à δ
60,9 ppm [Noreen 1998] (Tableau 27 p 123). Ce déplacement est significatif d’une fixation en
4’ [Agrawal 1989], alors qu’une fixation en 3’ comme pour la larycitrine, aurait entraîné un
signal plus blindé vers 56 ppm [Guo 1998].
Nos données spectrales sont comparables avec celles de la littérature (UV [Gabetta
1973, Jay 1978], RMN 1H [Hoffmann-Bohm 1992], RMN 13C [Noreen 1998]) aussi, nous
pouvons conclure à l’identification de Flav-7 à la méarnsitrine ou 4’-méthoxy-myricétrine.
OH
OMe
4'
HO O
OH
3
O
OH O
OH
OH
O
OH
CH3
Ce flavonol glycosylé et méthoxylé est rare dans le monde végétal, et est nouvellement
identifié dans la famille Leeaceae. Il a été isolé la première fois de chez Acacia mearnsii
(Fabaceae) [Mackenzie 1969].
141
Tableau 26 : RMN 1H des flavonoïdes (200 MHz, DMSO-d6)
Protons Kaempferol Quercétine Quercitrine Méarnsitrine Quercitrine Quercétine Quercétine
-3’-sulfate -3,3’-disulfate -3,3’,4’-trisulfate
H-6 6,18 6,17 6,20 6,20 6,20 6,16 6,16
d (1,9) d (1,6) d (2,0) d (2,0) d (2,1) d (2,1) d (2,0)
H-8 6,43 6,40 6,38 6,37 6,39 6,39 6,33
d (2,0) d (1,7) d (2,0) d (2,1) d (2,0) d (2,1) d (2,0)
H-2’ 8,03 7,66 7,29 6,82 7,76 7,85 8,12
dd (2,6, 8,9) d (1,8) d (1,9) s d (2,0) d (2,1) d (2,2)
H-3’ 6,91
dd (2,7, 8,9)
H-5’ 6,9 6,87 6,86 6,96 6,87 7,59
dd (2,7, 8,9) d (8,5) d (8,3) d (8,1) d (8,7) d (8,9)
H-6’ 8,03 7,53 7,24 6,82 7,52 8,04 8,03
dd (2,6, 8,9) dd (8.4, 2,0) dd (2,2, 8,4) s dd (2,3, 8,5) dd (2,3, 8,6) dd (2,2, 8,9)
OH-3 10,06 9,55
OH-5 12,46 12,46 12,64 12,56 12,59
OH-7 10,73 10,76 10,83 10,83
OH-3’ 9,26 9,29 9,46
OH-4’ 9,33 9,30 9,66 9,62
Rha-1 5,24 5,13 5,20
d (1,1) d (1,5) sl
Rha-2 3,96 3,98 3,98
sl sl sl
Rha-3 3,50 3,5-3,0 3,55
dd (3,1, 8,6) nd m
Rha-4 3,29-3,21 3,5-3,0 3,1
nd nd nd
Rha-5 3,21-3,08 3,5-3,0 3,0-3,3
nd nd nd
Rha-6 0,81 0,79 0,80
d (5,5) d (5,4) d (5,7)
4’-OMe 3,72
s
142
Tableau 28 : UV des flavonoïdes avec λmax dans MeOH
Flavonols bande MeOH +NaOAc +NaOAc +NaOMe +AlCl3 +AlCl3 +HCl
+H3BO3 +HCl
Kaempferol II 265 274 269 278 268 268,5 -
I 365 302,5, 389 375 415 352, 427 350,5, 427
déc
Quercétine II 255 267,5 259 252 271 268
I 369 322,5, 389,5 386 325 339, 456 365, 429
déc déc
Quercitrine II 255 270,5 259,5 269,5 273,5 270 255
I 347,5 369 365 388,5 383, 429,5 399,5 350
Méarnsitrine II 263 271,5 264 272 272,5 273
I 337,5 360 330 361 300s, 337, 391 338,5, 389
Quercitrine II 265 268 269 272 273 274 256
-3’-sulfate I 342 344 342 324, 392 357, 395 341, 389,5 355
Quercétine II 268 275 268 275 276 277 255
-3,3’-disulfate I 342 307s, 387 349 328s, 398 308s, 364, 396s 349, 395s 369
Quercétine II 268 275 268 276 279 277 325
-3,3’,4’-trisulfate I 311 356 313 360 307s, 389 337 368
déc=décomposition
[M+K-2H]– 499
[M+2K-3H]– 617
[M+3K-4H]– 655
[M-Rha-H]– 301
[M-SO3-Rha-H]– 300
[M-SO3+K-2H]– 499
[M-SO3+Na-2H]– 403
143
C- Etude de composés divers
I- Identification de Ac Ph-1
Ce composé a été isolé dans l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme d’aiguilles
blanches. Sur CCM, après pulvérisation à l’acide, il développe une coloration bleue qui vire au
violet.
En DCI, l’adduit à m/z 188 [M+NH4]+ et le pic pseudo-moléculaire à m/z 171 [M+H]+
permettent de déduire un PM de 170 et par conséquent une formule brute de C7H6O5 (5
insaturations ou cycles). On retrouve aussi un pic dû la perte d’un hydroxyle à m/z 153 [M-
H2O+H].
Le spectre 1H révèle un seul singulet aromatique à 7,05 ppm (H-2 et H-5, s), révélateur
de la symétrie de la molécule.
Cette même symétrie entraîne sur le spectre 13C, l’apparition de 5 carbones seulement,
dont la fonction acide libre à δ 170,4 (C-1’) et 4 carbones aromatiques à δ 146,4 (C-3 et C-5),
δ 139,6 (C-4), à δ 122,0 (C-1, Q) et à δ 110,3 (C-2 et C-6, 2 CH).
C-2
C-6
C-3
C-5
C-1’
C-1
C-4
144
Ces données sont en accord avec la littérature [Aldrich 1993], et nous permettent
d’identifier Ac Ph-1 à l’acide gallique :
1'
COOH
HO OH
4
OH
Composé très courant, il est déjà répertorié dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith
1959, Yem Yok Siv 1971, Hegnauer 1990].
La formule brute de C9H10O5 est suggérée par l’ion moléculaire à m/z 198 [M]+ en EI
(5 insaturations ou cycles). Le pic à m/z 170 est obtenu après la perte d’un radical éthoxy
(C2H5+). Celui à m/z 153 correspond à la perte du groupe ester COOEt.
Par ailleurs, en plus du singulet aromatique caractéristique à δ 7,01 (H-2 et H-6, s, 2H),
on retrouve sur le spectre 1H, le système classique d’un groupe éthoxy : un quadruplet à δ 4,24
(H-2’, q, J = 7 Hz, 2H) et un triplet à δ 1,31 (H-3’, t, J = 7 Hz, 3H).
145
H-2
H-6
H-3’
H-2’
13
Sur le spectre C, hormis les signaux phénoliques du gallate (Tableau 30), nous
n’observons plus de fonction acide libre (170 ppm), mais plutôt un carbone caractéristique
d’une fonction ester à δ 168,6 (C-1’) et les deux carbones de la chaîne éthoxy à δ 61,7 (C-2’)
et δ 14,6 (C-3’).
HO OH
4
OH
146
III- Identification de AG-1
Isolé sous forme d’huile blanche (50 mg), AG-1 est issu de l’extrait au
dichlorométhane.
Le spectre EI présente le pic moléculaire à m/z 256 [M]+ confirmant la formule brute
C16H32O2 (1 insaturation ou cycle). On observe une cascade de coupures radicalaires dues à des
pertes successives de 14 uma correspondant à un CH2 comme C3H7+, C4H9+, C5H11+, etc. Cela
confirme par ailleurs la structure linéaire d’une chaîne grasse [McLafferty 1980].
[M]+
Cette chaîne est de nouveau mise en évidence par l’allure générale du spectre 1H, où
seuls les protons en alpha de la fonction acide à δ 2,33 (H-2, t, J = 7,3 Hz, 2H) sont bien
distincts. Puis le groupe des CH2 et le méthyle de fin de chaîne sont observés respectivement
entre 1,7-1,0 ppm et à δ 0,86 (H-16, t, J = 7 Hz, 3H).
147
Cette chaîne aliphatique entraîne une mauvaise résolution du spectre 13C, où les signaux
de la plupart des carbones se trouvent concentrés entre 29,7 et 29,1 ppm. Néanmoins, le
carbone quaternaire de la fonction acide résonne à δ 175,6 (C-1) ppm, le méthyle à δ 14,1 (C-
16), le CH2 en alpha de la fonction acide à δ 33,7 (C-2) et celui en alpha du méthyle à δ 24,7
(C-15).
1 O
16
Cet acide gras fait partie des constituants les plus majoritaires obtenus par
hydrodistillation.
148
Chapitre IV - Activités Biologiques
I Introduction
L’effet d’un composé sur la viabilité cellulaire peut être étudié in vitro sur culture
cellulaire à l’aide de plusieurs techniques comme l’inclusion de colorants vitaux ou la
métabolisation de réactifs par les cellules vivantes. Parmi ces méthodes, nous avons employé la
technique de métabolisation d’un sel de tétrazolium, le XTT.
Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique du XTT, en un produit
coloré, le formazan. Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules
vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé
hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrométrie à 450 nm.
NO2
SO3
NO2
H3CO
H3CO SO3 NH SO3
N N N
H H
N C N C C N N NO2
O N N Transformation par O
les cellules viables H3CO
H3CO SO3
NO2
XTT Formazan
149
Nous nous sommes proposés de tester les extraits EtOAc, BuOH et H2O à l’aide du
test du XTT, sur une microplaque, afin d’estimer la population cellulaire vivante, après
l’application durant 48 heures de diverses concentrations de produit.
II Résultats
Tableau 31 : Taux de viabilité des kératinocytes en culture après 48H d’incubation avec les extraits
Viabilité cellulaire
Concentrations Extrait Extrait Extrait
EtOAc BuOH H2 O
150
0.01 µg/ml
0.1 µg/ml
1 µg/ml
10 µg/ml
100 µg/ml
0.01 µg/ml
0.1 µg/ml
1 µg/ml
10 µg/ml
100 µg/ml
0.01 µg/ml
0.1 µg/ml
1 µg/ml
10 µg/ml
100 µg/ml
20
10
0
-10
% d’activité
-20
-30
-40
-50
-60
-70
-80
Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des kératinocytes humains SVK14
en culture pendant 48H
III Conclusion
151
B Activité du palmitate de β-amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur
la production de prostaglandines 6KF1α.
I Introduction
Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à une prostaglandine particulière, la
PG6KF1α qui est un des métabolites majeurs produits par le kératinocyte stimulé, et
représentatif de la modulation de la production des métabolites de l'acide arachidonique issus
de la voie de la cyclo-oxygénase.
Nous avons ainsi évalué l'activité de trois extraits et d’un composé purifié majoritaire
de l’extrait hexanique :
152
II Résultats
Tableau 32 : Production de prostaglandines 6KF1α après 5 heures de culture avec le palmitate de β-amyrine
TRAITEMENTS pg PG6KF1α / 1x106 % Activité/
kératinocytes/ml A23187
Témoin n =3 32 + 4 -
A23187 5µM n =3 182 + 25 -
Palmitate de β-amyrine 10µg/ml n =3 130 + 5 *** -28%
+A23187 5µM
Palmitate de β-amyrine 50µg/ml n =3 116 + 7 *** -36%
+A23187 5µM
Palmitate de β-amyrine 100µg/ml n =3 96 + 3 *** -47%
+A23187 5µM
*** = Valeurs significativement différentes, au seuil 0,05, du témoin A23187.
153
Pg PG6KF1α/.106 kératinocytes/ml
180
160
Pg PG6KF1α/.106 kératinocytes/ml
140
120
100
80
60
40
20
0
Témoin
5 µM
A23187
0.1 µg/ml
1 µg/ml
5 µg/ml
0.1 µg/ml
1 µg/ml
5 µg/ml
0.1 µg/ml
1 µg/ml
5 µg/ml
EtOAc BuOH
H2O
Figure 71 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par les
kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM.
154
III Conclusion
Cette activité sur les collagénases mérite d’être rechercher pour le palmitate de β-
amyrine.
155
C Activité du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la
métalloprotéinase MMP-1
I Introduction
Les métalloprotéinases (MMPs) sont des enzymes impliquées dans tout processus
normal ou pathologique de remodelage de la matrice extracellulaire. Leurs principales
fonctions concernent leur capacité à dégrader les composants de la matrice. Elles permettent
aussi le détachement des cellules de leur support, la libération et l’activation de cytokines
inflammatoires et de facteurs de croissance. Les métalloprotéinases de la matrice sont classées
selon la nature de la matrice extracellulaire qu’elles dégradent, en collagénases, gélatinases ou
stromélysines. Les collagènes fibrillaires sont dégradés, entre autres, par la collagénase
interstitielle exprimée par les fibroblastes dermiques et sécrétés dans la matrice extracellulaire
du derme. Dans le système cutané, l’expression basale des MMPs est relativement faible mais,
est, par contre, induite à la suite d’exposition à divers stimuli comme certaines cytokines,
certains facteurs de croissance (IL1, IL6, TNFα) ou une exposition UV.
Dans la présente étude, nous avons suivi, par la technique de Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) semi-quantitative, l’expression de l’ARN messager de la
collagénase MMP-1, dans un modèle cellulaire in vitro de fibroblastes humains normaux,
soumis à une stimulation inflammatoire chimique, au "Phorbol Meristate Acetate" (PMA).
Nous avons montré précédemment que le palmitate de β-amyrine, présente une activité
anti-inflammatoire significative, en régulant le métabolisme de l’acide arachidonique. Dans
cette étude, nous avons évalué le pouvoir inhibiteur du palmitate de β-amyrine, sur
l’induction de l’ARN messager de MMP-1, suite à une stimulation inflammatoire.
