BIOQUIMICA HUMANA

Cadena de Transporte de Electrones Fosforilacin oxidativa Mitocondriopatias

Objetivos: Definir los conceptos de oxidado, reducido, oxidante, reductor. Definir potencial redox Describir las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de las mitocondrias. Enumerar los componentes de la cadena respiratoria y de las molculas transportadoras de electrones Describir los procesos de transferencia de electrones dentro de cada componente de la cadena respiratoria Enumerar los compuestos que especficamente bloquean el transporte de electrones y localizar sus sitios de accin Describir el modelo quimiosmtico de fosforilacin oxidativa Describir la localizacin mitocondrial, la estructura y funcionamiento de la ATP sintasa. Explicar el mecanismo propuesto para la sntesis de ATP por la ATP sintasa durante el flujo de protones. Describir l mecanismo de la ATP-ADP traslocasa Estimar el rendimiento de ATP por cada molcula de NADH FADH2 que entrega sus electrones en la cadena respiratoria Explicar el control respiratorio Explicar el efecto de desacoplantes sobre la fosforilacin oxidativa y cmo este mecanismo puede ser usado para la termognesis. Describir cadenas de transporte de electrones no fosforilantes Analizar desde el punto de vista bioqumico las mitocondriopatias

_______________________________________________________________

Oxidaciones biolgicas Las clulas necesitan energa para realizar el trabajo que representa mantenerse vivas, crecer y reproducirse. La habilidad para encauzar la energa en un trabajo biolgico es una propiedad fundamental de los organismos vivos. La transferencia de electrones en las reacciones de xido-reduccin es una caracterstica central del metabolismo. Estas reacciones involucran la prdida de un electrn por una especie qumica, la cual ser por lo tanto oxidada, y la ganancia de electrones por otra especie qumica, la cual ser reducida. El flujo de electrones en las reacciones de xido-reduccin es responsable, directa o indirectamente, de todo el trabajo realizado por los organismos vivos. Es decir, las oxidaciones biolgicas son reacciones que cumplen 2 funciones: 1) oxidar a ciertas molculas orgnicas generando nuevos compuestos con propiedades diferentes. Por ej. el citocromo P450 hidroxila compuestos aromticos hacindolos ms solubles en soluciones acuosas. Tambin, los aminocidos pueden ser oxidados para producir neurotransmisores. 2) producir energa para impulsar los procesos biolgicos termodinmicamente desfavorables tales como la sntesis de protenas, cidos nucleicos o la contraccin muscular. La energa qumica potencial no es liberada en las reacciones biolgicas, sino que en realidad se conserva en un enlace de alta energa en las molculas de ATP.

Se denomina respiracin celular al proceso de oxidacin total de todos los nutrientes a CO2 y H2O, con la participacin del O2 como aceptor final de los electrones provenientes

de las oxidaciones de los nutrientes y la consecuente generacin de ATP a partir de ADP ms fosfato (Pi). De modo que en la respiracin celular, gran parte de la energa liberada en el proceso oxidativo se conserva en uniones qumicas, que son las que se establecen entre los grupos fosfatos y las molculas de ADP para generar molculas de ATP.

Metabolismo respiratorio El metabolismo energtico de los organismos quimiotrficos es una oxidacin gradual de molculas combustibles de naturaleza orgnica (glucosa, aminocidos, cidos grasos), siempre acompaado por la reduccin de una coenzima de oxido-reduccin, ya sea NAD+ o FAD, que acta como aceptor de electrones y de H+. Por ejemplo, en el metabolismo de la glucosa se observan 6 procesos oxidativos diferentes: uno durante la gluclisis, otro durante la transformacin de piruvato en acetil CoA y el resto en el ciclo de los cidos tricarboxlicos (CTC). Durante estos procesos, los 6 tomos de carbono de la molcula de glucosa se oxidan completamente a CO2 y 12 pares de electrones se transfieren al NAD+ y al FAD, generando las formas reducidas de estas coenzimas, NADH y FADH2. La oxidacin de los cidos grasos consiste en la remocin cclica de unidades de 2 carbonos, como acetil CoA. Cada ciclo de oxidacin est acompaado por la reduccin de una molcula de NAD+ y otra de FAD. Adicionales molculas de coenzimas reducidas se forman al oxidarse los restos de acetil CoA en el CTC. Los aminocidos tambin se catabolizan por vas oxidativas que utilizan las mismas coenzimas como aceptores de electrones. De lo expuesto surge entonces que es necesario asegurar una disponibilidad continua de coenzimas oxidadas para permitir la constante oxidacin de todos los nutrientes. La disponibilidad continua de molculas de coenzimas oxidadas para actuar como aceptores de electrones depende de la reoxidacin inmediata de las coenzimas reducidas, de manera que la reduccin de las coenzimas durante la oxidacin de los sustratos est acompaada y balanceada por un proceso simultneo en el que se generan las formas oxidadas de las mismas. En estos procesos de reoxidacin de las coenzimas es donde se pone en evidencia la necesidad del O2 para el metabolismo aerbico, ya que es el aceptor final de electrones de las coenzimas reducidas durante la oxidacin gradual de los combustibles metablicos. La transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 al oxgeno es un proceso muy exergnico, por lo que la reoxidacin de las coenzimas es responsable de la mayor parte del ATP que se forma durante el metabolismo (32 de los 36 ATP que se forman por oxidacin aerbica de la glucosa en las clulas eucariotas). Todos los procesos descriptos constituyen el metabolismo respiratorio, que puede considerarse como dos procesos separados pero ntimamente relacionados: 1) el metabolismo oxidativo, en el cual electrones y H+ se transfieren desde sustancias orgnicas a coenzimas oxidadas, con la consiguiente reduccin de las mismas y 2) la reoxidacin de las coenzimas reducidas por transferencia de los electrones al O2 acompaada indirectamente por la formacin de ATP. La transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxgeno no se realiza en forma directa, sino que en este proceso participan una serie de molculas que actan como transportadoras de electrones. El proceso de transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxgeno se denomina cadena respiratoria. En condiciones aerbicas, la va glucoltica es la fase inicial del catabolismo de la glucosa, como lo es la oxidacin del catabolismo de los cidos grasos. Los otros tres componentes del metabolismo respiratorio son:

a) el ciclo de los cidos tricarboxlicos (CTC), responsable de la oxidacin total del acetil CoA , b) la cadena de transporte de electrones, necesaria para la reoxidacin de las molculas de coenzimas a expensas del oxgeno molecular y c) la fosforilacin oxidativa (FO) del ADP a ATP como consecuencia de un gradiente de protones que se genera durante el transporte de electrones.

A continuacin se estudiar el mecanismo de reoxidacin de las coenzimas por transferencia de electrones al oxgeno molecular, como as tambin el mecanismo que acopla la energa liberada durante el transporte de electrones con la fosforilacin oxidativa del ADP que lleva a la sntesis de ATP. Sin embargo no debe olvidarse que en las clulas estos procesos no ocurren como eventos aislados, sino que integran el metabolismo respiratorio. Las cuatro etapas: fase inicial, CTC, transporte de electrones y fosforilacin oxidativa tienen que realizarse en forma continua y muy integrada para que el metabolismo respiratorio pueda satisfacer las necesidades energticas de las clulas, segundo a segundo. Caractersticas generales de las mitocondrias La mitocondria es la organela en donde ocurre la etapa final de la oxidacin de los nutrientes. As, la mitocondria es el sitio del metabolismo oxidativo de los eucariontes. Contiene, como demostraron A. Lehninger y E. Kennedy en 1948, la piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo de los cidos tricarboxlicos, las enzimas que catalizan la oxidacin de los cidos grasos y las enzimas y protenas redox que intervienen en el transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa. Estos procesos generan la mayor parte de la energa celular en condiciones aerbicas. Por ello se le describe como la planta de energa de la clula. El tamao, nmero y forma de las mitocondrias vara de un tejido a otro, pero la estructura bsica de las mismas es igual en todos ellos. El nmero y tamao de las mitocondrias guarda estrecha relacin con las necesidades energticas de la clula. Los hepatocitos pueden contener ms de 1000 mitocondrias cada uno, mientras que los eritrocitos maduros, que dependen totalmente de la glucolisis para obtener energa, no contienen ninguna. Las mitocondrias estn constitudas por dos membranas concntricas con propiedades y funciones biolgicas marcadamente diferentes. La membrana mitocondrial externa est en contacto con el medio citoplasmtico, en tanto que la interna delimita un espacio central denominado matriz mitocondrial. La membrana mitocondrial interna se presenta plegada, estos pliegues se denominan crestas. Las crestas son ms abundantes en mitocondrias de clulas con intensa actividad respiratoria. La siguiente figura muestra un corte esquemtico de una mitocondria.

