Permeabilnost (propusnost) stani ne membrane ovisna je o: v Crpkama i v Kanalima

Membranski kanali i crpke

v Crpke koriste izvore energije kao to je ATP ili svjetlost za termodinami ki teak prijenos iona ili molekula. v Sposobne su preoblikovati jedan oblik slobodne energije u drugi. v Primjer su aktivnog transporta.

________________________________________________________________________
Prof.dr.sc. Ljubica Glava-Obrovac

v ATP-aze, P-tip ATPaza i ATP vezuju#e kasetne, hidrolizom ATP pomau prijenos iona kroz membranu. v Fosforilacija i defosforilacija predstavnica P tipa ATPaza crpki: Ca2+ -ATPaze i Na+-K+ATPaze, povezane su s promjenama u orijentaciji i afinitetu njihovih ion-veznih mjesta. v Kao primjer druga ijeg mehanizma aktivnog transporta koji koristi gradijent iona za aktivni transport drugih moe posluiti Na-Ca izmjenjiva . Ova crpka ima vanu ulogu u izbacivanju Ca2+ iz stanice.

Kanali omogu#avaju ionima brz prolaz kroz stani nu membranu Primjer su pasivnog transporta ili olakane difuzije.
Receptor za acetilkolin je kanal koji posreduje u prijenosu iv anog signala kroz sinapse (funkcionalni spojevi izme#u neurona).Ovisan je o ligandu i otvara se kao odgovor na vezanje acetilkolina. Natrij i kalij kanali, koji posreduju preko razlike potencijala u aksonima membrana ivaca, naj e$e se otvaraju depolarizacijom membrana, a rijetko vezanjem alosteri kog efektora. Rad tih kanala ovisan je o naponu. Vrlo su zanimljivi jer razlikuju vrlo sli ne ione poput K+ i Na+.

Transport molekula kroz membrane moe biti aktivan i pasivan

Dva imbenika odre# uju na koji na in $ e molekula pro$ i kroz membranu: 1) Permeabilnost molekule u lipidnom dvosloju 2) Dostupnosti izvora energije Lipofilne molekule prolaze kroz membranu jer su topljive u lipidima. Neke molekule prolaze kroz membranu jednostavnom difuzijom na osnovi gradijenta gusto$e i drugog zakona termodinamike. U tom slu aju entropija pove$ava sposobnost prolaza kroz membranu.
n

Mnoge molekule trebaju proteine-nosa e za prolaz kroz membranu

Natrijevi ioni prolaze specifi nim kanalima kroz membranu procesom zvanim olakana difuzija Prolaz natrijevih iona moe se zvati i pasivni transport jer se energija potrebna za prijenos iona dobiva na osnovi gradijenta iona. Kanali, sli no proteinima, pokazuju specifi nost za supstrat

Slobodna energija uskladitena u gradijentu koncentracije moe se izmjeriti

Odre# ivanje energije potrebne za stvaranje gradijenta koncentracije za nenabijenu otopljenu molekulu: &G = RT ln(c2/c1) = 2.303RT log10 (c2/c1)
c1 koncentracija molekule na jednoj strani; c2- koncentracija molekule na drugoj strani

Za ione promjena slobodne energije moe se prikazati kao:

&G = RT ln(c2/c1)+ZF &V = 2.303RT log10 (c2/c1) + ZF&V Z je elektri ki naboj transportirane vrste, &V je potencijal kroz membranu, izraen u voltima F je jedinica za razliku potencijala (Faraday) i iznosi 23.1 kcalV-1mol-1, odnosno 96.5 kJV-1mol-1 Kada je &G pozitivna transportni procesi su aktivni

P-tip ATP-aza
Proteini koriste hidrolizu ATP za prijenos iona kroz membranu Na+K+-ovisna ATP-aza

Ca2+-ATP-aza v enzim koji prenosi Ca2+ iz citoplazme u sarkoplazmatski retilukum (SR) mii$nih stanica v 'ini 80% proteina SR i ima vanu ulogu u kontrakcijama mii$ a v SR Ca2+ATP-aza je polipeptid (110 kDa s transmembranskom domenom koja se sastoji od 10 )uzvojnica Tri citoplazmatske domene imaju razli ite funkcije: N vee ATP; P-prihva$ a fosforil skupinu na Asp 351; A-pokre$e N-domenu. Odnosi izme#u domena zna ajno se mijenjaju hidrolizom ATP

v U ivotinjskim stanicama c(Na+) je niska, a c(K+) visoka za razliku od izvanstani nog prostora gdje su koncentracije tih iona obrnute. v Gradijent koncentracije odrava se pomo#u membranske Na+K+-ovisne ATP-aze. v Enzim se u razli itim koncentracijama nalazi u membrani svih stanica. v Hidrolizom ATP dobiva se energija za aktivni transport Na+ iz stanice i ulazak K+ u stanicu stvaraju#i pritom gradijent. v Po molekuli ATP izlazi 3 Na+, a ulazi 2 K+. Pri tome se enzim prvo fosforilira, a zatim defosforilira.

