Manual PR CellBiol-V6

Manual de Prcticas
y texto gua con conceptos tericos bsicos de
Bases de Biologa Celular

Universidad de Guadalajara, CUCI-UdG
Zaira Lpez
Peter Knauth
Vanessa Orozco
Joel Salazar
Prcticas de Biologa Celular
ndice
ndice..............................................................................................................................................I Abreviaciones............................................................................................................................... II Reglamento del Laboratorio........................................................................................................III Bioseguridad .................................................................................................................................1 Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro ...............................................................9 Microscopio: componentes y observacin ..................................................................................15 Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas.................................................................22 Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad ........29 Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas..........................................................34 Fijacin y tincin de tejidos animales .........................................................................................39 Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales..................................................................................48 Anexo: Colorantes y soluciones isotnicas.................................................................................54
Abreviaciones
Abs A. dest. BSL DNA DPX EM GLP GMO HEPA HHS HIV N.A. NB PBS RAMP rER RG RI rpm soln TSB HWD WHO Absorbancia Aqua destillatum (agua destilada) Biosafety Level (nivel de bioseguridad) Deoxyribonucleic acid (cido desoxirribonucleico) Di-n-butyl-Phthalate in Xylene (di-n-butil-ftalato en xileno) Erlenmeyer Good Laboratory Practice (buenas prcticas del laboratorio) Genetically Modified Organism (organismo genticamente modificado) High-efficiency Particulate Air (filtro de aire de alta eficiencia) U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos) Human Immunodeficiency Virus (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH) Numeric Aperture (apertura numrica) Nutrient Broth (caldo nutritivo) Phosphate-Buffered Saline (buffer fosfato salino) Rapid Adhesive Mediated Procedure rough Endoplasmatic Reticulum (retculo endoplasmtico rugoso) Risk Group (grupo de riesgo) Refractive Index (ndice de refraccin) revolutions per minute (revoluciones por minuto) solucin Tryptic Soy Broth (caldo soya tripticasa) Height Width Depth (alto ancho profundo) World Health Organization (Organizacin Mundial de la Salud, OMS)
II
Reglamento del Laboratorio

Proteccin Personal
1. Usar batas limpias o uniformes especiales en todas las prcticas. 2. Est prohibido usar las batas o uniformes fuera del laboratorio, p. ej. en aulas, cafeteras, oficinas, bibliotecas, salas para el personal, baos etc.
3. Usar calzado cerrado, de preferencia de piel, seguro para caminar (no zapatos deportivos, sandalias, zapatillas, zapatos con tacn alto).
4. Usar guantes protectores apropiados para los procedimientos que entraan contacto directo o accidental con reactivos peligrosos o materiales biolgicos infecciosos. Uso de guantes: - Revisar los guantes visualmente antes del uso (existencia de agujeros) - No tocar con guantes objetos fuera del experimento (p.ej. telfono, teclado, equipos, puertas, grifera) para evitar la distribucin del contaminante - Cambiar guantes contaminados inmediatamente! - No usar guantes por mucho tiempo (daa la piel) - Desprenderse de los guantes de manera inside out (de 'dentro a fuera') - Desechar aspticamente guantes contaminados con agentes biolgicos infecciosos - Despus del uso, lavarse bien las manos y ponerse crema para piel * No existen guantes universales, que protegen contra todo * Guantes desechables tienen una solo cierta resistencia contra reactivos 5. Usar gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos para proteger los ojos y el rostro contra salpicaduras, impactos o radiacin cuando es indicado.
III
Reglas Generales de Comportamiento en el Laboratorio

1. Es obligatorio informarse sobre los riesgos especficos de sustancias peligrosas y/o material biolgico infeccioso. Vase: http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html 2. Hay que mantener el laboratorio limpio y ordenado: - al material usado (p.ej. quitar escrituras y adhesivos) - a los equipos (p.ej. limpiar centrfuga o balanza despus de su uso) - el lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo) 3. Las superficies de trabajo se limpian antes y al final de cada jornada. Adems, se descontamina inmediatamente de todo derrame de material potencialmente peligroso. 4. El laboratorio debe ser libre de materiales no relacionados con el trabajo (p.ej. bolsas, mochilas). 5. Hay que mantener libres las salidas de emergencias. Siempre! 6. Hay que avisar a los responsables situaciones peligrosas y/o mal funcionamiento de equipos.
7. Est prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos o manipular lentes de contacto.. 8. Est prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano. 9. Celulares deben ser apagados. 10. Est prohibido correr o jugar. 11. Est prohibido usar equipos sin instruccin previa por el responsable respectivo. 12. Hay que lavarse las manos despus de manipular reactivos, animales y/o materiales biolgicos, y antes de abandonar las zonas de trabajo.
IV
Reglas Especiales de Comportamiento en el Laboratorio

1. Est estrictamente prohibido pipetear con la boca. 2. Est prohibido colocarse materiales en la boca, pasar etiquetas por la lengua, tocarse la cara con manos contaminadas (especialmente ojos). 3. Cualquier derrame o accidente con sustancias peligrosas y/o materiales infecciosos se comunican al responsable del laboratorio. Se mantiene un registro escrito de esos accidentes e incidentes. 4. Materiales contaminados hay que descontaminar antes de tirarlos o limpiarlos para ser reutilizados. 5. Mujeres embarazadas y madres amamantando no deben trabajar con sustancias peligrosas y/o material biolgico infeccioso. 6. Almacenar sustancias y mezclas en recipientes adecuados marcando: - contenido (sustancia, mezcla, concentracin) - fecha, propietario, smbolo de peligro 7. Est prohibido almacenar reactivos en envases de alimentos. 8. No se debe colocar tapas boca abajo sobre la mesa: - eso deja residuos qumicos sobre la mesa y - trae contaminacin al recipiente 9. No se debe devolver reactivos a su envase original para evitar contaminacin al recipiente original. 10. Se usa una esptula para sacar reactivos de su envase. 11. No se debe daar las etiquetas al trasvasar (p.ej. por goteo). 12. No se debe llenar recipientes ms de 90 % de su mxima capacidad. 13. Cerrar bien los recipientes no usados. 14. Sustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles txicos, nocivos, cancergenos, corrosivos o inflamables se manejan en una campana de extraccin. 15. Para el transporte hay que evitar derrames accidentales utilizando envases secundarios (estrilizable) o recipientes irrompibles.
Prctica de Biologa Celular
Bioseguridad
Prctica 1
Bioseguridad
Tipo de prctica: grupal Duracin de la prctica: 2 h
Objetivo
Adquirir el conocimiento para la mejor utilizacin de agentes biolgicos en prcticas experimentales y con ello minimizar los riesgos que atenten contra la salud.
Introduccin
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas para reducir el riesgo de contraer enfermedades por diferentes agentes biolgicos. En los laboratorios, donde se utilice cualquier material biolgico, debe existir un manual de bioseguridad y una infraestructura adecuada para el manejo del agente biolgico; sin embargo la actitud y el modo de proceder de aquellas personas que trabajan en estos laboratorios determinarn su propia seguridad. Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgos La Organizacin Mundial de la Salud, la Ley General de Salud en Mxico, el Real Decreto 664/1997 de Espaa, la Directiva 2000/54/EC de la Unin Europea y el U.S. Department of Health and Human Services (HHS) coinciden en la clasificacin, que se basa en cuatro aspectos generales: 1) Caractersticas biolgicas del agente: - Reproductividad (sexual, asexual, frecuencia) - Capacidad de formar esporas, semillas etc. 2a) Virulencia para el ser humano - Infeciosidad: dosis infectiva mnima, vas de penetracin - Patogenicidad: virulencia y toxicidad - Modo de transmisin: por aerosoles, contacto, lesiones, vectores - Datos epidemiolgicos: presencia y grado de propagacin as como inmunizacin de la poblacin - Tenacidad: capacidad de sobrevivencia (dentro y fuera del laboratorio) - Tratamientos profilcticos y curativos 2b) Exposicin en el trabajo - Tipo de trabajo: organizacin y procedimiento - Frecuencia de exposicin - Medidas preventivas y posibilidad de desinfeccin 1