La membrana externa es permeable a pequeas molculas (de peso molecular menor a 5.000 Da) e iones. La permeabilidad de esta membrana se atribuye a la presencia en la misma de una protena transmembrana llamada porina la cual forma canales o poros. Otras protenas de esta membrana son las enzimas implicadas en la sntesis mitocondrial de lpidos y las enzimas que transforman en la matriz los sustratos lipdicos en formas metabolizables. En cambio la membrana interna, ms rica en protenas, es prcticamente impermeable a sustancias polares e inicas. El agua, el CO2 y el O2 son algunas de las pocas molculas que pueden atravesar libremente la membrana mitocondrial interna. La mayora de las molculas que atraviesan la membrana mitocondrial interna lo hacen nicamente por la mediacin de protenas transportadoras especficas. Por ejemplo, el ATP y el ADP no difunden libremente a travs de la membrana mitocondrial. Una protena transportadora especfica, ATP-ADP translocasa permite que estas molculas cargadas atraviesen la membrana. De manera similar el piruvato, los cidos grasos, los aminocidos y los cetocidos son llevados por transportadores especficos a la matriz mitocondrial, donde se localizan los sistemas enzimticos que participan en la degradacin de los mismos. Los componentes de la cadena de transporte de electrones y el complejo enzimtico responsable de la sntesis de ATP se hallan en la membrana mitocondrial interna. El espacio intermembrana contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucletidos. La matriz contiene una mezcla altamente concentrada de enzimas, incluyendo las que son necesarias para la oxidacin del piruvato y los cidos grasos y para el ciclo de Krebs. La matriz contiene tambin ADN llamado mitocondrial, ribosomas mitocondriales, tARN y varias enzimas requeridas para la expresin de genes mitocondriales. Al igual que el ADN bacteriano, y a diferencia del nuclear, el ADN mitocondrial es circular, no presenta los genes interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones) y no est asociado con protenas, es decir, se trata de ADN desnudo. Otro hecho sobresaliente es que la sntesis mitocondrial de protenas puede bloquearse con antibiticos, como el cloranfenicol, la tetraciclina, y otros del grupo de los macrlidos; pero no se inhibe con la cicloheximida como los ribosomas citoplasmticos. De todas maneras las mitocondrias no son genticamente autosuficientes. La mayora de las estructuras necesarias para que desarrollen su funcin, son codificadas por genes nucleares. El ADN mitocondrial slo tiene informacin para la sntesis de sus propios ribosomas y para algunos de sus ARN de transferencia. En cuanto a las protenas, codifica para algunas pocas subunidades de algunos complejos enzimticos situados en la membrana interna de la organela. El resto de las protenas involucradas en el ciclo de Krebs y en la fosforilacin se sintetizan en el citoplasma y se transporta hasta la mitocondria para cumplir su funcin. En la figura siguiente se esquematizan los procesos mitocondriales ms importantes.

CONCEPTO DE OXIDO-REDUCCION Antes de seguir adelante con la cadena respiratoria vamos a hacer un breve repaso de las reacciones de xido-reduccin. OXIDACION: Cuando una sustancia qumica se oxida, pierde electrones. Los siguientes son ejemplos de reacciones de oxidacin: Fe2+ ------------> Fe3+ + e +2e

R-CH2-OH ------------> R-C-H + 2H+ O + H2 ------------> 2 H + 2e

REDUCCION: Cuando una sustancia qumica se reduce, gana electrones. Ejemplos de reacciones de reduccin: Fe3+ + e -----------> Fe2+ O2 + 2 H+ --------> H2O CUANDO OCURRE UNA REACCION DE OXIDACCION, DEBE OCURRIR SIMULTANEAMENTE UNA REACCION DE REDUCCION. Los electrones liberados en la reaccin de oxidacin son captados inmediatamente por otra especie qumica, la cual se reduce, en la reaccin de reduccin, de manera que oxidacin y reduccin son procesos acoplados. Ejemplo: O O R-C-H + H2O --------> R-C-OH + 2 H+ + 2 e (Oxidacin) O2 + 2 H+ + 2 e ------> H2O (Reduccin) ---------------------------------------------------------O O R-C-H + H2O + O2 + 2 H+ + 2 e --->R-C-OH + 2 H+ + 2 e + H2O Reaccin global O O R-C-H + O2 ------------> R-C-OH La reaccin global que describe una reaccin de xido-reduccin o redox es la suma de dos reacciones que deben ocurrir simultneamente, una de ellas describe una reaccin de oxidacin y otra una de reduccin. Cada una de ellas constituye una hemireaccin. En la reaccin del ejemplo anterior, el aldehdo representado por la frmula R-CO-H se oxida a cido R-CO-OH, en tanto que el O2 se reduce a H2O, como se indica en cada hemireaccin. Se dice que la especie que se oxida (es decir aquella que cede electrones) acta como agente reductor, en tanto que la especie que se reduce (es decir aquella que acepta electrones) acta como agente oxidante. Por lo tanto en este ejemplo el aldehdo es el agente reductor, en tanto que el oxgeno es el agente oxidante. La tendencia de las sustancias reaccionantes, en una reaccin de redox, a ceder o captar electrones, se expresa numricamente como POTENCIAL REDOX.

Aspectos energticos del flujo electrnico En los sistemas biolgicos podemos hablar de cuatro modalidades de transferencia de electrones:

Directamente como electrones (por ej. De Fe2+ a Fe3+) Como hidrgeno ( H+ + e-) (reacciones en las que interviene el FAD) Como hidruro ( H - ) (deshidrogenadas ligadas a NAD) Por combinacin directa de un reductor orgnico con O2 (hidroxilacin de esteroides)

A igual concentracin de reactantes y productos, los electrones tendern a fluir espontneamente desde un transportador con un valor de Eo ms negativo hacia otro con Eo positivo. La secuencia lineal de los distintos transportadores que est propuesta en los modelos aceptados coincide con este razonamiento y puede verse en diferentes representaciones. Podemos concluir entonces que la posicin de los transportadores en la cadena depende del valor de su Eo. Debemos tener en cuenta que debido a que las concentraciones de reactivos y productos raramente son iguales, lo que determinar la direccin del flujo electrnico no ser el potencial estndar, sino el potencial real teniendo en cuenta las concentraciones de todas las molculas participantes en el proceso del transporte, y su estado de oxidacin. Los electrones se desplazarn entonces en la direccin de un Eo ms positivo, si los reactivos (las formas reducidas de los dadores de electrones y las formas oxidadas de los aceptores), estn presentes en una concentracin suficientemente alta relativa con sus productos (dadores oxidados y aceptores reducidos). Esto es simplemente aplicar la ley de Accin de Masas. Finalmente, an si el proceso es termodinmicamente favorable, puede que no ocurra a menos que los transportadores estn lo suficientemente cerca. Los contactos entre transportadores en la cadena respiratoria depender de cmo estn ubicados los Hemos, flavinas, quinonas y centros Fe-S en las protenas a las que se unen, y de cmo estn acomodadas las protenas en las membranas Transportadores de electrones de generales de la cadena respiratoria la cadena respiratoria. Caractersticas

Como todos sabemos, vivimos en un bao de 20% de oxgeno. Desde un punto de vista termodinmico, la materia viva es muy inestable con respecto a la combustin por oxgeno. Pero desde un punto de vista cintico el oxgeno es estable. As es que para que las clulas consuman oxgeno activamente y a una velocidad compatible con la vida, se requieren enzimas que lo activen. La molcula de oxgeno es muy estable y por ello es energticamente desfavorable aadir un electrn para formar el radical aninico Superxido: O2- . Por esta razn el ataque oxidante por oxgeno tiende a ser lento. Luego que ha adquirido un electrn, resulta fcil a los electrones adicionarse a la estructura. Organizacin y componentes de la cadena respiratoria: A partir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cuatro complejos enzimticos denominados I, II, III y IV. Adems, se puede aislar y caracterizar el complejo V ATPasa o ATP sintasa que sintetiza ATP en un proceso denominado fosforilacin oxidativa. Los complejos I-IV contienen a la cadena de transporte de electrones, mientras que el complejo V cataliza la sntesis de ATP por lo que no es propiamente un componente de la cadena de transporte de electrones. Cada complejo acepta o dona electrones a acarreadores transportadores relativamente movibles como la coenzima Q y el citocromo c. Cada acarreador de la cadena de transporte de electrones puede recibir electrones de un donador y subsecuentemente

pueden donarlos al siguiente acarreador de la cadena, finalmente se combinan con Oxgeno y protones formando agua. Este requerimiento por Oxgeno hace que este proceso de transporte de electrones se denomine tambin cadena respiratoria, la cual utiliza la mayora del Oxgeno consumido por un organismo aerobio. Con la excepcin de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son protenas. Estas protenas pueden funcionar como enzimas como en el caso de varias deshidrogenasas, pueden contener hierro como parte de su centro hierro-azufre o pueden contener cobre, como en el caso de los citocromos a y a3.

