PRCTICA

N6
Objetivos

Siembra, aislamiento de levaduras y hongos y tipo de crecimiento

1. Que el alumno aprenda las tcnicas de cultivo y manipulacin de diferentes tipos de hongos. 2. Que el estudiante conozca las principales caractersticas morfolgicas (macroscpicas y microscpicas) de los hongos.

Introduccin
Entre los hongos filamentosos la cantidad y el tipo de esporas son muy variables y estn afectados por diferentes factores como el tipo de medio y las condiciones de cultivo. A fin de conseguir unas condiciones ptimas de esporulacin, es de gran importancia ofrecer al hongo las mejores condiciones de crecimiento posibles. Los principales mtodos aplicados para la observacin microscpica de los cultivos son la observacin en fresco con una solucin adecuada y las preparaciones en cinta adhesiva. Los cultivos observados segn estos mtodos resultan tiles en la mayora de los casos para identificar las especies, pero en muchas ocasiones no permiten revelar las principales caractersticas morfolgicas de una especie determinada. En esto caso es necesario recurrir a un tipo de preparacin ms compleja, como es la realizacin de microcultivos o cultivos en portaobjetos. Aunque existen varias alternativas que proporcionan unos buenos resultados a la vez permiten realizar preparaciones permanentes el Mtodo de Rivalier y Seydel.

Materiales
Muestras de tierra, agua de charco, frutas Agar papa dextrosa Medio de cultivo Sabouraud Suero fisiolgico ( 4,5 ml) en tubos Agua destilada estril Pipetas de 5 ml estriles Pinzas. Asas de siembra Portaobjetos Cubreobjetos Placas petri de vidrio Microscopio

Metodologa
INOCULACIN DIRECTA - (FRUTA) Con el asa de siembre en ngulo, coger una pequea porcin de la muestra de fruto u otro alimento (infectado con hongos) y sembrar por puntos, introduciendo suavemente la muestra en el agar papa zanahoria , incubar a temperatura de laboratorio .

TCNICA DE DILUCIONES - (AGUA DE CHARCO O TIERRA)

Preparar diluciones utilizando 0.5 gr de tierra o de 0.5 ml de agua en suero fisiolgico de 4.5 ml. Sembrar por diseminacin 0.1 ml de cada dilucin en una placa de PDA o agar Sabourand e incubar a temperatura ambiente. Observar el desarrollo de desarrollo de colonias de 2 a 7 das y realizar el conteo de colonias.

TCNICAS DE EXPOSICIN DE LA PLACA AL MEDIO AMBIENTE Destapar las placas de PDA o agar Sabourand y exponer al medio ambiente durante 15 minutos, luego taparlas e incubar al medio ambiente. Observar el desarrollo de colonias en los siguientes 7 das.

PREPARACIN DE LOS PORTAOBJETOS

1. Tomar portaobjetos nuevos y limpios, y colocarlos en el interior de una placa petri de vidrio de modo que en cada placa se coloque un soporte con un portaobjetos. 2. Envolver el conjunto con papel y esterilizar por calor seco en estufa. 3. Dejar enfriar antes de su utilizacin. 4. Colocar una fina capa de medio de cultivo sobre los portaobjetos. Para ello: a) Tomar un frasco de Borrell (o recipiente cilndrico de vidrio) y llenarlo con medio de cultivo fundidos que se mantendr a 42 - 45C mientras dure la preparacin. b) Al lado de un mechero abrir las placas que contienen los portaobjetos e introducirlos verticalmente en el frasco que contiene el medio de cultivo. c) Sacar el portaobjetos, dejar escurrir ligeramente y colocarlo de nuevo sobre su soporte de vidrio en el interior de la placa de petri. A continuacin cubrir y esperar a que el medio solidifique. d) Eliminar la capa de medio de cultivo de la cara inferior del portaobjetos deslizando este sobre un portaobjetos estril e) Depositar de nuevo el portaobjetos en su soporte y cubrir. El conjunto est dispuesto para a inoculacin del hongo.