156
II Résultats
Figure 72 : Effet du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1 à la suite d’une
stimulation inflammatoire
Les différents taux d’expression des ARNm de la MMP-1 selon les traitements, sont
représentés sur la figure ci-dessus. Il s’agit d’une observation semi-quantitative.
Le niveau basal d’expression de l’ARNm de la MMP-1 est relativement faible. Sous
stimulation inflammatoire au PMA, nous pouvons observer une induction du taux d’ARNm.
Dans ces conditions expérimentales de préincubation de 24 heures, le palmitate de β-
amyrine ne présente aucun effet.
III Conclusion
Cette étude in vitro montre que le palmitate de β-amyrine ne semble pas agir
significativement sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 à la suite d’une
stimulation inflammatoire.
157
D Activité antiradicalaire des extraits EtOAc, BuOH et H2O et des composés
phénoliques
I Introduction
Les radicaux libres sont présents dans le monde vivant, où ils sont associés au
métabolisme de l’oxygène et aux réactions d’oxydoréduction.
En général, les radicaux sont piégés par des systèmes enzymatiques tels que superoxyde
dismutase, catalase ou glutathion peroxidase.
Le DPPH est un radical stable qui présente une absorbance caractéristique entre 500 et
560 nm (violet). Cette couleur violette, disparaît rapidement quand le DPPH rencontre un
piégeur de radicaux libres et devient alors jaune.
158
O2N
N
N
NO2
O2N
Structure du DPPH
II Résultats
L’activité antiradicalaire est exprimée par le pourcentage de DPPH dégradé. Celle-ci est
évaluée par comparaison de la Densité Optique (DO) de l’échantillon avec celle de
l’échantillon standard mesurée dans le MeOH :
Tableau 34 : Pourcentage de dégradation du DPPH par les composés testés en microplaque 96 puits :
Concentrations
Composés CI50 (µM) 2 µM 10 µM 50 µM 100 µM 200 µM
Trolox (témoin positif) 100
Kaempferol 120 0 0 19 41 90
Quercétine 49 0 7 51 91 94
Quercitrine 88 0 7 29 57 84
Quercitrine 3’-sulfate >>200 0 0 0 2 6
Quercétine 3,3’-disulfate >>200 0 0 0 2 10
Quercétine 3,3’,4’-trisulfate 150 1 2 20 30 70
Acide gallique 35 4 16 67 90 92
Gallate d’éthyle 67 0 7 39 72 92
159
80
75 74
69
70 67
Rutine
60 Extrait EtOAc
Extrait BuOH
% de dégradation du DPPH
50 Extrait H2O
Acide gallique
40
30
20
20
10
0
Echantillons testés à 20mg/L
100
% de dégradation du DPPH
Trolox
Kaempferol
75 Quercétine
Quercitrine
Tro
lox 50 Quercitrine 3'-sulfate
Quercétine 3,3'-disulfate
Quercétine 3,3',4'-trisulfate
25
Acide gallique
Gallate d'éthyle
0
0 50 100 150 200 250
Concentration (µM)
160
La majorité des composés sont plus actifs que le Trolox.
Le kaempferol, avec un hydroxyl en 4’ sur le cycle B, est moins actif que le Trolox
alors qu’un système ortho-dihydroxyl sur le cycle B (la quercétine), permet une meilleure
activité antiradicalaire.
Mais la glycosylation sur la position 3 diminue cet effet (la quercitrine), et l’annule
quand on perturbe le système ortho-dihydroxyl 3’,4’ (quercitrine 3’-sulfate, quercétine
3,3’-disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate). Notons que l’on retrouve une légère activité avec
le flavonoïde trisulfaté. L’activité observée est un artefact. En effet, l’analyse sur CCM montre
que le dérivé trisulfaté s’est hydrolysé en partie en quercétine. On retrouve donc le système
ortho-dihydroxyl sur le cycle B responsable de cette activité.
Cela tend donc à montrer que la présence du système ortho-dihydroxyl sur le cycle B et
l’hydroxyle libre en 3 sont nécessaires pour avoir une forte activité antiradicalaire.
Quant aux acides phénoliques, c’est l’acide gallique qui est le plus actif. La présence de
la chaîne éthoxy dans le gallate d’éthyle réduit de moitié son activité antiradicalaire.
III Conclusion
L’étude montre que les trois extraits EtOAc, BuOH, H2O ont une activité
antiradicalaire. Hormis les flavonoïdes sulfatés, cette activité se retrouve dans la plupart des
composés isolés de ces mêmes extraits. Ainsi, l’acide gallique, la quercétine, le gallate
d’éthyle, la quercitrine et le kaempferol ont une activité antiradicalaire.
Cette activité est à rapprocher d’une éventuelle activité antiinflammatoire. En effet,
l’activité antiradicalaire, en piégeant les radicaux libres, est fortement impliquée dans les
sulfatés non actifs ici [Yagi 1994].
161
Discussion
162
DISCUSSION
Deux méthodes ont été utilisées pour l’étude phytochimique de Leea guineensis G.
Don (Leeaceae).
La première est l’hydrodistillation. Elle a permis d’identifier 47 composés des distillats
de feuilles, et 43 composés des distillats de bois, ainsi que 4 acides gras, soit au total 73
composés. Nous avons montré que la classe la plus représentative des distillats de bois et de
feuilles était celle des hydrocarbures (60% et 45 % respectivement) essentiellement dû au fort
taux d’acides gras et d’esters. Pour les feuilles, la fraction la plus importante est tout de même
celle des terpénoïdes (54%), où l’on rencontre un composé peu commun : le vitispirane.
La seconde a consisté en l’extraction et en l’isolement des composés à partir des
extraits héxanique, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles. Elle a
conduit après fractionnement sur différents supports chromatographiques à l’isolement de 17
composés qui se répartissent dans quatre classes que sont : les terpènoïdes (7), les flavonoïdes
(7), les acides phénols (2) et les acides gras (1).
Si un bon nombre de ces composés identifiés sont connus (kaempferol, quercétine,
quercitrine, acide gallique, E-phytol, squalène, lupéol, β-amyrine), ceux-ci, du point de vue
chimiotaxonomique, sont intéressants.
Chimiotaxonomie
Quatre composés sont déjà connus chez les Rhamnaceae et les Vitaceae. Il s’agit du
kaempferol, de la quercétine, de la quercitrine et de l’acide gallique. Le rapprochement des
Leeaceae des Vitaceae semble justifier par l’existence de composés rares comme le vitispirane,
provenant de l’hydrodistillation, et de raphides (oxalate de calcium). Quant à la distinction
entre les Leeaceae et les Vitaceae, celle-ci pourrait s’expliquer par le fait que l’on retrouve
chez les Leeaceae à la fois des triterpènes à noyaux lupanes, oléananes et ursanes et qu’ils
peuvent être acylés. A notre connaissance, il n’est pas répertorié de noyau lupane chez les
Vitaceae, ni de triterpène acylé. Les Rhamnaceae produisent pour leur part, des triterpènes
majoritairement à noyaux lupanes et dammaranes [Hegnauer 1973]. La présence de
flavonoïdes sulfatés est aussi un argument en faveur de la séparation actuelle des Leeaceae des
Vitaceae, (même si, nous l’avons vu, leur répartition fait plus référence à la nature du biotope).
163
Pour répondre à cette hypothèse, une étude plus vaste, sur d’autres Leea d’Asie et d’Afrique
semble indispensable. Elle permettrait de savoir si la famille possède ou non des flavonoïdes
sulfatés, et si c’est le cas, on pourra peut-être parler de traceur chimiotaxonomique spécifique
pour les Leeaceae.
Il nous paraît intéressant de recenser les activités des composés isolés au travers des
publications de ces dernières années. Ceci pour deux raisons. La première permet en
connaissant les activités biologiques des composés de comprendre les différentes utilisations de
la plante en médecine traditionnelle. La seconde est de montrer que de petites biomolécules
peuvent être douées de propriétés intéressantes (acide gallique par exemple).
Il serait certes prématuré de relier les activités potentielles des extraits ou des
métabolites purifiés à l’utilisation traditionnelle de Leea guineensis, mais bon nombre de ces
composés ont des activités qui recoupent le champ d’application de cette plante en
ethnopharmacologie, notamment dans les domaines anti-inflammatoire ou cardiovasculaire.
164
Tableau 36 : Liste des terpénoïdes et de leurs propriétés biologiques
Nouveau dans
Composés Propriétés biologiques
Famille Règne
végétal
E-phytol Antibactérienne [Rajab 1988]
Anti-inflammatoire [Shimizu 1994]
Antispasmodique [Pongprayon 1992]
Hypolipémiante [Watanabe 1983]
Squalène Antibactérienne,
Antitumorale,
Immunostimulante [Harborne 1999]
Chimiopréventive (cancers du colon) [Rao 1998]
Lupéol Cytotoxique pour les cellules tumorales HepG2, A431 et H
411E par inhibition de la topoisomérase II [Moriarity 1998]
Antitumorale contre le carcinome de Walker,
Antihypoglycémiante,
Hypotensive [Harborne 1999]
Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999]
Anti-inflammatoire [Geetha 1998, Akihisa 1996]
β-amyrine Aléxitérique [Pereira 1994]
Anti-inflammatoire [Harborne 1999, Akihisa 1996]
Palmitate Antidépressive et sédative [Kitada 1981, Subarnas 1992,
de β-amyrine 1993a-b]
Inhibiteur α1-adrénergique [Subarnas 1993c]
Palmitate Anti-inflammatoire et anti-arthritique [Kweifio-Okai 1993,
d’α-amyrine 1994a-b, 1995]
Pesticide inhibiteur de croissance [Shankaranarayana 1980]
Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999]
Mélange de Protecteur hépatique [Lin 1988]
palmitate d’α et de
β-amyrine
Coriolate Non déterminées
de β-amyrine
165
Tableau 37 : Liste des polyphénols et de leurs propriétés biologiques
Composés Nouveau dans Propriétés biologiques
Famille Règne
végétal
Kaempferol Anti-inflammatoire,
Antibactérienne,
Antimutagène,
Inhibiteur lipoxygénase,
Antiradicalaire [Harborne 1999]
Quercétine Comme le kaempferol mais plus actif
Antihépatotoxique,
Antivirale [Harborne 1999]
Aléxitérique [Pereira 1994]
Anti-inflammatoire [Robak 1996]
Vasorelaxante [Chen 1996]
Quercitrine Comme la quercétine
Inhibe l’aldose réductase (10-7M)
Antimutagène,
Anti-ulcéreuse [Harborne 1999]
Antidiarrhéique [Gálvez 1995]
Méarnsitrine Inhibe l’aldose réductase [Yoshikawa 1998]
Quercitrine Non déterminées
3’-sulfate
Quercétine Non déterminées
3,3’-disulfate
Quercétine Non déterminées
3,3’,4’-trisulfate
Acide gallique Antibactérienne,
Antivirale,
Antifongique,
Antitumorale,
Anti-anaphylactique,
Antimutagène,
Cholérétique,
Bronchodilatatrice,
Inhibe la dégradation de l’insuline,
Relaxante du muscle lisse,
Astringent [Harborne 1999]
Anti-inflammatoire,
Antimutagène,
Anticarcinogène [Kroes 1992]
166
Les terpénoïdes
Tous les composés de cette classe sont nouvellement identifiés dans la famille
Leeaceae.
Nous avons isolé, entre autres, le E-phytol, le squalène, le lupéol et la β-amyrine. Ces
composés sont très répandus dans le règne végétal.
Pour cela, nous discuterons essentiellement des triterpènes acylés que nous avons
isolés : le palmitate de β et d’α-amyrine et du coriolate de β-amyrine. On peut en effet se poser
la question de l’origine des triterpènes acylés. Sont-ils naturels ? Pour certains auteurs,
l’acylation d’alcools triterpéniques en présence de glycérides peut avoir lieu en milieu acide
donnant ainsi à ces composés une origine artefactuelle [Massiot 1996]. Ce n’est pas le cas ici,
car l’extraction à l’hexane ne fait pas intervenir d’acide. Par ailleurs, l’obtention de composés
sensibles à l’acide (flavonoïdes sulfatés) nous laisse penser qu’une augmentation de l’acidité au
cours du processus de séchage de la plante ou du mouillage de celle-ci avant extraction n’a pu
avoir lieu. D’autre part, dans le latex de différentes espèces d’Euphorbia (Euphorbiaceae), la
présence naturelle d’esters de triterpènes a été démontrée par une hypothèse biogénétique
[Warnaar 1987].
167
l'imipramine et la mianserine [Kitada 1981, Subarnas 1993b]. Ce composé possède des
propriétés sédatives justifiées par une action "mianserin-like" [Subarnas 1993b]. Pour préciser
son mode d’action, le palmitate de β-Amyrine a été testé en association avec d’autres
composés :
- phényléphrine (agoniste α1)
- clonidine (agoniste α2)
- apomorphine (agoniste dopaminergique)
- prazosine (antagoniste α1)
- yohimbine (antagoniste α2)
Il ressort de cette étude que le palmitate de β-amyrine se comporte comme un inhibiteur α1-
adrénergique [Subarnas 1993c].
Par ailleurs, dans ce groupe des triterpènes acylés, nous avons pu isoler le coriolate de
β-amyrine (Terp-6). Ce composé est nouveau dans le règne végétal, il n’a par conséquent pas
d’activité recensée. Cependant, l’acide coriolique isolé d’une culture de Pleurotus
pulmonarius possède une activité nématicide contre Caenorhabditis elegans (DL50 de 5-10
ppm) et antibactérienne contre Bacillus brevis et B. subtilis (CMI de 50 µg/ml et 100 µg/ml
168
respectivement) [Stadler 1994]. Il serait intéressant de savoir si le couplage β-amyrine et
coriolate potentialise cet effet, ou fait apparaître d’autres propriétés ?