Complejo

Nombre

No. de Protenas 46 5

Grupos prostticos

Complejo I ComplejoII

NADH Dehidrogenasa Succinato-CoQ Reductasa CoQ-cit c Reductasa Citocromo Oxidasa

FMN, 7 Fe-S centros FAD, cyt b560, 3 Fe-S centros

Complejo III Complejo IV

11 13

cit b, cit b, cit c1, Fe-S cit a, cit a3, CuA, CuB

COENZIMAS DE OXIDO REDUCCION La fosforilacin oxidativa comienza con la entrada de electrones en la cadena respiratoria. La mayora de esos electrones provienen de la accin de ciertas enzimas llamadas deshidrogenasas que colectan los electrones de diferentes vas catablicas y las canalizan en los aceptores universales de electrones que son los: (1) nucletidos de nicotinamida (NAD+ NADP+) y (2) los nucletidos de flavina

Nicotinamida adenina dinucletido (NAD+)

Participa en reacciones del tipo: Sustrato reducido + NAD+ sustrato oxidado + NADH + H+ Las deshidrogenadas que usan NAD+ como cofactor remueven 2 atomos de hidrogeno de sus sustratos. Uno de ellos es transferido como ion hidruro (:H-) al NAD+; el otro es liberado como H+ al medio. Fosfato del dinucletido de adenina y nicotinamida (NADP+): tiene una estructura similar al NAD+, pero el hidroxilo 2' del NAD+ se halla esterificado con cido fosfrico. Participa en generalmente en reacciones anablicas. Tanto el NAD+ como el NADP+ se asocian reversiblemente a las enzimas y ninguno de ellos puede atravesar la membrana mitocondrial interna.

Deshidrogenasas dependientes de NAD+: Isocitrato DH, Etanol DH, Gliceraldhido 3 fosfato DH, Lactato DH, Dihidrolipoil DH, L--Hidroxiacetil-CoA DH, D-- hidroxibutirato DH, Glicerol 3 fosfato DH, L-malato DH Deshidrogenasas dependientes de NADP+: Isocitrato DH, D-glucosa 6 fosfato DH Deshidrogenasas dependientes de NAD+ o NADP+: L-glutamato DH Mecanismos de las deshidrogenaciones dependientes de NAD+: El siguiente esquema muestra las transformaciones que experimenta el anillo de la nicotinamida en el transcurso de una reaccin redox. El caso particular representado corresponde a la oxidacin de un alcohol primario, R-CH2-OH, a aldhedo, R-COH. El centro reactivo del NAD+ es un anillo de nicotinamida. Este centro reactivo se reduce incorporando en su ncleo dos electrones, los que son aportados por el sustrato que se oxida, en forma de ion hidruro (H-). Recordamos que el ion hidruro contiene un protn y dos electrones y por lo tanto tiene carga negativa. La forma oxidada de la coenzima tiene una carga positiva, al incorporar en su estructura los equivalentes de reduccin en forma de in hidruro, la molcula queda elctricamente neutra.

Nucletidos de flavina: Flavina mono nucletido (FMN) y Flavina adenina dinucletido (FAD). Estn unidos covalentemente a la enzima. Los nucletidos de flavina oxidados pueden aceptar uno dos electrones cuando estan oxidados y ceder uno dos electrones cuando estn reducidos. El potencial de reduccin estndar de un nucletido de flavina depende de la protena con la que est asociado Estructura

Deshidrogenasas y oxidasas flavin dependientes Enzima NADH DH Succinato DH Dihidroxilipoil DH Acetil CoA DH Xantin oxidasa D-amino-acido oxidasa Aldehido oxidasa Coenzima FMN FAD FAD FAD FAD FAD FAD

10

Reduccin del anillo de isoaloxacina de los nucletidos flavnicos

Mecanismo de reduccin del anillo de isoaloxacina El ncleo isoaloxacina comprende dos dobles enlaces conjugados capaces de fijar dos tomos de H en forma reversible sobre los 2 tomos de N extremos, N1 y N5 , sealados en la figura. En este caso la molcula se reduce incorporando los equivalentes de reduccin en forma de tomos de H. Sobre cada tomo de N se fija un protn y un electrn. Cada electrn del tomo de H que se incorpora interacta con un electrn del tomo de N y permite que se establezca entre ambos tomos una unin covalente. Los dos tomos de H que toma el anillo de isoaloxacina en el proceso de reduccin provienen del sustrato que se oxida. Debe quedar claro que una especie qumica que se reduce acepta electrones. Sin embargo, esos electrones se pueden incorporar como electrones libres (como en el caso de la reduccin del tomo de Fe3+), como iones hidruro (por ejemplo en el caso de la reduccin del NAD+) donde la especie queomica que se reduce incorpora 2 electrones y un protn o como tomos de hidrgeno (como ocurre en la reduccin del FAD) donde la especie oxidada incorpora los electrones unidos a protones. El esquema siguiente muestra el mecanismo de reduccin del anillo de isoaloxacina presente en los nucletidos de flavina.

COENZIMA Q (CoQ) : Tambin llamada ubiquinona, es una quinona con una larga cadena isoprenoide. Las caractersticas hidrofbicas de esta molcula determinan su alta movilidad dentro de la membrana mitocondrial. Los grupos carbonilo que estn presentes en la forma oxidada de la molcula se reducen aceptando cada uno de ellos un electrn y un protn, de modo que cada una de las dos funciones cetona se transforman en funcin alcohol. La forma reducida de la molcula se denomina ubiquinol.

11

PROTEINAS con Fe Y AZUFRE: Otras protenas participan en el transporte de electrones en el complejo NADH DH y entre los citocromos. Son protenas con hierro (hierro no heminico) y S. Algunas de estas estructuras se muestran en la siguiente figura, donde los grupos R unidos a las cisteinas representan el resto de las cadenas polipeptdicas. Los tomos de Fe, que se unen a los grupos sulfhidrilo de cisteinas de las protenas, participan en la transferencia de electrones pasando del estado ferrico al estado ferroso y viceversa:

Citocromos: Son protenas que poseen la caracterstica de absorber determiando longitud de onda de la luz visible debido a que contienen un hemo como grupo prosttico. Las mitocondrias contiene 3 clases de citocromos: a, b y c. EI grupo hemo del citocromo b es del tipo que se encuentra en la hemoglobina y en la mioglobina. EI grupo hemo del citocromo a difiere del grupo hemo del citocromo b en las cadenas laterales unidas a los C2 y C8: en el C2 presenta una cadena isoprenoide y en C8 un grupo formilo, en lugar del grupo vinilo y del grupo metilo que presenta el hemo del citocromo c en los C 2 y 8 respectivamente. Ambos grupos hemo estn unidos fuertemente pero de manera no covalente a la protena. En el grupo hemo del citocromo c al C2 y al C4 se unen grupos tiometilos, en vez de los grupos vinilo que posee el citocromo b. Los grupos hemo de los citocromos del tipo c estn unidos covalentemente a la protena a travs de residuos de cistena.

12

Como ocurre con las flavoproteinas, el potencial de reduccin estndar del Fe en el hemo de un citocromo depende en gran medida del entorno proteico, esto determina que si bien la especie que se oxida y reduce reversiblemente en todos los citocromos es la misma (el Fe 2+/Fe 3+), el potencial de reduccin es diferente para cada uno de ellos, an cuando contengan el mismo tipo de grupo hemo. El citocromo C es una protena soluble de bajo peso molecular y muy conservada en los seres vivos. Se comporta como una molcula mvil que conecta los componentes III y IV de la cadena respiratoria. Flujo de electrones a travs de los transportadores Observando los valores de los potenciales de reduccin de los distintos transportadores de electrones (Tabla 1) se deduce que en la cadena respiratoria los electrones fluyen en el mismo sentido que se incrementan los potenciales de reduccin de los diferentes transportadores: desde los componentes de menor potencial de reduccin hacia los de mayor potencial de reduccin. Por lo tanto, la trayectoria que siguen los electrones desde las coenzimas reducidas hasta llegar al 02 est determinada por los potenciales de reduccin de los distintos transportadores ms que por un ordenamiento espacial de los mismos. Obviamente estos tienen que estar dispuestos de manera que los electrones puedan ser transferidos en el orden indicado por los potenciales de reduccin. AI fluir los electrones a travs de los transportadores desde el NADH hasta el 02 se producen descensos bruscos de energa libre, que estn sealados en la figura siguiente. Estos ocurren a nivel del complejo NADH-Coenzima Q reductasa, Coenzima Qcitocromo c reductasa y citocromo oxidasa. Simultneamente a la transferencia de electrones a travs de estos complejos, se produce un bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana, lo cual genera un gradiente electroqumico. La energa que genera la transferencia de electrones hacia el oxigeno es almacenada en el gradiente de protones que se forma simultneamente.