INOCULACIN DEL HONGO

1. Tomar con un asa un pequeo fragmento de colonia de la cepa que hay que inocular. 2. Colocar 5 10 mL de agua destilada estril en la placa con el fin de mantener un ambiente hmedo durante todo el tiempo que dure la incubacin. 3. Envolver con papel cada una de las placas y anotar la fecha de cultivo y especie inoculada.
INCUBACIN Y DESECACIN

1. Colocar las placas as preparadas en la estufa a 26-27C. 2. Observadas diariamente. 3. Eliminar el medio de la zona libre del cultivo por raspado con un portaobjetos limpio alrededor de la periferia de la colonia. 4. Sacar los portaobjetos de sus placas depositados en bandejas adecuada e incubarlas en la estufa a 37 C durante 24 horas ms.

Cuestionario
1. Dibujar y sealar las partes microscopias observables (hifas, filides, esporas, etc.) La muestra la obtuvimos de una fruta (naranja) con la ayuda de una cinta, para lo observacin de hifas, fialides, esporangios y esporas.

2. Describir las caractersticas microscpicas y macroscpicas de los siguientes hongos: (adjuntar la grfica respectiva). a) Alternaria Alternaria en cultivo presenta unas colonias de colores obscuros, grises, olivceos, marrones o negros. Sus conidiforos son macronematosos, mononematosos, simples o ramificados, de color marrn claro a obscuro. La clula conidigena es integrada, terminal o intercalar, generalmente simpodial. Los conidios, muy caractersticos por su tabicacin longitudinal, transversal u oblicua, son del tipo dictiospreo y presentan forma ovoide u obalavada, con superficie lisa o rugosa y de coloracin marrn claro a obscuro, generalmente se forman en cadenas acrpetas. Pleospora y Clathrospora engloban la mayora de los teleomorfos de este gnero.

b) Aspergillus La estructura microscpica del Aspergillus es nica. Tienen hifas tabiculares y conidioforas cuya cabeza est localizada en el extremo de un hifa, compuesta por una vescula rodeada por una corona de filides en forma de botella directamente insertadas sobre la vescula.8 De las filides se desprenden las esporas (conidios). Otras estructuras se encuentran en ciertas especies y no en otras, por ejemplo, las clulas de Hle. Tiene 2 formas de presentacin: Una saproftica en que aparece como un hongo con hifas septadas del que surgen los conidioforos que a su vez tienen una ampliacin que es la cabez aspergilar de la que surgen unas estructuras de forma ampular que son las filides, de las que surgirn las estructuras reproductivas (tambin llamados propgulos) que reciben el nombre de fialoconidias.

c) Fusarium Las colonias de este hongo las obtenemos en el medio de cultivo Sabouraud (no en Micosel), despus de 1 a 5 das. Pueden ser algodonosas de color blanco, con diversos pigmentos segun la especie (crema, rosado, salmn, amarillo, rojo o morado). Microscopicamente posee clulas conidigenas tipo fialides formadas en la hifa area. Poseen 2 tipos de conidia: macroconidias y microconidias, que varan en forma y nmero segn la especie: - Macroconidias fusiformes, con septos transversales, producidas por sucesin basiptala en los monofialides y acumuladas en pequeas masas en la punta de la fialide. - Microconidias elipsoidales, ovales, subesfricas, piriformes o en forma de clava, producidas por sucesin basiptala en mono y polifialides y acumuladas formando falsas cabezas o en cadenas.

d) Penicillium Los tipos de Penicillium son conocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete. Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fialides en forma de botella. Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes. La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del Penicillium. Algunos no son ramificados y llevan simplemente un racimo de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.

e) Rhizopus Rhizopus spp. es un hongo filamentoso cosmopolita de suelo, frutas y verduras en descomposicin, excrementos de animales, y pan viejo. Las especies de Rhizupus son contaminantes comunes, pero son causales de infecciones oportunistas en los humanos. Algunas especies son patgenos de las plantas. Las especies ms frecuentes son Rhizopus oryzae, R. rizopodimorfis, R. stolonifer, R. microsporasy R. nigricans.