Le coriolate ou acide (9Z, 11E)-13-hydroxy-9,11-octadécadiènoïque est un acide gras
assez répandu dans le règne végétal au même titre que l’acide dimorphécolique (9Z, 11Z)
[Rama Rao 1985, Tallent 1966]. Cependant, c’est la première fois que ce type d’acide gras est
fixé à un triterpène.
Les flavonoïdes
La classe des flavonoïdes, est une classe très importante dans la famille des Leeaceae.
Le kaempferol et la quercétine que nous avons isolés sont déjà répertoriés dans la
famille. Ils sont connus pour avoir sensiblement les mêmes activités. Bon nombre de
publications font état de leur activité antiradicalaire. Nous avons montré cette même activité
par le test au DPPH. Par ailleurs, ces composés sont impliqués dans les processus
antimutagène et anticarcinogène. Aussi, il est bon de se rappeler qu’ils sont retrouvés dans
notre alimentation, nous retrouvons par exemple la quercétine dans l’oignon (284-486 mg/kg),
le chou (110 mg/kg), et le kaempferol dans le chou (211 mg/kg) … [Hertog 1992].
169
Toutefois, le groupe le plus intéressant que nous avons rencontré reste celui des
flavonoïdes sulfatés. C’est la première fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la
famille des Leeaceae. Son biotope est un argument pour ce type de constituants. Rappelons
que notre échantillon provient d’une espèce qui pousse dans une forêt à raphiales
marécageuses ou périodiquement inondées du Cameroun.
La quercitrine 3’-sulfate et la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-4 et Flav-6) sont
recensées pour la première fois dans le règne végétal.
La quercitrine 3’-sulfate (Flav-4) a fait l’objet d’une publication [Op de Beck 1998].
Avec la 3-glucuronyl-3’-sulfate de quercétine isolé de Hypericum elodes (Guttifrae) [Seabra
1988], la quercitrine 3’-sulfate est le deuxième flavonoïde sulfaté en position 3’ et possédant
une unité osidique en 3. On ne recense d’ailleurs que 9 flavonols qui sont à la fois sulfaté et
glycosylé.
C’est aussi la deuxième fois que l’on rencontre la quercétine 3,3’-disulfate (Flav-5).
Celle-ci a été isolée de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b]. Les génines
disulfatées sont rares, on en dénombre 8, dont 3 sont sulfatées sur la quercétine en [3,7], [3,3’]
et [3,4’].
En ce qui concerne la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-6), son intérêt est lié à la
position de ces groupements sulfates. En effet, d’après la littérature, on recense que 7 flavonols
tri- ou tétra-sulfatés [Barron 1988a, Harborne 1994] (Tableau 10 p 45 ) :
- le kaempferol 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)),
- la quercétine 3,7,3’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),
- la quercétine 3,7,4’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),
- la quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),
- la quercétine 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),
- la rhamnétine 3’-glucuronique-3,5,4’-trisulfate (Tamarix aphylla (Tamaricaceae)),
- l’isorhamnétine 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)).
Notre composé doit son originalité à la position des groupements sulfates (3, 3’ et 4’).
Généralement, les flavonoïdes trisulfatés ont toujours la position 7 sulfatée et si ce n’est pas le
cas, cette position n’est pas libre mais est le plus souvent méthoxylée (rhamnétine). La
sulfatation s’effectuant dans l’ordre 3>>7>4’>3’pour les flavonols (et 7>>3’>4’>6>8 pour les
flavones) (Varin 1992a).
170
DPPH et sont en accord avec la littérature. Le système ortho-dihydroxyl libre sur le cycle B
ainsi que l’hydroxyl libre en 3 sont indispensables pour l’activité anti-radicalaire. Cependant,
ces flavonols sulfatés mériteraient d’être testés sur l’aldose réductase du cristallin ou sur la
xanthine oxydase, qui rappelons-le, sont fortement inhibés par ce genre de composés. Il
semblerait même que les données biologiques au sujet des flavonoïdes fassent plus référence à
leurs dérivés sulfatés. De plus, l’hydrosolubilité des flavonoïdes sulfatés est d’un grand intérêt
pour envisager des applications biologiques pour lesquelles le problème de solubilité est
souvent une barrière importante. Il convient par contre d’être séléctif sur les positions à
sulfater.
On retrouve particulièrement ces composés chez les Leea (nous avons recensé dans la
littérature les acides gentisique, p-hydroxybenzoïque, vanillique, syringique, protocatéchuique
et gallique). De ce fait, l’acide gallique a déjà été trouvé dans la famille, ce qui n’est pas le cas
pour le gallate d’éthyle.
Nous pourrions nous poser la question de savoir si ce dernier ne pourrait pas être un
artefact d’extraction ! En effet, l’extrait CH2Cl2 provient d’une extraction liquide-liquide contre
l’extrait hydroalcoolique de départ et obtenu à température ambiante (sur les feuilles
préalablement traitées à l’hexane et au dichlorométhane), puis concentré et lyophilisé.
171
Des travaux antérieurs ont montré que la formation de différents esters galliques peut
apparaître au cours du procédé d’extraction [Güven 1974]. Ainsi, en utilisant comme solvant
d’extraction l’éthanol, il y a formation de gallate d’éthyle, avec le méthanol, de gallate de
méthyle, et avec le propanol, de gallate de propyle.
L’analyse d’un extrait en CLHP couplée à la SM d’un extrait préparé à partir des
feuilles à l’aide d’un solvant approprié permettrait de lever ce doute.
Rappelons aussi, que les esters galliques sont utilisés depuis longtemps comme additifs
alimentaires. Ils servent d’agents antioxydants dans la prévention du rancissement des graisses,
il s’agit des additifs E310, E311 et E312 qui correspondent aux gallates de propyle, octyle et
lauryle respectivement.
Les extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux n’ont pas montré d’activité anti-
inflammatoire sur la voie des prostaglandines libérées par les kératinocytes. Mais d’après
l’usage en médecine traditionnelle et leurs fortes activités antiradicalaires, il serait intéressant
de poursuivre cette voie avec un modèle d’évaluation plus global. De même, la recherche de
l’activité cardiovasculaire est à rechercher.
Il apparaît aussi que les composés isolés ont contribué à l’étude phytochimique de la
famille. Il conviendrait cependant de faire une recherche plus large des constituants des
différentes espèces et partie de plante dans la famille des Leeaceae. L’étude des baies et des
fleurs pour rechercher la nature de leurs pigments ainsi que la recherche de flavonoïdes
sulfatés sont notamment à étudier.
172
Conclusion
173
CONCLUSION
Notre travail avait pour objet l’étude phytochimique et biologique de Leea guineensis
G. Don (Leeaceae).
Pour cela, un travail bibliographique a permis de situer la plante et la famille dans la
systématique moderne. Nous avons montré que les Leeaceae bien qu’ayant de très fortes
affinités avec les Vitaceae, ont suffisamment de caractères distinctifs pour être considérées
comme une famille monogénérique à part entière, elle-même appartenant à l’ordre des
Rhamnales.
Nous avons aussi pu remarquer que cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan
chimique que biologique. Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de
flavonoïdes, d’acides phénoliques et de tanins. L’utilisation en médecine traditionnelle montre
que le genre a des propriétés essentiellement calmante, astringente, anti-infectieuse, anti-
inflammatoire, antidysentérique et cardiovasculaire.
La découverte de flavonoïdes sulfatés dans Leea guineensis nous a conduit à effectuer
une mise à jour, et nous a permis de recenser, à ce jour, 134 flavonoïdes sulfatés, dont 32 sont
nouveaux dans le règne végétal, et d’ajouter 3 nouvelles familles renfermant ces produits.
Nos travaux personnels qui ont porté sur l’étude phytochimique et biologique de Leea
guineensis (Leeaceae) ont conduit à l’identification de 90 composés. 73 proviennent des
distillats de bois et de feuilles et 17 composés ont été isolés à partir des extraits hexanique,
dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles.
Ceux-ci ont été caractérisé par des analyses spectrales faisant appel au pouvoir
rotatoire, l’UV, la SM, et surtout la RMN 1D et 2D (COSY, COLOC, XHCORR).
On recense 7 terpénoïdes, 1 diterpène acyclique (E-phytol), 1 triterpène acyclique
(squalène), 2 triterpènes (lupéol et β-amyrine), 3 triterpènes acylés (palmitate et coriolate de β-
amyrine, palmitate d’α-amyrine), tous nouvellement recensés dans la famille.
A ceux-ci, s’ajoute 9 polyphénols, dont 2 flavonols (kaempferol, quercétine) déjà
connus dans la famille, 2 flavonols glycosilés (quercitrine, méarnsitrine) et 3 flavonoïdes
sulfatés (quercétine 3,3’-disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate, quercitrine 3’-sulfate)
nouveaux dans la famille ainsi que 2 acides phénols (acide gallique, gallate d’éthyle). Seul ce
dernier est nouveau dans la famille avec l’acide gras (acide palmitique).
174
3 composés sont isolés pour la première fois du règne végétal, ce sont le coriolate de β-
amyrine, la quercétine 3,3’,4’-trisulfate et la quercitrine 3’-sulfate. Ce dernier a fait l’objet
d’une publication [Op de Beck 1998].
En ce qui concerne les activités biologiques, nous avons montré que les extraits EtOAc,
BuOH et H2O des feuilles présentent une cytotoxicité à partir de 10 µg/ml sur la viabilité des
kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H, une forte activité antiradicalaire, mais
n’ont pas d’activité anti-inflammatoire significative sur la production de prostaglandines 6KF1
α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique. En revanche, le
palmitate de β-amyrine a, quant à lui, une activité anti-inflammatoire dose dépendante (47%
d’inhibition à 100 µg/ml), il régule le métabolisme de l’acide arachidonique, mais il ne semble
pas agir sur l’expression de l’ARNm de la collagénase MMP-1.
D’autre part, les flavonoïdes non sulfatés et les acides phénols sont de très bons
piégeurs de radicaux libres. Cette propriété en fait des candidats potentiels pour palier aux
problèmes impliqués dans le stress oxydatif (peroxidations lipidiques, vieillissement, désordre
cardiovasculaire, etc.).
175
Aussi, nos résultats, associés aux recherches antérieures, et l’intérêt croissant pour les
traitements utilisant la phytothérapie ces dernières années, ne peuvent qu’encourager à
poursuivre les investigations dans cette famille Leeaceae.
Cette famille mériterait bien de sortir des vrilles des Vitaceae !
176
Bibliographie
177
Bibliographie
Adjanohoun E.J., Aké Assi L., Chibon P., de Vecchy H., Duboze E., Eymé J., Gassita J.N.,
Goudote E., Guinko S., Keita A., Koudogbo B., Le Bras M., Mourambou I., Mve
Mengome E., Nguéma M.G., Ollome J.B., Posso P. and Sita P., in Médecine
traditionnelle et pharmacopée. Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques
au Gabon, Agence de Coopération Culturelle et Technique (A.C.C.T.), Paris, (1984), 22
23.
Adsersen A. and Adsersen H., Plants from Réunion Island with alleged antihypertensive and
diuretic effects an experimental and ethnobotanical evaluation, Journal of
Ethnopharmacology, (1997), 58, 189206.
Agrawal P.K., Carbon-13 NMR of flavonoids, in Studies in organic chemistry n° 39, Elsevier
Science Publishers, USA, (1989).
Aké Assi L., Abeye J., Guinko S., Giguet R. and Bangavou X., in Médecine traditionnelle et
pharmacopée. Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques en République
Centrafricaine, Agence de Coopération Culturelle et Technique (A.C.C.T.), Paris,
(1985), 1920.
Akihisa T., Yasukawa K., Oinuma H., Kasahara Y., Yamanouchi S., Takido M., Kumaki K.
and Tamura T., Triterpene alcohols from the flowers of Compositae and their anti
inflammatory effects, Phytochemistry, (1996), 43 (6), 12551260.
Aldrich library of 13C and 1H FT NMR spectra, vol. 1, Aldrich Chemical Compagny, USA,
(1993).
Ali A.M., Mackeen M.M., ElSharkawy S.H., Hamid J.A., Ismail N.H., Ahmad F.B.H. and
Lajis N.H., Antiviral and cytotoxic activities of some plants used in Malaysian indigenous
medicine, Pertanika J. Trop. Agric. Sci., (1996), 19 (2/3), 129136.
Barron D., Colebrook L.D. and Ibrahim R.K., An equimolar mixture of quercetin 3-sulphate
and patuletin 3-sulphate from Flaveria chloraefolia, Phytochemistry, (1986), 25 (7),
1719-1721.
Barron D. and Ibrahim R.K., Synthesis of flavonoid sulfates: I. Stepwise sulfation of positions
3,7 and 4’ using N,N’-dicyclohexylcarbodiimide and tetrabutylammonium sulfate,
Tetrahedron, (1987a), 43 (22), 5197-5202.
Barron D. and Ibrahim R.K., Quercetin and patuletin 3,3’-disulphate from Flaveria
chloraefolia, Phytochemistry, (1987b), 26 (4), 1181-1184.
178
Barron D., Advances in the phytochemistry, organic synthesis, spectral analysis and enzymatic
synthesis of sulfated flavonoids, Ph. D. Thesis, Concordia University, Montréal, (1987c).
Barron D., Varin L., Ibrahim R.K., Harborne J.B. and Williams C.A., Review, Sulphated
Flavonoids-An update, Phytochemistry, (1988a), 27 (8), 2375-2395.
Barron D. and Ibrahim R.K., Hydrochloric acid and aryl-sulphatase as reagents for UV-spectral
detection of 3- and 4’-sulphated flavonoids, Phytochemistry, (1988b), 27 (7), 2335-
2338.
Barron D. and Ibrahim R.K., Synthesis of flavonoid sulfates. III. Synthesis of 3’,4’-ortho
disulfates using sulfur trioxyde-trimethylamine complex, and of 3’-sulfates using aryl
sulfatase, Z. Naturforsch, (1988c), 43c, 631-635.