13

COMPLEJO I NADH deshidrogenasa NADH:ubiquinona oxido reductasa: Cataliza 2 procesos acoplados simultneos (1) la transferencia exergnicas de un ion hidruro desde el NADH y un protn desde la matriz a la ubiquinona (CoQ). NADH + H+ + CoQ _____ NAD+ + CoQH2 (2) La transferencia endergnica de 4 protones desde la matriz al espacio intermembrana cada 2 electrones transferidos. El Complejo I acta por lo tanto como una bomba de protones impulsada por la energa de la transferencia de electrones, moviendo los protones desde la matriz (que comienza a estar negativamente cargada) al espacio intermembrana (que comienza a estar positivamente cargado). El dominio que contiene el FMN con el cual interacciona el NADH penetra en la matriz mitocondrial. La CoQ reacciona dentro del dominio de membrana. Los centros hierroazufre estn en el dominio de unin al NADH en un dominio conector cercano al segmento de membrana.Las reacciones redox que ocurren son: NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2 FMNH2 + (Fe-S)ox FMNH + (Fe-S)red + H+ Despus, el FMNH es reoxidado por transferencia de electrones con el siguiente centro hierroazufre: FMNH + (Fe-S)ox FMN + (Fe-S)red + H+

Los electrones pasan a travs de una serie de centros Fe-S dentro del complejo I hasta que son transferidos a la CoQ, la cual acepta 2 electrones y toma 2 H+ para dar la CoQ reducida: QH2. COMPLEJO II Succinato Co Q deshidrogenasa: pertenece al ciclo de Krebs. El aceptor inicial de electrones es el FAD, el cual es reducido a FADH2 durante la oxidacin del succinato a fumarato. El FADH2 es luego reoxidado por transferencia de electrones a travs de una serie de 3 centros Fe-S a la CoQ, generando CoQH2 : FAD FeScentro 1 FeScentro 2 FeScentro 3 CoQ

14

IMPORTANTE: Otros sustratos de las deshidrogenadas mitocondriales tambin pasan electrones a la cadena respiratoria a nivel de la ubiquinona (CoQ), pero no a travs del Complejo II. Estos son: a) El primer paso en la beta-oxidacin de los cidos grasos (Acil CoA ) por la flavo protena Acil CoA deshidrogenasa es la transferencia de electrones desde el sustrato al FAD de la enzima. A continuacin, los electrones son cedidos a la protena transferidora de electrones (ETFP) quien a su vez pasa los electrones a la ETFP-Ubiquinona xido reductasa. Esta reductasa es una protena FeS que tambin tiene unido un nucletido de flavina y pasa los electrones a la cadena respiratoria al reducir al CoQ b) El glicerol que viene de la degradacin de los triglicridos, se convierte por fosforilacin en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) por la glicerol 3fosfato deshidrogenasa, enzima localizada en la cara externa de la membrana mitocondrial interna, que reduce a la CoQ (lanzadera del glicerol fosfato) COMPLEJO III Ubiquinona-cit c oxido reductasa: acepta electrones de la CoQH2 que se gener por la transferencia de electrones en los complejos I y II. Dentro de su compleja estructura, los electrones son transferidos por los citocromos b y por el Fe3+ de proteinas frricas no hmicas. Finalmente el Complejo III acopla la transferencia de electrones de QH2 al citocromo c con el transporte de cuatro protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. As, se puede plantear la siguiente ecuacin: QH2 + 2 cit c (oxidados) + 2 H+ -- Q + 2 cit c (reducidos) + 4 H+ El grupo prosttico del complejo III es el cit c1, el cual reduce al citcromo c que es el donor de electrones al complejo IV.

COMPLEJO IV citocromo oxidasa: acepta los electrones del cit c y los transfiere al oxigeno para realizar la siguiente reaccin irreversible:

O2 + 4 H+ + 4 e -------- 2 H2O El complejo citocromo oxidasa contiene hemo a, hemo a3, CuA (que consiste en 2 tomos de Cu adyacentes) y CuB. El O2 reacciona en un centro binuclear que consiste en hemo a3 y CuB. Por cada dos electrones que pasan a travs del complejo IV se transfieren 2 H+ hacia el espacio intermembrana

15

La energa de la transferencia de electrones es conservada como un gradiente de protones (energa potencial) La reaccin neta de transferencia de electrones a travs de la cadena respiratoria es altmente exergnica (G < 0). La finalidad del transporte de electrones a travs de la cadena no es solamente reoxidar las coenzimas reducidas (NADH FADH2), sino tambin generar ATP a partir de ADP + Pi. La energa liberada en la transferencia de electrones entre determinados componentes de la cadena es utilizada para la sntesis de ATP. En el esquema estn indicados los sitios de la cadena donde se libera energa suficiente para la sntesis de ATP.

Tabla 1: Potenciales de oxido-reduccin estandar de algunos pares redox conjugados (A pH 7 y a 25C) Ecuacin del electrodo 2 H+ + 2 e ----------- H2 NAD+ + 2 H+ + 2 e----- NADH + H+ Piruvato + 2 H+ + 2 e----- Lactato Oxaloacetato + 2 H+ +2 e-- malato Fumarato + 2 H+ +2 e----- Succinato Ubiquinona + 2 H+ + 2 e--- ubiquinol EO' (V) - 0.421 - 0.320 - 0.185 - 0.166 - 0.031 + 0.100

2 citocromo b (Ox.) + 2 e -- 2 cit b (red.) + 0.030 2 citocromo c (Ox.) + 2 e --- 2 cit c + 0.254 (red.) 2 citocromo a3 (ox.) + 2 e --- 2 cit3 + 0.385 (red.) O2 + 2 H+ + 2 e------- H2O + 0.816

Etapas de la transferencia de electrones que permiten la formacin de ATP

16

La cadena de transporte de electrones puede ser inhibida en sitios especficos Una serie de compuestos qumicos tienen efectos txicos debido a que inhiben en sitios especficos, el transporte de electrones de la cadena respiratoria. Como puede observarse en la figura presentada a continuacin, la rotenona (insecticida) y el amital (un barbiturato) inhiben a nivel de la NADH deshidrogenasa. Por lo tanto los electrones o equivalentes de reduccin derivados de la deshidrogenasa unida al NAD no son oxidados por la cadena de transporte de electrones en presencia de rotenona, mientras que los derivados de las deshidrogenasas unidas al FAD son libremente oxidados. El antibitico antimicina A inhibe la transferencia de electrones a nivel de citocromo b, mientras que el paso terminal catalizado por la citocromo c oxidasa es inhibido por cianuro, azida o monxido de carbono. El cianuro y la azida se combinan con el Fe3+ del hemo en los citocromos a y a3 e impiden su reduccin por los electrones que derivan del citocromo c reducido. El monxido de carbono se une al Fe2+ de citocromo oxidasa. Por lo tanto la inhibicin del transporte de electrones mitocondrial resulta en una alteracin de la funcinnormal generadora de energa y lleva a la muerte del organismo.

FOSFORILACION OXIDATIVA: SINTESIS DE ATP ASOCIADA AL FLUJO DE ELECTRONES EN LA CADENA RESPIRATORIA. Hasta ahora vimos como se realizaba el flujo de electrones a travs de los componentes de la cadena respiratoria. La pregunta que se plantea ahora es: de que modo este flujo de electrones a travs de la cadena respiratoria conduce la energa hacia la sntesis de ATP? Es decir, cual es el mecanismo por el cual la energa liberada en una reaccin exergnica (oxidacin de NADH y reduccin de O2) se canaliza hacia (o bien se acopla con) una reaccin endergnica (condensacin de ADP y Pi).

Teora Quimiosmtica Volvamos ahora a la bsqueda de una teora que permita responder De qu manera la transferencia de electrones a travs de la cadena respiratoria coopera con la ATP-Sintetasa para producir la fosforilacin de ADP produciendo ATP? Se plantearon varias hiptesis para contestar este interrogante. Entre ellas, por analoga con los mecanismos de fosforilacin a nivel de sustrato, que vieron en la gluclisis, se postul la existencia de un intermediario qumico de alta energa. En la va glucoltica, por ejemplo, el gliceraldehdo 3-fosfato se oxida y se convierte en 1,3 difosfoglicerato, un compuesto con un grupo de alta energa en el sitio de oxidacin. Cuando este compuesto transfiere el Pi activado al ADP, se produce la sntesis de ATP.