3) Para el medio ambiente - Relacin con otros organismos (p.ej. predadores, insectos tiles como abejas) - Relacin a los ciclos de nutrientes (p.ej. fijacin de nitrgeno) - Cambios a la biodiversidad (extinguir formas silvestres) - Medidas para un monitoreo 4) Organismos Genticamente Modificados (GMO)
Bioseguridad
- Estabilidad gentica del husped y presencia de factores de virulencia (p.ej. E. coli K12) - Estabilidad gentica de la modificacin en el husped - Movilizacin del vector/de la modificacin gentica (transferencia gentica horizontal) - Expresin de genes nuevos y la actividad del producto del gen (toxinas, factores de virulencia) Basndose en esto los agentes biolgicos se han clasificado en cuatro grupos de riesgo (RG): Agente biolgico del RG-1: Aquel que resulta poco probable que cause una enfermedad por infeccin en el ser humano. El RG-1 incluye organismos no conocidos como patgenos, microorganismos de RG > 1 con delecin (es) en su (s) gen(es) de virulencia, psicrfilos (< 20 C), termfilos (> 50 C), acidfilos (pH < 4), alcalfilos (pH > 8,5), fottrofo obligado as como cultivos celulares (de plantas, no-vertebrata y vertebrata sin primata). Cepas microbianas representativas pueden ser Agrobacterium, Bacillus (mayora), Desulfobacter, Escherichia coli K12, Lactobacillus, Leuconostoc, Propionibacterium (sin acnes), Pseudomonas (mayora), Rhodococcus, Streptomyces, Thiobacillus; Aspergillus (mayora), Candida (varios), Hansenula, Kluyveromyces, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pichia, Rhizopus, Saccharomyces, Trichoderma, Ustilago. Agente biolgico del RG-2: Aquel que puede causar una enfermedad en el ser humano y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la poblacin y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-2 incluye la mayora de organismos patgenos y parsitos, con virulencia baja para seres humanos sanos y baja probabilidad de causar una epidemia, como: patgenos para plantas (sin riesgo para animales), Actinomyces, Bacillus cereus, Chlamydia, Clostridium (algunos son RG-1), Corynebacterium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia coli, Haemophilus, Helicobacter pylori, Klebsiella, Mycobacterium (varios son RG-3), Neisseria, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus; Aspergillus niger, A. flavus y A. fumigatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. tropicalis, Microsporum, Trichphyton; Trypanosomas (varios son RG-3), Toxoplasma gondii; Adenovirus, Coronavirus, Epstein-Barr virus, Herpes simplex, Influenza virus, Papilloma virus, Polio virus as como material no caracterizado y posiblemente infeccioso (p.ej. heces, lodos activados, rganos de animales, fluidos corporales etc.). 2
Bioseguridad
Agente biolgico del RG-3: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano, presenta un serio peligro para los trabajadores y riesgo de que se propague a la poblacin, pero existe generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-3 incluye los organismos patgenos y parsitos, con virulencia moderada para seres humanos sanos y moderada probabilidad de causar una epidemia, como: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, M. bovis, Mycoplasma, Rickettsia, Yersinia pestis; Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis; Trypanosoma brucei, T. cruzi; Dengue virus, Hanta virus, Hepatitis virus, Rabia virus, Human immunodeficiency virus (HIV), Zinga virus; Creutzfeld-Jacob prin. Agente biolgico del grupo 4: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano, presenta un serio peligro para los trabajadores y alta probabilidad de que se propague a la poblacin, sin que exista una profilaxis o tratamiento eficaz. Los virus son los nicos agentes biolgicos presentes en este grupo, los ms representativos son: Ebola virus, Flavivirus, Herpes B virus, Junin virus, Lassa fiebre virus, Machupo virus, Marburg virus, X-Arbovirus.
Fig. 1: Smbolo internacional de Riesgo Biolgico
Medidas preventivas En base a la clasificacin en los 4 RG se puede implementar medidas preventivas para compensar el riesgo respectivo. Estas medidas preventivas pueden ser: a) Tcnicas: - Construccin de edificios - Construccin de equipos - Material de proteccin individual b) Organizacionales: - Responsabilidades - Instrucciones de seguridad y seales - Anotacin (experimentos, accidentes) - Cursos de seguridad - Personal calificado - Tcnicas (microbiolgicas) apropiadas (GLP) - Clulas y vectores huspedes seguros
c) Personales d) Biolgicas:
Bioseguridad
La mayora de las reglas a respeto de la bioseguridad se refiere a medidas tcnicas de contencin, es decir inhibir la liberacin (accidental) de los agentes biolgicos. Se diferencia entre 1) las tcnicas de laboratorio, 2) equipo (barreras primarias) y 3) instalacin/diseo del laboratorio (barreras secundarias). 1) Tcnicas de laboratorio: El elemento ms importante para contener los riesgos biolgicos es el seguimiento estricto de las buenas prcticas y tcnicas biolgicas (GLP). Como parte de estas prcticas est el desarrollo o adopcin por parte de cada laboratorio de un manual de operaciones (o manual de seguridad biolgica) en que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar los riesgos. Las causas ms comunes para infectarse son: - Pipetear con la boca - Lastimarse con agujas y jeringas - Exposicin a aerosoles liberados por agitacin, centrifugacin, desintegracin, flamear asas, homogeneizacin, pipetear, ultrasnicar - Falta de higiene: desinfectar rea de trabajo, equipo y manos antes y despus del trabajo as como inmediatamente cuando ocurre una contaminacin o derrame; estrilizar material contaminado 2) Equipo de seguridad (barreras primarias): Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad del personal (p.ej. campanas de seguridad biolgica nivel 1, 2 3 que eviten la liberacin de aerosoles y filtran aires de escape (Fig. 2)), como las prendas de proteccin personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, lentes etc.).
a) no seguro
b) BSL-1
c) BSL-2
d) BSL-3
Fig. 2: Campanas, las flechas indican el flujo de aire: rojo = contaminado, azul = estril. a) Banco de trabajo de aire limpio: estril para el experimento e inseguro para el trabajador, que recibe aire contaminado. b) Campana de extraccin, que protege el trabajador contra aerosoles, pero el experimento es expuesto a aire contaminado. c) Campana de flujo laminar: adecuado para trabajos de RG-2, protegiendo tanto al trabajador como al experimento. d) Cabina de alta bioseguridad, hermticamente sellada para evitar que cualquier agente biolgico pueda salir; la manipulacin ocurre a travs de guantes: adecuado para trabajos de RG-3 y RG4.
Bioseguridad
3) Diseo y construccin de la instalacin (barreras secundarias): La magnitud de las barreras secundarias depende del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas donde tiene acceso el pblico, la disponibilidad de sistemas de descontaminacin (autoclaves, incineradores etc.), el filtrado de aire de salida, presin negativa, flujo de aire direccional etc. (Tab. 1).
Tab. 1: Medidas de contencin (nivel de bioseguridad BSL) !ue se a"lican seg#n la naturale$a de las
actividades !ue est en concordancia con los gru"os de riesgos (%&)'
Medidas de contencin
1. Lugar de trabajo separado de toda actividad que se desarrolle en el mismo edificio 2. El aire introducido y extrado del lugar de trabajo se filtra por filtros de alta eficacia para partculas en el aire (HEPA) o de forma similar 3. Solamente se permitir el acceso al personal designado 4. El lugar de trabajo debe ser precintado para permitir su desinfeccin (con gas) 5. Procedimientos de desinfeccin especficos 6. El lugar de trabajo se mantendr con una presin negativa respecto a la presin atmosfrica 7. Control eficiente de vectores p.ej., roedores e insectos 8. Superficies impermeables al agua y de fcil limpieza No No
RG-2 BSL-2
RG-3 BSL-3
Aconsejable S, para la salida de aire S Aconsejable S Aconsejable S como RG-2, adems suelo S S, seguro Aconsejable S
RG-4 BSL-4
Aconsejable No S No Aconsejable S, para mobiliario Aconsejable S Aconsejable Aconsejable Cuando proceda
S, para la entrada y salida de aire S, con esclusa de aire S S S S como RG-3, adems techo y paredes S S, de alta seguridad S
9. Superficies resistentes a cidos, lcalis, disolventes y desinfectantes 10. Almacenamiento para agentes biolgicos 11. Ventanilla de observacin/un dispositivo alternativo en las zonas para que se pueda ver a sus ocupantes 12. Laboratorio con equipo propio 13. El material infectado, animales incluidos, se debe manejar en una cabina de seguridad biolgica o en un aislador u otra contencin apropiada 14. Incinerador para destruccin de animales muertos
Aconsejable
S S Si, cuando la S infeccin se propague por el aire S, disponible S, en el mismo lugar
Bioseguridad
Material a utilizar
Material didctico y visita a los laboratorios donde se trabaja con material biolgico.
Procedimiento
Esta prctica se iniciar en el saln de clases, donde el profesor explicar a los estudiantes las medidas de seguridad en los laboratorios donde se trabaja con material biolgico (infeccioso). Despus de ello el profesor trasladar a los estudiantes a cada uno de los laboratorios del Centro Universitario para ensearles la infraestructura de cada laboratorio.
Resultados
Elementos de seguridad Manual de Bioseguridad Clasificacin de agentes biol. en grupos de riesgo Medidas de contencin Laboratorio de ... Laboratorio de ... Laboratorio de ... Laboratorio de ...
Observaciones
Conclusiones
Bioseguridad
Cuestionario
Definir los siguientes conceptos: 1. Agente biolgico:
2. Microorganismo:
3. Cultivo celular:
4. Peligro:
5. Dao:
6. Riesgo:
7. Desinfeccin:
8. Contaminacin:
9. Estrilizacin:

10. Incineracin:
Bioseguridad
11. Cules pases cuentan con laboratorios de BSL-4?:
Referencias bibliogrficas
1. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. Diario Oficial de la Federacin del 3 de febrero de 1983. Disponible en: http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/compi/rlgsmis.html 2. Manual de procedimientos de Bioseguridad. Instituto de Investigaciones Biomdicas. Universidad Nacional Autnoma de Mxico (2010). Disponible en: http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/manual_bioseguridad .pdf 3. Proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos durante el trabajo. Real Decreto 664/1997, de 12 de Mayo. B.O.E. No. 124 de 24 de Mayo. 4. Biosafety in Microbbiological and biomedical laboratories. U.S. Department of Health and Human Service, 5th ed. (2009). Disponible en: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf 5a. Manual de Bioseguridad, OMS, 3a ed. (2005) http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf 5b. Laboratory Biosafety manual, WHO, 3rd ed. (2004) http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf 6. Pgina Web del Laboratorio de Biologa Celular en CUCINEGA: http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html
Soluciones ( )s"ectro*ot+etro
Prctica 2
Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 2-4 h
Objetivo
Adquirir la habilidad y aprender estrategias en la preparacin de soluciones y el uso del espectrofotmetro.
Introduccin
Solucin qumica Una solucin o disolucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. Usualmente el componente en mayor proporcin se denomina "solvente" y los que se hallan en menor proporcin "solutos". Las soluciones a su vez se pueden denominar "concentrada" si posee una cantidad relativamente alta de soluto y "diluida" si la cantidad es relativamente baja (RiaoCabrera, 2007). En funcin a la cantidad de soluto disuelto, las soluciones se pueden clasificar en insaturadas, saturadas o sobresaturadas: Insaturada: Solucin en que se ha disuelto una cantidad de soluto menor a la cantidad mxima que se puede disolver en el solvente. Saturadas: Solucin en que no se puede seguir admitiendo ms soluto, esto es cuando ms soluto ya no puede ser disuelto en el solvente. Sobresaturadas: Solucin en que se ha aadido ms soluto del que puede ser disuelto en el solvente, por lo tanto, se observa que una parte del soluto se precipita (va al fondo del recipiente). La solubilidad puede estar influenciada por la temperatura: si la temperatura aumenta, la capacidad para admitir ms soluto tambin aumenta. Fundamentos sobre el uso del espectrofotmetro Absorcin de luz: Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber radiacin electromagntica a una frecuencia caracterstica. En este proceso se transfiere energa a la molcula, que provoca una disminucin en la intensidad de la radiacin electromagntica incidente. Por consiguiente, la absorcin de la radiacin atena el rayo incidente de acuerdo con la ley de la absorcin.
La ley de absorcin, tambin conocida como ley de Lambert y Beer, o simplemente ley de Beer, proporciona informacin cuantitativa de cmo la atenuacin de la radiacin depende de la concentracin (c) de las molculas que la absorben y de la distancia (d) que recorre el rayo de luz en el medio ambiente (p.ej. una solucin). Cuando la luz atraviesa una solucin con el analito, la intensidad de la radiacin disminuye (= atenuacin) como consecuencia de la excitacin del analito (= absorcin) as como, en menor parte, la reflexin. Cuanto mayor sea la trayectoria (d) del rayo en la solucin de analito de una concentracin (c), habr ms analito que absorba la radiacin, y la atenuacin ser mayor (Fig. 3). La absorbancia y transmitancia son fracciones respectivas en el espectro electromagntico de la luz. Debido a las interacciones que suceden entre los fotones y las partculas absorbentes (= analitos), la intensidad del rayo disminuye desde I0 hasta I. La transmitancia T de la solucin, es la fraccin de radiacin incidente que transmite la solucin, tal como se muestra en la ecuacin T = I/I0. La transmitancia suele expresarse como porcentaje o porcentaje de transmitancia (Skoog et al., 2003).
T = I/I0 A = lg I0/I
,-
d: distancia [cm] c: concentracin analito [mol/l]
Fig. 3: Atenuacin de un haz de radiacin por una solucin absorbente. La flecha ms grande es el rayo incidente, significa que la energa radiante es mayor que la que trasmite la solucin.
Espectrofotmetro Este equipo es utilizado frecuentemente para anlisis qumicos en la industria farmacutica y alimentaria. Sirve para medir la relacin entre valores relativos de una misma magnitud fotomtrica a dos haces de radiaciones, mide tambin la concentracin o reacciones qumicas o bioqumicas de una muestra; ambas mediciones se realizan en funcin de una longitud de onda (Skoog et al., 2003). Estos instrumentos son utilizados principalmente para la cuantificacin de compuestos orgnicos e inorgnicos as como de microorganismos.
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Material a utilizar
Material 6 Tubos de ensayo de 13100 1 Matraz EM o vaso de precipitados de 50 ml 2 Pipetas serolgicas de 5 10 ml 2 Celdas espectrofotomtricas de 1 ml 1 Perilla de tres vas 1 Micropipeta de 10 a 100 l 1 Micropipeta de 100 a 1000 l Puntas amarillas y azules Tubos tipo Eppendorf Consumibles Etanol 70 % Agua destilada (A. dest.) Medios de cultivo Tryptic Soy Broth (TSB) (anexo) Nutrient Broth (NB) (anexo) Equipo 1 Autoclave 1 Espectrofotmetro
Procedimiento
Esta prctica complementa el conocimiento y habilidad del estudiante en la preparacin y uso de soluciones, equipo o instrumentos utilizados en el rea de farmacia y biotecnologa. La preparacin de una solucin no solo debe asociarse a la preparacin de una solucin qumica, tambin existen otro tipo de soluciones, como en el caso de la biotecnologa donde se utilizan soluciones fisiolgicas, medios de cultivos lquidos y slidos etc. Por otra parte el uso del espectrofotmetro no solo se utiliza para medir absorbancia o transmitancia en soluciones coloreadas sino tambin se puede utilizar para medir la absorbancia de una suspensin celular bacteriana. Como se observar en esta prctica. En algunas disciplinas de la biotecnologa o en ciertas circunstancias no es necesaria la exactitud de las mediciones de volmenes o cantidades como frecuentemente se exige en el rea de qumica. Preparacin de un medio de cultivo lquido 1. Realizar los clculos necesarios (seguir instrucciones del proveedor) para obtener la cantidad de medio de cultivo que se disolvern en 20 ml de A. dest. 2. Pesar el medido de cultivo en una balanza semianaltica y transferirlo a un matraz EM de 50 ml y adicionar 20 ml de A. dest. (en la preparacin de medios de cultivo no es necesario aforar la solucin). 3. Mezclar muy bien el medio de cultivo en el A. dest.; esta solucin se le llama caldo de cultivo. 4. Transferir 3 ml de caldo de cultivo homogneo, con una pipeta serolgica de 5 10 ml, a cada uno de los 6 tubos de ensayo. 11
5. Tapar estos tubos; dejarlos con la tapa floja para su estrilizacin (autoclave). 6. Inocular con 100 l de caldo con Escherichia coli 3 tubos con caldo de cultivo estril e incubar 12 h a 37 C. 7. Despus de 12 h se obtendr una suspensin celular de aprox. 109 clulas/ml. Nota: Por fines prcticos, los puntos 5 y 6 pueden ser omitidos, si previo a la prctica los tubos con caldo de cultivo fueron estrilizados e inoculados. Uso del espectrofotmetro 8. Transferir de la suspensin celular (muestra) con aprox. 109 cel/ml con una micropipeta 100 y 10 l, respectivamente, a diferentes tubos Eppendorf y aadir 900 y 990 l de caldo de cultivo estril, respectivamente. Con ello se obtiene diluciones de 1/10 y 1/100 (esto realizarlo por triplicado). 9. De cada una de las muestras (triplicado): Transferir con una micropipeta, 1 ml de suspensin celular original, dilucin 1/10 y 1/100, respectivamente, a una celda espectrofotomtrica as como 1 ml de caldo de cultivo estril a otra celda espectrofotomtrica. La primera ser la muestra y la segunda ser la referencia. 10. Calibrar el espectrofotmetro con la solucin de referencia a 600 nm (longitud de onda visible utilizada en suspensiones microbianas) y realizar la medicin. Anotar las absorbancias (Abs).
Eliminacin de residuos biolgicos

1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %. 2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se estrilizan en la autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Despus los caldos de cultivos se desechan al desage con abundante agua.
Resultados
1. Realizar los clculos de la cantidad de medio de cultivo a pesar
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2. Anotar el nmero de clulas en cada dilucin y la absorbancia que le corresponde. Muestras (cel/ml) Abs (1) Abs (2) Abs (3) Suspensin original = 109 Dilucin 1/10 = Diucin 1/100 =
3. Graficar los resultados Abs vs concentracin
4. Con los resultados obtenidos responda a la siguiente pregunta: Si una suspensin bacteriana con 109 cel/ml tiene una absorbancia de ___________ cuntas clulas microbianas tendrn las diluciones?
Observaciones
Conclusiones
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Cuestionario
1. Cul es la ecuacin de Lambert y Beer?
2. Cul es la diferencia entre una solucin, suspensin, dispersin y emulsin? (no definir los conceptos de cada una).
3 Qu es una solucin fisiolgica? Un medio de cultivo lquido es una solucin fisiolgica? Por qu?
4. Para qu se utiliza una solucin de referencia para medir al espectrofotmetro una muestra?
1. Riao-Cabrera N. (2007): Fundamentos de Qumica Analtica Bsica: Anlisis Cuantitativo. 1a ed., Universidad de Caldas, Colombia. pp. 19-20 2. Skoog D.A., West D.M., Holler F.J., Crouch S.R. (2003): Qumica Analtica. 7a ed., Mc Graw Hill, Mxico. pp. 575-576 3. Manual de Qumica General de la Universidad Pontificia Catlica del Per (UPCP). Disponible en: http://corinto.pucp.edu.pe/quimicageneral/contenido/62-tipos-de-solucionesy-solubilidad
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Microsco"io
Prctica 3
Microscopio: componentes y observacin