Behnke H.D. and Dahlgren R., The distribution of characters within an angiosperm system,
2. Sieveelement plastids, Bot. Notiser, (1976), 129 (3), 287296.
Bin Rahmani M., Kiew R., Lajis N. HJ., Othman R. and Toia R.F., A contribution to the
phytochemical survey of Peninsular Malaysia, Pertanika, (1985), 8 (3), 347357.
Blasco F., in Montagnes du sud de l’Inde: forêts, savanes, écologie, Tome X, Inst. fr.
Pondichery, Trav. Sec. sci. tech., Pondichery, India, (1971), 157159.
Blois M.S., Antioxydant determination by the use of a stable free radical, Nature, (1958), 181
(4617), 1199-1200.
Bouquet A. and Debray M., in Plantes Médicinales de la Côte d’Ivoire, travaux et documents
de l’O.R.S.T.O.M. N°32, O.R.S.T.O.M., Paris, (1974), 1516.
Brahman M. and Saxena H.O., Phytochemical screening of the plants of Gandhamardan hills
of Orissa (India) for tannins, saponins, flavonoids and alkaloids, Asian Jour. Pl. Sci.,
(1989), 1, 8992.
Brasseur T., Angenot L., Pincemail J. et Deby C., La troxérutine et la rutine sulfate sodique
possèdent-elles encore les propriétés de la rutine ?, Ann. pharm. Fr., (1987), 45 (4), 329-
334.
Breitmeier E. and Kelter W., Carbon-13 NMR spectroscopy, third ed., VCH, Weinheim,
(1990), 327.
179
Cadet T., in La végétation de l’Ile de la Réunion, Orphy, Livry, (1980).
Chen C.K., PaceAsciak C.R., Vasorelaxing activity of resveratrol and quercetin in isolated rat
aorta, Gen. Pharmac., (1996), 27 (2), 363366.
Chopra R.N., Nayar S.L. and Chopra I.C., in Glossary of Indian Medicinal Plants, Concil of
Scientific & Industrial Research, New Delhi, (1956), 151152.
Christow S., Luther H., Ludwig P., Gruner S. and Schewe T., Actions of gallic esters on the
arachidonic acid metabolism of human polymorphonuclear leukocytes, Pharmazie,
(1991), 46, 282283.
Corner E.J.H., in The seeds of Dicotyledons, Cambridge University Press, Cambridge, (1976).
Cronquist A., in The Evolution and Classification of Flowering Plants, Second Edition, The
New York Botanical Garden, Bronx, New York, USA, (1988).
da Silva E.L., Piskula M.K., Yamamoto N., Moon J. and Terao J., Quercetin metabolites
inhibit copper ion-induced lipid peroxidation in rat plasma, FEBS Letters, (1998), 430
(3), 405-408.
Dahlgren R., General concept in botany : botanical classification, Rev. Latinoamer. Quim.,
(1989), Suppl. 1, 1036.
Del Pero Martìnez M.A. and Martìnez A.J., Flavonoid distribution in Tradescantia,
Biochemical Systematics and Ecology, (1993), 21 (2), 255-265.
de Montarby L., Mosset P. and Grée R., Sorbic acid iron tricarbonyl complex as resolving
agent. Chiral syntheses of 4-hydroxy nonenal and coriolic acid, Tetrahedron Letters,
(1988), 29 (32), 3937-3940.
Descoings B., in Flore de Madagascar et des Comores (plantes vasculaires) 124e Famille
Vitacées Famille 124 bis Leeacées, Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris,
(1967).
Descoings B., in Flore du Cameroun, Vitacées, Leeacées, Muséum National d’Histoire
Naturelle, Paris, (1972), 133137.
Douk P., Contribution à l’étude des Plantes Médicinales du Cambodge, Thèse de Docteur en
Pharmacie, Paris, (1966), 82.
180
Dyas L., Threlfall D.R. and Goad L.J., The sterol composition of five plant species grown as
cell suspension cultures, Phytochemistry, (1994), 35 (3), 655-660.
El-Sayed N.H., Norris J.A., Ahmed A.A. and Mabry T.J., Flavonoids of Brickellia longifolia,
Phytochemistry, (1990), 29 (7), 2364-2365.
Engel R., Gutman M., Hartisch C., Kolodziej H. and Nahrstedt A., Study on the composition
of the volatile fraction of Hamamelis virginiana, Planta Medica, (1998), 64, 251-258.
Falany C.N., Sulfation and sulfotransferase, Introduction : Changing view of sulfation and the
cytosolic sulfotransferase, FASEB Journal, (1997), 11, 1-2.
Faulkner I.J. and Rubery P.H., Flavonoids and flavonoid sulphates as probes of auxin-transport
regulation in Cucurbita pepo hypocotyl segments and vesicles, Planta, (1992), 186, 618-
625
Filho V.C., Santos A.R.S., De Campos R.O.P., Miguel O.G., Yunes R.A., Ferrari F., Messana
I. and Calixto J.B., Chemical and pharmalogical studies of Phyllanthus caroliniensis in
mice, J. Pharm. Pharmacol., (1996), 48, 12311236.
Fourneau C., Laurens A., Hocquemiller R. and Cavé A., Radical scavenging evaluation of
Green Tea extracts, Phytotherapy Research, (1996), 10, 529-530.
Fukuoka M., Yoshihira K., Natori S., Sakamoto K., Iwahara S., Hosaka S. and Hirono I.,
Characterization of mutagenic principles and carcinogenicity test of dill weed and seeds,
J. Pharm. Dyn., (1980), 3, 236-244.
Gabetta B., Martinelli E.M. and Mustich G., Plants of Mozambique. III. Flavonoids of
Ladolphia kirkii, Fitoterapia, (1973), 44 (3), 93-94.
Gagnepain F., Révision des Ampélidacées asiatiques et malaises, Bull. Soc. Hist. nat. Autun,
(1911), 24, 141.
Gálvez J., Sánchez de Medina F., Jiménez J., Torres M.I., Fernández M.I., Núñez M.C., Ríos
A., Gil A. and Zarzuelo A., Effect of quercitrin on lactoseinduced chronic diarrhoea in
rats, Planta medica, (1995), 61, 302306.
Ganesan T., Antifungal Properties of wild plants, Adv. Plant Sci., (1994), 7 (1), 185187.
Garnier P., Noms de plantes en : langue mandingue langue baoulé. Essai de classification
logique des noms populaires de plantes, Thèse de l’Université, Marseille, (1976), 52 et
55.
181
Geetha T. and Varalakshmi P., Anti-inflammatory activity of lupeol and lupeol linoleate in
adjuvant-induced arthritis, Fitoterapia, (1998), 69 (1), 13-19.
Gerrath J.M., Lacroix C.R., Gerrath J.M., and Posluszny U., The developmental morphology
of Leea guineensis. II. floral development, Bot. Gaz., (1990), 151 (2), 210220.
Gerrath J.M. and Lacroix C.R., Heteroblastic sequence and leaf development in Leea
guineensis, Int. J. Plant Sci., (1997), 158 (6), 747756.
Grandmaison J. and Ibrahim R.K., Evidence for nuclear protein binding of flavonol sulfate
esters in Flaveria chloraefolia, J. Plant Physiol., (1996), 147, 653-660.
Gudej J., Flavonoids, phenolic acids and coumarins from the roots of Althaea officinalis,
Planta Medica, (1991), 57, 284-285.
Guo J., Yu D.-L., Xu L., Zhu M. and Yang S.-L., Flavonol glycosides from Lysimachia
congestiflora, Phytochemistry, (1998), 48 (8), 1445-1447.
Gupta K.C. and Chopra I.C., Tuberculostatic activity of Leea hirta Roxb. (Kaka Jangan), Ind.
Jour. Med. Res., (1953), 41 (4), 427429.
Gurni A.A. and Kubitzki K., Flavonoid chemistry and systematics of the Dilleniaceae,
Biochem. Syst. Ecol., (1981), 9 (2/3), 109114.
Güven K.C., Koyuncuoglu H., Ulubelen A. and Güven N., Studies on gallic acid esters formed
by the extraction of Paeonia peregrina Mill., Pharmazie, (1974), 29, 350.
Hannoufa A., Varin L. and Ibrahim R.K., Spatial distribution of flavonoid conjugates in relation
to glucosyltransferase and sulfotransferase activities in Flaveria bidentis, Plant Physiol.,
(1991), 97, 259-263.
Hannoufa A., Brown R.H. and Ibrahim R.K., Variations in flavonoid sulphate patterns in
relation to photosynthetic types of five Flaveria species, Phytochemistry, (1994), 36 (2),
353-356.
Haraguchi H., Ohmi I., Sakai S., Fukuda A., Toihara Y., Fujimoto T., Okamura N. and Yagi A.,
Effect of Polygonum hydropiper sulfated flavonoids on lens aldose reductase and related
enzymes, Journal of Natural Products, (1996), 56, 443-445.
Harborne J.B., Review Flavonoid sulphates: a new class of sulphur compounds in higher
plants, Phytochemistry, (1975a), 14, 1147-1155.
Harborne J.B., Flavonoid bisulphates and their co-occurrences with ellagic acid in the
Bixaceae, Frankeniaceae and related families, Phytochemistry, (1975b), 14, 1331-1337.
Harborne J.B., Flavonoid sulphates: a new class of natural product of ecological significance in
plants, in Progress in Phytochemistry, Pergamon Press, New York, (1977), 4, 189-208.
182
Harborne J.B. and Mabry T.J., in The Flavonoid advances in research, Chapman and Hall,
London (1982).
Harborne J.B., in The Flavonoids advances in research since 1980, Chapman and Hall Ltd.,
London, (1988), 310.
Harborne J.B., in The Flavonoids advances in research since 1986, Chapman and Hall Ltd.,
London, (1994).
Hasan M. and Burdi D.K., Diterpene fatty acid ester from Leucas nutans, Journal of Natural
Products, (1991), 54 (5), 1444-1446.
Hasmeda M., Kweifio-Okai G., Macrides T. and Polya G.M., Selective inhibition of eukaryote
protein kinases by anti-inflammatory triterpenoids, Planta Medica, (1999), 65, 14-18.
Hegnauer R., in Chemotaxonomie der Pflanzen, vol. VI, Birkhäuser Verlag Basel,
Switzerland, (1973), 5676.
Hegnauer R., in Chemotaxonomie der Pflanzen, vol. IX, Birkhäuser Verlag Basel,
Switzerland, (1990), 689699.
Hertog M.G.L., Hollman P.C.H. and Katan M.B., Content of potentially anticarcinogenic
flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the Netherlands, J.
Agric. Food Chem., (1992), 40, 23792383.
Hutchinson J., in The Families of Flowering Plants, Third Edition, Museums of Botany Royal
Botanic Garen, Oxford, (1973).
Ibrahim A., and Abul-Hajj Y.J., Aromatic hydroxylation and sulfation of 5-hydroxyflavone by
Streptomyces fulvissimus, Applied and Environmental Microbiology, (1989), 55 (12),
3140-3142.
Ibrahim R.K., Ananvoranich S., Varin L. and Gulick P.J., The flavonol sulfotransferase family :
from metabolites to genes, Polyphenols 94, INRA, Paris, (1995), 79-87.
Iwu M.M., in Handbook of African Medicinal Plants, CRC press, United States, (1993), 40.
183
Jay M., Hasan A., Voirin B., Favre-Bonvin J. et Viricel M.R., Les flavonoïdes de Dorycnium
suffruticosum et de tetragonolobus siliquosus (Leguminosae), Phytochemistry, (1978),
17, 1196-1198.
Jennings. W.G. and Shibamoto T., Qualitative Analysis of Flavor and Fragrance Volatiles by
Glass Capillary Gas Chromatography, Académic Press, New York, (1980).
Kann N., Rein T., Akermark B. and Helquist P., New functionalized Horner-Wadsworth-
Emmons reagents : Useful building blocks in the synthesis of polyunsaturated aldehydes.
A short synthesis of (+)-(E,E)-coriolic acid, J. Org. Chem., (1990), 55, 5312-5323.
Kayser O. and Kolodziej H., Antibacterial activity of extracts and constituents of Pelargonium
sidoides and Pelargonium reniforme, Planta Medica, (1997), 63, 508510.
Kerharo J. et Bouquet A., in Plantes Médicinales et Toxiques de la Côted’IvoireHauteVolta,
Vigot Frères, Paris, (1950), 146.
Kitada Y., Miyauchi T., Satoh A. and Satoh S., Effects of antidepressants in the rat forced
swimming test, European J. of Pharmacology, (1981), 72, 145-152.
Kondjoyan N. and Berdagué J.L., A Compilation of Relative Retention Indices for the
Analysis of Aromatic Compounds, Laboratoire Flaveur, INRA de Theix, France, (1996).
Kroes B.H., van den Berg A.J.J., Quarles van Ufford H.C., van Dijk H. and Labadie R.P.,
Anti-inflammatory of gallic acid, Planta medica, (1992), 58, 499-504.
KweifioOkai G., Triterpene compounds having antiinflammatory and antiarthritic activity,
Patent Cooperation Treaty (PCT) Int. Appl. 35p., WO 93/09129, (1993).
KweifioOkai G., Bird D., Carroll A.R., Ambrose R. and Field B., Effect of αamyrin
palmitate on adjuvant arthritis, Drugs exptl. Clin. Res., (1994a), 20 (1), 15.
KweifioOkai G., De Munk F., Rumble B.A., Macrides T.A. and Cropley M., Antiarthritic
mechanisms of amyrin triterpenes, Research Comm. in Mol. Path. and Pharm., (1994b),
85 (1), 4555.
184
KweifioOkai G., Bird D., Field B., Ambrose R., Carroll A.R., Smith P. and Valdes R.,
Antiinflammatory activity of a Ghanaian antiarthritic herbal preparation : III, Journal
of Ethnopharmacology, (1995), 46, 715.