17

Esta idea dio origen a la llamada teora de acoplamiento qumico, segn la cual, a partir de la energa liberada en la transferencia de electrones a travs de la cadena respiratoria, se produce algn intermediario qumico de alta energa. La energa de este posible intermediario podra ser utilizada para la sntesis de ATP. A pesar de los mltiples esfuerzos invertidos en la bsqueda de este posible intermediario qumico, no se pudo identificar ningn compuesto capaz de cumplir con esta funcin. Durante la dcada del 60, Peter Mitchell, postul una hiptesis alternativa que permite explicar los resultados experimentales, y an hoy, luego de ms de cuatro dcadas de exhaustiva experimentacin con tcnicas cada vez ms sofisticadas, es la teora ms ampliamente aceptada. Segn la teora de Mitchell, tambin llamada teoria quimiosmotica, la transferencia de electrones a travs de la cadena respiratoria es acompaada por el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana. Este mecanismo tiene como consecuencia la generacin de una diferencia en la concentracin de protones a travs de la membrana, es decir un gradiente de pH (pH). Segn la teora quimiosmtica, esta energa del gradiente electroqumico se utiliza para la sntesis de ATP catalizada por F1 cuando los protones retornan pasivamente a la matriz mitocondrial a travs del poro de protones del componente Fo de la ATPsintasa. En estas condiciones, el medio presente en la matriz mitocondrial se alcaliniza (se hace menos cida) respecto al medio presente en espacio intermembrana, ambos separados por la membrana mitocondrial interna. Dado que el protn es una especie qumica con carga elctrica, se genera en realidad, un gradiente electroqumico (o sea de concentracin y de carga). La energa electroqumica inherente a esta diferencia en la concentracin de protones y a la separacin de cargas, se denomina fuerza protnmotriz y representa la conservacin parcial de la energa de oxidacin de los combustibles. La ATP-Sintasa es un complejo enzimtico localizado en la membrana mitocondrial interna, que est formado por dos componentes principales llamados fraccin F1 y fraccin Fo (atencin aqu el subndice se refiere a que es el componente sensible a oligomicina de la enzima y por lo tanto es la letra o y no el nmero 0 (cero)). El componente F1 proyecta hacia la matriz mitocondrial y el Fo forma un poro o canal travs de la membrana mitocondrial interna. La porcin F1 purificada y aislada no slo no cataliza la sntesis de ATP, sino que tambin cataliza la reaccin inversa, es decir la hidrlisis del ATP formando ADP + Pi, por lo que originalmente se la denomin F1-ATPasa. F1 est constituida por seis subunidades (tres pares de subunidades y ) que tiene varios sitios de unin de ADP y ATP y que forman como una cabeza apoyada sobre un tallo constituido por las subunidades (delta), (gama), y (psilon). Este complejo proteico est ubicado en la periferia de la membrana y se mantiene unida a sta mediante su interaccin con la porcin Fo de la enzima. Fo es, a su vez, un complejo proteico integral de membrana formado por cuatro o ms subunidades diferentes que conforman un canal transmembrana a travs del cual pueden pasar los protones. El complejo completo F1 Fo, al igual que F1 aislada, puede catalizar la hidrlisis de ATP, pero su funcin biolgica es la reaccin inversa, es decir la condensacin de ADP y Pi, para formar ATP. Por lo tanto el complejo F1 Fo se denomina correctamente ATP-Sintasa.

18

Cmo se logra la sntesis de ATP? Paul Boyer propuso el mecanismo de catalisis rotacional. Como mencionamos en prrafos anteriores la parte principal del complejo F1 est formado por los tres dimeros , esta unidad tiene forma de hexamero. La actividad catalittica de este hexamero est localizada en las subunidades . Las subunidades y estn unidas al anillo c, y giran con l. Cada rotacin de 120 de la subunidad induce la aparicin de cambios de conformacin en los centros catalticos de las unidads del los dmeros , provocando la alteracin de los centros de fijacin de los nucetidos situado en . As, los centros de fijacin de nucletidos van alternando entre tres estados: Estado O = estado abierto, L = unin libre y T= unin tensa (en ingls, tight) Aunque la composicin de aminocidos de las tres subunidades es idntica, sus conformaciones difieren en parte por la asociacin a la subunidad . Los dmeros son asimtricos, cada uno de ellos presenta una conformacin diferente en cada estado. Las tres subunidades interaccionan de tal modo que, cuando una adopta la conformacin O, otra ha de adoptar la conformacin L y la del otro una conformacin T. La conformacin T posee mayor afinidad para ATP que para ADP + Pi y disminuye con ello la constante de velocidad de la reaccin en valores cercano a uno; es decir, substrato y producto se encuentran en condiciones estndar, cerca de la equimolaridad.

H+N: H+ en la matriz mitocondrial (negativamente cargada) H+P: H+ en el espacio intermembrana (positivamente cargado)

La sntesis de ATP se inicia en el estado L con la unin de ADP y Pi. El siguiente estado es la conformacin T que sigue la condensacin del ADP y Pi a ATP con la formacin de un enlace fosfodister. Finalmente, el estado O deja libre el producto ATP, y vuelve nuevamente al estado L iniciando nuevamente la siguiente ronda de sntesis. Por lo tanto, una rotacin completa de la subunidad provoca que cada subunidad se cicle a travs de sus tres conformaciones posibles y en cada rotacin se sintetizan y se liberan de la superficie del enzima tres molculas de ATP. La interconvercin conducida por protones, direccional y cclica, de los estados O, L y T, permite una produccin continua. Este mecanismo se conoce como mecanismo de cambio de la fijacin.3 El paso dependiente de energa no es la sntesis de ATP sino su liberacin de un lugar de unin compacta. Esta liberacin se produce por la rotacin de que requiere energa, que impulsa los cambios conformacionales de los dmeros . Est liberacin se produce simultneamente con la unin del ADP y el Pi, que se haban unido previamente, se unen a un lugar T para experimentar una conversacin espontnea a ATP, mientras que el lugar O, del que se liber el ATP, une otro ADP y Pi para empezar de nuevo el proceso

Inhibidores y desacoplantes de la Fosforilacin oxidativa: Como ya mencionamos, la teora quimiosmtica permite explicar la dependencia de la transferencia de electrones con la sntesis mitocondrial de ATP. Cuando la sntesis de ATP se bloquea, por ejemplo en presencia de oligomicina, los protones no pueden fluir hacia la matriz a travs del complejo F1Fo (que est bloqueado por la oligomicina). Por lo tanto, sin la posibilidad del retorno de protones hacia la matriz mitocondrial y a medida

19

que contina el bombeo de protones por la actividad de la cadena de transporte de electrones, el gradiente no slo no se disipa sino que se va incrementando hasta que la energa que se necesita (cada vez mayor) para bombear un protn hacia afuera en contra de su gradiente, iguala o supera la energa que se obtiene en el transporte de electrones. En esa situacin, se interrumpe la transferencia de electrones, la energa libre del proceso completo del flujo de electrones y el bombeo de protones se hace igual a cero y por lo tanto se alcanza el estado de equilibrio. Esta teora tambin permite explicar el mecanismo de accin de los desacoplantes qumicos. Como ya dijimos, algunos de estos desacoplantes son cidos dbiles hidrofbicos que pueden difundir fcilmente a travs de la membrana mitocondrial. Luego de entrar a la matriz mitocondrial en estado no disociado, pueden disociarse, liberar protones y con ello, disipar el gradiente de pH. Dado que se produce un cortocircuito, los protones no atraviesan la ATP-Sintetasa y por lo tanto no hay sntesis de ATP. Los ionforos, como ya dijimos, interaccionan con iones inorgnicos rodendolos de un medio hidrofbico y los complejos formados atraviesan fcilmente la membrana mitocondrial interna. Por ejemplo, la valinomicina forma un complejo lipdico con iones K+, que atraviesa la membrana mitocondrial. La entrada de cargas positivas neutraliza el exceso de cargas negativas dentro de la matriz, disipa el gradiente elctrico (aunque no el qumico) y por lo tanto, disminuye la fuerza protn-motriz. Por lo tanto, la valinomicina disminuye significativamente la sntesis de ATP sin bloquear la transferencia de electrones al O2. Mecanismos de Transporte Activo en la Membrana Mitocondrial Interna El rol primario de la transferencia de electrones es proveer energa para la sntesis de ATP, sin embargo, esta energa tambin se utiliza en otros procesos esenciales para la fosforilacin oxidativa. La membrana mitocondrial interna es impermeable a especies cargadas pero contiene dos sistemas especficos para el transporte de ADP y Pi hacia la matriz mitocondrial y de ATP hacia el citosol. La translocasa de nucletidos de adenina se extiende a travs de la membrana mitocondrial interna, une ADP3- del lado citoslico, lo transporta hacia el interior de la matriz, intercambindolo simultneamente por ATP4- que se transporta hacia el citosol. Como este mecanismo de contra-transporte, mueve cuatro cargas negativas hacia afuera y tres hacia adentro (es decir el balance es la salida de una carga negativa neta), su accin se favorece por el gradiente electroqumico (que tiene ms cargas negativas adentro que afuera). Por lo tanto, la fuerza protn-motriz favorece el intercambio de ATP/ADP a nivel mitocondrial. Existe un inhibidor especfico de este transportador, el atractilsido, un glicsido altamente txico. La toxicidad de este compuesto reside, precisamente, en su capacidad de inhibir la llegada del ATP al citosol y por ello la inhibicin de los procesos citoslicos que requieren ATP. El otro sistema de transporte esencial en la fosforilacin oxidativa es la translocasa de fosfatos, que transporta conjuntamente H2PO4- y H+ hacia la matriz a travs de un mecanismo de cotransporte que tambin est favorecido por el gradiente de protones.