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 2-4 h
Objetivo
Conocer los componentes del microscopio y adquirir la habilidad de usarlo mediante la observacin de distintos tipos de clulas.
Introduccin
Microscopia Es el uso de un rayo de luz o electrones para hacer visibles los objetos que no son visibles a simple vista. Sus principios generales son: radiacin de longitud de onda, magnificacin, resolucin y contraste. Radiacin de longitud de onda Cuando se habla de un haz de radiacin se refiere tanto a rayos como ondas. La luz visible es una parte del espectro electromagntico que incluye rayos X, microondas y ondas de radio. Estas formas de radiacin difieren en longitud de onda y la distancia entre dos puntos de la misma. El ojo humano es limitado a un rango de longitudes de onda (llamado "luz visible") y enva impulsos nerviosos al cerebro, el cual los interpreta como diferentes colores, p.ej. longitudes de onda de 400 nm como violeta y de 650 nm como rojo. La luz blanca est compuesta de muchos colores (longitudes de onda) y tiene un promedio de 550 nm (Fig. 4). Por otra parte los electrones son cargados negativamente y su movimiento acta como ondas, donde sus longitudes dependen de su voltaje. Por ejemplo una longitud de onda de 10.000 V es 0,01 nm, mientras que una de 1.000.000 V es 0,001 nm. Esto significa que al usar radiaciones de longitudes de onda ms pequeas se incrementa la utilidad del microscopio.
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Microsco"io
Fig. 4: )s"ectro electro+agn.tico i+agen e/trada de 0tt"1221'b"'blogs"ot'co+2
Magnificacin Este concepto se refiere al aparente incremento del tamao de un objeto, que es indicado por una "x" que significa "vez". La magnificacin resulta cuando un haz de radiacin refracta al cruzar una lente. Lentes con curvatura refractan la luz y campos magnticos refractan el haz de electrones. Una lente con curvatura convexo refracta rayos de luz que pasan a travs de su periferia en mayor proporcin que cuando pasan en el centro; parecido como una serie de prismas: los rayos que atraviesan la lente se reencuentran en el punto focal (Fig. 5). En este punto focal los rayos se dispersan y favorecen al agrandamiento de la imagen (Fig. 6). El grado de la magnitud de la imagen depende del grosor de la lente, su curvatura y la velocidad de la luz al atravesar la muestra. Las propiedades que determinan la utilidad de la magnificacin son resolucin y contraste.
Fig. 6: Magnificacin de un objeto por una lente planoFig. 5 Refraccin de un haz de luz por una lente biconvexo: distancia focal (f) y punto focal (F) convexo
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Microsco"io
Resolucin: Esta propiedad describe la habilidad de distinguir con claridad dos objetos muy cercanos. Cuando luz pasa por una apertura se difracta, que limita a la resolucin (Fig. 7). Los microscopios modernos, que funcionan con luz visible y ultravioleta, pueden distinguir entre objetos de 200 nm de distancia, los electrnicos, que funcionan con haz de electrones, tienen un poder de resolucin de 0,1 nm. La resolucin depende de la longitud de onda de una radiacin electromagntica, la apertura numrica de la lente y la capacidad de la lente para recuperar luz (Bauman, 2007).
Fig. 71 Poder de resolucin1 2 "untos son resueltos cuando sus "atrones de di*raccin no se sola"an
(i$!uierdo) cuando se inician de sola"ar se alcan$a el l+ite de resolucin (centro) 3 cuando los "untos se sola"an no son resueltos (derec0o)'
Contraste: Esta propiedad se refiere a las diferencias en intensidad del brillo entre dos objetos (Fig. 8) u objeto y el soporte (fondo). La mayora de los microorganismos no son coloreados y presentan muy poco contraste. Una forma de aumentar el contraste es tindolos. Otra forma es explotar las diferencias entre el ndice de refraccin de la clula y del medio; a este proceso se le llama fase (Nester et al., 2004).
Fig. 8: En reas con poco contraste (izquierda) no se puede diferenciar elementos; en reas con contraste elevado (derecha) se puede distinguir estructuras. En rojo se representa la "tone curve" respectiva; curvas muy inclinadas indican reas de contraste elevado.
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Microscopios ms utilizados
Tab. 2: Diferentes tipos de microscopa y su uso (Bauman, 2007)
Microsco"io
Tipo de microscopio
Descripcin de la imagen
Usos
Microscopio de luz Magnificacin til de 1x a 2 000x; Luz visible, la longitud de onda azul resolucin hasta 200 nm suministra mejor resolucin - Campo claro - Campo obscuro Muestras coloreadas o no teidas en contra de un fondo brillante fondo obscuro - Contraste de fases Muestras con reas claras y obscuras - Nomarski Observacin y conteo de microorganismos muertos vivos y no teidos Observacin de estructuras internas de microorganismos vivos
Muestras brillantes en contra de un Observacin de microorganismos
Parecen imgenes tridimensionales Observacin de estructuras de por contraste de interferencia microorganismos vivos diferencial Muestras con colores fluorescentes Localizacin de estructuras o en contra de un fondo obscuro compuestos qumicos especficos Estructuras en un solo plano (corte Observacin detallada de estructuras ptico) normalmente en celulares en una poblacin celular combinacin con fluorescencia Magnificacin tpica 1 000x a 10 000x, resolucin a 0,1 nm Montono, doble dimensin, imagen altamente magnificada, Usa electrones con longitudes de onda corta; las muestras tienen que estar en vaco Observacin de detalles ultraestructurales extremas de clulas,
- Fluorescencia - Confocal
Microscopio electrnico - Transmisin
puede tener un incremento de color virus y bacterias - Scanning Montono, tridimensional, imagen Observacin de los detalles de la altamente magnificada; puede superficie de la estructura celular tener un incremento de color Magnificacin mayor de 100 000 000x Molculas individuales y tomos visibles Molculas individuales y tomos visibles 18 Estos microscopios se mueven sobre la superficie de la muestra Observacin de la superficie del objeto, suministra finamente detalles Observacin de material biolgico a nivel molecular y atmico
Microscopios de proximidad - Scanning tunneling - Fuerza atmica
Microsco"io
Componentes y fundamento del microscopio Explicar y describir con material didctico los componentes ms importantes que forman a un microscopio. Trasladar a los estudiantes al laboratorio y demostrarles el funcionamiento del aparato, mediante observaciones con diferentes tipos de clulas.
Material a utilizar
Material 3 Portaobjetos con muestras teidas de clulas vegetales, bacterianas y levaduras 3 Cubreobjetos Consumibles Etanol 70 % Agua destilada (A. dest.) Equipo 1 Microscopio
Procedimiento
Observacin al microscopio 1. Muestras fijadas y coloreadas sobre un portaobjeto les sern entregadas a cada uno de los equipos. Las muestras son clulas vegetales para el objetivo de 10x, levaduras para el objetivo de 40x y bacterias para el objetivo de 100x. 2. Tomar un portaobjeto con la muestra de clula vegetal y colocar el cubreobjeto sobre la muestra. 3. Colocar la preparacin sobre la platina y asegurarla con las pinzas, ajustar el objetivo 10x, enfocar, primero con el anillo macromtrico y despus, para lograr nitidez, enfocar con el anillo micromtrico. Por ltimo observar todo el campo con la perilla de movimiento. Para observar las bacterias se debe usar el objetivo de 100x y aceite de inmersin.

Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 % por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser reutilizados o desecharlos directamente a donde se almacena el material de vidrio para reciclar. Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso. Las soluciones de hipoclorito sdico, como la leja de uso domstico, contienen 50 g/l de cloro libre y por tanto deben diluirse 1:10 para obtener una concentracin final de 5 g/l.
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Microsco"io
Resultados
1. Dibujar y sealar los componentes del microscopio.
2. Dibujar o fotografiar a las clulas observadas sealando los objetivos utilizados.
Observaciones
Conclusiones
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Microsco"io
Cuestionario
1. Usando un microscopio con el objetivo de 40x y una lente en el ocular de 10x Cuntas veces magnificada se ve la muestra?
2. Por qu se debe utilizar aceite de inmersin con el objetivo de 100x y no con el objetivo de 10x?
3. Describa los 4 partes ms importante del microscopio? A cul sistema pertenece cada una?
1. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed. Pearson, San Francisco, USA. pp. 93-122 2. Nester E.W., Anderson D.G., Roberts C.E., Pearsall N.N., Nester M.T. (2004): Microbiology: a Human Perspective. 4th ed. McGraw Hill, New York, USA. pp. 39-45
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4incin de c.lulas
Prctica 4
Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 4 h
Objetivo
Adquirir habilidad en la fijacin biolgica y tincin de diferentes tipos de clulas y observar con el microscopio sus formas, tamaos y distribucin en un mismo plano.
Introduccin
Fijacin de clulas Las clulas teidas y vistas bajo el microscopio deben ser semejantes a clulas vivas. La fijacin es un proceso en cual las estructuras internas y externas de clulas o microorganismos son conservadas e inmovilizadas en una posicin. Entonces, en la fijacin se inactivan las enzimas, que pueden alterar la morfologa celular, y se endurecen las estructuras celulares, para que estas no cambien durante la tincin y observacin. Por lo tanto, la clula muere al momento de la fijacin. Hay dos tipos de fijacin fundamentalmente diferentes: 1) Fijacin al calor: las muestras biolgicas se extienden (comnmente bacterias) sobre el portaobjeto y con una flama azul se confiere calor seco prudentemente y se fija la pelcula. Esto preserva la morfologa pero no la estructura interna de las clulas. 2) Fijacin qumica: se usa para proteger las estructuras finas internas de las clulas y la morfologa de los orgnulos subcelulares. Los fijadores qumicos penetran a las clulas y reaccionan con componentes celulares; usualmente protenas y lpidos para inactivar, insolubilizar e inmovilizarlos. La mezcla comn de fijadores contienen tales componentes como metanol, etanol, acetona, cido actico, cloruro de mercurio, formaldehdo o glutar(di)aldehdo (Prescott et al., 2005). Tinciones comunes Los diferentes colorantes usados para teir cualquier tipo de clula tienen dos caractersticas en comn: a) Tienen agentes cromforos (el que proporciona color a la molcula) que absorben luz, al ser excitados emiten diferentes colores dependiendo de la longitud de onda.
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4incin de c.lulas
b) Pueden unirse a las clulas mediante uniones covalentes, inicos o hidrofbicos. P.ej., un colorante cargado positivamente puede unirse a las estructuras celulares cargadas negativamente. Los colorantes ionizables pueden ser divididos en dos clases, de acuerdo con la naturaleza y carga de su grupo: 1) Colorantes bsicos: Azul de metileno, fucsina bsica, cristal-violeta, safranina o verde de malaquita tienen grupos con cargas positivas (algunas formas de nitrgeno tetravalente) y son generalmente vendidos como sales de cloruro. Los colorantes bsicos se unen a las molculas cargadas negativamente como cidos nucleicos y la mayora de las protenas. Dado que las superficies de la mayora de las clulas son cargadas negativamente, los colorantes bsicos son frecuentemente usados. Estos colorantes son utilizados para determinar el tamao, forma y arreglo o distribucin de las clulas. 2) Colorantes cidos: Eosina, rosa de bengala o fucsina cida poseen grupos cargados negativamente tales como carboxilos (-COOH) o hidroxilos (-OH). Los colorantes cidos se unen a las estructuras celulares cargadas positivamente (Prescott et al., 2005). Las clulas pueden ser coloreadas in-vitro o in-vivo (p.ej. tejidos vivos). En las tinciones in-vivo las clulas o estructuras adquieren los colorantes de contraste y se puede estudiar sus arreglos, distribucin, morfologa mientras estn desempeando su funcin. Este tipo de tincin puede revelar donde o como se lleva a cabo una reaccin qumica-enzimtica dentro de las clulas o tejidos, donde se almacena algn producto qumico determinado, donde est presente una protena especifica etc. Una tincin in-vitro es colorear clulas y estructuras que han sido extradas de su sitio biolgico y tpicamente se observan formas, tamaos y estructuras con mejor detalle que in-vivo (Penney et al., 2002). En esta prctica se realiza una tincin in-vitro Las tinciones simples o diferenciales son las ms utilizadas para material biolgico en estudios preliminares. Tincin simple: es el uso de un solo colorante, frecuentemente azul de metileno, que se aplica al material biolgico mediante pasos sencillos. Esta tincin se utiliza principalmente para observar el tamao, la morfologa y la distribucin de las clulas en el mismo plano (Bauman, 2007). Tincin diferencial: es el uso de dos o ms colorantes, donde uno es el que colorea y el (los) otro (s) son utilizados como mordiente (s) (proporciona mayor afinidad al colorante) o como colorante (s) de contraste. Esta tincin se utiliza para distinguir grupos de microorganismos en el mismo plano o contrastar estructuras externas o internas de la misma clula (Bauman, 2007).
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4incin de c.lulas
Material a utilizar
Material biolgico Saccharomyces cerevisiae (levadura) Consumibles Etanol 70 %
Escherichia coli, Staphylococcus aureus (bacterias) Agua destilada (A. dest.) Cebolla Azul de metileno (anexo) Cristal violeta (anexo) Material 3 Portaobjetos Safranina (anexo) 3 Cubreobjetos Lugol (anexo) 1 Pinza 1 Placa de Petri 1 Escalpelo 1 Asa de Kolle Etanol-Acetona (anexo) Soluciones isotnicas (anexo) Equipo 1 Microscopio 1 Mechero Bunsen
Procedimiento
Tincin simple La tincin simple se realiza a las tres muestras: Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y cebolla. 1) Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli a) Fijar 1. Desengrasar el portaobjeto con etanol. 2. Tomar una gota del cultivo, si es lquido, con el asa de Kolle o nicromo y colocarla en el centro del portaobjeto. Si es slido tomar una gota de solucin isotnica y colocarla en el portaobjeto. Despus tomar una "asada" de la colonia y colocarla en medio de la gota. 3. Extender con el asa haciendo un valo. 4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra). 5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida, si proviene de medio slido, solo 1 vez). b) Colorear 1. Colocar unas gotas de azul de metileno sobre la muestra ya fijada y esperar 90 s. 2. Lavar con A. dest. y decantar. 3. Secar y observar al microscopio la levadura con el objetivo de 40x; la bacteria con el de 100x y aceite de inmersin.
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2) Preparacin de clulas epidermiales de la cebolla a) Fijar
4incin de c.lulas
1. Partir una cebolla y separar sus capas, extraer con ayuda del escalpelo y una pinza la capa ms delgada. 2. Depositar la capa o membrana en una placa Petri con solucin isotnica. Introducir oblicuamente el portaobjeto en la placa y con ayuda de una pinza colocar la membrana en el portaobjeto, intentar que no quede arrugas. b) Colorear 1. Cubrir con gotas de azul de metileno la membrana y esperar 5 min. 2. Colocar el portaobjeto en la placa Petri vaca, un extremo en el borde y el otro en la base (inclinacin aprox. 45) lavar desde el extremo superior al inferior con un chorro dbil de A. dest., presionando con una pinza la membrana para evitar que sea arrastrada. 3. Cuando el agua es clara o sin rastros del colorante, colocar el cubreobjeto sobre la muestra evitando la presencia de burbujas. 4. Observar al microscopio a 10x y 40x. Tincin diferencial: Tincin de Gram (Fig. 9) Cultivo mixto de Escherichia coli y Staphylococcus aureus Fijacin 1. Desengrasar el portaobjeto con etanol. 2. Tomar una gota del cultivo lquido, con el asa y colocar en el centro del portaobjeto. 3. Extender con el asa haciendo un valo. 4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra). 5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida). Tincin 1. Colocar unas gotas de cristal violeta sobre la muestra ya fijada. Esperar 90 s. 2. Inclinar el portaobjeto y lavar del extremo superior con A. dest. 3. Colocar unas gotas de Lugol para lograr una mayor afinidad al colorante. Esperar 30 s. 4. Lavar con etanol-acetona por 20 s y decantar. 5. Lavar con A. dest. y decantar. 6. Agregar safranina y esperar 90 s. 7. Lavar con A. dest. y decantar. 8. Secar y observar al microscopio con objetivo 100x y aceite de inmersin.
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4incin de c.lulas
Fig. 9: Las fases de la tincin de Gram: Fijacin, tincin con cristal violeta, aplicar mordiente con Lugol, decoloracin con etanol/acetona y coloracin de contraste con safranina.
Nota: para la preparacin de los colorantes vase anexo I.