Mehanizam djelovanja P-tipa ATP-aza elu ana H+-K+ATPaza vEnzim odgovoran za ubacivanje dovoljno protona u eludac radi sniavanja pH (blizu 1.0)

1 i 2 vezanje Ca2+ i ATP i fosforilacija ATP-aze; 3- preokretanje veznog mjesta i 4-osloba# anje Ca2+ na unutranjoj strani membrane. 5- Hidroliza fosfoaspartata i ponovno preokretanje (korak 5) vra$a enzim u po etno stanje.

P-tip ATP-aza evolucijski je konzerviran i posjeduje velik raspon uloga u metabolizmu Uz prijenos Na, K, Ca i H iona ta obitelj proteina sudjeluje u prijenosu fosfolipida s aminokiselinom kao glavnom skupinom. Enzimi flipaze potpomau u izgradnji membranske asimetrije prijenosom lipida kao to je fosfatidil-serin s vanjskog u unutranji sloj membranskog dvosloja.

Digitalis specifi no inhibira Na+K+ crpku zaustavljanjem njene defosforilacije Kardiotoni ni steroidi- digitoksigenin i ouabain inhibiraju defosforilaciju E2-P oblika ATP-aze kada se primjenjuju sa vanjske strane stani ne membrane. Digitalis je smjesa kardiotoni nih steroida dobivenih iz naprstka (D. purpurea. Pove$ava kontrakcije sr anog mii$a to ga ini lijekom izbora pri kongestivnom zatajenju rada srca. Djeluje tako da inhibira Na+-K+ATP-azu.

ABC transporteri
MDR protein (multidrug resistence protein ili P-glikoprotein - Na#eno je da taj 170 kDa velik membranski protein djeluje kao ATPovisna pumpa i izbacuje velik broj molekula lijeka izvan stanice. Sastoji se od 2 transmembranske domene i 2 ATP-vezuju$e domene nazvane ATP-vezuju $e kasete (ABC). MDRP je odgovoran za injenicu da smanjenjem osjetljivosti tumorskih stanica na jedan lijek one postaju neosjetljive i na druge razli ite molekule-kemoterpaeutike. CFTR transmembranski regulator cisti ne fibroze po gra#i je homologan protein MDR proteinu. Kodira ga mutirani gen u oboljelih od cisti ne fibroze. Djeluje kao ATPregulirani kloridni kanal plazmine membrane epitelnih stanica.

ABC transporteri
v ABC su lanovi P-petlja (P-loop) nadobitelji NTPaza v Neki ABC proteini , posebno u prokariota, su proteini gra# eni od vie jedinica tako da su domena koja prolazi kroz membranu i ABC domene nalaze na razli itim polipeptidnim lancima. v Histidin permeaza iz S.
Typhimurium prenosi histidin iz u bakteriju. Gra# ena je od 2 razli ita proteinska lanca s domenom koja prolazi kroz membranu (HisQ i HisM) i homodimernog proteina (HisP) s ABC domenom. Topljivi histidin-vezuju $i protein (HisJ) vee histidin nakon to u#e u stanicu.

Sekundarni transporteri ili kotransporteri

koriste jedan gradijent koncentracije da bi imali energiju za stvaranje drugog mehanizmom obratne zamjene Sekundarne transportere dijelimo na: - antiportere - simportere Antiporteri izmjena tvari u suprotnim smjerovima; Natrij-kalcij izmjenjiva djeluje kao antiporter tako da koristi elektrokemijski gradijent Na+ za izbacivanje Ca2+ iz stanice. Pomo$ u Na+-K+ ATPaze 3 Na+ ulaze u stanicu i izlazi 1 Ca2+. Kako je kalcij vitalni glasnik za stanicu izuzetno je vana fina regulacija njegove koncentracije u stanici.

Simporteri koriste tok jedne molekule za transport druge molekule u istom smjeru. Glukoza se ubacuje u stanicu pomo$u simportera uz istovremeni ulazak Na+. Ulazak Na+ daje 2.2 kcal/mol slobodne energije pri uobi ajenim uvjetima: vanjska konc. Na+ = 143 mM, a unutarnja konc. Na+ = 14mM. Ovaj dotok slobodne energije je dovoljan za stvaranje 66x gradijenta koncentracije za nenabijene molekule poput glukoze.

Sekundarni transporteri su drevni molekularni strojevi, zajedni ki bakterijama, arheama i eukariotima -150 od 4000 proteina E. Coli su sek. transporteri

N+-K+-ATPaza pretvara slobodnu energiju prijenosa fosforila u slobodnu energiju gradijenta Na+ iona. Gradijent Na+ iona koristi se za ubacivanje molekula u stanicu djelovanjem sekundarnog transportera kakav je Na+-glukoza simporter.