20

Rendimiento del acoplamiento entre la cadena respiratoria y ala fosforilacin oxidativa Esta teora predice, entonces, la existencia de un gradiente de pH transmembrana. Esto se puede comprobar experimentalmente. Cuando se agrega un sustrato oxidable (succinato, por ejemplo) y O2 a una suspensin de mitocondrias aisladas, se puede detectar la acidificacin del medio. Las determinaciones estequiomtricas indican que cuando se transfiere un par de electrones a partir del NADH a travs del complejo I se translocan 4 H+ y los complejos III y IV translocan 6 H+ entre ambos. Adems, se ha detectado que por cada ATP sintetizado se toman 3 4 H+ del espacio intermembrana que son utilizados para transportar ADP, ATP y Pi a travs de la embrana mitocondrial interna. Cuando se calcula la relacin P/O no da un nmero exacto y actualmente se considera que el rendimiento de la cadena respiratoria acoplada a la fosforilacin oxidativa es de 2,5 cuando se oxida un NADH (10/6)y de 1,5 cuando se oxida un FADH2 (6/4). Regulacin de la Fosforilacin Oxidativa La velocidad de la respiracin celular est sujeta a diversos mecanismos de control y generalmente est limitada por la disponibilidad de ADP como sustrato para la fosforilacin. En ausencia de ADP, el consumo de O2 es muy bajo y se incrementa luego de su agregado. Se denomina control por aceptor a la dependencia de la respiracin con la concentracin de ADP. En algunos tejidos el ADP puede aumentar hasta 10 veces el consumo de O2. La concentracin intracelular de ADP es una medida del estado energtico celular. Tambin puede utilizarse como ndice, la relacin: [ATP]/[ADP] x [Pi]. Este cociente es normalmente muy alto porque predomina el compuesto ms fosforilado. Cuando aumenta la velocidad de algunos procesos que requieren energa (por ejemplo la sntesis de protenas) aumenta la velocidad de hidrlisis de ATP y por lo tanto el cociente de las concentraciones disminuye. Cuanto mayor es la disponibilidad de ADP para la fosforilacin oxidativa, la velocidad de la respiracin aumenta, causando la regeneracin de ATP. Este proceso contina hasta que el cociente de concentraciones alcanza los niveles normales altos y entonces la respiracin celular se hace ms lenta. La velocidad de la oxidacin de los distintos combustibles celulares est regulada con tal sensibilidad y precisin que el cociente ATP/ADP x Pi flucta muy ligeramente an frente a variaciones extremas de demanda energtica. Es decir, el ATP se genera prcticamente, a la misma velocidad que se utiliza en los procesos celulares que lo requieren. Curvas de consumo de oxgeno: Hay varios experimentos que demuestran el acoplamiento entre la cadena de transporte de electrones y la sntesis de ATP. Cuando mitocondrias aisladas se suspenden en una solucin a pH regulado que contiene ADP y Pi, y luego se agrega un sustrato oxidable como el succinato o el malato se producen tres procesos: 1.- El sustrato se oxida 2.- se consume O2 y 3.- se sintetiza ATP. Se puede observar sin embargo que cuando se usa malato como sustrato oxidable, se producen 3 moles de ATP/mol de malato mientras que con el succinato se obtienen 2 moles de ATP/mol de succinato. Esta experiencia nos indica que an en condiciones aisladas, las mitocondrias presentan consumo de O2 y son capaces de realizar sntesis de ATP.

21

Si ahora en un nuevo experimento se utiliza un electrodo de O2 que nos permita medir los niveles de esta molcula en la suspensin de mitocondrias, es decir el consumo de O2 mitocondrial y a distintos intervalos de tiempo a mas de determinar la cantidad de O2 se toman muestras de la suspensin para determinar el contenido de ATP. Los resultados transferidos a un eje de coordenadas sern (ver figura) Cuando se agrega una mezcla de ADP y Pi, no se modifican ni el consumo de O2 ni la sntesis de ATP. Cuando se agrega succinato, rpidamente aumenta la respiracin (es decir crece el consumo de O2) y se sintetiza ATP.

Cuando se agrega cianuro (CN-), que bloquea la transferencia de electrones entre la citocromo oxidasa y el O2, ambos procesos se detienen. Dado que la energa de oxidacin del sustrato (succinato, en este caso), es necesaria para la sntesis de ATP, no debera sorprendernos que un inhibidor del pasaje de electrones al O2 (el cianuro), bloquee la sntesis de ATP. Otro procedimiento es verificar si la inhibicin de la sntesis de ATP bloquea la transferencia de electrones en las mitocondrias aisladas. Para realizar dicha experiencia lo ms sencillo sera utilizar una suspensin de mitocondrias en una solucin de pH regulado en presencia de O2 con el agregado de un sustrato oxidable pero sin el agregado ADP es decir sin sustrato. En estas condiciones se observar que adems de la falta de formacin de ATP, la transferencia de electrones al O2, se reduce drsticamente.

Tambin se puede comprobar el acoplamiento entre la oxidacin y la fosforilacin mediante el uso de oligomicina, un antibitico txico que inhibe la ATP sintetasa mitocondrial. Como se observa en la siguiente figura, cuando se agrega oligomicina a una suspensin de mitocondrias, se detienen tanto la sntesis de ATP como el consumo de O2.

22

Dado que la oligomicina slo acta directamente sobre la sntesis de ATP, la demostracin de que esta droga tambin bloquea el consumo de O2, implica que, en condiciones fisiolgicas, ambos procesos estn obligatoriamente acoplados, es decir, cada uno de estos procesos (transporte de electrones o sntesis de ATP) no ocurre si el otro se ve alterado (sntesis de ATP o transporte de electrones) por algn motivo particular. Existen, sin embargo, ciertas condiciones y/o reactivos que permiten desacoplar la oxidacin de las coenzimas de la fosforilacin del ADP. Por ejemplo, cuando las mitocondrias aisladas se rompen mecnicamente o por el uso de detergentes, en los fragmentos de membrana obtenidos se puede observar que persiste la transferencia de electrones al O2, pero que no se produce la sntesis de ATP. Asimismo, ciertos compuestos qumicos pueden desacoplar ambos procesos sin romper la estructura mitocondrial. Estos desacoplantes qumicos incluyen cidos dbiles con propiedades hidrofbicas, como por ejemplo el 2,4-dinitrofenol (DNP) y compuestos denominados ionforos que se unen a iones inorgnicos y los rodean de una estructura hidrofbica que fcilmente atraviesa la membrana. Como se observa en la figura, cuando se agrega DNP a una suspensin de mitocondrias, an en presencia de oligomicina (que interrumpe la sntesis de ATP), se restablece el consumo de O2. Tejido Adiposo Pardo En la mayora de los mamferos, incluyendo el hombre, los recin nacidos tienen un tipo de tejido adiposo muy particular, llamado tejido adiposo pardo, en el cual la oxidacin de combustibles no se utiliza para la sntesis de ATP sino para generar calor y mantener la temperatura corporal. Los animales que hibernan, an en estado adulto, tienen tambin grandes cantidades de grasa parda. Este tejido especializado est localizado en la parte posterior del cuello de los recin nacidos y tiene color marrn debido a la presencia de un gran nmero de mitocondrias y por lo tanto de citocromos cuyos grupos hemo absorben fuertemente la luz visible. Las mitocondrias de este tejido oxidan combustibles, fundamentalmente cidos grasos, transfieren sus electrones a travs de la cadena respiratoria y como consecuencia se bombean protones hacia afuera de la matriz mitocondrial, anlogamente a lo que ocurre en otros tipos celulares. Sin embargo, las mitocondrias de este tejido poseen una protena particular en la membrana interna, la termogenina, tambin llamada protena desacoplante. Es una protena integral de membrana a travs de la cual los protones pueden volver a la matriz mitocondrial sin atravesar el complejo F1Fo. Como consecuencia de este cortocircuito de protones, la energa de oxidacin no se conserva en la sntesis de ATP, sino que se disipa como calor y contribuye a mantener la temperatura corporal. Regulacin de los niveles de ATP en el corazn El msculo cardaco que tiene una alta demanda de ATP, tiene un contenido de mitocondrias mayor que la mayora de los tejidos. Las crestas densamente empaquetadas en las mitocondrias cardacas tienen un alto contenido de enzimas del ciclo de Krebs, protenas de la cadena respiratoria, ATP-Sintetasa, ATP/ADP-translocasa, y otros componentes del metabolismo energtico. Particularmente, el msculo cardaco tiene un alto contenido de la enzima creatina-kinasa (CK), que cataliza la transferencia del enlace de alta energa del ltimo fosfato del ATP a la creatina. El rol de la creatinafosfato en el corazn (tambin en el cerebro y el msculo esqueltico) es de ser un amortiguador y un transportador energtico. La isoenzima mitocondrial de la CK est localizada en la membrana mitocondrial interna. All utiliza rpidamente el ATP para sintetizar creatina-fosfato y regenerar ADP en un sitio prximo a la ATP/ADP-translocasa. La cretina-fosfato y el ATP difunden hacia la membrana plasmtica y all pueden acceder a la Na+/K+ ATPasa, a la miosina y otras enzimas. A nivel de las miofibrillas, otra isoenzima de la CK cataliza la regeneracin de ATP a travs de la reaccin inversa. El corazn es particularmente sensible a los efectos de la anoxia isqumica y a los compuestos que interfieren con el metabolismo energtico. La prdida de ATP en la 23