Lacroix C.R., Gerrath J.M. and Posluszny U., The developmental morphology of Leea
guineensis. I. vegetative development, Bot. Gaz., (1990), 151 (2), 204209.
Le Maout E. et Decaisne J., in Traité Général de Botanique Descriptive et analytique, Firmin
Didot et Cie, Paris, (1876).
Li C.J., Elgamal M.H., Sharker K.H., Ahmed A.A., Mabry T.J., A new sulfated flavonoid from
Zygophyllum dumosum, Natural Product Letters, (1996), 8, 281-284.
Lin C.-N. and Tome W.-P., Antihepatoxic principles of Sambucus formosana, Planta Medica,
(1988), 223-224.
Luther H., Jordanov D., Ludwig P. and Schewe T., Inhibition of rabbit erythroid 15
lipoxygenase and sheep vesicular gland prostaglandin H synthase by gallic esters,
Pharmazie, (1991), 46, 134136.
Mabry T.J., Markham K.R. and Thomas M.B., The systematic identification of flavonoids,
Springer-Verlag, Berlin, (1970).
Mackeen M.M., Ali A.M., Abdullah M.A., Nasir R.M., Mat N.B., Razak A.R. and Kawazu K.,
Antinematodal Activity of Some Malaysian Plant Extracts against the Pine Wood
Nematode, Bursaphelenchus xylophilus, Pest. Sci., (1997), 51 (2), 165170.
MacKenzie A.M., The flavonoids of the leaves of Acacia mearnsii, Phytochemistry, (1969), 8,
1813-1815.
Mahato S.B. and Kundu A.P., Review article number 98, 13C NMR spectra of pentacyclic
triterpenoids-a compilation and some salient features, Phytochemistry, (1994), 37(6),
1517-1575.
Mann P., Tofern B. Kaloga M. and Eich E., Flavonoid sulfates from the Convolvulaceae,
Phytochemistry, (1999), 50, 267-271.
Marsolais F. and Varin L., Mutational analysis of domain II of flavonol 3-sulfotransferase, Eur.
J. Biochem., (1997), 247 (3), 1056-1062.
Marsolais F. and Varin L., Recent developments in the study of the structure-function
relationship of flavonol sulfotransferases, Chemico-Biological Interactions, (1998), 109,
117-122.
185
Masaki H., Okamoto N. Sakaki S. and Sakurai H., Protective effects of hydroxybenzoic and
their esters on cell damage induced by hydroxyl radicals and hydrogen peroxides, Biol.
Pharm. Bull., (1997), 20 (4), 304308.
Massiot G., Dijoux M.G. and Lavaud C., in Saponins Used in Food and Agriculture,
Advances in experimental medicine and biology vol. 405, Waller and Yamasaki, Plenum
Press, New York, (1996), 183192.
McLafferty F.W., Interpretation of mass spectra, Third edition, University Science Books,
USA, (1980).
McLafferty F.W. and Staufer D.B., The Wiley/NBS Registry of Mass Spectral Data, John
Wiley Interscience, USA, (1989).
Mérat F.V. et De Lens A.J., in Dictionnaire Universel de Matière Médicale et de
Thérapeutique Générale, tome I, Baillière J.B., Paris, (1829).
Merck Index, The Merck Index, an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals, ed. by
Budavari S., O’Neil M. J., Smith A. and Heckelman P. E., Merck & CO., Inc., USA,
(1989), eleventh ed.
Moriarity D.M., Huang J., Yancey C.A., Zhang P., Setzer W.N., Lawton R.O., Bates R.B. and
Caldera S., AN 128 : 326392 CA, Lupeol is the cytotoxic principle in the leaf extract of
Dendropanax, Planta Medica, (1998), 64(4), 370-372.
Nagai H., Osuga K. and Koda A., Inhibition of hypersensitivity reactions by soluble derivatives
of baicalein, Japan J. Pharmacol., (1975), 25, 763-772.
Nair N.C. and Nambisan P.N.N., Contribution to the floral morphology and embryology of
Leea sambucina Wild, Bot. Notiser, (1957), 110 (2), 160172.
Nair N.C., Contribution to the floral morphology and embryology of two species of Leea with
a discussion on the taxonomic position of the genus, The Journal of the Indian
Botanical Society, (1968), XLVII, 193205.
Nissen P. and Benson A.A., Absence of selenate esters and « selenolipid » in plant, Biochim.
Biophys. Acta, (1964), 82, 400402.
Nonaka G.-I., Muta M. and Nishioka I., Myricatin, a galloyl flavanonol sulfate and
prodelphinidin gallates from Myrica rubra, Phytochemistry, (1983), 22 (1), 237-241.
Noreen Y., Serrano G., Perera P. and Bohlin L., Flavan-3-ols isolated from some medicinal
plants inhibiting COX-1 and COX-2 catalysed prostaglandin biosynthesis, Planta
Medica, (1998), 64, 520-524.
186
Öksüz S. and Topcu G., Triterpene fatty acid esters and flavonoids from Inula britannica,
Phytochemistry, (1987), 26(11), 3082-3084.
Op de Beck P., Dijoux M.G., Cartier G. and Mariotte A.M., Quercitrin 3’-sulphate from leaves
of Leea guinnensis, Phytochemistry, (1998), 47 (6), 1171-1173.
Pal D.C., Observations on folklore about plants used in veterinary medicine in Bengal, Orissa
and Bihar, Bull. Bot. Sur. India, (1980), 22 (14), 9699.
Patil S.G. and Patil V.P., Interspecific Variations in Stomatal Characters in Vitis, Cissus and
Leea, Biovigyanam, (1984), 10, 1320.
Pereira N.A., Ruppelt Pereira B.M., do Nascimento M.C., Parente J.P. and Mors W.B.,
Pharmacological screening of plants recommended by folk medicine as snake venom
antidotes ;IV. Protection against Jararaca venom by isolated constituents, Planta
Medica, (1994), 60, 99100.
Pérez L.M., Rojas C.V. and Cori O., The use of quercetin sulphates from Flaveria bidentis as
inhibitors of the enzymic reduction of carbonyl groups, Phytochemistry, (1986), 25 (7),
15871589.
Peterson T.G., Coward L., Kirk M., Falany C.N. and Barnes S., The role of metabolism in
mammary epithelial cell growth inhibition by the isoflavones genistein and biochanin A,
Carcinogenesis, (1996), 17 (9), 1861-1869.
Pharmacopée Française Xème Edition, Maisonneuve SA, Moulins, Les Metz, (1983).
Phou Ngeun SoukAloun, in La médecine bouddhique traditionnelle en pays Theravada, Roger
Jollois, Limoges, (1995), 112.
Pongprayoon U., Baeckström P., Jacobsson U., Lindström M. and Bohlin L., Antispasmodic
activity of β-damascenone and E-phytol isolated from Ipomoea pes-caprae, Planta
Medica, (1992), 58, 19-21.
Radt F., Triterpenes, in Elseviers’s encyclopedia of organic chemistry, Elsevier, USA, (1940),
528-593.
Rajab M.S., Cantrell C.L., Franzblau S.G. and Fischer N.H., Antimycobacterial activity of (E)-
Phytol and derivatives : A preliminary structure-activity study, Planta Medica, (1998),
64, 2-4.
Rama Rao A.V., Rajarathnam Reddy E., Sharma G.V.M., Yadagiri P. and Yadav J.S., A
stereoselective synthesis of coriolic acid and dimorphecolic acid, Tetrahedron Letters,
(1985), 26 (4), 465-468.
Rao C.P., Hanumaiah T., Vemuri V.S.S. and Jagannadha Rao K.V., Flavonol 3-glycosides from
the leaves of Flemingia stricta, Phytochemistry, (1983), 22 (2), 621-622.
187
Rao C.V., Newmark H.L. and Reddy B.S., AN 128 :278727 CA, Chemopreventive effect of
squalene on colon cancer, Carcinogenesis, (1998), 19(2), 287-290
Rasool N., Ahmad V.U. and Malik A., Terpenoids from Pentatropis spiralis, Phytochemistry,
(1991), 30 (4), 1331-1332.
Reynolds W.F., McLean S., Poplawski J., Enriquez R.G., Escobar L.I. and Leon I., Total
assignment of 13C and 1H spectra of three isomeric triterpenol derivatives by 2D NMR :
An investigation of the potential utility of 1H chemical shifts in structural investigations
of complex natural products, Tetrahedron, (1986), 42, 3419-3428.
Ridsdale C.E., A revision of the family Leeaceae, Blumea, (1975), 22 (1), 57100.
Sakai W.S., Shiroma S.S. and Nagao M.A., A study of raphide microstructure in relation to
irritation, Scanning electron microscopy, (1984), 11, 979986.
Saleh N.A.M., El-Sissi H.I. and Nawwar M.A.M., A rhamnetin glucuronide trisulphate from
the leaves of Tamarix aphylla, Phytochemistry, (1975),14, 312-313.
Sato Y., Oketani H., Singyouchi K., Ohtsubo T., Kihara M., Shibata H. and Higuti T.,
Extraction and purification of effective antimicrobial constituents of Terminalia chebula
Rets. against MethicillinResistant Staphylococcuc aureus, Biol. Pharm. Bull., (1997),
20 (4), 401404.
Schulte-Elte K.H., Gautschi F., Renold W., Hauser A., Fankhauser P., Limacher J. and Ohloff
G., Vitispirane, important constituents of vanilla aroma, Helvetica Chimica Acta,
(1978), 61 fasc.3, 1125-1133.
Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Paull K.D., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens
M.J., Seniff D. and Boyd M.R., Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for
cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines,
Cancer Research, (1988), 48, 4827-4833.
Seabra R.M. and Correia Alves A., Quercetin 3-glucuronide-3’-sulphate from Hypericum
elodes, Phytochemistry, (1988), 27 (9), 3019-3020.
Seabra R.M. and Correia Alves A., Quercetin 3’-sulphate from Hypericum elodes,
Phytochemistry, (1991), 30 (4), 1344-1345.
Serrano A., Palacios C., Roy G., Cespòn C., Villar M.L., Nocito M. and GonzàlezPorqué P.,
Derivatives of gallic acid induce apoptosis in tumoral cell lines and inhibit lymphocyte
proliferation, Archives of biochemistry and biophysics, (1998), 350 (1), 4954.
188
Shali N.A., Curtis C.G., Powell G.M. and Roy A.B., Sulphation of the flavonoids quercetin
and catechin by rat liver, Xenobiotica, (1991), 21 (7), 881-893.
Shankaranarayana K.H., Ayyar K.S. and Krishna Rao G.S., Insect growth inhibitor from the
bark of Santalum album, Phytochemistry, (1980), 19, 1239-1240.
Shimamura H., Suzuki H., Hanano M., Suzuki A and Sugiyama Y., Identification of tissues
responsible for the conjugative metabolism of liqiritigenin in rats : An analysis based on
metabolite kinetics, Biol. Pharm. Bull., (1993), 16 (9), 899-907.
Shimizu M. and Tomoo T., Anti-inflammatory constituents of topically applied crude drugs. V.
Constituents and anti-inflammatory effect of Aoki, Aucuba japonica Thunb., Biol.
Pharm. Bull., (1994), 17 (5), 665-667.
Shiojima K., Arai Y., Masuda K., Takase Y., Ageta T. and Ageta H., Mass Spectra of
pentacyclic triterpenoids, Chem. Pharm. Bull., (1992), 40(7), 1683-1690.
Simpson R.F., Strauss C.R. and Williams P.J., Vitispirane : a C13 spiro-ether in the aroma
volatiles of grape juice, wines and distilled grape spirits, Chemistry and Industry, (1977),
663-664.
Stadler M., Mayer A., Anke H. and Sterner O., Fatty acids and other compounds with
nematicidal activity from culture of Basidiomycetes, Planta Medica, (1994), 60, 128-
132.
Staples G.W. and Herbst D.R., Nomenclatur Changes Affecting Cultivated Plants I., Baileya,
(1996), 23 (4), 169183.
Stenhagen E., Abrahamsson S. and McLafferty F.W., Registry of Mass Spectral Data . John
Wiley, New York, (1974).
Subarnas A., Oshima Y. and Ohizumi Y., An antidepressant principle of Lobelia inflata L.
(Campanulaceae), Journal of Pharmaceutical Sciences, (1992), 81 (7), 620-621.
Subarnas A., Tadano T., Nakahata N., Arai Y., Kinemuchi H., Oshima Y., Kisara K. and
Ohizumi Y., A possible mechanism of antidepressant activity of beta-amyrin palmitate
isolated from Lobelia inflata leaves in the forced swimming test, Life Sciences, (1993a),
52 (3), 289-296.
Subarnas A., Tadano T., Oshima Y., Kisara K. and Ohizumi Y., Pharmalogical properties of β-
amyrin palmitate, a novel centrally acting compound, isolated from Lobelia inflata
leaves, J. Pharm. Pharmacol., (1993b), 45, 545-550.
Subarnas A., Tadano T., Kisara K. and Ohizumi Y., An α-adrenoceptor-mediated mechanism of
hypoactivity induced by β-amyrin palmitate, J. Pharm. Pharmacol., (1993c), 45, 1006-
1008.
189
Suessenguth K., in Die Natürlichen Pflanzenfamilien, Engler A. und Prantl K., Duncker &
Humblot, Berlin, (1953), Zweite Auflage, Band 20d, 372390.
Takhtajan A., in Floristic Regions of the World, University of California press, Berkeley,
(1986).
Takhtajan A., in Diversity and classification of flowering plants, California University press,
New York, (1997).
Tallent W.H., Harris J., Wolff I.A. and Lundin R.E., (R)13hydroxycis9, trans11
octadecadienoic acid, the principal fatty acid from Coriaria nepalensis Wall. seed oil,
Tetrahedron Letters, (1966), 36, 43294334.
Tarnavschi I.T. and Petria E., Contribution to the knowledge of the miscrosporal structure in
the fam. Leeaceae., Pollen et Spores, (1968), 10 (2), 221249.