Laktoza permeaza , simporter iz E. Coli, ubacuje laktozu kroz zid bakterije koriste$i gradijent protona. Sadri proton-vezuju$ e i laktoza-vezuju$e mjesto.Preokretanjem permeaze osloba#a se prvo proton, a potom laktoza.

Ionski kanali su pasivni transportni sustavi v Ionski kanali su visoko sofisticirani molekularni strojevi koji odgovaraju na kemijske i fizikalne promjene okolia. v Visoko su selektivni za pojedine ione (prim. Neki dozvoljavaju prolaz K+, ali ne i Na+ kroz membranu. Drugi prenose katione, a zaustavljaju transport aniona)

Ionski kanali
v Ionski kanali postoje u otvorenom (ioni mogu prolaziti) i zatvorenom (ne mogu poduprijeti transport iona) stanju v Prijelazi iz otvorenog u zatvoreno stanje (i obratno) regulirani su vezanjem specifi ne molekule liganda (ligand-ovisni) ili elektri nim potencijalom kroz membranu (napon-ovisni). v Otvoreno stanje kanala esto spontano prelazi u inaktivno (zatvoreno) stanje. Djeluju kao svojevrsni timer-i i tako odre#uju trajanje protoka iona.

Patch-clamp tehnike za mjerenje aktivnosti kanala

Proteini ionskih kanala gra# eni su iz jednostavnih jedinica Acetilkolin receptorski kanal
- ligand-ovisni receptor

Neurotransmiteri: male difuzibilne molekule poput acetilkolina koje prolaskom kroz sinapse prenose iv ane impulse.

Protok iona kroz kanal i prijelaz izme#u otvorenog i zatvorenog stanja kanala moe se mjeriti u mikrosekundama.

Presinapti ka membrana sinapse odvojena je od postsinapti ke membrane sinapti kom pukotinom (razmakom od 50 nm). Zavretak presinapti kog aksona ispunjen je sa sinapti kim vezikulama koje sadre oko 10 4 acetilkolinskih molekula.

Dolazak iv anog podraaja dovodi do istovremenog pranjenja sadraja 300 vezikula, a time i pove $ane koncentracije acetilkolina u pukotini od 10 nM do 500 *M za manje od 1ms.

Aktivnost acetilkolinskog receptora moe se mjeriti patch-clamp tehnikom:

Vezanjem acetilkolina na postsinapti ku membranu zna ajno se mijenja njena ionska permeabilnost. Provodljivost Na+ i K+ jako naraste unutar 0,1 ms to dovodi do velike ulazne struje Na+ i male izlazne K+. Ulazna struja Na+ depolarizira postsinapti ku membranu. Acetilkolin otvara jednostavnu vrstu kationskog kanala koji je gotovo jednako propustan i za K+ i Na+.

Snimka pokazuje promjene u provodljivosti acetilkolinskog receptora u prisustvu acetilkolina. Kanal neprestano prelazi iz otvorenog u zatvpreno stanje i obrnuto.

Shematski prikaz zatvorenog oblika acetilkolinskog receptorskog kanala

Vezanje acetilkolina na ekstracelularnu domenu dovodi do strukturnih promjena koje poti u rotaciju ) uzvojnice i na taj na in otvaraju poru.

Acetilkolinski receptor je pentamer 4 vrste podjedinica koje prolaze kroz membranu ()2, +, , i -) i spojene su u oblik prstena koji tvori poru kroz membranu.

Veliki hidrofobni aminokiselinski ostaci L (ILe, Leu, Phe) zatvaraju poru. Dolaskom acetilkolina i uslijed rotacije uzvojnice mali aminokiselinski ostaci S (Ser, Thr, Gly) zauzimaju mjesta velikih (L) i tako ine poru propusnom.

Napon-ovisni kanali Natrijevi kanali

Unutranjost neurona sadri visoke konc. K+ i nisku konc. Na+. Ionski gradijent stvara se pomo$u ATP-aza. U stanju mirovanja membranski potencijal je -60 mV.

iv ani impuls stvara se pri depolarizaciji membranskog potencijala sa -60 na -40 mV. Depolarizacijom membrane otvara se Na+ kanal. Ulaskom natrija pove$ava se membranski potencijal koji unutar 1ms postaje pozitivan (+30 mV) prije nego se vrati na staru vrijednost. Na+ kanali se tada zatvaraju, a otvaraju se K+ kanali

iv ani impuls je elektri ni signal proizveden protokom iona kroz plazminu membranu neurona i osnovno je sredstvo u komunikaciji u iv anom sustavu.