membrana celular provoca el influjo de iones, especial-mente de sodio y calcio aumentando el volumen tisular. Las mitocondrias cardacas pueden secuestrar el Ca2+, que en baja concentracin estimula el ciclo de Krebs y otras reacciones del metabolismo oxidativo, pero a altas concentraciones activa una fosfolipasa que degrada lpidos de membrana. El resultado es el hinchado de las mitocondrias y la prdida de nucletidos de adenina y nicotinamida. CADENAS DE TRANSPORTE DE ELECTRONES NO-FOSFORILANTES

Adems de la cadena de transporte de electrones mitocondrial ya descripta, cuya funcin es la de sintetizar ATP utilizando la energa liberada por el flujo de electrones a travs de los distintos transportadores, existen otras cadenas que transportan electrones desde coenzimas reducidas hasta el O2 con liberacin de energa que es utilizada con otros fines. Los transportadores de todos estos sistemas se hallan siempre asociados a membranas. Las oxidasas son enzimas que catalizan la oxidacin de diferentes sustratos utilizando O2 como aceptor de electrones. El oxgeno no se incorpora en la molcula oxidada. Un ejemplo de este tipo de enzimas es la citocromo oxidasa de la cadena respiratoria que hemos descripto. En este caso el oxgeno recibe 2 electrones e incorpora 2 H+ del medio y forma H2O. Una gran mayora de las oxidasas son flavoprotenas. Las oxigenasas catalizan reacciones de oxidacin en las que un sustrato se oxida a expensas del oxgeno, pero a diferencia de las oxidasas, en este caso el oxgeno se incorpora en la molcula oxidada. Las dioxigenasas catalizan reacciones en las que los dos tomos de oxgeno del O2 se incorporan en el sustrato. Las monooxigenasas tienen un mecanismo de accin ms complejo. Catalizan reacciones donde uno slo de los tomos del O2 se incorpora en el sustrato, en tanto que el otro tomo de oxgeno se reduce a H2O. Las monooxigenasas requieren dos sustratos que actan como reductores de los dos tomos del O2: el sustrato principal acepta uno de los dos tomos de O2, el cosustrato aporta los tomos de hidrgeno para reducir el otro tomo de oxigeno a H2O. La ecuacin general de las reacciones catalizadas por monooxigenasas es la siguiente: AH + BH2 + O - O ------> A- OH + B + H2 O

donde AH es el sustrato principal y BH2 es el cosustrato. Debido a que gran parte de las monooxigenasas catalizan reacciones en las que se hidroxila el sustrato principal, a este tipo de enzimas se las denomina tambin hidroxilasas u oxigenasas de funcin mixta (e incluso se las llama oxigenasas de funcin mixta, si bien esta denominacin no es estricta). Las diferentes monooxigenasas utilizan distintos cosustratos: nucletidos de flavina reducidos (FADH2, FMH2), NADH, NADPH. Las reacciones de hidroxilacin que catalizan estos complejos enzimticos implican la transferencia de electrones desde el cosustrato hacia el tomo de oxgeno que se reduce a H2O. Esta transferencia no es directa sino que participan diferentes transportadores de electrones. Estos transportadores se organizan formando una cadena de transporte de electrones, pero en este caso como consecuencia de la transferencia de electrones a travs de estos intermediarios no se produce la sntesis de ATP. Por tal motivo a estos complejos enzimticos se los conoce como "cadena de electrones no fosforilantes". Un gran nmero de estos sistemas utilizan como transportador de electrones a una hemoprotena llamada citocromo P-450. Las reacciones de hidroxilacin catalizadas por monooxigenasas que emplean citocromo P-450 utilizan NADPH2 NADH. Estas coenzimas transfieren los electrones hacia el citocromo P-450 a travs de otro transportador de electrones, generalmente una protena Fe-S.

24

Sistema de monooxigenasas del citocromo P450 microsomal Localizacin celular: Fraccin microsmica heptica (retculo endoplsmico). Dador de equivalentes reductores: NADPH o NADH. Componentes: Flavoprotenas- Citocromo P450- protenas ferrrosulfuradas- Citocromo b5. Funcin:Catalizan la hidroxilacin de diferentes sustratos, como aminocidos, escualeno , frmacos como fenobarbital, anfetaminas, morfina. Intervienen adems en la desaturacin de cidos grasos. El citocromo P450 es inducible, es decir la sntesis de todas las enzimas que integran este complejo se incrementa cuando se ingieren drogas, por ejemplo anfetaminas o barbitricos, que son metabolizadas por este complejo. En estos casos se ha observado proliferacin del retculo liso. Esto explica porqu aquellas personas que habitualmente consumen por ejemplo barbitricos, los metabolizan ms rpidamente y deben aumentar la dosis para mantener el efecto deseado.

Sistema de monooxigenasas del citocromo p450 mitocondrial Localizacin celular: MMI de tejidos esteroidognicos: corteza suprarrenal, testculo, ovario, placenta. Dadores de equivalentes reductores: NADPH. Componentes: Citocromo P450 Protena ferrosulfurada (adrenodoxina)Adrenodoxina reductasa (flavoprotena) Funcin: Hidroxilacin de esteroides.

25

MUTACIONES DEL ADN MITOCONDRIAL La gran mayora de las enfermedades genticas estn causadas por defectos en el genoma nuclear. Adems, un pequeo nmero de enfermedades se deben a mutaciones en el ADN mitocondrial. Dadas las propiedades nicas de las mitocondrias, estas enfermedades presentan un modo de herencia caracterstico y un amplio grado de variaciones fenotpicas. Todas las clulas humanas contienen varios cientos de mitocondrias. Estas organelas contienen sus propias molculas de ADN y requieren ribosomas y ARN de transferencia propios debido a que poseen su propia versin del cdigo gentico. La transcripcin del ADN mitocondrial se produce en forma independiente del ncleo. El ADN mitocondrial est formado por 16560 pares de bases distribuidos en una molcula circular de doble cadena, es compacto. En su secuencia estn codificados dos ARN ribosomales, 22 ARN de transferencia y 13 polipptidos que intervienen en la cadena de transporte de electrones y en la fosforilacin oxidativa. Slo una pequea regin es no codificante y representa los orgenes de replicacin y los promotores para la sntesis de ARN. El ADN mitocondrial tiene herencia materna: A diferencia del ADN nuclear, el ADN mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre a travs de las mitocondrias del vulo. Los hombres heredan el ADN mitocondrial de sus madres, pero no pueden pasarlo a sus hijos puesto que los espermatozoides no aportan sus mitocondrias al fecundar el vulo. El ADN mitocondrial es heteroplsmico: dado que cada clula tiene un contenido variado de molculas de ADN mitocondrial, una nica clulas puede tener algunas molculas de ADN mitocondrial con una mutacin y otras sin mutacin. Esta heterogeneidad en la composicin del ADN se denomina heteroplasmia y es una causa importante de la expresin diferencial de las enfermedades mitocondriales. La proporcin de molculas de ADN mitocondrial mutante puede modificarse por la segregacin, cuando se dividen las clulas y proliferan las mitocondrias. Aunque la clula progenitora duplica el nmero de mitocondrias y de molculas de ADN mitocondrial antes de dividirse, y provee cantidades aproximadamente iguales a cada clula hija, la progenitora no determina cules mitocondrias irn a cada clula hija. Esto quiere decir que si un vulo fecundado lleva una mutacin en su ADN mitocondrial, una clula hija puede heredar una proporcin mayor de mitocondrias que porten un ADN mutante y otra heredar una proporcin mayor de ADN normal. Cuanto mayor sea la proporcin de molculas de ADN mitocondrial mutante, ms grave es la expresin de la enfermedad. La variacin en la expresin de las mutaciones afecta tanto a los diferentes tejidos de un individuo como a los distintos hijos de la misma madre. Un nio formado a partir de una cigota heteroplsmica puede tener algunos tejidos enriquecidos en ADN mitocondrial mutante y sus hijos pueden diferir en la gravedad y sntomas que presentan. Las alteraciones del ADN mitocondrial tienen un umbral de expresin: Cada tipo celular requiere para su funcionamiento normal una determinada cantidad de ATP producido por las mitocondrias. Aunque puede tolerarse alguna variacin en los niveles de ATP, existe un nivel umbral por debajo del cual las clulas comienzan a degenerar y a morir. Los sistemas orgnicos con grandes requerimientos de ATP y umbrales elevados tienden a ser los ms afectados. Por ejemplo, el sistema nervioso central (SNC) consume cerca del 20% de la produccin de ATP del organismo y, por lo tanto, es afectado a menudo por mutaciones del ADN mitocondrial. Los tejidos que son principalmente afectados por una disminucin en la produccin de energa son el SNC, msculo cardaco y esqueltico, riones y glndulas endocrinas.