1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %. 2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se esteriliza en la autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Desechar los caldos de cultivo al desage con abundante agua. 3. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 % por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser reutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso.
Resultados
1. Dibujar cada clula observada.
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2. Nombrar a que dominio filogentico pertenece cada clula.
4incin de c.lulas
3. Sealar en los dibujos los nombres de las estructuras observadas.
Observaciones
Conclusiones
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4incin de c.lulas
Cuestionario
1. Por qu es necesario fijar la muestra?
2. De acuerdo al rbol filogentico a qu divisin pertenece cada una de las clulas que utilizamos en esta prctica?
3. Por qu es necesario teir la muestra?
1. Penney D.P., Powers J.M., Frank M., Willis C., Churukian C. (2002): Analysis and testing of biological stains the Biological Stain Comission Procedures. Biotech. & Histochem., 77: 237-275 2. Presccott M.L., Harley J.P., Klein D.A. (2005): Microbiology. 6th ed., McGraw Hill, Singapur. pp. 39-45 3. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed., Pearson, San Francisco, USA. pp. 93-122
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5s+osis
Prctica 5
Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad

Objetivo
Identificar el comportamiento de las clulas expuestas a soluciones isotnicas, hipotnicas e hipertnicas.
Introduccin
Tonicidad: La tonicidad es la osmolaridad de una solucin comparada con la osmolaridad de cualquier tipo de clula. En otras palabras, es la relacin entre la concentracin de los iones (solutos) en una solucin y los iones dentro de las clulas. Las soluciones que tienen la misma concentracin (osmolaridad) de iones que dentro de la clula son llamadas soluciones isotnicas. Las soluciones con mayor osmolaridad que dentro de las clulas son llamadas hipertnicas y las soluciones con menor osmolaridad que dentro de las clulas son hipotnicas (Speralakis, 2011). Soluciones isotnicas: Cuando las clulas se sumergen en una solucin con la misma osmolaridad, la difusin del agua es en ambas direcciones y el ndice de difusin de agua es el mismo en ambos sitios. Entonces es una solucin isotnica o isoosmtica. Ejemplo de una solucin isotnica es una solucin salina de NaCl al 0,9 %. Soluciones hipertnicas: En la biologa una solucin hipertnica (hiperosmtica) es una solucin con mayor concentracin de solutos que el citosol. Cuando se sumergen las clulas dentro de una solucin hipertnica, la tendencia del flujo de agua es hacia fuera de las clulas con el fin de equilibrar la concentracin de solutos. Ejemplos de soluciones hipertnicas son mermeladas, salmueras etc. En el caso de clulas animales, las clulas pierden agua y se arrugan, se ven hundidas o se encogen. En los eritrocitos este proceso se conoce como crenacin. En el caso de clulas vegetales o microbianas el agua sale del medio intracelular, el protoplasma se retrae, producindose un espacio entre la membrana plasmtica y la pared celular. A este fenmeno se le conoce como plasmlisis.
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5s+osis
Soluciones hipotnicas: En la biologa una solucin hipotnica (hipoosmtica) tiene menor concentracin de solutos que el citosol o citoplasma. Cuando las clulas se sumergen en soluciones hipotnicas el agua se difunde del exterior hacia el interior de la clula con el fin de equilibrar la concentracin de solutos para ambos sitios. Ejemplo tpico de una solucin hipotnica es el agua destilada (A. dest.). Clulas animales sufren del fenmeno de citlisis, dado que el agua entra al citosol, la clula se hincha y se pueden romper las membranas. En el caso de eritrocitos, a este fenmeno se le denomina hemlisis. En clulas vegetales ocurre una presin de turgencia: cuando el agua entra a la clula se hincha y se puede destruir la membrana (lisis) pero no la pared celular debido a su gran estabilidad; algo muy parecido pasa con los hongos y bacterias (Speralakis 2011, Donnersberger, 2002). Aunque en el caso de bacterias la pared celular puede ser destruida.
Material a utilizar
Material biolgico Sangre humana Material 3 Portaobjetos 3 Cubreobjetos 2 Lancetas estriles Equipo 1 Microscopio Consumibles Etanol 70 % Agua destilada (A. dest.) Solucin salina al 0,9 % Solucin salina al 1,5 % Algodn Aplicadores de madera Papel para cocina
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5s+osis
Procedimiento
Nota: Durante esta prctica es necesario usar guantes. 1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja. 2. Colocar tres portaobjetos desengrasados sobre la servilleta, rotular en un extremo de un portaobjeto Iso (soln. isotnica), Hipo (soln. hipotnica), Hiper (soln. hipertnica). 3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice. 4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo. 5. Apretar la punta del dedo hasta ver una gota de sangre. 6. Colocar una gota de sangre sobre cada portaobjeto. Nota: El siguiente proceso debe ser rpido! para evitar que la sangre se seque. 7. Al portaobjeto sealado con Iso colocar una gota de solucin salina al 0,9 %. 8. Al portaobjeto sealado con Hipo colocar una gota de A. dest. 9. Al portaobjeto sealado con Hiper colocar una gota de solucin salina al 1,5 %. 10. Con el aplicador mezclar suavemente las soluciones con la sangre de 3 a 5 s. 11. Inmediatamente! colocar un cubreobjeto sobre cada muestra y observar al microscopio. 12. Observar con el objetivo de 40x las clulas normales, la crenacin y hemlisis.

1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %. 2. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 % por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser reutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso. 3. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgico infeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).
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5s+osis
Resultados
1. Dibujar las clulas normales, la crenacin y la hemlisis. Iso Hipo Hiper
Observaciones
Conclusiones
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5s+osis
Cuestionario
1. Qu ocurre en una clula vegetal si se sumerge en una solucin salina al 5 %?
2. Por qu en las clulas vegetales no ocurre una lsis? Qu tipo de componentes tiene su pared celular?
3. Cuando ocurre una crenacin o hemlisis en los eritrocitos?
4. Cmo se prepara 100 ml de una solucin isotnica de NaCl? Qu osmolaridad tiene esta solucin?
5. Qu es la diferencia entre osmolaridad y osmolalidad?
1. Donnersberger A.B., Lesak A.E. (2002): Laboratorio de Anatoma y Fisiologa. 1a ed., Paidotribo, Barcelona, Spain. pp. 345-347 2. Sperelakis N. (2011): Cell Physiology Source Book: Essential of Membrane Biophysics. 4th ed. Academic Press, Waltham, USA. pp. 288
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)structuras intracelulares
Prctica 6
Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas

Objetivo
Observar las estructuras internas de clulas animales mediante la tcnica de frotis sanguneo.
Introduccin
Las clulas eucariotas son muy complejas con un citoplasma organizado con orgnulos limitados por membranas biolgicas, que son similares en su composicin a la membrana celular. El ncleo es el orgnulo ms notable y caracterstico tanto en clulas animales como en vegetales, hongos y protistas. Por esto mismo un ejemplo tpico para observar una estructura interna de una clula animal es el ncleo. Frotis sanguneo La tcnica de frotis sanguneo consiste en una extensin de sangre realizada sobre un portaobjeto con ayuda de otro portaobjeto (Fig. 10), que permite observar bajo el microscopio diferentes formas celulares sanguneas. Con dbil aumento se explora la preparacin para localizar la zona en la que el frotis es ms perfecto (Fig. 11). En el campo del microscopio se ven con un dominio predominante los eritrocitos (tambin llamados glbulos rojos o hemates), teidos de color rojo. No tienen ncleo y se observa un entorno ms claro en medio que en los bordes. Los leucocitos (tambin llamados glbulos blancos) se identifican fcilmente por la presencia del ncleo (Warhurst & Williams, 1996). Estos se clasifican en: Linfocitos: Un poco ms grandes que los eritrocitos, con un ncleo muy voluminoso que ocupa casi toda la clula. Aparece fuertemente teido de un color violeta oscuro. Monocitos: Normalmente son poco frecuentes, hay que desplazarse por la preparacin para encontrar alguno. Tienen un ncleo muy grande y redondeado que aparece teido en color violeta. Polimorfonucleares: Presentan el ncleo fragmentado, como lbulos grandes. Eosinfilos: Son granulocitos poco abundantes de color rojizo y el ncleo teido de color azul marino. Estas clulas aumentan su nmero en caso de parasitosis o alergia. Basfilos: Presentan un ncleo teido de rojo y grnulos en el citoplasma teidos de color azul oscuro. 34
Fig. 10: Tcnica del frotis sanguneo extendiendo la gota de sangre de un extremo al otro de un portaobjeto.
Fig. 11: Morfologa celular y ncleo de las clulas sanguneas (extrado de "Prcticas de citologa").
Material a utilizar
Material biolgico Sangre humana Material 6 Portaobjetos Consumibles Etanol 70 % Agua destilada (A. dest.) Metanol Colorante de Giemsa (anexo)
6 Cubreobjetos Guantes de latex 2 Lancetas estriles Papel de cocina 1 Soporte de tincin (recipiente rectangular de plstico, Equipo 10 - 15 cm largo y 5 - 10 cm de ancho) 1 Cinta adhesiva 1 Microscopio 2 Aplicadores de madera largos (del mismo ancho que 1 Mechero Bunsen el soporte de tincin)
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Procedimiento
Nota: En esta prctica se usa guantes. Fijacin 1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja. 2. Colocar los 6 portaobjetos desengrasados sobre la servilleta. 3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice. 4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo. 5. Apretar la punta del dedo hasta lograr ver una gota de sangre. 6. Colocar una gota de sangre en el extremo de uno de los portaobjetos. 7. Seguidamente colocar un portaobjeto como lo indica Fig. 10 y deslizarlo de un extremo al otro. Slo debe pasarse una vez de forma continua e ininterrumpida. 8. Repetir la operacin con 2 portaobjetos ms, con el fin de seleccionar la mejor tincin. 9. Secar al aire las extensiones lo ms rpido posible. La desecacin se facilita con un movimiento en forma de abanico, nunca soplando ni usando calor. La rpida desecacin evita la deformacin de las clulas sanguneas. 10. Depositar el portaobjeto con la extensin de sangre encima del soporte de tinciones. 11. Depositar sobre la extensin unas gotas de metanol y esperar que se evapore. Tincin 1. Una vez evaporado el metanol, depositar unas gotas de Giemsa (vase anexo I) cubriendo toda la extensin, evitar desecacin y esperar 5 min. 2. Lavar con A. dest. la preparacin hasta que arrastre todo el colorante. 3. Secar al aire o bien al calor dbil de la flama del mechero. 4. Colocar el cubreobjeto y observar al microscopio iniciando con 40x y despus con 100x. 5. Identificar las clulas sanguneas de acuerdo a la Fig. 11. Nota: Esta tcnica es muy til en anlisis clnicos para el conteo de clulas sanguneas y comparar los resultados con valores estandarizados. En esta prctica no se tiene tal objetivo.
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1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %. 2. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 % por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser reutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso. 3. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgico infeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).
Resultados
1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de clulas sanguneas con el ncleo correspondiente.
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Observaciones
Conclusiones
Cuestionario
1. Qu otras estructuras internas celulares eucariotas se podran observar al microscopio de campo claro? Por qu?
2. Cul estructura interna es la ms notable dentro del compartimento de una clula vegetal?
3. Enliste las estructuras internas que constituyen a las clulas eucariotas y distinga cada una de ellas de acuerdo al tipo de clula animal, vegetal y hongos.
1. Warhurst D.C., Williams J.E. (1996): Laboratory diagnosis of malaria. J. Clin. Pathol., 49: 533-538 2. Prcticas de Citologa (2007). Disponible en:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/averroes/html/adjuntos/2007/12/13/0003/frotissangre.html
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4e6idos
Prctica 7
Fijacin y tincin de tejidos animales

Objetivo
Comprender los conceptos y tcnicas histolgicas bsicas usadas para el estudio de tejidos animales.
Introduccin
Conceptos bsicos: Un tejido es un conjunto de clulas con caractersticas estructurales y funcionales similares, que se organizan de una forma especfica y provienen de una capa germinal en comn. Un rgano es una estructura anatmicamente distinguible, formada por diferentes tejidos, que cumplen con una funcin en comn (corazn, rin etc). Un aparato o un sistema es un conjunto de rganos para cumplir una funcin en comn (aparato digestivo, sistema sanguneo, sistema inmunitario etc). Tejidos bsicos Se pueden diferenciar cinco tejidos bsicos: 1. Tejido epitelial 2. Tejido conectivo 3. Tejido muscular 4. Sangre 5. Tejido nervioso Recientemente se consideran tambin otros criterios de clasificacin, surgidos de la disciplina: Biologa celular, por las caractersticas estructurales y funcionales de las clulas que se agrupan como clulas contrctiles, clulas secretoras o clulas del sistema inmune (Stevens & Lowe, 1997).
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4e6idos
Tcnicas histolgicas bsicas utilizando un microtomo: Para microscopia ptica

1. Seleccionar la muestra a estudiar 2. Fijacin de la muestra La fijacin de la muestra tiene dos objetivos: - preservar las estructuras del tejido lo ms parecido posible a su estado in-vivo (inhibir autolisis). - aumentar la dureza de la muestra, para su posterior diseccin en cortes delgados. El fijador ms usado es una solucin acuosa de formaldehdo, sea "neutral buffered formalin" o paraformaldehdo al 4 %. Tambin se pueden usar otros fijadores (metanol, cido pcrico, etc). Los fijadores hacen que precipiten (cross-linking) las protenas tisulares. 3. Inclusin en parafina La inclusin en parafina tiene como objetivo que la muestra tenga una dureza suficiente y homognea para poder hacer cortes delgados. Como la parafina es inmiscible con el agua hay que deshidratar la muestra antes de incluirla en parafina. La deshidratacin de la muestra se consigue pasndola por una serie de etanol con graduacin creciente: etanol 50 % (24 h) etanol 70 % (8 h) - etanol 96 % (14 h) - etanol absoluto (4 h). Despus se pasa la muestra por un solvente intermedio (como xileno, benceno o tolueno, 24 h) y se introduce en un recipiente con parafina lquida durante varias horas hasta das (la parafina se mantiene lquida en una estufa a temperatura superior a su punto de fusin) hasta que la parafina se ha adherido completamente a la muestra. Finalmente, en un molde se hace un bloque de parafina que contenga la muestra y se deja solidificar a temperatura ambiente. A veces no es posible hacer la inclusin en parafina porque el proceso de deshidratacin altera algunas estructuras celulares que se quieren estudiar (p.ej. los lpidos, que se desnaturalizan con alcoholes durante el proceso de deshidratacin). Un cuidado especial requieren las tcnicas de inmunohistoqumica: tanto el fijador como la serie de etanol y la parafina hasta el aumento de la temperatura (mantener la parafina lquida) pueden alterar los epitopes en la muestra, que despus no sean reconocidas por los anticuerpos especficos. En estos casos se pueden hacer cortes delgados endureciendo la muestra (fijada o incluso antes de la fijacin) por congelacin. 4. Corte de la muestra El bloque de parafina, que contiene la muestra, se puede cortar en secciones delgadas de 2-5 m con un microtomo (o de 5-10 m con un microtomo de congelacin). Estos cortes se colocan sobre portaobjetos para su tincin posterior.
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5. Tincin de los cortes Los diversos componentes tisulares tienen ndices de refraccin similares, y no podran distinguirse si no se usan colorantes, que tien diferentes componentes segn su composicin qumica. Como los colorantes suelen ser hidroflicos hay que desparafinizar (p.ej. con xileno, 5 min) y rehidratar los cortes, pasando los portaobjetos por una serie de etanol con graduacin decreciente: etanol absoluto (2 min) - etanol 90 % (2 min) - etanol 70 % (2 min) - etanol 50 % (2 min) - agua (5 min). Despus de la rehidratacin se tien los cortes con el colorante o la mezcla de colorantes adecuados: Hematoxilina-eosina: la hematoxilina (un colorante bsico) tie las estructuras cidas (ncleo, rER) de color azul-violeta y la eosina (un colorante cido) tie las estructuras bsicas (la mayora de las protenas citoplasmticas, mitocondrias) de color rosa-rojo. Las fibras de colgeno de la matriz extracelular se tien de color rosa. Azan (Azocarmin G + Aniline blue): con esta tcnica se tie los ncleos celulares de color rojo, el citoplasma de color rosa y las fibras de colgeno de color azul. El msculo y los eritrocitos se tien de color rojo-naranja. Tricrmico de Mallroy: esta tcnica utiliza la fucsina cida que tie el citoplasma de color rosa y el ncleo celular de color rojo, el azul de anilina que tie las fibras de colgeno de color azul y el naranja G que tie los eritrocitos de color naranja. van Gieson (Hematoxilina, cido pcrico, fucsina cida): esta tcnica tie los ncleos celulares de color azul oscuro-negro, el citoplasma y eritrocitos de color amarillo y las fibras de colgeno de color rojo. PAS (cido perydico, reactivo de Schiff [= fucsina bsica]): esta tcnica tie los carbohidratos complejos de las clulas de color rojo oscuro (p.ej. glucgeno, mucoprotenas, proteoglicanos, etc). Tinciones de lpidos: para visualizar las gotas lipdicas (lipid droplets) en las clulas (p.ej. en adipocitos) o las estructuras celulares ricas en lpidos (como la mielina) se utilizan diferentes colorantes de Sudan. Tinciones argnticas: son utilizadas para ver fibras finas de colgeno (fibras de reticulina) o clulas con prolongaciones celulares finas ricas en elementos del citoesqueleto (clulas dendrticas, axones neuronales etc.), que se tien en color negro o marrn oscuro y el fondo de la preparacin se ve dorado.
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Inmunohistoqumica: con esta tcnica se usa anticuerpos especficos dirigidos contra estructuras histolgicas o celulares dianas. El anticuerpo puede ser marcado con un fluorocromo o con una enzima, que revela un colorante (cromgeno). Si se usan anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes hay que utilizar un microscopio de epifluorescencia para observar los preparados. Despus de teir los cortes se aclara el exceso de colorantes que quede sin fijar en los tejidos y, dependiendo de la tcnica, se vuelven a deshidratar. 6. Montaje de los cortes Antes de observar los cortes al microscopio hay que preservarlos y cubrirlos con un cubreobjeto. La preservacin se logra con un montaje con resina en base de plsticos (p.ej. DPX) o aceites (p.ej. Permount). Adems, con resinas en base de plsticos se consigue que todos los elementos (muestra-cubreobjeto-aceite de inmersin-lente) sean pticamente homogneos. Una vez que la resina se ha polimerizado, se puede examinar la preparacin con el microscopio.
Lente (ob6etivo) 7ceite in+ersin %esina Portaob6eto