Natrijev kanal

je jednolan ani 260 kd protein s 4 ponavljaju$e jedinice (IIV).Svaka homologna jedinica sadri 5 hidrofobnih segmenata (S1, S2, S3, S5 i S6) i 1 pozitivno nabijen segment S4 koji djeluje kao naponski senzor u kanalu. Petlja izme# u S5 i S6 Visoko je konzerviran.

Djelomi no ovisi o steri kim imbenicima; Na+ i Li+, zajedno s vodom ulaze u kanal kao i hidroksilamin i hidrazin. K+ s molekulom vode je prevelik i ne ulazi u kanal:

Ionska selektivnost natrijevih kanala

Tetrodotoksin , izoliran iz ribe puhalice, vee se za natrijev kanal i u konc. od 10 ng letalan je za ovjeka.

Kalijevi kanali
Postoje strukturne sli nosti izme#u pojedinih regija natrijevih, kalcijevih i kalijevih kanala koji pokazuju etverostruku simetriju: Kalijevi kanali izgra#eni su od 4 identi ne podjedinice. Od kojih svaka sadri 2 transmembranske )-uzvojnice. Poru konusnog oblika tvore 4 podjedinice (sredina slike). S unutranje strane pora ima promjer od 10 A. Pora je ispunjena vodom.

Prolaz K+ kroz kanal

Kalijev ion prolazi u vodi udaljenost od 22 A kroz membranu. Pora se zatim suava sa 10 A na 3 A i kalij stupa u reakciju s karbonilnim skupinama aminokiselinskih ostatka pore (crveno).

Interakcije kalijevih iona sa karbonilnim skupinama u suenom dijelu pore omogu$ avaju visoku selektivnost kanala

Visoka selektivnost postignuta je i smanjenjem dijametra pore koja ne propusta ione ve$ e od 1.5 A

Energetska osnova visoke selektivnosti kalijevih kanala

Dehidratacijom K+ u interakcijama s karbonilnim kisikom omogu$ena je selektivnost kanala. Taj kisik ne stupa u rekacije s Na+ jer je premali i ostaje hidratiziran i kao takav ne prolazi kroz poru.

Gra#a kalijevog kanala omogu$ava vrlo brz transport iona

Inaktivacija kalijevog kanala

Pokusima ra#enim na divljem i mutiranom shaker proteinu (kalijev kanal) na#eno je da je amino-kraj proteina odgovoran za brzu inaktivaciju kanala (1 ms) nakom otvaranja.

Brzo

Sueni dio kanala ima dva energetski identi na vezna mjesta. Vezanjem drugog K+ stvara elektrostatsko odbijanje koje tjera prvi K+ izvan kanala.

Inaktivacija mutiranog kanala moe se ponovno uspostaviti dodatkom peptida koji sadri prvih 20 aminokiselinskih ostataka prirodnog lanca u konc. 100 *M.

Izvana

Unutra

Pukotinski prolazi (Gap junctions) omogu$avaju ionima i malim molekulama putovanje izme# u stanica i izuzetno su vani za komunikaciju me# u stanicama
Inaktivacija

Depolarizacija

Otvoreno

Zatvoreno

Neaktivno

Kanali me# u stanicama ili pukotinski prolazi su nakupljeni u plazminoj membrani. Vrlo su usko pakirani u heksonalnom nizu (A). Pukotinski prolazi premo$ uju razmak me#u stanicama. Dugi su oko 35 A. Male hidrofilne molekule (e$eri. Aminokiseline i nukleotidi) i anorganski ioni prolaze kroz te prolaze.

Inaktivacijska domena (crveno) povezana je s kanalom savitljivim lancem. Kad je kanal zatvoren ionizirana domena nalazi se u citosolu. Depolarizacijom se otvara kanal i stvara negativno nabijeno vezno mjesto za pozitivno ioniziranu domenu. Ulaskom domene u vezno mjesto inaktivira se kanal.

Kanali me# u stanicama gra#eni su od 12 molekula koneksina (30-40 kd transmembranskog proteina)

Kanali izme%u stanica razlikuju se od drugih membranskih kanala po: 1) Prolaze kroz dvije stani ne membrane 2) Povezuju citosol i citosol 3) Kanale napravljene od koneksona sintetiziraju razli ite stanice Jednom stvoren kanal izme%u stanica nastoje biti otvoreni u vremenu od 1 s do 1 min. Visoke konc. kalcija i nizak pH zatvaraju kanale izme%u stanica. Na taj na in se normalne stanice tite od traumatiziranih i umiru#ih susjeda. Ovi kanali su tako%er kontrolirani membranskim potencijalom i hormonski induciranom fosforilacijom.

Svaka molekula koneksina ima 4 transmembranske uzvojnice. est koneksinkih molekula su heksagonalno usmjerene tvore $u polukanal ili konekson. Dva koneksona stvaraju funkcionalan kanal me# u stanicama.