Tattje D.H.E. and Bos R.,Valeranone, valeranal and vitispirane in the leaf oil of Liquidambar
styraciflua, Phytochemistry, (1979), 18, 876.
Thorne R.F., Classification and geography of flowering plants, Botanical Review, (1992), 58,
225348.
Toki K., Saito N., Ueda T., Chibana T., Shigihara A. and Honda T., Malvidin 3-glucoside-5-
glucoside sulphates from Babiana Stricta, Phytochemistry, (1994), 37 (3), 885-887.
Tomás Lorente F. and Ferreres F., Nota. Sulfatos de flavonoides en frutos de Phoenix
dactilifera, Rev. Agroquìm. Tecnol. Aliment., (1988), 28 (4), 581-585.
Umadevi I. and Daniel M., Taxonomy of the Vitaceae – A chemical approach, Acta Botanica
Indica, (1991), 19, 168170.
Varin L. and Ibrahim R.K., Partial purification and characterization of three flavonol-specific
sulfotransferase from Flaveria chloraefolia, Plant Physiol., (1989), 90, 977-981.
Varin L. and Ibrahim R.K., Partial purification and some properties of flavonol 7-
sulfotransferase from Flaveria bidentis, Plant Physiol., (1991), 95, 1254-1258.
190
Varin L., Chapter 8 : Flavonoid sulfation : phytochemistry, enzymology and molecular biology,
in Phenolic metabolism in plants, ed. by Stafford H.A. and Ibrahim R.K., Plenum press,
New York, (1992a), 233-254.
Varin L., Marsolais F., Richard M. and Rouleau M., Sulfation and sulfotransferase 6,
Biochemistry and molecular biology of plant sulfotransferase, FASEB Journal, (1997),
11, 517-525.
Warnaar F., Triterpene ester synthesis in latex of Euphorbia species, Phytochemistry, (1987),
26 (10), 27152721.
Watanabe T. and Suga T., Effects of Phytol, a branched, long-chain aliphatic alcohol, on
biochemical values and on hepatic peroxisomal enzymes of rats, Chem. Pharm. Bull.,
(1983), 31, 2756-2761.
Williams C.A., Harborne J.B., Greenham J., Briggs B.G. and Johnson L.A.S., Flavonoid
patterns and the revised classification of australian Restionaceae, Phytochemistry,
(1998), 49 (2), 529-552.
Wong C.-K. and Keung W.M., Daidzein sulfoconjugates are potent inhibitors of sterol sulfatase
(EC 3.1.6.2), Biochemical and Biophysical Research Communications, (1997), 233,
579-583.
Yagi A., Uemura T., Okamura N., Haraguchi H., Imoto T. and Hashimoto K., Antioxidative
sulphated flavonoids in leaves of Polygonum hydropiper, Phytochemistry, (1994), 35
(4), 885-887.
Yasuda T., Mizunuma S., Kano Y., Saito K.-I. and Ohsawa K., Urinary and biliary metabolites
of genistein in rats, Biol. Pharm. Bull., (1996), 19 (3), 413-417.
Yasukawa K., Ogawa H. and Takido M., Two flavonol glycosides from Lysimachia
nummularia, Phytochemistry, (1990), 29 (5), 1707-1708.
Yem Yok Siv, Etude de quelques plantes médicinales du Cambodge, Thèse de l’Université
René Descartes, Paris, (1971).
Yoshikawa M., Shimada H., Nishida N., Li Y., Toguchida I., Yamahara J. and Matsuda H.,
Antidiabetic principles of natural medicines. II. Aldose reductase and α-glucosidase
191
inhibitors from brazilian natural medicine, the leaves of Myrcia multiflora DC.
(Myrtaceae) : Structure of myrciacitrins I and II and myrciaphenones A and B, Chem.
Pharm. Bull., (1998), 46 (1), 113-119.
Banque informatisée de spectres de masse pour composés aromatiques, INRA Dijon, France,
(1997).
Cancer cell line screening data,
http://epnws1.ncifcrf.gov :2345/dis3d/FTP/NATPROD/LEEACEAE.HTML
GRIN database
www.arsgrin.gov/cgibin/npgs/html/tax_search.pl ?Leeaceae
Image Leea
arboretum.harvard.edu/kalimantan/key/ENGLISH/WWW/leea.gif
Phytochemical and Ethnobotanical Database,
http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/duke/ethnobot.pl
192
Annexe :
Matériels et méthodes
Fiches produits
Liste des noms usuels des flavones
Liste des noms usuels des flavonols
Liste des figures
Liste des tableaux
193
MATERIELS ET METHODES
I Lyophilisation
La lyophilisation a été effectuée sur les extraits aqueux, acétate d’éthyle et butanolique,
ainsi que pour des fractions aqueuses. Cependant, les extraits EtOAc et BuOH ont été
concentrés sous pression réduite, et repris progressivement à l’eau jusqu’à l’élimination des
solvants organiques. Les phases aqueuses sont alors congelées à –50°C et lyophilisées sur les
appareils USIFROID® et AIRLIQUID LY5®.
II Matériel Chromatographique
Les analyses sur plaque CCM sont réalisées en grande partie sur des plaques de silice
60 F254 (200x200x0,15 mm) sur feuilles aluminium (SDS). Plus rarement, nous avons utilisé
des plaques en verre (10x10 cm nano) HPTLC Diol F254, et RP18 F254 (Merck).
L’élution est adaptée en fonction des extraits ou composés analysés. La migration se
faisant dans des cuves de type Desaga Heildelberg.
Les révélateurs utilisés pour mettre en évidence les composés ont été la lumière UV
(254 et 366 nm), l’acide sulfurique dilué à 50% dans du MeOH avec observation sous UV
avant et après chauffage.
B) Chromatographie préparative
Elles sont réalisées sur des plaques de verre (200 X 200 mm) préparées au laboratoire
avec de la silice 60 F254 (2,5-5 mm d’épaisseur) avec un dépôt d’échantillon inférieur de 10 mg
à 30 mg selon l’épaisseur de la plaque.
194
Les plaques sont lavées par élution successive dans du cHex, MeOH et solvant
d’élution chromatographique avant de déposer l’échantillon. L’observation des bandes est fait
sous lampe UV (parfois avec révélation à l’acide d’un coté de la plaque).
L’appareillage utilisé est classique, cependant nous avons fait en sorte d’utiliser des
dimensions de colonne adéquate à la quantité d’échantillon à séparer (en général le poids de
support sec est de 50 fois celui de l’échantillon).
Plusieurs supports ont été utilisés
Charbon végétal (SDS®)
Silice 60 de granulométrie 63-200 µm (SDS®)
Sephadex LH-20 (Pharmacia®)
Les fractions sont collectées et rassemblées si nécessaire après visualisation CCM.
Les échantillons sont déposés après empattage sur un gel de silice 60 placé dans un
verre fritté N°4.
Ce sont des colonnes prête à l’emploi sous forme de seringue commercialisé sous le
nom de Visiprep® et remplies par deux types de support différent : silice normale et en silice
greffée C18.
Les purifications sont réalisées sur silice (35-70 µm) ou sur silice greffée RP-18 (40-63
µm) dans des colonnes Büchi®. La pression est fournie par une pompe moyenne pression de
type Büchi 688. Les colonnes utilisées dépendent de la complexité et de la masse de la fraction
à purifier. La sortie de colonne est couplée à un détecteur UV (Knauer ®). La détection se
faisant pour la plupart du temps à λ 254 nm. Les solvants d’élution sont dégazés avant
utilisation.
195
C) Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
Cette méthode a été utilisée avec un couplage à la spectrométrie de masse (SM) afin d’analyser
les composés volatiles des feuilles et du bois.
Ces analyses en CG/SM ont été réalisées à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de
Montpellier par le Pr. J.M. BESSIERE.
L’appareillage est constitué d’un chromatographe HP 5890 en phase gazeuse équipé d’un
détecteur d’ionisation de flamme et d’une colonne Optima 1 (Macherey-Nagel®) 25 m X 0,20
mm X 0,25 µm, phase stationnaire polydiméthylsiloxane.
Le gaz vecteur est l’hélium avec un débit constant de 0,6 ml/min.
La température de l’injecteur est de 220°C, celle du détecteur de 250°C. La température de la
colonne est programmée à 50°C pendant 3 min puis augmente jusqu’à 250°C à raison de 3
°C/min.
Le volume d’injection est en général de 0,2 ml.
Le spectromètre de masse couplé est un HP 5791 à potentiel d’ionisation de 75 eV, de vitesse
de balayage de 1,1 s.décade-1 (réitérée dans tout le passage).
Les composés détectés sont présentés dans un tableau en fonction de leurs indices de rétention
de Kováts. Cet indice est établi en comparant le temps de rétention d’un composé à ceux des
deux hydrocarbures les plus proches.
I= 100 X lg[VI/VHi] / lg[VHi+1/VHi] + 100i
I est l’indice de rétention du composé I
Hi est le pic de l’hydrocarbure qui sort immédiatement avant celui du composé I et dont le
nombre d’atomes de carbone est i,
Hi+1 est le pic d’hydrocarbure qui sort immédiatement après celui du composé I.
196
III Méthodes chromatographiques
Toutes les fractions obtenues avec les différentes techniques chromatographiques, pour
la séparation, les regroupements et l’isolement des composés ont été contrôlées par CCM.
20 g de l’extrait Hex sont déposés sur une colonne ouverte de charbon (260 X 80 mm)
et élués au CH2Cl2 par fractions de 500 ml. Les 3 premiers litres sont regroupés dans la
fraction A et les 4 autres dans la fraction B.
Solvants Fractions
cHex CHCl3 MeOH
100 0 0 1-2
90 10 3-4
80 20 5-6
70 30 7-10
60 40 11-12
50 50 13-14
40 60 15-16
30 70 17-18
20 80 19-20
10 90 21-22
0 100 23-24
Après contrôle CCM et regroupement, la fraction [3] donne Terp-5 (1 g) ; les fractions
[4-9] purifiées de nouveau sur CCMprép Si (cHex-EtOAc 9:1) conduisent à Terp-7 (6 mg) ;
les fractions [11-15] donnent Aa et la fraction [16-19] Ab.
Solvants Fractions
cHex CHCl3
7 3 1-20
6 4 21-40
Chromatographie de Aaa (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)
Solvants Fractions
MeOH CHCl3
9 1 1-15
8 2 16-25
197
Solvants Fractions
MeOH CHCl3
90 10 1-6
85 15 7-15
80 20 16-21
Solvants Fractions
cHex CHCl3
7 3 1-10
6 4 11-20
5 5 21-40
Chromatographie de Aba (45 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)
Solvants Fractions
MeOH CHCl3
9 1 1-10
8 2 11-30
La fraction [5] conduit à Terp-1 (20 mg) ; les fractions [9-10] à Terp-4 (20 mg) et les
fractions [11-12] à Abaa.
Solvants Fractions
cHex CHCl3 MeOH
100 0 0 1-36
95 5 37-55
90 10 56-75
80 20 76-94
70 30 95-113
65 35 114-174
60 40 175-186
50 50 187-191
40 60 192-196
20 80 197-201
0 100 202-205
50 50 206-209
Le regroupement, des fractions [86-119] conduit à Terp-5 (500 mg) et les fractions
[206-207] à Ba.
Chromatographie de Ba (200 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)
Solvants Fractions
MeOH CHCl3
198
9 1 1-16
8 2 17-27
5 g d’extrait cHex sont déposés sur une CO Si (400 X 25 mm), et élué au CHCl3. Les
2 premières fractions de 15 ml conduisent à C.
Chromatographie de C (250 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fraction 15 ml)
Solvants Fractions
MeOH CHCl3
70 30 1-19
65 35 20-
Les fractions [6-7] sont rassemblées et donnent Ca et purifiées sur CCMprép Si (cHex)
pour avoir Terp-2 (25 mg).
6 g de l’extrait CH2Cl2 sont chromatographiés par VLC sur verre fritté (60 X 130 mm,
fractions de 1 L).
Solvants Fractions
cHex CH2Cl2 MeOH
100 0 0 1
70 30 2
50 50 3
30 70 4
0 100 5
70 30 6
50 50 7
30 70 8
Chromatographie de A (850 mg) sur CO sephadex LH-20 (300 X 70 mm), éluée par
CHCl3-MeOH (50:50), fractions de 20 ml.
Solvants Fractions
CHCl3 MeOH
10 0 1-10
9 1 11-20
199
Chromatographie de Aaa (460 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 20 ml)
Solvants Fractions
CH2Cl2 EtOAc
10 0 1-10
9 1 11-20
8 2 21-30
7 3 31-40
Les fractions [9-10] correspond à AGr-1 (30 mg) ; les fractions [15-19] à Aaaa et les
fractions [20-24] à Aaab.
Chromatographie de Ab (30 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
6 4 1-10
5 5 11-20
Chromatographie de B (140 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 100 ml)
Solvants Fractions
CHCl3 MeOH
10 0 1
9 1 2-4
Chromatographie de Bb (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm), avec un mélange
isocratique MeOH-H2O (50:50), fractions de 20 ml. Les fractions [7-9] conduisent à Bba.
Chromatographie de Bba (20 mg) sur CO Sephadex LH-20 (320 X 50 mm), élué au
MeOH, fraction de 50 ml. Les fractions [1-3] donnent Bbaa et [8-11] Bbab.
Solvants Fractions
EtOAc MeOH
100 0 1-14
90 10 15-28
80 20 29-36
70 30 37-44
200
Les fractions [7-16] après regroupement mènent à A, la fraction [19] correspond à
Flav-1 (36 mg), les fractions [23-28] à B et les fractions [29-37] à C.
Chromatographie de A (420 mg), sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 100 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-5
90 10 6-9
Chromatographie de B (580 mg) sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 250 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-3
90 10 4-6
80 20 7-11
70 30 12-14
65 35 15-17
60 40 18-24
50 50 25-31
45 55 32-35
La fraction [4] conduit à Ac Ph-1 (30 mg), les fractions [21-22] à Ba, les fractions [29-
30] à Bb et les fractions [31-35] à Bc.