Fig. 12: Sistema ptico: diferencias en los ndices de refraccin (RI) causan un deterioro de la imagen por aberracin. El sistema se compone de: lente (RI = 1,51); aceite de inmersin (RI = 1,51) o aire (RI = 1,00); cubreobjeto (RI = 1,51; crown glass); resina de plsticos (RI = 1,5) y la muestra (RI = 1,5, como la resina). Sistemas en base de agua usan aceite de inmersin especial (RI = 1,48); cubreobjeto de borosilicato (RI = 1,47); resina en base de glicerol (RI = 1,48). Para objetivos con una apertura numrica (N.A.) elevada (i.e. N.A. > 1,2), la ptica es corregida por el grosor del cubreobjeto (0,17 mm).
Cubreob6eto Muestra
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Material a utilizar
Material biolgico Un rgano interno de ave Material 2 Portaobjetos 2 Cubreobjetos 1 Esptula acondicionada con una cuchilla de microtomo desechable 1 Soporte de madera de 5 x 7 x 10 cm (HWD) 1 Escalpelo 1 Pinza larga (10 cm) 2 Clips de carpeta 2 Clips normales Consumibles Etanol 70 %, 80 %, 90 % y 100 % Agua destilada (A. dest.) Hematoxilina de Harris (anexo) Eosina Y cida (anexo) Xileno Quitaesmalte (acetona) Mounting media Guantes de ltex Papel de cocina Equipo 1 Microscopio
Procedimiento
El estudiante de primer semestre de una carrera de Ciencias Biolgicas o de la Salud no tiene las bases ni los conocimientos para realizar este tipo de fijacin y cortes. Sin embargo si es necesario que observe la conformacin de tejidos de los diferentes rganos humanos. En esta prctica se realiza una tcnica ms sencilla, que la descrita en la introduccin, llamada RAMP (Rapid Adhesive-Mediated Procedure), donde no se utiliza microtomo (real) sino un microtomo "casero" y rganos de aves. Finalmente tambin se observan tejidos de rganos humanos previamente preparados con la tcnica (real) del microtomo. Seleccin de la muestra 1. Seleccionar un rgano interno de un ave (normalmente pollo o gallina) recientemente sacrificado. 2. Cortar transversalmente el rgano logrando un cuadrado de aproximadamente 4 cm2 por 2 cm de alto. Fijacin 1. En uno de los extremos de un portaobjeto pasar el pincel de un adhesivo (p.ej. Kola Loka) dejando el adhesivo extendido en la superficie. 2. Invertir el portaobjeto (adhesivo abajo) y colocarlo firmemente sobre el tejido y mantenerlo as 10 s. 43
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3. Retirar el portaobjeto mediante un jaln suave pero firme y dejar secar el tejido pegado en el adhesivo por 2 a 3 min. 4. Sobre un trozo de madera de 5 cm de alto y 7 cm de ancho se coloca el portaobjeto. A una esptula de 10 cm de ancho se fija con tornillos a los lados una cuchilla desechable de un microtomo (casero). Se invierte la esptula (cuchilla hacia abajo) y se corta con un ngulo de 20, obteniendo una pelcula muy fina (10-20 m) que queda en el adhesivo (este paso requiere paciencia y repeticiones). Tincin 1. Depositar unas gotas de hematoxilina (vase anexo I) sobre la pelcula y esperar 40 s. 2. Lavar con A. dest. 3. Cubrir la pelcula con una capa densa de etanol al 80 % y esperar 1 min. 4. Eliminar el etanol y depositar unas gotas de eosina cida Y (vase anexo I) y esperar 1 min. 5. Sumergir el portaobjeto con la pelcula en etanol al 90 % y despus al 100 %; aprox. 1 min por cada inmersin (dos veces cada una). 6. Para evitar perder la muestra durante el siguiente paso, se recomienda sujetarla con un clip de carpetas, asegurando la orilla de la pelcula y la orilla del portaobjeto. Despus se coloca sobre el resto de la pelcula un cubreobjeto de plstico y se sujeta con un clip normal. 7. Con la ayuda de unas pinzas sujetadas al otro extremo del portaobjeto se sumerge en una solucin de quita-esmalte por 5-10 min. 8. Sacar el portaobjeto. Clarificarlo rpidamente con xileno. 9. Retirar lentamente el clip de carpeta. 10. Separar el cubreobjeto de la pelcula (en este punto la pelcula no es adherida al cubreobjeto) y se deposita una gota de medio para montar (mounting media = es un agente orgnico esencial para lograr una buena resolucin bajo el microscopio) sobre el tejido y sobre esta el cubreobjeto. El tejido ahora est permanentemente conservado y se puede observar cada vez que se desee (Fig. 12 en lugar de resina puede ser Permount). Nota: Otros colorantes pueden ser usados como: azul de metileno, verde de metileno, azul de toluidina etc. Los tejidos que pueden ser observados de esta forma son: corazn, pulmn, trquea, hgado, rin, piel, nudo linfoide, timo etc. (Troyer et al., 2002).
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4e6idos

1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %. 2. Los tejidos utilizados en esta prctica se deben incinerar; si no se cuenta con un incinerador se pueden autoclavar y desecharlos a la basura normal. 3. Los portaobjetos y cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso. 4. La esptula con la cuchilla del microtomo se sumerge en etanol al 70 % por 20 min. Luego lavarla con agua y por ltimo con A. dest. 5. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgico infeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).
Resultados
1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de tejidos observados.
45
4e6idos
Observaciones
Conclusiones
Cuestionario
1. Explique qu es un microtomo?
2. Es necesario utilizar un microtomo para observar tejidos animales? Por qu?
3. Cules son las diferencias entre el corte, fijacin y tincin entre las muestras de tejidos animales y tejidos vegetales?
4. Por qu hay que deshidratar y rehidratar la muestra durante la fijacin y tincin en la tcnica del microtomo?
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4e6idos
5. Qu es un azetropo? Cmo se obtiene etanol absoluto? Qu es etanol desnaturalizado?
6. Por qu en la tcnica RAMP no se utiliza parafina? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________
1. Stevens A., Lowe J.S. (1997): Histologa Humana. 2a ed., Elsevier-Health Sciences Division, Espaa. pp. 5. 2. Introduccin a la Histologa. (2013). http://wzar.unizar.es/acad/histologia/texto/TemasHistologia_I/1_1_Introduccion-Tecnicas.pdf 3. Troyer D.L., Cash W.C., Provo-Klimek J., Kennedy G.A. (2002): A novel method for preparing histology slides without a microtome. Anat. Hist. Embryol. 31:129-131
47
Ciclo delular
Prctica 8
Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 8 d
Objetivo
Observar, identificar y aprender las diferentes fases de la mitosis en clulas vegetales.
Introduccin
Ciclo celular El objetivo del ciclo celular es generar de una clula dos clulas hijas genticamente idnticas: para eso se requiere duplicar en forma exacta la cantidad de DNA cromosmico y distribuir las copias a las clulas hijas. Este proceso vara mucho en los distintos tipos de clulas. Por ejemplo, una levadura en condiciones ideales puede dividirse en aproximadamente 2 h, mientras que una clula heptica de mamfero en ms o menos 24 h; aunque esto ocurre, en promedio, menos de una vez por ao. El ciclo celular de eucariontes, examinado con el microscopio, muestra 4 fases, y los dos acontecimientos ms notables son la divisin nuclear (mitosis) y la divisin de la clula en dos (citocinesis) (Fig. 13). Mitosis El mecanismo de la mitosis (del griego "mitos" = filamento, hilo) es semejante en todas las clulas eucariontes, aunque existen diferencias entre clulas animales y vegetales. Durante la interfase (G1, S y G2) la clula se prepara a la divisin celular: formar biomasa, replicar el genoma, corroborar las condiciones adecuadas (p.ej. suficiente espacio). Durante toda la interfase el DNA est disperso y se observa como cordones finos. Al final de la fase G2 la clula empieza la divisin celular (mitosis o fase M), que se puede diferenciar en cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase; de stas la de mayor duracin suele tener la profase. Inicialmente el DNA se "condensa", es decir se compacta, y se forman los cromosomas, que ahora son teibles (Fig. 14); cada uno consiste en dos rplicas llamadas cromtidas unidas entre s por el centrmero. Dentro de ste hay estructuras proteicas, los cinetcoros. Despus los cromosomas se alinean, se separan los cromtidos a los dos polos de la clula, se re-estabiliza el ncleo y se inicia con la separacin en dos clulas hijas (citocinesis). Al final la clula regresa a la fase G0, el estado fisiolgico normal.
48
Ciclo delular
Fig. 13: Etapas del ciclo celular: G1 - S - G2 - M http://www.acercaciencia.com/2012/10/15/ciclo-celular/
Fig. 14: Cromosoma replicado. http://genomasur.com/lecturas/Guia12b.htm
Material a utilizar
Material biolgico 20 semillas de haba con 8 das de germinacin Material Navajas de afeitar o escalpelo Aguja de diseccin (recta) Toallas de papel Portaobjetos y cubreobjetos Vidrios de reloj o placas Petri Mechero Bunsen Equipo 1 Microscopio Consumibles Acetocarmn (anexo) o Acetorcena (anexo) HCl (1 N) Aceite de inmersin Agua destilada (A. dest.)
49
Ciclo delular
Procedimiento
1. Escoger 20 semillas de habas y colocarlas sobre una servilleta de papel, estas a su vez colocarlas sobre una placa Petri y humedecer durante 8 das para lograr su germinacin. 2. Realizar cortes transversales lo ms delgado posible en los pices radicales de las habas. 3. Colocar los cortes en placas Petri, vidrios de reloj o portaobjetos limpios y cubrirlos con unas gotas de HCl durante 15 min. 4. Despus quitar el exceso del cido con A. dest. y cubrirlos con unas gotas de acetocarmn (vase anexo I) y esperar 15 min. 5. Colocar un cubreobjeto sobre la muestra con acetocarmn, encima de esto una servilleta y presionar. 6. Proceder a observar las diferentes etapas de mitosis al microscopio en 40x y 100x
Fig. 15: Las diferentes fases de la mitosis de izquierda a derecha: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Extrada del Manual de Biologa Celular y Molecular II
50
Ciclo delular