3. Cules son los antimicticos ms frecuentemente usados en la prctica clnica? Mencione 5 con sus respectivos mecanismos de accin. Ketoconazol Su oxidacin por parte de los sistemas enzimticos dependientes del citocromo P450 interfiere el metabolismo del lanosterol (dificulta la 14-desmetilacin) lo que lleva a una disminucin del ergosterol y, de forma secundaria, a un acmulo de esteroles anmalos (esteroles 14-alfametilados). Al ser mucho ms importante el ergosterol para la pared de los hongos que para la de las clulas humanas, y debido a la mayor afinidad de los primeros por los azoles, se explica la accin selectiva del ketoconazol.La falta de ergosterol altera la permeabilidad de las membranas de los hongos lo que lleva a una desestructuracin de los orgnulos intracelulares y de la capacidad de divisin. Secundariamente, el acmulo de esteroles anmalos contribuye a la fragilidad y muerte celular. Esta situacin se ve reforzada por un cierto efecto del ketoconazol sobre la sntesis de otros compuestos qumicos como son los fosfolpidos y los triglicridos. Finalmente, en algunos hongos (como es el caso de las Candidas) impiden la transformacin en pseudohifas, lo que las hace ms sensibles a la accin de los leucocitos del organismo. Terbinafina La terbinafina inhibe a la enzima escualeno 2-3 epoxidasa, por lo cual interfiere en la etapa temprana de la sntesis del ergosterol, la cual es el componente fundamental de la membrana del hongo, llevando a una deficiencia de Ergosterol y a una acumulacin del Escualeno, dando como resultado la muerte celular. Fluconazol Como otros antimicoticos imidazol y triazol, el fluconazol inhibe el citocromo P450 fngico de la enzima 14-demetilasa. La actividad de la demetilasa mamfera es mucho menos sensible al fluconazol que la demetilasa fngica. Esta inhibicin previene la conversin de lanosterol a ergosterol, componente esencial de la membrana citoplasmtica, y subsecuente acumulacin de esteroles 14-metil.El fluconazol es principalmente fungisttico, pero puede funcionar como fungicida contra ciertos organismos en una dosis dependiente.

Anfotericina B Se fija a los esteroles de la membrana de las clulas eucariotas, con mayor afinidad al ergosterol de los hongos, alterando la permeabilidad de la membrana con salida de iones sodio, potasio e hidrogeniones, provocando la muerte del hongo

Miconazol Acta de forma similar a otros imidazlicos bloqueando la sntesis de ergosterol por interaccin con el complejo enzimtico del citocromo p450, aunque de forma menos selectiva que otros antifngicos sistmicos (ketoconazolo itraconazol entre otros), lo que acarrea ms capacidad de provocar efectos secundarios.

4. Esquematice el desarrollo de la prctica y redacte una discusin. INOCULACIN DIRECTA - (FRUTA)

Tomar una pequea porcin de la muestra de fruto

Sembrar por puntos en PDA

Incubar a Temperatura del laboratorio

TCNICA DE DILUCIONES - (TIERRA)

Tomamos 10g de muestra de tierra contaminada por hongos

Llevarlo a un matraz erlenmeyer con aprox. 250 ml de agua destilada

Preparar 3 soluciones sucesivas en tubos de ensayo tomando 1 ml de la anterior y agregando 5ml de agua destilada Sembrar por diseminacin 0.1 ml de cada dilucin en una placa de PDA o agar Sabourand

Incubar a temperatura de laboratorio : Observar el desarrollo de desarrollo de colonias de 2 a 7 das

TCNICAS DE EXPOSICIN DE LA PLACA AL MEDIO AMBIENTE Destapar las placas de PDA o agar Sabourand y exponer al medio ambiente durante 15 minutos,luego taparlas e incubar al medio ambiente. Observar el desarrollo de colonias en los siguientes 7 das.

Tener el Agar en el cual se desarrollaran los hongos del medio ambiente

Exponerlas al medio ambiente durante 15 min

Observar el desarrollo durante7 das.

DISCUSION: De acuerdo a el aislamiento y siembra q realizamos a los hongos usamos mtodos de una forma correcta pero aun as siempre habr algn error ya que al evaluar el crecimiento de hongos y levaduras en ambos casos trabajamos de forma cualitativa durante la prctica.