26

El ADN mitocondrial est afectado por mutaciones somticas Las alteraciones del ADN mitocondrial suelen heredarse pero, en algunos casos, son tambin el resultados de mutaciones espontneas durante el desarrollo embrionario o de mutaciones somticas en el curso de la vida. La acumulacin de mutaciones somticas explica porque frecuentemente las enfermedades tardan aos en manifestarse y se agravan con el paso del tiempo. Pero la acumulacin aleatoria de mutaciones somticas disminuye ms la produccin de energa hasta que el nivel de energa desciende hasta valores no compatibles con el funcionamiento normal. Es decir, existe un umbral de deterioro del ADN mitocondrial por encima del cual la manifestacin fenotpica de la enfermedad aumenta marcadamente. El ADN mitocondrial tiene una velocidad de mutacin elevada. La tasa de mutacin del ADN mitocondrial es 10 veces mayor a la del ADN nuclear, y esto se debe en parte a la ausencia de los sistemas de reparacin y en parte a la generacin de radicales libres en las mitocondrias afectadas. Los radicales libres se generan como subproductos de la cadena de transporte de electrones, ms an si existe un mal funcionamiento de este proceso por una mutacin inicial en el ADN mitocondrial. Los radicales libres pueden atacar a los componentes celulares y en particular a las protenas que participan en el transporte de electrones y al ADN mitocondrial. Esto significa que basta una mutacin para iniciar un ciclo que produzca la acumulacin de mutaciones somticas en el ADN mitocondrial. La teora mitocondrial del envejecimiento propone que la acumulacin de mutaciones somticas en el ADN mitocondrial generada por los radicales libres y otros factores en el transcurso de la vida, an en personas que nacieron con ADN mitocondrial normal, lleva a un descenso en la produccin de energa. Esta alteracin de la funcin mitocondrial contribuira al deterioro del envejecimiento, como por ejemplo la prdida de vista, del odo, de la memoria, etc. Esto coincide en que en patologas producidas por mutaciones heredadas en el ADN mitocondrial aparecen caractersticas propias de la vejez: diabetes, sordera, miopatas y problemas motores. MITOCONDRIOPATIAS Las mitocondriopatas son un grupo de enfermedades que resultan de la alteracin estructural, bioqumica o gentica de las mitocondrias, como resultado de mutaciones localizadas en los genes nucleares o en los genes mitocondriales. Las mitocondriodriopatas, tambin conocidas como miopatas mitocondriales o enfermedades mitocondriales, son un grupo diverso de alteraciones que resultan de la alteracin gentica, estructural o bioqumica de las mitocondrias. Las manifestaciones clnicas de estas enfermedades son muy variadas, entre las ms comunes se encuentran: deterioro de funciones mentales, alteraciones motoras, fatigabilidad, intolerancia al ejercicio, accidentes cerebrovasculares, epilepsia, oftalmoplega, ptosis, retinitis pigmentaria, hipoacusia, ceguera, cardiopata, falla heptica y pancretica, anemia sideroblstica, pseudo-obstruccin intestinal, acidosis metablica y otras. En general se considera que afectan principalmente a los rganos que dependen predominantemente de la energa mitocondrial (sistema nervioso central, msculo, riones, sistema endocrino), sin embargo, como se encuentran mitocondrias en todos los tejidos, otros sistemas pueden estar tambin afectados. Qu pasa cuando hay un defecto en la produccin de energa? Cuando existe un defecto en la produccin de energa las reacciones metablicas que la requieren no funcionan eficazmente, ni tampoco lo hacen los rganos y sistemas de nuestro organismo, especialmente aquellos que necesitan ms energa para su funcin cerebro y sistema nervioso en general, msculo, hgado, rin).

27

Qu ocurre en el caso de un nio/a que nace con una enfermedad mitocondrial? El nio puede ya nacer con problemas, ya que la energa es necesaria para todos los procesos vitales. No obstante, las enfermedades mitocondriales pueden manifestarse a cualquier edad, en cualquier rgano o tejido que requiera energa, an cuando los sntomas predominantes son neuromusculares. Posibles manifestaciones clnicas son la hipotona, dificultad respiratoria, acidosis lctica, cardiopata, miopata, ataxia, retinitis, etc

Encefalomielopata necrotizante subaguda: Esta patologa es conocida como enfermedad de Leigh. Se manifiesta en infantes como una severa acidosis lctica y anormalidades neurolgicas. Est caracterizado por lesiones simtricas en el ganglio basal, cerebro y mdula espinal detectables por tomografa. La condicin es frecuentemente fatal. Comnmente hay una disfuncin de la cadena de transporte de electrones a nivel de la citocromo c oxidasa. Disfunciones a nivel de los complejos I (NADH - deshidrogenasa) y II (succinato deshidrogenasa), F1-F0 ATPasa., o piruvato deshidrogenasa producen el mismo cuadro clnico. Es claro que la condicin es genticamente heterognea, y puede provenir de una serie de mutaciones en los genes nucleares que codifican para las protenas de la matriz mitocondrial o la membrana interna, o de los genes mitocondriales. La enfermedad de Leigh puede ocurrir sin una historia familiar de una enfermedad similar o bien puede ser transmitida como un defecto autosmico recesivo cuando la mutacin es en un gen nuclear o bien por herencia materna cuando la mutacin es en un gen mitocondrial.

Como se diagnostica este tipo de patologas? Para el diagnstico, la evaluacin incluye la determinacin de cido lctico srico, que puede encontrarse elevado (>2.5mM) con una relacin lactato/piruvato elevada (>20). Los niveles de CPK pueden estar normales o discretamente elevados. Los exmenes disponibles para determinar posibles alteraciones metablicas incluyen a la prueba de esfuerzo y la espectroscopia por resonancia nuclear con fsforo. La biopsia muscular constituye probablemente la principal arma para el diagnstico de miopata mitocondrial. El anlisis del tejido muscular incluye el estudio de la morfologa de las fibras musculares, el estudio bioqumico de la cadena respiratoria y finalmente el anlisis molecular para la bsqueda de mutaciones del ADNmt. No hay un tratamiento dirigido disponible. Sin embargo, medidas de soporte como mejora de la nutricin, la implantacin de marcapaso cardiaco cuando est indicado, la correccin quirrgica de la ptosis y el tratamiento de epilepsia se deben utilizar para mejorar la calidad de vida de los pacientes. El tratamiento metablico incluye el uso de productos como: creatina,

28

coenzima Q, idebenone, succinato, menadion, riboflavina, nicotinamida, vitamina E, cido ascrbico, tiamina y L-carnitina. Qu tratamientos se aplican a las enfermedades mitocondriales? El tratamiento de las enfermedades mitocondriales se basa en 1) modificar la funcin de la cadena respiratoria administrando transportadores o aceptores de electrones (ubiquinona, vitaminas C), 2) reducir el acmulo de metabolitos txicos (carnitina) y 3) administrar antioxidantes (vitaminas A,E,C y ubiquinona) para reducir el estrs oxidativo causado por la mala funcin la cadena respiratoria.

29