Solvants Fractions
H2O MeOH
60 40 1-9
50 50 10-15
Les fractions [6-11] conduisent à Ca (30 mg) qui donne après CCMprép Si (EtOAc-
MeOH-H2O 100:16,5:13,5), Caa qui est purifiée sur Visiprep C-18 pour donner Flav-4 (8
mg).
201
D) Extrait butanolique – Purification des flavonoïdes
Solvants Fractions
CH2Cl2 MeOH
80 20 1
60 40 2-3
50 50 4
40 60 5-7
20 80 8
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-10
90 10 11-20
80 20 21-30
70 30 31-40
Les fractions [16-19] donnent Flav-6 (6 mg) et les fractions [22-38] donnent Flav-5 (3
mg).
202
Chromatographie de Ba (80 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 100 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-3
90 10 4-7
Chromatographie de Baa (15 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-13
95 5 14-17
Solvants Fractions
CH2Cl2 MeOH H2O
20 80 0 1
0 100 2-3
80 20 4
Chromatographie de A (380 mg) sur CLMP C-18 (230 X15 mm, fractions 100 ml)
Solvants Fractions
H2O MeOH
100 0 1-4
95 5 5-10
90 10 1-17
80 20 18-23
70 30 24-28
60 40 29-33
40 60 34-42
20 80 43-48
Les fractions [24-29] donnent Aa, les fractions [31-37] conduisent à Flav-5 et les
fractions [38-43] à Flav-2.
203
IV Mesures spectrales
A) Spectres UV
Les spectres RMN sont enregistrés pour la plupart sur un appareil Bruker AC 200 de
l’UFR de Pharmacie de Grenoble, dont la fréquence nominale du proton est de 200,13 MHz et
celle du carbone 13 de 50,03 MHz. Quelques spectres ont été enregistrés sur un appareil
Bruker AMX 400 (400,13 MHz proton 100,61 MHz carbone 13) (Laboratoire de biophysique
du Centre de Recherche du Service de Santé des Armées CRSSA - Grenoble), sur unappareil
Bruker 500 MHz à Reims, ou sur un 300 MHz (C.E.A. de Grenoble).
Les mesures sont réalisées dans les solvants deutériés suivant : CDCl3, CD3OD,
DMSO-d6 ou D2O. Les valeurs de déplacements chimiques, δ en ppm, sont exprimées par
rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS).
Les [α] 20 ®
D (c = 0,2) sont mesurés sur un polarimètre Perkin Elmer , de type PE-341,
204
V Méthodes chimiques
A) Recherche de tanins
50 mg d’extrait EtOAc, BuOH, H2O sont placés respectivement dans un ballon de 100
ml avec 15 ml H2O distillé et 7 ml du réactif de Stiasny (mélange formol-HCl 2:1 v:v). Les
ballons sont portés à ébullition 30 min. L’apparition d’un précipité rouge indique la présence de
tanins condensés. La solution refroidie est filtrée sur papier. Le filtrat recueilli est saturé en
acétate de sodium. Par ajout de quelques gouttes de fer, la solution se colore en bleu-noir,
indiquant la présence de tanins hydrosolubles.
B) Recherche d’alcaloïdes
20g de feuilles sèches sont mouillées dans 25ml de NH4OH aqueux à 20%. Puis, on
ajoute 200ml d’acétate d’éthyle et on laisse macérer 24H. Après lixiviation, les marcs sont
épuisés par trois fois 100ml d’EtOAc. Cette phase EtOAc est extraite à trois reprises par
H2SO4 à 5%. La phase acide est alors alcalinisée par NH4OH jusqu’à pH = 8 puis est extraite à
trois reprise par du CHCl3. La phase chloroformique est rincée à l’eau distillée jusqu’à pH = 7,
filtrée sur Na2SO4 et concentrée. De cet extrait (20mg), la mise en évidence des alcaloïdes par
les réactifs classiques de Dragendorff et de Mayer s’avère négative.
C) Recherche de saponines
205
VI Tests biologiques
Matériel :
Matériel biologique:
Réactifs :
Produits testés :
Les produits ont été testés aux concentrations suivantes : 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, 1 µg/ml, 10 µ
g/ml et 100 µg/ml.
Selon les échantillons, une solution mère est préparée dans le DMSO à 1 g/ml ou directement
dans le milieu de culture à 1 mg/ml.
206
Toutes les dilutions sont réalisées dans le milieu de culture à 1% de SVF.
Protocole :
Le protocole suivi est celui décrit par : Neal W. ROEHM et al., Journal of Immunological
Methods, 142, (1991), 257-265.
Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d’un sel de tétrazolium, le XTT,
en un produit coloré, le formazan.
Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en présence
d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le
formazan dosable par spectrométrie à 450 nm.
Protocole opératoire :
La lignée cellulaire SVK 14 est cultivée dans du MEM avec 10% de SVF.
t-18H :
Ensemencement des cellules à raison de 1,5.104 cellules par puits sous un volume de 100 µl de
milieu de culture à 10% de SVF. Incubation à 37°C durant 18H en présence d’une atmosphère
saturée en H2O et à 5% de CO2.
T=0 :
Elimination du milieu de culture et rinçage des microplaques à l’aide de 100 µl de PBS par
puits.
Introduction des différentes concentrations d’échantillons sous un volume de 100 µl de milieu
de culture avec 1% de SVF.
Incubation à 37°C pendant 48H.
T+48H :
207
B) Activité du palmitate de β-amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la
production de prostaglandine 6KF1α par les kératinocytes humains
Matériel biologique :
Réactifs :
Produits testés :
Protocole :
- La suspension de kératinocytes (1x106 cellules/2ml) dans le MEM 10% SVF est distribuée
dans les plaques 6 puits (1x106 cellules/puits) et incubée pendant 16 heures à 37°C dans une
atmosphère à 5% CO2. Les kératinocytes sont alors rincés avec du PBS pour éliminer les
cellules non-adhérentes puis exposés aux produits à tester inclus dans du MEM sans SVF (qui
pourrait interférer dans le dosage).
- Selon les extraits, une solution mère à 1 g/ml d’échantillon est préparée dans le DMSO ou
directement dans le milieu de culture à 1 mg/ml. Des dilutions sont réalisées dans du MEM
sans SVF.
Les extraits sont testés en culture aux concentrations 0,1, 1 et 5 µg/ml.
- Le palmitate de β-Amyrine est solubilisé dans du DMSO à 200 mg/ml. Une solution mère à
500µg/ml est ensuite préparée dans le MEM sans SVF.
L’échantillon est testé en culture aux concentrations de 10, 50 et 100 µg/ml.
Ces concentrations ont été choisies après un test de cytotoxicité et qui n’a révélé aucune
toxicité.
208
Pour chaque lot, 3 puits sont réalisés. Les cellules sont pré-incubées pendant 60 mn avec le
produit à tester puis un agent stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, l’ionophore
calcique (A23187 à 5µM), est ajouté pendant 5 heures.
Ce temps écoulé, les milieux de culture de chaque puits sont récupérés, centrifugés à 3000
tr/mn et conservés à -80°C.
La production de prostaglandine 6KF1α pour chacun des essais est mesurée par le Kit Elisa
EUROMEDEX.
- Lot témoin
- Lot témoin stimulé A23187 5µM
- Extrait acétate d’éthyle 0,1 µg/ml + A23187 5µM
- Extrait acétate d’éthyle 1 µg/ml + A23187 5µM
- Extrait acétate d’éthyle 5 µg/ml + A23187 5µM
Cellules :
Des fibroblastes humains normaux sont isolés à partir de biopsies cutanées issues de plasties
mammaires et cultivés dans du milieu de culture DMEM (Gibco- Ref : 41965-039),
supplémenté en sérum de nouveau-né (SNN) (10%) et en antibiotiques
Pénicilline/Streptomycine (P/S) (1%).
209
Réactifs et Matériel:
Echantillon testé :
palmitate de β-amyrine
Protocole :
A confluence, les fibroblastes humains normaux sont décollés à l’aide de la trypsine et sont
réensemencés dans des boîtes de 60 mm à un taux d’ensemencement de 0,8x10 6 cellules dans
du DMEM avec 10% SNN, 1% P/S. Les cellules sont incubées pendant 18 heures à 37°C, 5%
CO2, atmosphère humide. Les cellules, ici à passage P4, sont ainsi prêtes pour les tests.
RT-PCR :
1µg d’ARN totaux est utilisé pour la réaction de RT-PCR. A cet ARN est ajouté un mélange de
dNTP, d’enzymes Reverse transcriptase et DNA Polymérase, de MgSO4 25mM, de tampon,
issu du kit Access RT-PCR System (Promega) et les deux amorces. Celles-ci, issues de la
séquence de la MMP-a pour la réaction d’hybridation, sont les suivantes :
amorce 5’ : 5’ CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA 3’
amorce 3’ : 5’ AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT 3’
210
Après amplification, les divers échantillons sont déposés dans un gel d’agarose 3% soumis à un
champ électrique. En fin de migration, le gel préalablement coloré au bromure d’ethidium est
observé sous UV.
Matériel :
Réactifs :
Produits testés :
Extrait EtOAc
Extrait BuOH
Extrait H2O
Acide gallique
Gallate d’éthyle
Kaempferol
Quercétine
Quercitrine
Quercitrine 3’-sulfate
Quercétine 3,3’-disulfate
Quercétine 3,3’,4’-trisulfate
Les extraits sont testés dans le MeOH à une concentration de 20 mg/L. Les composés quant à
eux, ont été testés dans le MeOH aux concentrations suivantes : 200, 100, 50, 10 et 2 µM.
Protocole :
-Pour les extraits, le protocole suivi est celui de : Fourneau C. et al., Phytotherapy Research,
10, (1996), 529-530.
-Pour les composés testés, nous ajoutons dans les plaques 96 puits, 100 µl de la solution à
analyser et 100 µl de solution de DPPH à 0,5 mM dans le MeOH (le témoin est effectuer avec
100 µl de MeOH et 100 µl de solution de DPPH). Après agitation, on place la plaque à
211
l’obscurité à TA pendant 30 min, puis on lit l’absorbance à λ 550 nm. Nous avons procédé à 3
mesures par échantillon.
Les mesures sont effectuées après 30 min, temps au bout duquel l’activité est maximale et
stable.