1. Desinfectar las mesetas de trabajo con etanol al 70 %. 2. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 % por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser reutilizados o depositados donde se almacena vidrio para reciclar.
Resultados
1. Reconocer las fases celulares auxilindose de la Fig. 15. 2. Dibujar y nombrar las fases celulares observadas en esta prctica.
Observaciones
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Ciclo delular
Conclusiones
Cuestionario
1. En cunto tiempo aproximadamente ocurre una divisin celular en vegetales?
2. Cules son las diferencias entre la mitosis de clulas animales y clulas vegetales?
3. Explique brevemente las fases de la mitosis: Profase:
Metafase:
Anafase:
Telofase:
Citocinesis:
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4. Mencione las principales diferencias entre mitosis y meiosis.
Ciclo delular
1. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2011): Introduccin a la Biologa Celular. 3a ed., Panamericana, Mxico. pp. 609-614 2. Martnez-Trujillo M., Farias-Chagoya A., Ballesteros L. (2011): Manual de Prcticas de Biologa Celular y Molecular II. Disponible en: http://bios.biologia.umich.mx/
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7ne/o
Anexo: Colorantes y soluciones isotnicas

Tincin simple
Azul de metileno Azul de metileno 1,0 g A. dest. 100,0 ml Preparacin: Disolver 1 g de azul de metileno en 100 ml de A. dest.
Tincin Gram
Cristal violeta Cristal violeta Oxalato de amonio Etanol A. dest. 2,0 g 0,8 g 20,0 ml 80,0 ml
Preparacin: 1) Solucin a: disolver 2 g de cristal violeta en 20 ml de etanol. 2) Solucin b: disolver 0,8 g de oxalato de amonio en 80 ml de A. dest. 3) Mezclar cuidadosamente las soluciones a y b. 4) Guardar la mezcla en un frasco mbar en oscuridad durante 24 h. 5) Filtrar con papel Whatman No.1 antes de utilizarlo. Lugol Yoduro de potasio 0,66 g Yodo 0,4 g A. dest. ~100 ml Preparacin: En un matraz aforado de 100 ml disolver 0,66 g de yoduro de potasio en 40 ml de A. dest. y enseguida agregar 0,4 g de yodo. Mezclar completamente y aforar con A. dest. Etanol-Acetona Etanol
70,0 ml
Acetona 30,0 ml Preparacin: En una probeta de 100 ml colocar 70 ml de etanol y 30 ml de acetona, mezclar.
54

Safranina Safranina
7ne/o
0,25 g
Etanol 10,0 ml A. dest. ~90 ml Preparacin: En un matraz aforado de 100 ml colocar 10 ml de etanol, disolver 0,25 g de safranina y aforar con A. dest.
Colorantes para estructuras internas de clulas eucariotas

Colorante de Giemsa para frotis sanguneo Polvo de Giemsa
0,75 g
Glicerol 35,0 ml Metanol 65,0 ml Preparacin: En una botella mbar, a la cual se le agrega perlas de vidrio, vaciar los tres compuestos mencionados anteriormente y agitar constantemente a 50 rpm durante 3 das. Despus filtrar y almacenar en botella mbar. De esta solucin, utilizar 2 gotas por 1 ml de Buffer de fosfatos 4/5 pH 7,2. Buffer de fosfatos 4/5 Na2HPO4 (anhidro) 8,0 g KH2PO4 (cristales) 10,0 g Mezcla total 18,0 g Preparacin: Disolver 1 g de la mezcla en 1000 ml de A. dest., pH 7,2. Polvo de Giemsa Eosinato de azur A 0,5 g Eosinato de azur B 2,5 g Cloruro de azul de metileno 2,0 g Preparacin: Mezclar bien con la ayuda de un mortero.
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Acetocarmn para ticin de cromosomas Carmn
7ne/o
5,0 g
cido actico glacial 45,0 ml A. dest. ~55 ml Preparacin: Disolver 5 g de carmn en 45 ml de cido actico, hervir con refrigeracin hasta que tenga un color oscurecido, enfriar a temperatura ambiente, aforar a 100 ml con A. dest. y filtrar con papel Whatman No.1 antes de utilizarlo. Acetorcena para ticin de cromosomas Orcena en polvo cido actico glacial A. dest. 2,0 g 55,0 ml ~50 ml
cido clorhdrico (HCl), 1 N Preparacin: Disolver 2 g de orcena en 55 ml de cido actico, hervir, enfriar y aforar a 100 ml con A. dest. Tras 12 h de reposo filtrar con papel filtro Whatman No. 1. Para utilizarlo como colorante se debe usar la relacin: 1 parte de solucin de orcena y 9 partes de HCl. cido clorhdrico (HCl), 1 N HCl, 36 % 10,0 ml A. dest. ~90 ml Preparacin: Mezclar 10 ml de HCl 36 % en A. dest. y aforar a 100 ml.
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Hematoxilina de Harris Hematoxilina (cristales oscuros) Etanol, 96 % Sulfato de amonio y aluminio xido de mercurio cido actico glacial A. dest.
7ne/o
0,5 g 5,0 ml 10,0 g 0,25 g 40,0 ml ~60 ml
Preparacin: Disolver 0,5 g de hematoxilina en etanol y, por separado, 10 g de sulfato de amonio y aluminio en A. dest. Mezclar las dos soluciones y calentarla a 95 C. Despus, a la solucin an caliente, adicionar lentamente el xido de mercurio, hasta una coloracin prpura. Posteriormente introducir la mezcla completa en un bao fro y despus agregar el cido actico y aforar a 100 ml con A. dest. Finalmente filtrar la mezcla y almacenar en un frasco mbar. Utilizar la solucin despus de 48 h. Eosina Y cida Eosina Y cido actico glacial
0,5 g 0,5 ml
A. dest. ~100 ml Preparacin: Disolver 0,5 g eosina Y en 50 ml A. dest., despus agregar 0,5 ml cido actico y por ltimo aforar a 100 ml con A. dest.
Soluciones isotnicas
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) un buffer muy usado en la biologa celular y molecular NaCl 80,1 g KCl Na2HPO4 * 2 H2O KH2PO4 2,00 g 7,65 g 2,00 g
A. dest. ~1000 ml pH 7,4 Preparacin: En un matraz aforado de 1 l colocar 900 ml de A. dest. y disolver las sales; el pH debe estar a pH 7,4 sin ajustar, aforar con A. dest. hasta 1000 ml y estrilizar a 121 C, 1 bar durante 20 min. El buffer se usa a la concentracin 1x: diluir 100 ml 10x PBS con 900 ml A. dest. (estril) en una botella estril; mezclar bien. 57

Solucin salina Cloruro de sodio
7ne/o
0,9 g
A. dest. 100 ml Preparacin: Disolver 0,9 g en 100 ml de A. dest. y estrilizar a 121 C, 1 bar durante 20 min. Ringer 1/4 NaCl KCl CaCl2 NaHCO3 2,25 g 0,105 g 0,120 g 0,05 g
A. dest. 1000 ml pH 7,3 0,2 Preparacin: Pesar cada uno de los componentes, disolver uno por uno en 800 ml de A. dest. y ajustar el pH con cido clorhdrico 1 N o hidrxido de sodio 1 N. Aforar la solucin a 1000 ml, estrilizar a 121C, 1 bar durante 20 min. Caldo peptonado Peptona
1g
A. dest. 100 ml Preparacin: Disolver 1 g de peptona en 100 ml de A. dest. y estrilizar a 121 C, 1 bar durante 20 min.
Medios de cultivo
Tryptic Soy Broth (TSB) Peptona de casena Peptona de soya NaCl A. dest. pH 15 g 5g 5g 1000 ml 7,3
Preparacin: Disolver cada uno de los componentes en 1000 ml de A. dest. (el pH debe estar a pH 7,3 sin ajustar) y estrilizar a 121 C, 1 bar durante 20 min. Nutrient Broth (NB) Extracto de carne Peptona de carne
3g 5g
58

A. dest. pH 1000 ml 6,8
7ne/o
Preparacin: Disolver cada uno de los componentes en 1000 ml de A. dest. (el pH debe estar a pH 6,8 sin ajustar) y estrilizar a 121 C, 1 bar durante 20 min.
1. Castro-Castillo A., Guerrero-Bermdez O.M. (2006): Tcnicas de Diagnstico Parasitolgico. 2a ed. Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica. pp. 25 2. Madrid C., Fras J., Grifoll M., Merino S., Rosa M.P., Anna M.S. (1997): Guia per a les Practiques de Microbiologia. Universitat de Barcelona, Barcelona. pp.73-75
59

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Fig. 1: Smbolo internacional de Riesgo Biolgico

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actividades !ue est en concordancia con los gru"os de riesgos (%&)'

Aconsejable No S No Aconsejable S, para mobiliario Aconsejable S Aconsejable Aconsejable Cuando proceda

S S Si, cuando la S infeccin se propague por el aire S, disponible S, en el mismo lugar

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11. Cules pases cuentan con laboratorios de BSL-4?:

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Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro

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d: distancia [cm] c: concentracin analito [mol/l]

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Eliminacin de residuos biolgicos

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3. Graficar los resultados Abs vs concentracin

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Microscopio: componentes y observacin

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Fig. 4: )s"ectro electro+agn.tico i+agen e/trada de 0tt"1221'b"'blogs"ot'co+2

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Muestras brillantes en contra de un Observacin de microorganismos

Microscopio electrnico - Transmisin

Microscopios de proximidad - Scanning tunneling - Fuerza atmica

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Eliminacin de residuos biolgicos

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2. Dibujar o fotografiar a las clulas observadas sealando los objetivos utilizados.

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Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas

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Nota: para la preparacin de los colorantes vase anexo I.

Eliminacin de residuos biolgicos

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3. Sealar en los dibujos los nombres de las estructuras observadas.

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3. Por qu es necesario teir la muestra?

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Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad

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6. Por qu en la tcnica RAMP no se utiliza parafina?