Le résultat est exprimé en pourcentage de dégradation du DPPH :
DO de la solution X
% de dégradation du DPPH = 1- X 100
DO dans le MeOH
212
VII FICHES
Terp-1 (E-phytol)
2 CH2OH
11 7
1
15
PM = 296 C20H40O
Comportement chromatographique :
C: δ 140,3 (C-3), 123,1 (C-2), 59,5 (C-1), 39,9 (C-4), 39,4 (C-14), 37,4 (C-8, C-
13
10 et C-12), 36,7 (C-6), 32,8 (C-7 et C-11), 28,0 (C-15), 25,2 (C-5), 24,8 (C-13),
24,5 (C-9), 22,7 (C-16 et Me-15), 19,8 (Me-7 et Me-11), 16,2 (Me-3)
m/z : 314 [M+NH4]+, 297 [M+H]+, 296 [M+NH4-H2O]+, 279 [M-H2O+H]+, 123
(C9H15+), 97 (C7H13+), 85 (C5H9O+), 83 (C6H11+), 81 (C6H9+)
213
Terp-2 (squalène)
19 23
15
6 10
PM = 410 C30H50
Comportement chromatographique :
C (J modulé): δ 135,10 (C, C-6, C-19), 134,89 (C, C-10, C-15), 131,22 (C, C-2,C-
13
23), 124,42 (CH, C-3, C-22), 124,31 (CH, C-7, C-11, C-14, C-18), 39,75 (CH2, C-5,
C-9, C-16, C-20), 28,28 (CH2, C-12, C-13), 26,79 (CH2, C-4, C-21), 26,70 (CH2, C-
8, C-17), 25,67 (CH3, Me-1, Me-24), 17,66 (CH3, Me-2, Me-23), 16,03 (CH3, Me-6,
Me-10, Me-15, Me-19)
m/z : 428 [M+NH4]+, 411 [M+H]+, 428 [M+H]+, 342 [M-C5H9+H]+, 274 [M-
C10H17+H]+, 206 [M-C15H25+H]+, 138 [M-C20H33+H]+, 70 [M-C25H41+H]+
214
Terp-3 (lupéol)
29
30 CH2
20
21
19
22
25 26 28
3 27
HO
24 23
PM = 426 C30H50O
Comportement chromatographique :
C (J modulé) : δ 151,0 (C-20), 109,3 (C-29), 79,0 (C-3), 55,4 (C-5), 50,5 (C-9),
13
48,4 (C-18), 47,8 (C-19), 43,0 (C-17), 42,8 (C-14), 40,8 (C-8), 40,0 (C-22), 38,8
(C-4), 38,7 (C-1), 38,1 (C-13), 37,2 (C-10), 35,6 (C-16), 34,3 (C-7), 29,7 (C-21),
28,0 (C-23), 27,5 (C-2, C-15), 25,2 (C-12), 21,0 (C-11), 19,4 (C-30), 18,4 (C-6),
18,0 (C-28), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26), 15,4 (C-24), 14,5 (C-27)
m/z : 444 [M+NH4]+, 427 [M+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 394 [M-H2O-Me+H]+, 218
(g), 207 (a), 203 (g-15), 190 [a-OH+H]+, 136, 135, 121
215
Terp-4 (β-amyrine)
29 30
12
H
25 26
28
3 27
HO
24 23
PM = 426 C30H50O
Comportement chromatographique :
C (J modulé): δ 145,2 (Q C-13), 121,7 (CH C-12), 79,0 (CHOH C-3), 55,2 (CH C-
13
5), 47,7 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,9 (CH2 C-19), 41,7 (Q C-14), 39,8 (Q C-8),
38,8 (Q C-4), 38,6 (CH2 C-1), 37,2 (CH2 C-22), 37,0 (Q C-10), 34,8 (CH2 C-21),
33,3 (CH3 C-29), 32,7 (CH2 C-7), 32,5 (Q C-17), 31,1 (Q C-20), 28,4 (CH3 C-28),
28,1 (CH3 C-23), 27,3 (CH2 C-2), 27,0 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 26,0 (CH3 C-
27), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 18,4 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-26), 15,6 (CH3
C-24 et C-25)
m/z : 427 [M+H]+, 412 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 218 (g’), 207 (a), 203
(g’-15), 189 (g’-29, a-18)
216
Terp-5 (palmitate de β-amyrine)
29 30
12 H
25 26
28
3 27
C15 H31 COO
24 23
PM = 664 C46H80O2
Comportement chromatographique :
Pouvoir rotatoire
[α] 20
D = +58° (c 0,2, CHCl3)
C (J modulé) : δ 173,5 (COO C-1’), 145,2 (C C-13), 121,7 (CH C-12), 80,6
13
(CHOO C-3), 55,3 (CH C-5), 47,6 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,8 (CH2 C-19),
41,7 (C C-14), 39,8 (C C-8), 38,3 (CH2 C-1), 37,7 (C C-4) 37,8, 37,2 (CH2 C-22),
36,9 (C C-10), 34,8 (CH2 C-21 et C-2’), 33,3 (CH3 C-29), 32,6 (CH2 C-7), 32,5 (C
C-17), 31,9 (CH2 C-14’), 31,1 (C C-20), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4,
29,3, 29,2, 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 26,9 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15),
25,9 (CH3 C-27), 25,2 (CH2 C-3’), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 23,5 (CH2 C-
2), 22,7 (CH2 C-15’), 18,3 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,5 (CH3 C-25),
14,1 (CH3 C-16’)
Données SM
217
Terp-6 (coriolate de β-amyrine)
30 29
12
25 26 28
1' 3 27
9' COO
Z
13' 24 23
18'
E
11'
OH
PM = 704 C48H80O3
Comportement chromatographique :
λmax = 236 nm
[α] 20
D = +32° (c 0,2, CHCl3)
m/z : 722 [M+NH4]+, 705 [M+H]+, 690 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 295
(C18H31O3+), 279 (C18H31O2+), 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (g’-29, a-18), 167,
71 (C4H9+)
218
Terp-7 (palmitate d’α-amyrine)
30
29 19
12
25 26 28
3
27
C15H31COO
1'
24 23
PM = 664 C46H80O2
Comportement chromatographique :
Pouvoir rotatoire :
[α] 20
D = +53° (c 0,2, CHCl3)
C (J modulé) : δ 173,6 (COO C-1’), 139,8 (C C-13), 124,4 (CH C-12), 80,6
13
(CHOO C-3), 59,1 (CH C-18), 55,3 (CH C-5), 47,7 (CH C-9), 42,1 (C C-14), 41,6
(CH2 C-22), 40,1 (C C-8), 39,6 (CH C-19 et C-20), 38,5 (CH 2 C-1), 37,7, 37,8 (C
C-4), 36,8 (C C-10), 34,9 (CH2 C-2’), 33,8 (C C-17), 32,9 (CH2 C-7), 31,9 (CH2 C-
14’), 31,3 (CH2 C-21), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4, 29,3 (CH2 C-15),
29,2, 28,7 (CH3 C-23), 28,1 (CH3 C-28), 26,6 (CH2 C-16), 26,2, 25,2 (CH2 C-3’),
23,7 (CH2 C-2), 23,4 (CH2 C-11), 23,3 (CH3 C-27), 22,7 (CH2 C-15’), 21,4 (CH3 C-
30), 18,3 (CH2 C-6), 17,5 (CH3 C-29), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,7 (CH3 C-25),
14,1 (CH3 C-16’)
Données SM
219
Flav-1 (kaempferol)
OH
4'
HO O
3
OH
5
OH O
PM = 286 C15H10O6
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
C: δ 175,9 (C-4), 163,8 (C-7), 160,7 (C-5), 159,1 (C-4’), 156,1 (C-9), 146,8 (C-2),
13
135,6 (C-3), 129,4 (C-2’ et C-6’), 121,6 (C-1’), 115,4 (C-3’ et C-5’), 103,0 (C-10),
98,1 (C-6), 93,4 (C-8)
220
Flav-2 (quercétine)
OH
3'
OH
4'
HO O
9
10 3
5 OH
OH O
PM = 302 C15H10O7
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
C: δ 175,8 (C-4), 163,6 (C-7), 160,7 (C-5), 156,1 (C-9), 147,8 (C-4’), 146,7 (C-
13
2), 145,0 (C-3’), 138,6 (C-3), 121,9 (C-1’), 119,9 (C-6’), 115,5 (C-5’), 114,9 (C-2’),
102,9 (C-10), 98,1 (C-6), 93,3 (C-8)
Données SM
221
Flav-3 (quercitrine) OH
OH
4'
HO O
3
O
OH O Rha-1
OH
OH
O
OH
CH3
Rha-6
PM = 448 C21H20O11
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
Pouvoir rotatoire :
[α] 20
D = -158° (c 0,2, MeOH)
C: δ 177,7 (C-4), 164,1 (C-7), 161,2 (C-5), 157,2 (C-9), 156,4 (C-2), 148,4 (C-
13
4’), 145,1 (C-3’), 134,2 (C-3), 121,0 (C-6’), 120,7 (C-1’), 115,8 (C-5’), 115,4 (C-
2’), 104,0 (C-10), 101,8 (Rha-1), 98,6 (C-6), 93,6 (C-8), 71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-
3), 70,3 (Rha-2), 70,0 (Rha-5), 17,4 (Rha-6)
Données SM
222
Flav-4 (quercitrine 3’-sulfate)
OSO3-
OH
4'
HO O
3
O
OH O Rha-1
OH
OH
O
OH
CH3
Rha-6
PM = 527 C21H19O14S
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
Pouvoir rotatoire :
[α] 20
D = -10° (c 0,2, MeOH)
C: δ 177,6 (C-4), 164,2 (C-7), 161,2 (C-9), 156,7 (C-5), 156,4 (C-2), 151,7 (C-
13
4’), 140,7 (C-3’), 134,5 (C-3), 125,6 (C-6’), 123,0 (C-1’), 120,8 (C-2’), 117,0 (C-
5’), 104,1 (C-10), 102,0 (Rha-1), 98,7 (C-6), 93,6 (C-8), 71,4 (Rha-4), 70,6 (Rha-
3), 70,1 (Rha-2 et Rha-5), 17,4 (Rha-6)
223
Flav-5 (quercétine 3,3’-disulfate)
OSO3-
3'
OH
4'
HO O
9
10 3
5 OSO3-
OH O
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
H: δ 8,04 (H-6’, dd, J=2,3 et 8,6 Hz), 7,85 (H-2’, d, J=2,1 Hz), 6,87 (H-5’, d, J=8,7
1
C: δ 177,6 (C-4), 163,9 (C-7), 161,2 (C-5), 156,0 (C-9), 155,7 (C-2), 151,8 (C-
13
4’), 140,5 (C-3’), 132,5 (C-3), 126,9 (C-6’), 123,0 (C-1’), 121,6 (C-2’), 116,8 (C-
5’), 104,1 (C-10), 98,4 (C-6), 93,3 (C-8)
m/z : 499 [M+K-2H]-, 483 [M+Na-2H]-, 461 [M-H]-, 403 [M-SO3+Na-2H]-, 381
[M-SO3-H]-, 301 [M-2SO3-H]-
224
Flav-6 (quercétine 3,3’,4’-trisulfate)
OSO 3 -
3' OSO 3-
4'
HO O
7
3
5 OSO 3-
OH O
Données UV (MeOH) :
H: δ 8,12 (H-2’, d, J=2,2 Hz), 8,03 (H-6’, dd, J=2,2 et 8,9 Hz), 7,59 (H-5’, d, J=8,9
1
C: δ 177,6 (C-4), 162,8 (C-7), 160,2 (C-5), 154,8 (C-9), 147,5 (C-2), 145,3 (C-
13
4’), 141,7 (C-3’), 132,1 (C-3), 123,5 (C-1’), 122,5 (C-6’), 118,5 (C-2’), 117,4 (C-
5’), 103,0 (C-10), 97,3 (C-6), 92,0 (C-8)
m/z : 655 [M+3K-4H]-, 617 [M+2K-3H]-, 585 [M+2Na-3H]-, 563 [M+Na-2H]-, 541
[M-H]-, 499 [M-SO3+K-2H]-, 461 [M-SO3-H]-, 381 [M-2SO3-H]-, 301 [M-3SO3-H]-
225
Flav-7 (méarnsitrine)
OH
OMe
4'
HO O
OH
3
O
OH O Rha-1
OH
OH
O
OH
CH3
Rha-6
PM = 478 C22H22O12
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
C: δ 150,7 (C-4’), 108,1 (C-2’ et C-6’), 102,1 (Rha-1), 98,2 (C-6), 93,2 (C-8),
13
71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-3), 70,3 (Rha-2), 70,1 (Rha-5), 59,8 (4’-OMe), 17,5 (Rha-
6)
Données SM
226
Ac Ph-1 (Acide gallique)
COOH
HO OH
OH
PM = 170 C7H6O5
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
C : δ 170,4 (C-1’), 146,4 (C-3 et C-5), 139,6 (C-4), 122,0 (C-1), 110,3 (C-2 et C-
13
6)
227
Ac Ph-2 (gallate d’éthyle)
COOCH 2CH 3
1
HO OH
OH
PM = 198 C9H10O5
Comportement chromatographique :
Données UV (MeOH) :
H: δ 7,01 (H-2 et H-6, 2H, s), 4,24 (H-2’, 2H, q, J=7 Hz), 1,31 (H-3’, 3H, t, J=7
1
Hz)
C: δ 168,6 (C-1’), 146,5 (C-3 et C-5), 139,7 (C-4), 121,8 (C-1), 110,0 (C-2 et C-
13
Données SM EI
228
AG-1 (acide palmitique)
OH
1 O
16
PM = 256 C16H32O2
Comportement chromatographique :
C: δ 175,6 (C-1), 33,7 (C-2), 32,0 (C-3 ou C-14), 29,7-29,1 nd, 24,7 (C-15), 22,7,
13
14,1 (C-16)
Données SM EI
229
VIII Liste des noms usuels pour les flavones
Nom OH OMe
Kaempferol 3,5,7,4’
Kaempferide 3,5,7 4’
Rhamnocitrine 3,5,4’ 3’
6-hydroxykaempferol 3,5,6,7,4’
Quercétine 3,5,7,3’,4’
Rhamnétine 3,5,3’,4’ 7
Isorhamnétine 3,5,7,4’ 3’
Tamarixétine 3,5,7,3’ 4’
Rhamnazine 3,5,4’ 7,3’
Ombuine 3,5,3’ 7,4’
Myricétine 3,5,7,3’,4’,5’
Patulétine 3,5,7,3’,4’ 6
Eupatolitine 3,5,3’,4’ 6,7
Spinacétine 3,5,7,4’ 6,3’
Jacéidine 5,7,4 3,6,3’
Véronicafoline 3,5,4’ 6,7,3’
Eupatine 3,5,3’ 6,7,4’
Quercétagétine 3,5,6,7,3’,4’
Gossypétine 3,5,7,8,3’,4’
230
X Liste des figures
Page
231
Figure 47 : Spectre 13C J modulé de Terp-7 (50 MHz, CDCl3) 101
Figure 48 : Spectre 1H de Flav-1 (200 MHz, DMSO-d6) 104
1
Figure 49 : Spectre H de Flav-2 (200 MHz, DMSO-d6) 106
Figure 50 : Spectre 13C de Flav-2 (50 MHz, DMSO-d6) 106
Figure 51 : Spectre 1H de Flav-3 (200 MHz, DMSO-d6) 108
13
Figure 52 : Spectre C de Flav-3 (50 MHz, DMSO-d6) 109
Figure 53 : Spectre FAB- de Flav-4 110
Figure 54 : Spectre 1H de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 111
13
Figure 55 : Spectre C de Flav-4 (50 MHz, DMSO-d6) 112
Figure 56 : Spectre XHCORR de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 113
Figure 57 : Spectre COSY de Flav-4 (DMSO-d6) 114
Figure 58 : Spectre FAB- de Flav-5 115
Figure 59 : Spectre 1H de Flav-5 (200 MHz, DMSO-d6) 116
13
Figure 60 : Spectre C de Flav-5 (50 MHz, DMSO-d6) 117
Figure 61 : Spectre FAB- de Flav-6 118
Figure 62 : Spectre 1H de Flav-6 (200 MHz, DMSO-d6) 119
13
Figure 63 : Spectre C de Flav-6 (100 MHz, DMSO-d6) 120
Figure 64 : Spectre 1H de Flav-7 (300 MHz, DMSO-d6) 121
Figure 65 : Spectre 13C de Ac Ph-1 (50 MHz, CD3OD) 125
1
Figure 66 : Spectre H de Ac Ph-2 (200 MHz, CD3OD) 127
Figure 67 : Spectre EI de AG-1 128
Figure 68 : Métabolisation du XTT en formazan 130
Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des
kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H 132
Figure 70 : Activité du palmitate de β-amyrine sur la production de prostaglandine 6KPGF1α
par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM 135
Figure 71 : Activité des extraits sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par
les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM 135
Figure 72 : Effet du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1
à la suite d’une stimulation inflammatoire 138
Figure 73 : Principales réactions dans l’organisme 139
Figure 74 : Activité antiradicalaire des différents extraits à 20 mg/ml 141
Figure 75 : Activité antiradicalaire des composés isolés 141
232
XI Liste des tableaux
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233